一种测定小白菊中含α,β-不饱和酮的倍半萜内酯总量的试剂和方法
阅读说明：本技术 一种测定小白菊中含α,β-不饱和酮的倍半萜内酯总量的试剂和方法 (Reagent and method for measuring total amount of alpha, beta-unsaturated ketone-containing sesquiterpene lactone in feverfew ) 是由 陈雏 吴燕 李彬 杜蕾蕾 于 2021-05-31 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种测定小白菊中含α,β-不饱和酮的倍半萜内酯总量的试剂和方法,属于药物分析技术领域,所述检测试剂为4-氯-N-(2-巯基乙基)苯甲酰胺,其检测方法是将小白菊提取液与4-氯-N-(2-巯基乙基)苯甲酰胺在设定条件下反应一定时间,检测反应液中4-氯-N-(2-巯基乙基)苯甲酰胺的剩余量,通过计算得到小白菊中含α,β-不饱和酮的倍半萜内酯总量；本发明不依赖被测化合物的对照品,为测定小白菊中含α,β-不饱和酮的倍半萜内酯总量提供了一种简便易行的分析方法。(The invention discloses a reagent and a method for measuring the total amount of alpha, beta-unsaturated ketone-containing sesquiterpene lactone in feverfew, belonging to the technical field of drug analysis, wherein the detection reagent is 4-chloro- N - (2-mercaptoethyl) benzamide, which is detected by mixing the feverfew extract with 4-chloro- N Reacting (2-mercaptoethyl) benzamide for a certain time under set conditions, and detecting 4-chloro- N The residual amount of the- (2-mercaptoethyl) benzamide is calculated to obtain the total amount of sesquiterpene lactone containing alpha, beta-unsaturated ketone in the feverfew; the invention does not depend on a reference substance of a tested compound, and provides a simple and easy analysis method for determining the total amount of the sesquiterpene lactone containing alpha, beta-unsaturated ketone in the feverfew.)
技术领域
本发明涉及一种测定小白菊中含α,β-不饱和酮的倍半萜内酯总量的方法， 属于药物分析
技术领域
。背景技术
小白菊，又名短舌匹菊[Tanacetum parthenium(L.)Schultz Bip.]是一种原 产于欧洲的菊科药用植物，具有防治偏头痛、消炎、缓解胃痛等功效。研究 表明，小白菊中含有多种倍半萜内酯，这些成分大多具有抗炎、抗肿瘤和免疫 调节等作用。该类成分的共同特点是具有α,β-不饱和酮的结构片段，使得其能 够与体内某些蛋白质的半胱氨酸残基发生共价结合，进而对蛋白的功能进行调 控。倍半萜内酯被认为是小白菊中最主要的药效物质类群，其代表性化合物为 小白菊内酯(parthenolide)。
小白菊内酯的结构如下所示：
对于小白菊药材、提取物或制剂中的小白菊内酯的含量测定通常采用高 效液相色谱法，以小白菊内酯为对照品。然而，由于缺乏相应的市售对照品， 小白菊中其它含α,β-不饱和酮的倍半萜内酯的含量却鲜有报道。
考虑到小白菊中含有α,β-不饱和酮的倍半萜内酯通常具有相似的药效活性 和作用机制，而仅以小白菊内酯含量来反映小白菊原料及其产品的质量存在局 限，因此有必要对这类成分的总含量进行测定，这对于以小白菊为原料的有关 产品的质量控制具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种测定小白菊中含α,β-不饱和酮的倍半萜内酯总 量的试剂。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是这样的：
一种测定含α,β-不饱和酮的倍半萜内酯含量的试剂，所述试剂为4-氯-N-(2- 巯基乙基)苯甲酰胺，其结构如下所示：
本申请的发明人通过大量试验研究，证实上述化合物可以用于小白菊中含 α,β-不饱和酮的倍半萜内酯总量的简易测定。
本发明的目的之二，在于提供一种采用上述试剂进行小白菊中含α,β-不饱 和酮的倍半萜内酯总量的测定的方法，具体方法为：
将小白菊提取液与4-氯-N-(2-巯基乙基)苯甲酰胺反应后，检测反应液中4- 氯-N-(2-巯基乙基)苯甲酰胺的剩余量，通过计算得到小白菊中含α,β-不饱和酮 的倍半萜内酯总量。
上述的小白菊提取液一般是指小白菊原药材采用75％甲醇超声提取后得 到的提取液，当然，也可以是采用其他提取溶剂和方法提取得到的提取液。
作为优选的技术方案，所述计算的公式为：
C＝0.0082x+0.1458，其中，C为4-氯-N-(2-巯基乙基)苯甲酰胺的清除率％， C的计算方法为：(反应前4-氯-N-(2-巯基乙基)苯甲酰胺的量-反应后4-氯-N-(2- 巯基乙基)苯甲酰胺的量)/反应前4-氯-N-(2-巯基乙基)苯甲酰胺的量*100％；x 为初始反应液中小白菊内酯浓度，单位为μM(μmol/L)。
本领域技术人员知晓的，本发明所述的含α,β-不饱和酮的倍半萜内酯的通 式如下所示：
本发明采用4-氯-N-(2-巯基乙基)苯甲酰胺与这类化合物反应的机理如下：
首先，小白菊内酯与4-氯-N-(2-巯基乙基)苯甲酰胺反应方程式为：
由于其他含α,β-不饱和酮的倍半萜内酯与4-氯-N-(2-巯基乙基)苯甲酰胺反 应的摩尔比”与“小白菊内酯4-氯-N-(2-巯基乙基)苯甲酰胺反应的摩尔比”相 同，比如：
基于上述原理，将小白菊提取液与4-氯-N-(2-巯基乙基)苯甲酰胺反应 90-150分钟后，通过检测反应液中4-氯-N-(2-巯基乙基)苯甲酰胺的变化量，然 后通过公式计算，即可得到小白菊中含α,β-不饱和酮的倍半萜内酯总量。
关于前述的反应时间90-150分钟，需要说明的是，反应不完全不影响定 量。本发明的实施例中反应时间选择了120分钟，是我们在试验过程中选择的 一个时间点,在这个时间点绘制的校正曲线，在5-75μM范围内，4-氯-N-(2-巯 基乙基)苯甲酰胺的清除率和初始反应液中小白菊内酯的浓度呈线性，用来检 测小白菊中含α,β-不饱和酮的倍半萜内酯总量；因为在我们设定的反应条件下 内酯与硫醇之间的反应是按特定速率进行的(某一时间点的反应程度是相对固 定的)，以小白菊内酯建立了标准曲线后(小白菊内酯与4-氯-N-(2-巯基乙基) 苯甲酰胺)，总内酯与4-氯-N-(2-巯基乙基)苯甲酰胺的反应程度是可以测定， 与标准曲线对比后即可以算出总内酯含量。
作为优选的技术方案：所述反应的温度为25℃～50℃。
作为优选的技术方案：所述反应的时间为90～150分钟。
作为优选的技术方案：含α,β-不饱和酮的倍半萜内酯与4-氯-N-(2-巯基乙基) 苯甲酰胺反应时的摩尔比为5:100～75:100。
作为优选的技术方案：所述反应在磷酸缓冲液-甲醇混合溶液中进行。
作为优选的技术方案：所述磷酸缓冲液的浓度为10mM，pH7.4，所述磷 酸缓冲液-甲醇混合溶液的体积比为1:1。这是较优的反应条件，本领域技术人 员知晓的，在上述条件的基础上进行适度调整变化，也能实现本发明。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：采用本发明的方法，能够不依 赖被测化合物的对照品即可实现定量测定，为测定小白菊中含α,β-不饱和酮的 倍半萜内酯总量提供了一种简便易行的分析方法。
附图说明
图1为检测4-氯-N-(2-巯基乙基)苯甲酰胺的UPLC图；
图2为4-氯-N-(2-巯基乙基)苯甲酰胺的氢谱图；
图3为4-氯-N-(2-巯基乙基)苯甲酰胺的碳谱图；
图4为含量测定的校正曲线。
具体实施方式
实施例1
4-氯-N-(2-巯基乙基)苯甲酰胺的合成
在0℃的二氯甲烷(30ml)中，缓慢加入4-氯苯甲酰氯(1.00g,5.71mmol)， 随后加入β-巯基乙胺(0.45g,5.86mmol)，回流加热2小时。反应液依此经饱和 碳酸氢钠(10mL)和浓盐水(10mL)洗涤，Na2SO4干燥，减压浓缩的微黄色 固体。经正己烷-二氯甲烷的混合溶剂(1:1,v/v)多次结晶，得白色固体(0.62 g,得率50.3％)。ESI-MS:m/z 214.0087[M-H]-(计算值m/z 214.0093， C9H9ClNOS)；1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.64(2H,d,J＝8.6Hz),7.31(2H,d, J＝8.6Hz),6.80(1H,br s),3.53(2H,d,J＝6.4Hz),2.69(2H,dt,J＝8.4Hz,6.4 Hz),1.38(H,t,J＝8.4Hz)；13C NMR(150MHz,CDCl3)δ166.6,137.9,132.6, 128.7,128.4,42.9,24.6，其中，氢谱和碳谱图见图2和图3。
实施例2
4-氯-N-(2-巯基乙基)苯甲酰胺的检测方法
采用ACQUITYUPLC超高效液相色谱法，色谱条件为色谱柱Waters BEH C18(50×2.1mm,1.7μm)，流动相乙腈-水(35:65，v/v)，流速0.4mL/min，柱 温35℃，检测波长238nm，色谱图见附图1。在该条件下，4-氯-N-(2-巯基乙 基)苯甲酰胺的回归方程为y＝2284.6x－1474.9(R2＝0.9999)，y为峰面积，x为 4-氯-N-(2-巯基乙基)苯甲酰胺的浓度(μM)，R2为相关系数，线性范围 2.5-200μM。
实施例3
校正曲线的建立
取小白菊内酯适量，精密称定，以磷酸缓冲液(10mM，pH7.4)-甲醇混 合溶液(1:1，v/v)溶解，配成浓度为10,20,60,80,100,150,200μM的系列对 照品溶液。取4-氯-N-(2-巯基乙基)苯甲酰胺适量，精密称定，以磷酸缓冲液 (10mM，pH7.4)-甲醇混合溶液(1:1，v/v)溶解，配成浓度为200μM的溶 液。不同浓度的小白菊内酯溶液分别与等体积的4-氯-N-(2-巯基乙基)苯甲酰胺 溶液混合，置37℃条件下反应120分钟。检测反应120分钟后溶液中4-氯-N-(2- 巯基乙基)苯甲酰胺的剩余量，计算其清除率。以初始反应液中小白菊内酯的 浓度为横坐标，以反应120分钟后4-氯-N-(2-巯基乙基)苯甲酰胺的清除率为纵 坐标，绘制校正曲线，见图4。
结果显示，4-氯-N-(2-巯基乙基)苯甲酰胺的清除率(17.6％-74.8％)与小 白菊内酯的浓度(5-75μM)之间呈良好的线性关系，回归方程为C＝0.0082x+ 0.1458(R2＝0.9982)。其中，C为清除率(％)，x为初始反应液中小白菊内酯 浓度(μM)，R2为相关系数。因此，在设定的条件下，当小白菊提取液中的小 白菊内酯以及其它含α,β-不饱和酮的倍半萜内酯的总浓度在5-75μM之间时， 可以根据4-氯-N-(2-巯基乙基)苯甲酰胺的清除率来计算得到小白菊中含α,β-不 饱和酮的倍半萜内酯的总量(以小白菊内酯计)。
实施例4
小白菊中含α,β-不饱和酮的倍半萜内酯总量的测定
取小白菊原药材样品干燥粉末0.2g，精密称定，以75％甲醇8mL超声提 取2次，每次15分钟。合并两次的提取液，转移入25mL容量瓶，以75％甲 醇定容至刻度，即得样品储备液。样品储备液经磷酸缓冲液(10mM，pH7.4) -甲醇混合溶液(1:1，v/v)稀释10倍后，与等体积的4-氯-N-(2-巯基乙基)苯 甲酰胺溶液(200μM)混合，置37℃反应120分钟，检测4-氯-N-(2-巯基乙 基)苯甲酰胺的剩余量，计算其清除率。将清除率代入实施例3中的回归方程，可得小白菊样品中含α,β-不饱和酮的倍半萜内酯总量(以小白菊内酯计)。结果 显示，所测三批次小白菊的花中含α,β--不饱和酮的倍半萜内酯总量为67-108 μmol/g，叶中的含量为76-98μmol/g，其结果见表1。
表1.小白菊样品中含α,β-不饱和酮的倍半萜内酯总量(μmol/g干重，n＝3).
样品号
植物部位
总量
FF-1
花
107.97±2.82
FF-1
叶
76.40±1.09
FF-2
花
67.38±1.17
FF-2
叶
78.53±2.70
FF-3
花
75.07±2.54
FF-3
叶
95.09±2.34
实施例5
方法验证
5.1精密度小白菊内酯溶液(20、80、150μM)分别与4-氯-N-(2-巯基乙 基)苯甲酰胺(200μM)等体积混合，置37℃反应120分钟，检测4-氯-N-(2- 巯基乙基)苯甲酰胺的剩余量，计算其清除率，得日内精密度为1.02％(n＝3)， 日间精密度为3.54％(n＝3)，表明该方法的精密度良好。
5.2加样回收率取小白菊样品六份，每份0.1g，分别加入已知含α,β-不饱 和酮的倍半萜内酯总量的80％、100％和120％的小白菊内酯，按给定方法提取 测定。结果显示，该方法的回收率在111.3％-112.4％，表明该方法准确性良好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明 的保护范围之内。
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