具体实施方式

实施例1发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HCS08-005 CGMCC No.16259菌株的筛选及生理生化特性

婴儿粪便5g加到5mL缓冲蛋白胨液中，以10倍稀释法稀释至10^-3，每个稀释度划线到MRS改良培养基平板上。37℃培养24～48h(平板放入自封袋中)；挑取具有目的菌株典型特征(观察形态、大小、色泽、及其透明度等)、菌落较大、活性较强的单菌落，于MRS改良培养基进行划线纯化培养，如此反复2～3次，直到划线平皿中菌落特征一致；每个纯化后的平皿挑取2个以上单菌落进行涂片、革兰氏染色，并且在显微镜下观察其颜色、菌体形状是否一致，从而确定该平皿中菌落是否为纯培养物。如镜下观察结果一致，则将得到的纯培养物(平皿菌落)作为疑似菌株，将对应平皿编号，待鉴定；如镜下观察结果不一致，则继续进行上述操作。

所述的改良MRS培养基：蛋白胨10g/L，牛肉粉3g/L，酵母粉4g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸三铵2g/L，乙酸钠5g/L，葡萄糖20g/L，七水合硫酸镁0.58g/L，四水合硫酸锰0.15g/L，吐温-80 0.6g/L，碳酸钙10g/L，中性红0.05g(1％浓度5mL)，番茄汁10mL/L(v/v)，琼脂粉18g/L，调pH至6.0；115℃，30min灭菌；

实施例2发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HCS08-005 CGMCC No.16259菌株的鉴定

将实施例1中分离纯化后的纯培养物通过划线、涂片镜检，进一步确定其为纯培养物后进行菌种鉴定，包括革兰氏染色试验，接触酶试验，糖发酵鉴定，API鉴定，及16S rDNA全序列测序鉴定。最终鉴定分离得到的菌株为一株发酵乳杆菌，命名为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HCS08-005，已于2018年08月14日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC No.16259。

上述发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HCS08-005菌株为革兰氏阳性菌，兼性厌氧，无芽孢，不运动；菌落较小且大小均一，边缘整齐，表面光滑细密，白色或乳白色；菌体呈短杆状，成堆或成链排列；其生理生化特征是：其生理生化特征是：接触酶阴性，氧化酶阴性，可利用D-核糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、棉子糖。

实施例3发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HCS08-005 CGMCC No.16259菌株的耐消化道逆环境试验

发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HCS08-005耐消化道的逆环境能力是其能够以较高存活率到达肠道并在肠道存活、定植生长及发挥功效的先决条件。

1、耐酸试验

将传代三次的菌液按照10％的接种量分别接种于空白对照、pH2.0和pH3.0的MRS培养基中。37℃静置培养，于17h取样，用灭菌的生理盐水进行10倍系列稀释，分别取适宜稀释度的菌液1000μL进行活菌计数操作，每个稀释度2次重复，37℃静置培养36～48h后计数。

耐酸试验数据指标：

测得空白对照的活菌数用N₀表示，其他pH条件下测得的活菌数用N′表示，其耐酸性活菌数对数比率计算公式如下：

受试菌株耐酸性试验存活率(％)＝lgcfuN′/lgcfu N₀×100％；

表3 HCS08-005耐酸试验数据表

由表3可知，HCS08-005菌株在pH 3.0的条件下经过17h后，存活率达87.2％；pH2.0条件下处理17h存活率达50.1％，这个存活率可保证其通过胃酸的抑制作用仍保持较高活性，从而发挥其益生作用。

2、耐胆盐试验

将传代三次的菌液按照10％的接种量分别接种于未含有进口牛胆盐(空白对照)、含有0.3％、0.5％、1.0％、1.5％进口牛胆盐浓度的MRS液体培养基，37℃静置培养，于17h取样，测定活菌数。

耐胆盐试验数据指标：

测得空白对照的活菌数用N₀表示，其他胆盐浓度条件下测得的活菌数用N′表示，其耐胆盐活菌数对数比率计算公式如下：

受试菌株耐胆盐试验存活率(％)＝lgcfuN′/lgcfu N₀×100％；

表4 HCS08-005耐胆盐试验数据表

由表4可知，虽然HCS08-005菌株随胆盐浓度的升高，活菌数逐渐下降，但是在1.5％胆盐浓度处理条件下，存活率仍然达93％。

3、模拟胃液试验

将传代三次的菌液震荡摇匀，取菌悬液10mL离心(5000×g，10min，5℃)获得菌泥，用PBS缓冲液冲洗3次，获得的菌泥重悬于10mL模拟胃液中，37℃条件下消化3h，分别于0h、3h取样测活菌数。

经在模拟胃液培养基中消化0h、3h后计数测得的活菌数分别用N和N″表示，受试菌株模拟胃液试验存活率计算公式如下：

受试菌株模拟胃液试验存活率(％)＝lgcfu N″/lgcfuN×100％；

表5 HCS08-005模拟胃液试验数据表

由表5可知，HCS08-005菌株在模拟胃液中的存活能力较强，经3h处理，存活率可达到83.6％，其在胃内停留较长时间仍保持较高活性。

4、模拟肠液试验

将传代三次的菌液震荡摇匀，取菌悬液10mL离心(5000×g，10min，5℃)获得菌泥，用PBS缓冲液冲洗3次，获得的菌泥重悬于10mL的人工肠液中，37℃条件下培养，于0h、2h、4h分别取样测活菌数。

经在模拟肠液培养液中培养0h的活菌数用N表示，经在模拟肠液培养液中培养2h、4h后计数测得的活菌数用N″表示，受试菌株模拟肠液试验存活率计算公式如下：

受试菌株模拟肠液试验存活率(％)＝lgcfuN″/lgcfuN×100％；

表6 HCS08-005模拟肠液试验数据表

由表6可知，HCS08-005菌株在模拟肠液中的存活能力强，随处理时间延长，活菌数基本没有下降，存活率高达约100％。

综上，说明该菌株具有较强的耐酸耐胆盐能力，且能够有效抵抗胃肠液的影响，从而能够在通过消化道后依然维持较高活性。

实施例4发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HCS08-005 CGMCC No.16259排便功效试验

试验选用辽宁长生生物技术有限公司提供的清洁级昆明种(KM)的繁殖小鼠32只，雄性小鼠15-20g。试验条件为清洁级动物实验室，温度22±1.5℃，湿度50％±10％，工作照度160-280lx，噪音<60dB。

经口灌胃给予造模药物盐酸洛哌丁胺，建立小鼠便秘模型，考察实验动物6h内排黑便粒数与首次排黑便时间，来反映模型排便情况。试验设置2个剂量组、一个模型对照组和一个溶剂对照组。受试物剂量组为1.5g/kg、3.0g/kg，每天灌胃一次，灌胃体积为10ml/kg，共给予8天。试验结果见表7。

表7 发酵乳杆菌(HCS08-005)排便功效试验结果

*(P＞0.05)

结果表明，受试物在3.0g/kg剂量下给予8天，对盐酸洛哌丁胺的便秘模型有促排便效果。

实施例5发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HCS08-005 CGMCC No.16259耐热性试验

1、样品制备

将传代两次的菌液按照5％的接种量接种于MRS培养基中，于35℃条件下静置培养，培养17小时后取样，备用计数，活菌数用N₁表示；

将传代两次的菌液按照5％的接种量接种于MRS培养基中，于45℃条件下静置培养，培养17小时后取样，备用计数，活菌数用N₂表示；

2、活菌计数

将备用的样品用灭菌的生理盐水进行10倍系列稀释，分别取适宜稀释度的菌液1000μL进行活菌计数操作，每个稀释度2次重复，35℃静置培养36-48h后计数；

3、试验指标：菌液活菌数(单位：cfu/mL)；

受试菌株耐热性试验存活率计算公式如下：

受试菌株耐热性试验存活率(％)＝lgcfuN₂/lgcfuN₁×100％；

表8 HCS08-005耐热性试验数据表

由表8耐热性试验数据显示，菌株HCS08-005在较高温度45℃条件下培养17h后活菌数检测结果为2.2×10⁷cfu/mL，存活率可达75.2％，具有较好的耐热性，能够在较高温环境中保持较好的存活性。

实施例6菌株抑菌功能特性实验

指示菌株准备：取实验菌株冻存管在37℃水浴锅中使其迅速融化，用微量移液器取100μL菌液加入10mL液体培养基中，大肠杆菌/金黄色葡萄球菌/鼠伤寒沙门氏菌/志贺氏菌37℃恒温过夜培养。

制备固体培养基，将培养至对数期的致病菌稀释至菌液浓度为10⁵CFU/mL，取菌悬液100μL均匀涂布于固体培养基上，用镊子将无菌牛津杯竖于涂布有菌液的平皿中，每个牛津杯中加入200μL受试样品。将平皿置于适宜温度的恒温培养箱中，培养适当时间后观察拍照，并用游标卡尺计量抑菌圈直径。

实验结果见表9。表9中采用牛津杯法，牛津杯内直径6mm，外直径8mm；使用受试菌株发酵液上清，分别进行3倍、5倍浓缩以及直接取原上清进行试验。

表9抑菌谱记录表

通过试验结果可以得出，HCS08-005对胃肠道中主要致病菌有明显抑菌作用。

实施例7发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HCS08-005 CGMCC No.16259培养方法

1、冻存菌种复苏：取存于低温冰箱内的菌种冻存管，立即放入37℃水浴锅内进行菌种复苏，15～30s，至冻存管内的固体全部融化；

2、一级培养：将复苏好的1mL冻存管菌种接种至装有10mL基础培养基试管中，35℃培养箱恒温静置培养16.5±0.5h；

3、二级培养：将菌种活化所得菌悬液按5％接种量接种于100mL基础培养基中，装液量80％，35℃静置培养8±0.5h；

4、三级培养：将二级培养的菌悬液按5％接种量接种到300mL优化培养基中，装液量80％，35℃静置培养17.5±0.5h。

所述的基础培养基配方：葡萄糖30.0g/L、酵母蛋白胨22.0g/L、酵母浸出物6.0g/L、柠檬酸4.0g/L、余量为纯化水；按照配方比例称量、加热溶解，用1mol/L食品级NaOH溶液调培养基pH值至7.00，115℃下灭菌30min；

所述的优化培养基配方：酵母蛋白胨30.0g/L、葡萄糖25.0g/L、酵母浸出物10.0g/L、乳糖20.0g/L、结晶果糖5.0g/L、柠檬酸4.0g/L、L-苹果酸5.0g/L、余量为纯化水；按照配方比例称量、加热溶解，115℃下灭菌30min，用1mol/L食品级NaOH溶液调培养基pH值至6.20；

上述发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HCS08-005三级培养所得的菌悬液活菌数为5.8×10⁹cfu/mL。