一种N-芴甲氧羰基-γ-(S-三苯甲基-半胱胺基)-L-谷氨酸的制备方法
阅读说明:本技术 一种N-芴甲氧羰基-γ-(S-三苯甲基-半胱胺基)-L-谷氨酸的制备方法 (Preparation method of N-fluorenylmethoxycarbonyl-gamma- (S-trityl-cysteamine) -L-glutamic acid ) 是由 徐红岩 张家宝 付静晗 李仲才 朱银 曹世团 付等良 于 2020-06-16 设计创作,主要内容包括:本发明提供了一种N-芴甲氧羰基-γ-(S-三苯甲基-半胱胺基)-L-谷氨酸的制备方法,主要解决原工艺中的复杂性,周期长,成本高,收率低等技术问题,本发明包括以下步骤:(1)、N-芴甲氧羰基-L-谷氨酸的制备;(2)、N-芴甲氧羰基-L-谷氨酸-1-苄酯的制备;(3)、S-三苯甲基半胱胺的制备;(4)、N-芴甲氧羰基-γ-(S-三苯甲基-半胱胺基)-L谷氨酸-α-苄酯的制备;(5)、N-芴甲氧羰基-γ-(S-三苯甲基-半胱胺基)-L谷氨酸的制备。本发明具有快速、高产、分离和纯化简单,且使用的溶剂为对环境友好的溶剂,适合大批量生产。(The invention provides a preparation method of N-fluorenylmethyloxycarbonyl-gamma- (S-trityl-cysteamine) -L-glutamic acid, which mainly solves the technical problems of complexity, long period, high cost, low yield and the like in the prior art, and comprises the following steps: (1) preparing N-fluorenylmethyloxycarbonyl-L-glutamic acid; (2) preparing N-fluorenylmethyloxycarbonyl-L-glutamic acid-1-benzyl ester; (3) preparing S-trityl cysteamine; (4) preparing N-fluorenylmethyloxycarbonyl-gamma- (S-trityl-cysteamine) -L glutamic acid-alpha-benzyl ester; (5) and preparing N-fluorenylmethyloxycarbonyl-gamma- (S-trityl-cysteamine) -L glutamic acid. The method has the advantages of rapidness, high yield, simple separation and purification, and environment-friendly solvent, and is suitable for mass production.)
技术领域
本发明涉及多肽合成、药物多肽等领域,具体涉及一种N-芴甲氧羰基-γ-(S-三苯甲基-半胱胺基)-L-谷氨酸的制备方法。
背景技术
目前现有技术中,N-芴甲氧羰基-γ-(S-三苯甲基-半胱胺基)-L-谷氨酸及其中间体的制备方法路线为:将谷氨酸通过侧链羧基苄基保护做成h-glu(obzl)- OH,再经过和z-基团反应得到z-glu(obzl)- OH,在通异丁烯反应制备得到z-glu(obzl)-otbu,再加氢裂解得到h-glu-otbu,在和fmoc-基团反应得到fmoc-glu-otbu,再和hosu反应做成fmoc-glu(osu)-otbu,再和先期做好的S-三苯甲基半胱胺反应制得fmoc-glu(NHCH2CH2Strt)-otbu,最后再脱除叔丁基得到fmoc-glu(NHCH2CH2Strt)-COOH。此方案步骤繁琐,周期长,得率低,成本高,不适宜商业化生产。
发明内容
本发明技术目的在于克服原工艺中的复杂性,周期长,成本高,收率低等技术问题,提供了一种N-芴甲氧羰基-γ-(S-三苯甲基-半胱胺基)-L-谷氨酸及其中间体的制备方法,该方法简单易控制,反应周期较短,成本低,适宜于规模化生产。
为了达到上述发明目的,本发明采用的技术方案是:一种N-芴甲氧羰基-γ-(S-三苯甲基-半胱胺基)-L-谷氨酸的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)、将谷氨酸加入水和丙酮的混合液中,再加入氢氧化钠搅拌,冰浴降温并加入氨基保护剂fmoc基团供体进行反应,TLC跟踪检测进程,后经过酸化萃取、水洗,盐水洗,制得到fmoc-glu-OH;
(2)、将fmoc-glu-OH和苄基供体混合于二甲基甲酰胺中,加入木瓜蛋白酶并加热反应,TLC跟踪监测反应进程,反应好后加水稀释,并经乙酸乙酯洗涤,在加醋酸乙酯和柠檬酸酸化萃取,并经水洗,盐水洗,浓缩加石油醚结晶制得fmoc-glu-obzl;
(3)、将2-巯基乙胺加入冰醋酸中,升温,之后加入三苯甲基供体物,之后缓慢加入三甲基氯硅烷,机械搅拌反应,之后降温至4-6℃,并用质量百分含量20%的醋酸钠水溶液调节体系pH值并搅拌结晶,之后将体系过滤,滤饼经水和***冲洗,晾干后制备得到S-三苯甲基半胱胺;
(4)、将fmoc-glu-obzl加入THF中,机械搅拌并降温,之后加入缩合剂和三乙胺,之后再加入S-三苯甲基半胱胺反应,TLC跟踪监测反应进程,反应完后减压浓缩出去thf,之后加乙酸乙酯溶解,再经酸水洗、碱水洗,水洗,盐水洗,干燥,浓缩结晶得fmoc-glu(NHCH2CH2Strt)-obzl;
(5)、将fmoc-glu(NHCH2CH2Strt)-obzl加入甲醇中,之后加入钯炭,并通氢气反应,TLC跟踪监测进程,反应完成后,过滤去钯炭,之后浓缩至干加少许醋酸乙酯溶解并加石油醚结晶,之后抽滤烘干得fmoc-glu(NHCH2CH2Strt)-COOH,经NMR和MS验证,结构符合预期。
所述步骤(1),谷氨酸和fmoc-基团的物质的量比为1:(1-1.5),反应的温度为:10-20℃,反应时间为6-12h,所述的fmoc-基团供体为fmoc-osu、fmoc-CL或fmoc-NH2中的一种。优选fmoc-基团供体为fmoc-osu。
所述步骤(2),fmoc-glu-OH、苄基供体的物质的量比为:1:(1-1.6),反应温度为38-42℃,反应时间为22-26h,所述木瓜蛋白酶的用量为氨基酸质量的10%-15%,所述苄基供体为苯甲醇、溴化苄或氯化苄中的一种,优选溴化苄。
所述步骤(3),2-巯基乙胺、三苯甲基供体物和三甲基氯硅烷的物质的量比为1:(1-1.5):(0.9-1.3),所述反应温度为30-50℃,所述反应时间为2-6h,所述三苯甲基供体物为三苯甲醇、三苯基溴甲烷或三苯基氯甲烷中的一种,优选三苯基溴甲烷。
所述步骤(4),fmoc-glu-obzl、缩合剂和S-三苯甲基半胱胺物质的量比的比为:1:(0.9-1.3):(1-1.3),所述反应温度为5-15℃,所述反应时间14-18h,所述的缩合剂为HTBU、TBTU或HOBT中的一种,优选TBTU。
所述步骤(5),所加的钯炭用量为氨基酸重量的5%-15%,所述反应时间为12-24h。
所述TLC跟踪检测进程的条件:1)正丁醇:冰醋酸:水的体积比=4:1:1;2)三氯甲烷:甲醇:乙酸体积比=90:8:2。
本发明的有益效果:本发明制备方法通过先制备成价格低廉的fmoc-glu-obzl来代替价格昂贵的fmoc-glu-otbu,并最终制得N-芴甲氧羰基-γ-(S-三苯甲基-半胱胺基)-L-谷氨酸,此方法简单易控制,大大简化了工艺,降低了成本,缩短了周期,适用于大规模生产,本发明制得N-芴甲氧羰基-γ-(S-三苯甲基-半胱胺基)-L-谷氨酸收率高,质量也有明显的提高。
附图说明
图1为本发明实施例1产物的色谱图谱。
图2为本发明实施例1产物的质谱图谱。
图3为本发明实施例1产物的核磁图谱。
图4为本发明实施例2产物的色谱图谱。
图5为本发明实施例3产物的色谱图谱。
图6为本发明实施例4产物的色谱图谱。
图7为本发明实施例5产物的色谱图谱。
图8为本发明实施例6产物的色谱图谱。
图9为本发明实施例6产物的质谱图谱。
图10为本发明实施例6产物的核磁图谱。
图11为本发明实施例7产物的色谱图谱。
图12为本发明比较例产物的质谱图谱。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明进行详细的描述,但他们不是对本发明的进一步限制。
实验所用主要检测仪器:
1、岛津20A
2、检验条件:色谱柱:4.6*250㎜,sinoCHrom ODS-BP 5μm
3、检测波长:220nm
4、流动相:A: 0.1%质量百分浓度三氟乙酸溶液
B:0.1%质量百分浓度三氟乙酸乙腈混合溶液
5、流速:1.0ml/min
6、柱温:25℃
7、岛津:LCMS-2020质谱仪
8、瓦立安400兆核磁共振波普仪。
实施例1,
1.1、将100g(0.68mol)谷氨酸加入1L水和丙酮的混合液中,冰浴降温,再加入2N的氢氧化钠水溶液搅拌调节体系pH值为8-9,待温度小于5℃后,开始分批缓慢加入229g(0.68mol)的fmoc-osu,升温至10℃进行反应,TLC检测,反应12h后结束,后向体系中加入1L醋酸乙酯萃洗杂质3次,再加3L醋酸乙酯并加入盐酸酸化pH值为1-2,之后油相用1L酸水洗2次、1L水洗2次,1L盐水洗,无水硫酸钠干燥,之后浓缩结晶,抽滤制得到fmoc-glu-OH,烘干得到185.3g(73.8%,0.50mol)。
1.2、将185.3g(0.50mol)fmoc-glu-OH和85.5g(0.5mol)溴化苄混合于926ml的二甲基甲酰胺中,加入18.5g木瓜蛋白酶。之升温至42℃反应26h反应,TLC跟踪监测反应进程,反应好后加1L水稀释,再加入3L乙酸乙酯,乙酯相再用1.5L水洗3次,1.5L盐水洗一次,无水硫酸钠干燥,之后浓缩加石油醚结晶制得fmoc-glu-obzl,烘干得102.1g(44.3%,0.22mol)。
1.3、将100g(1.3mol)2-巯基乙胺加入冰醋酸中,升温,之后加入628.8g(1.95mol)三苯基溴甲烷,之后缓慢加入126.8g(1.17mol)三甲基氯硅烷,机械搅拌下升温至30℃反应6h,之后降温至5℃,并用质量百分含量20%的醋酸钠水溶液调节体系pH值并搅拌结晶,之后将体系过滤,滤饼经水和***冲洗,得到S-三苯甲基半胱胺,烘干得319.7g(77.2%,1mol)。
1.4、将102.1g(0.22mol)fmoc-glu-obzl加入THF中,机械搅拌并降温,之后加入63.6g(0.198mol)TBTU和三乙胺,之后再加入70.3g(0.22mol)S-三苯甲基半胱胺反应,控制温度在15℃下反应18h,TLC跟踪监测反应进程,反应完后减压浓缩出去THF,之后加3L乙酸乙酯溶解,用质量百分含量5%的柠檬酸水洗3次、质量百分含量5%的碳酸钠水洗3次,1.5L水洗2次,1.5L饱和盐水1洗,干燥,过滤,浓缩结晶得fmoc-glu(NHCH2CH2Strt)-obzl,得到120g(71.2%,0.158mol)。
1.5、将120g(0.158mol)fmoc-glu(NHCH2CH2Strt)-obzl加入甲醇中,之后加入6g钯炭,常温下通氢气反应24h,TLC跟踪监测进程,之后过滤去钯炭,之后浓缩至干加少许醋酸乙酯溶解并加石油醚结晶,之后抽滤烘干得fmoc-glu(NHCH2CH2Strt)- COOH 81.1g(76.6%,0.12mol),经分析,符合预期。参见图1、图2、图3。
实施例2
2.1、将100g(0.68mol)谷氨酸加入1L水和丙酮的混合液中,冰浴降温,再加入2N的氢氧化钠水溶液搅拌调节体系pH值为8-9,待温度小于5℃后,开始分批缓慢加入286.6g(0.85mol)的fmoc-osu,升温至15℃进行反应,TLC检测,反应9h后结束,后向体系中加入1L醋酸乙酯萃洗杂质3次,再加3L醋酸乙酯并加入盐酸酸化pH值为1-2,之后油相用1L酸水洗2次、1L水洗2次,1L盐水洗,无水硫酸钠干燥,之后浓缩结晶,抽滤制得到fmoc-glu- OH,烘干得到206.8g(82.4%,0.56mol)。
2.2、将206.8g(0.56mol)fmoc-glu- OH和124.5g(0.73mol)溴化苄混合于1034ml的二甲基甲酰胺中,加入25.9g木瓜蛋白酶。之升温至40℃反应24h反应,TLC跟踪监测反应进程,反应好后加1L水稀释,再加入3L乙酸乙酯,乙酯相再用1.5L水洗3次,1.5L盐水洗一次,无水硫酸钠干燥,之后浓缩加石油醚结晶制得fmoc-glu-obzl,烘干得147.1g(57.2%,0.32mol)。
2.3、将100g(1.3mol)2-巯基乙胺加入冰醋酸中,升温,之后加入525.2g(1.625mol)三苯基溴甲烷,之后缓慢加入155.3g(1.43mol)三甲基氯硅烷,机械搅拌下升温至40℃反应4h,之后降温至4℃,并用质量百分含量20%的醋酸钠水溶液调节体系pH值并搅拌结晶,之后将体系过滤,滤饼经水和***冲洗,得到S-三苯甲基半胱胺,烘干得347.9g(84%,1.09mol)。
2.4、将147.1g(0.32mol)fmoc-glu-obzl加入THF中,机械搅拌并降温,之后加入113g(0.352mol)TBTU和三乙胺,之后再加入122.6g(0.384mol)S-三苯甲基半胱胺反应,控制温度在10℃下反应16h ,TLC跟踪监测反应进程,反应完后减压浓缩出去THF,之后加3L乙酸乙酯溶解,用质量百分含量5%的柠檬酸水洗3次、质量百分含量5%的碳酸钠水洗3次,1.5L水洗2次,1.5L饱和盐水1洗,干燥,过滤,浓缩结晶得fmoc-glu(NHCH2CH2Strt)-obzl,得到184.9g(76.1%,0.24mol)。
2.5、将184.9g(0.24mol)fmoc-glu(NHCH2CH2Strt)-obzl加入甲醇中,之后加入18.5g钯炭,并通氢气反应18h,TLC跟踪监测进程,之后过滤去钯炭,之后浓缩至干加少许醋酸乙酯溶解并加石油醚结晶,之后抽滤烘干得fmoc-glu(NHCH2CH2Strt)-COOH 137.9g(84.5%,0.2mol),经分析符合预期。参见图4。
实施例3
3.1、将100g(0.68mol)谷氨酸加入1L水和丙酮的混合液中,冰浴降温,再加入2N的氢氧化钠水溶液搅拌调节体系pH值为8-9,待温度小于5℃后,开始分批缓慢加入344g(1.02mol)的fmoc-osu,升温至20℃进行反应,TLC检测,反应6h后结束,后向体系中加入1L醋酸乙酯萃洗杂质3次,再加3L醋酸乙酯并加入盐酸酸化pH值为1-2,之后油相用1L酸水洗2次、1L水洗2次,1L盐水洗,无水硫酸钠干燥,之后浓缩结晶,抽滤制得到fmoc-glu-OH,烘干得到200.9g(82%,0.54mol)。
3.2、将200.9g(0.54mol)fmoc-glu-OH和147.8g(0.86mol)溴化苄混合于1004.5ml的二甲基甲酰胺中,加入30.1g木瓜蛋白酶。之升温至38℃反应22h反应,TLC跟踪监测反应进程,反应好后加1L水稀释,再加入3L乙酸乙酯,乙酯相再用1.5L水洗3次,1.5L盐水洗一次,无水硫酸钠干燥,之后浓缩加石油醚结晶制得fmoc-glu-obzl,烘干得137.2g(54.9%,0.298mol)。
3.3、将100g(1.3mol)2-巯基乙胺加入冰醋酸中,升温,之后加入420.2g(1.3mol)三苯基溴甲烷,之后缓慢加入183.5g(1.69mol)三甲基氯硅烷,机械搅拌下升温至50℃反应2h,之后降温至6℃,并用质量百分含量20%的醋酸钠水溶液调节体系pH值并搅拌结晶,之后将体系过滤,滤饼经水和***冲洗,得到S-三苯甲基半胱胺,烘干得338g(81.6%,1.06mol)。
3.4、将137.2g(0.298mol)fmoc-glu-obzl加入THF中,机械搅拌并降温,之后加入124.3g(0.387mol)TBTU和三乙胺,之后再加入123.7g(0.387mol)S-三苯甲基半胱胺反应,控制温度在5℃下反应14h ,TLC跟踪监测反应进程,反应完后减压浓缩出去THF,之后加3L乙酸乙酯溶解,用质量百分含量5%的柠檬酸水洗3次、质量百分含量5%的碳酸钠水洗3次,1.5L水洗2次,1.5L饱和盐水1洗,干燥,过滤,浓缩结晶得fmoc-glu(NHCH2CH2Strt)-obzl,得到167g(73.7%,0.22mol)。
3.5、将167g(0.22mol)fmoc-glu(NHCH2CH2Strt)-obzl加入甲醇中,之后加入25g钯炭,并通氢气反应12h,TLC跟踪监测进程,之后过滤去钯炭,之后浓缩至干加少许醋酸乙酯溶解并加石油醚结晶,之后抽滤烘干得fmoc-glu(NHCH2CH2Strt)-COOH 118.2g(80.2%,0.176mol),经分析符合预期。见图5。
实施例4
4.1、将100g(0.68mol)谷氨酸加入1L水和丙酮的混合液中,冰浴降温,再加入2N的氢氧化钠水溶液搅拌调节体系pH值为8-9,待温度小于5℃后,开始分批缓慢加入229g(0.68mol)的fmoc-osu,升温至10℃进行反应,TLC检测,反应6h后结束,后向体系中加入1L醋酸乙酯萃洗杂质3次,再加3L醋酸乙酯并加入盐酸酸化pH值为1-2,之后油相用1L酸水洗2次、1L水洗2次,1L盐水洗,无水硫酸钠干燥,之后浓缩结晶,抽滤制得到fmoc-glu- OH,烘干得到176.3g(70.2%,0.48mol)。
4.2、将176.3g(0.48mol)fmoc-glu- OH和82.1g(0.48mol)溴化苄混合于881.5ml的二甲基甲酰胺中,加入26.4g木瓜蛋白酶。之升温至42℃反应22h反应,TLC跟踪监测反应进程,反应好后加1L水稀释,再加入3L乙酸乙酯,乙酯相再用1.5L水洗3次,1.5L盐水洗一次,无水硫酸钠干燥,之后浓缩加石油醚结晶制得fmoc-glu-obzl,烘干得106.6g(48.6%,0.232mol。
4.3、将100g(1.3mol)2-巯基乙胺加入冰醋酸中,升温,之后加入628.8g(1.95mol)三苯基溴甲烷,之后缓慢加入183.5g(1.69mol)三甲基氯硅烷,机械搅拌下升温至30℃反应2h,之后降温至5℃左右,并用质量百分含量20%的醋酸钠水溶液调节体系pH值并搅拌结晶,之后将体系过滤,滤饼经水和***冲洗,得到S-三苯甲基半胱胺,烘干得343g(82.8%,1.07mol)。
4.4、将106.6g(0.232mol)fmoc-glu-obzl加入THF中,机械搅拌并降温,之后加入67.4g(0.0.21mol)TBTU和三乙胺,之后再加入96.3g(0.3mol)S-三苯甲基半胱胺反应,控制温度在5℃下反应18h,TLC跟踪监测反应进程,反应完后减压浓缩出去THF,之后加3L乙酸乙酯溶解,用质量百分含量5%的柠檬酸水洗3次、质量百分含量5%的碳酸钠水洗3次,1.5L水洗2次,1.5L饱和盐水1洗,干燥,过滤,浓缩结晶得fmoc-glu(NHCH2CH2Strt)-obzl,得到122.7g(69.7%,0.16mol)。
4.5、将122.7g(0.16mol)fmoc-glu(NHCH2CH2Strt)-obzl加入甲醇中,之后加入6.1g钯炭,并通氢气反应12h,TLC跟踪监测进程,之后过滤去钯炭,之后浓缩至干加少许醋酸乙酯溶解并加石油醚结晶,之后抽滤烘干得fmoc-glu(NHCH2CH2Strt)-COOH 59.7g(55.1%,0.089mol),经分析符合预期。见图6。
实施例5
5.1、将100g(0.68mol)谷氨酸加入1L水和丙酮的混合液中,冰浴降温,再加入2N的氢氧化钠水溶液搅拌调节体系pH值为8-9,待温度小于5℃后,开始分批缓慢加入344g(1.02mol)的fmoc-osu,升温至20℃进行反应,TLC检测,反应12h后结束,后向体系中加入1L醋酸乙酯萃洗杂质3次,再加3L醋酸乙酯并加入盐酸酸化pH值为1-2,之后油相用1L酸水洗2次、1L水洗2次,1L盐水洗,无水硫酸钠干燥,之后浓缩结晶,抽滤制得到fmoc-glu- OH,烘干得到196.4g(78.2%,0.48mol)。
5.2将196.4g(0.48mol)fmoc-glu- OH和131.3g(0.768mol)溴化苄混合于982ml的二甲基甲酰胺中,加入19.6g木瓜蛋白酶。之升温至38℃反应26h反应,TLC跟踪监测反应进程,反应好后加1L水稀释,再加入3L乙酸乙酯,乙酯相再用1.5L水洗3次,1.5L盐水洗一次,无水硫酸钠干燥,之后浓缩加石油醚结晶制得fmoc-glu-obzl,烘干得136g(55.7%,0.296mol)。
5.3、将100g(1.3mol)2-巯基乙胺加入冰醋酸中,升温,之后加入420.2g(1.3mol)三苯基溴甲烷,之后缓慢加入126.8g(1.17mol)三甲基氯硅烷,机械搅拌下升温至50℃反应6h,之后降温至5℃左右,并用质量百分含量20%的醋酸钠水溶液调节体系pH值并搅拌结晶,之后将体系过滤,滤饼经水和***冲洗,得到S-三苯甲基半胱胺,烘干得313.5g(75.7%,0.98mol)。
5.4、将196.4g(0.48mol))fmoc-glu-obzl加入THF中,机械搅拌并降温,之后加入200.3g(0.624mol)TBTU和三乙胺,之后再加入153.3g(0.48mol)S-三苯甲基半胱胺反应,控制温度在15℃下反应14h ,TLC跟踪监测反应进程,反应完后减压浓缩出去THF,之后加3L乙酸乙酯溶解,用质量百分含量5%的柠檬酸水洗3次、质量百分含量5%的碳酸钠水洗3次,1.5L水洗2次,1.5L饱和盐水1洗,干燥,过滤,浓缩结晶得fmoc-glu(NHCH2CH2Strt)-obzl,得到243.3g(75%,0.32mol)。
5.5、将243.3g(0.32mol)fmoc-glu(NHCH2CH2Strt)-obzl加入甲醇中,之后加入36.5g钯炭,并通氢气反应24h,TLC跟踪监测进程,之后过滤去钯炭,之后浓缩至干加少许醋酸乙酯溶解并加石油醚结晶,之后抽滤烘干得fmoc-glu(NHCH2CH2Strt)-COOH 179.7g(83.7%,0.268mol),经分析符合预期。见图7。
实施例6
6.1、将100g(0.68mol)谷氨酸加入1L水和丙酮的混合液中,冰浴降温,再加入2N的氢氧化钠水溶液搅拌调节体系pH值为8-9,待温度小于5℃后,开始分批缓慢加入228.7g(0.884mol)的fmoc-CL,升温至10℃进行反应,TLC检测杂点较多,反应12h后结束,后向体系中加入1L醋酸乙酯萃洗杂质3次,再加3L醋酸乙酯并加入盐酸酸化pH值为1-2,之后油相用1L酸水洗2次、1L水洗2次,1L盐水洗,无水硫酸钠干燥,之后浓缩结晶,抽滤制得到fmoc-glu- OH,烘干得到150.9g(60.1%,0.41mol)。
6.2、将150.9g(0.41mol)fmoc-glu-OH和91.2g(0.533mol)氯化苄混合于1034ml的二甲基甲酰胺中,加入18.8g木瓜蛋白酶。之升温至40℃反应24h反应,TLC跟踪监测反应进程,反应好后加1L水稀释,再加入3L乙酸乙酯,乙酯相再用1.5L水洗3次,1.5L盐水洗一次,无水硫酸钠干燥,之后浓缩加石油醚结晶制得fmoc-glu-obzl,烘干得107.4g(57.2%,0.32mol)。
6.3、将100g(1.3mol)2-巯基乙胺加入冰醋酸中,升温,之后加入423g(1.625mol)三苯甲醇,之后缓慢加入155.3g(1.43mol)三甲基氯硅烷,机械搅拌下升温至60℃反应6h,之后降温至5℃左右,并用质量百分含量20%的醋酸钠水溶液调节体系pH值并搅拌结晶,之后将体系过滤,滤饼经水和***冲洗,得到S-三苯甲基半胱胺,烘干得259.7g(62.7%,1.09mol)。
6.4、将107.4g(0.32mol)fmoc-glu-obzl加入THF中,机械搅拌并降温,之后加入113g(0.352mol)HOBT和三乙胺,之后再加入122.6g(0.384mol)S-三苯甲基半胱胺反应,控制温度在10℃下反应16h ,TLC跟踪监测反应进程,反应完后减压浓缩出去THF,之后加3L乙酸乙酯溶解,用质量百分含量5%的柠檬酸水洗3次、质量百分含量5%的碳酸钠水洗3次,1.5L水洗2次,1.5L饱和盐水1洗,干燥,过滤,浓缩结晶得fmoc-glu(NHCH2CH2Strt)-obzl,得到134g(75.5%,0.176mol)。
6.5、将134g(0.176mol)fmoc-glu(NHCH2CH2Strt)-obzl加入甲醇中,之后加入13.5g钯炭,并通氢气反应18h,TLC跟踪监测进程,之后过滤去钯炭,之后浓缩至干加少许醋酸乙酯溶解并加石油醚结晶,之后抽滤烘干得fmoc-glu(NHCH2CH2Strt)-COOH 97.9g(82.8%,0.146mol),经分析符合预期。见图8、图9、图10。
实施例7
7.1、将100g(0.68mol)谷氨酸加入1L水和丙酮的混合液中,冰浴降温,再加入2N的氢氧化钠水溶液搅拌调节体系pH值为8-9,待温度小于5℃后,开始分批缓慢加入229g(0.68mol)的fmoc-NH2,升温至10℃进行反应,TLC检测,反应12h后结束,后向体系中加入1L醋酸乙酯萃洗杂质3次,再加3L醋酸乙酯并加入盐酸酸化pH值为1-2,之后油相用1L酸水洗2次、1L水洗2次,1L盐水洗,无水硫酸钠干燥,之后浓缩结晶,抽滤制得到fmoc-glu-OH,烘干得到185.3g(73.8%,0.50mol)。
7.2、将185.3g(0.50mol)fmoc-glu-OH和81g(0.75mol)苯甲醇混合于926ml的二甲基甲酰胺中,加入27.8g木瓜蛋白酶。之升温至42℃反应26h反应,TLC跟踪监测反应进程,反应好后加1L水稀释,再加入3L乙酸乙酯,乙酯相再用1.5L水洗3次,1.5L盐水洗一次,无水硫酸钠干燥,之后浓缩加石油醚结晶制得fmoc-glu-obzl,烘干得88.7g(38.5%,0.19mol)。
7.3、将100g(1.3mol)2-巯基乙胺加入冰醋酸中,升温,之后加入525.2g(1.625mol)三苯基氯甲烷,之后缓慢加入155.3g(1.43mol)三甲基氯硅烷,机械搅拌下升温至40℃反应4h,之后降温至5℃左右,并用质量百分含量20%的醋酸钠水溶液调节体系pH值并搅拌结晶,之后将体系过滤,滤饼经水和***冲洗,得到S-三苯甲基半胱胺,烘干得347.9g(84%,1.09mol)。
7.4、88.7g(0.19mol)fmoc-glu-obzl加入THF中,机械搅拌并降温,之后加入79.3g(0.21mol)HBTU和三乙胺,之后再加入78.9g(0.247mol)S-三苯甲基半胱胺反应,控制温度在10℃下反应16h ,TLC跟踪监测反应进程,反应完后减压浓缩出去THF,之后加3L乙酸乙酯溶解,用质量百分含量5%的柠檬酸水洗3次、质量百分含量5%的碳酸钠水洗3次,1.5L水洗2次,1.5L饱和盐水1洗,干燥,过滤,浓缩结晶得fmoc-glu(NHCH2CH2Strt)-obzl,得到109g(74.5%,0.0.14mol)。
7.5、将109g(0.0.14mol)fmoc-glu(NHCH2CH2Strt)-obzl加入甲醇中,之后加入11g钯炭,并通氢气反应18h,TLC跟踪监测进程,之后过滤去钯炭,之后浓缩至干加少许醋酸乙酯溶解并加石油醚结晶,之后抽滤烘干得fmoc-glu(NHCH2CH2Strt)-COOH 80.5g(83.7%,0.12mol),经分析符合预期。见图11。
比较例
1、将100g 谷氨酸悬浮于1L的***中,降温并滴加123g浓硫酸,10-20℃反应6h,之后加入680g苯甲醇反应过夜,之后浓缩除去***,再加入600ml酒精,降温,之后用三乙胺调节体系pH值至8左右,析出大量固体,抽滤,固体用热水重结晶一次,烘干得到104g ,即为h-glu(obzl)-OH。
2、将104g h-glu(obzl)-OH悬浮于1L水中,再加入600mlTHF,用碳酸钠调节体系pH值为8-9,之后缓慢加入142g z-osu反应12h,之后用***洗涤3次,加入3L醋酸乙酯并用柠檬酸酸化pH值为2-3, 之后乙酯相用质量百分含量5%的柠檬酸水洗涤3次,水洗3次,饱和盐水洗一次,干燥,浓缩加石油醚结晶,抽滤,烘干得116.5g,即为z-glu(obzl)- OH。
3、将 116.5g z-glu(obzl)-OH 悬浮用1L二氯甲烷中,之后降温并滴加6ml浓硫酸,之后通入200g异丁烯密封反应4天,之后真空拉走多余的异丁烯,之后用碳酸钠调节体系pH值8左右,静置分层,油相再用质量百分含量5%的碳酸钠水溶液洗3次,水洗三次,干燥,浓缩至余油180g 左右,即为z-glu(obzl)-otbu。
4、将180g z-glu(obzl)-otbu加入1L甲醇中,之后加入18g钯炭,之后通入氢气反应3天,反应完成过滤除去钯炭,之后浓缩并加***结晶,得到38g ,即为h-glu-otbu。
5、将 38g h-glu-otbu 悬浮于38ml的水中,降温,再加入250ml丙酮,用碳酸钠调节体系pH值为8-9,之后加入70g fmoc-osu,反应完全后,用醋酸乙酯和石油醚的混合液洗三次,之后加入1L醋酸乙酯并用柠檬酸调节体系pH值为3左右,油相再用质量百分含量5%的柠檬酸水洗3次,水洗3次,饱和盐水洗一次,干燥,浓缩后加石油醚结晶,烘干的71g,即为fmoc-glu-otbu。
6、将500g(0.65mol)2-巯基乙胺加入冰醋酸中,升温,之后加入211.5g(0.81mol)三苯甲醇,之后缓慢加入101.5g(0.715mol)三氟化硼***,机械搅拌下升温至60℃反应6h,之后降温至5℃左右,并用质量百分含量20%的醋酸钠水溶液调节体系pH值并搅拌结晶,之后将体系过滤,滤饼经水和***冲洗,得到S-三苯甲基半胱胺,烘干得113.3g(0.35mol)备用。
7、将71g fmoc-glu-otbu 加入71ml THF中,再加入20.2g 1-羟基琥珀酰亚胺,降温至0℃以下,之后加入DCC的THF溶液(36gX150ml)反应12h,之后降温并过滤除去副产物,母液浓缩后加石油醚结晶,抽滤烘干得到72.3g粗品,乙酯和石油醚重结晶一次得到61g,即为fmoc-glu(osu)-otbu。
8、将35g S-三苯甲基半胱胺溶于350ml THF中,之后降温,用三乙胺调节pH值为8-9,之后滴加fmoc-glu(osu)-otbu的THF溶液(61gx240ml),反应好后,浓缩除去一半THF,之后加入乙酸乙酯溶解,用质量百分含量5%的碳酸钠水溶液洗涤三次,水洗2次,饱和盐水洗1次,无水硫酸镁干燥过夜,过滤,减压蒸馏后加石油醚结晶 ,抽滤得到68g,即为fmoc-glu(nhCH2CH2strt)-otbu。
9、将68g fmoc-glu(nhCH2CH2strt)-otbu悬浮于 680ml的***中,之后通入盐酸气,TLC跟踪监测反应进程,反应完全后,体系低温减压浓缩除去部分***,之后加石油醚结晶,得到25g,即为fmoc-glu(nhCH2CH2strt)-COOH,经分析符合要求,见图12。