阅读说明：本技术 一种硫化氢的供体及其制备方法和用途 (Donor of hydrogen sulfide and preparation method and application thereof ) 是由 陈鲲 樊静 程魁 *** 胡滨雁 陈韵帆 胡佳钦 秦嘉裕 李海鹏 于 2019-07-11 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种硫化氢的供体及其制备方法和用途,属于医药技术领域。本发明提供的硫化氢的供体,其化学名称为S-(4-氟苄基)-N-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-L-半胱氨酸甲酯,化学结构式如式(Ⅰ)所示；本发明提供的硫化氢的供体(MTC),能有效治疗缺血性脑卒中的疾病,通过激活PI3K/AKT通路、抑制线粒体凋亡信号通路、降低内质网应激、激活ERK-MEK信号通路、增加神经细胞的存活率或保护神经元缺血性损伤的多种治疗靶点来实现有效治疗缺血性脑卒中的目的。<Image he="556" wi="603" file="DDA0002127037900000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The invention relates to a donor of hydrogen sulfide, a preparation method and application thereof, belonging to the technical field of medicines. The chemical name of the donor of hydrogen sulfide provided by the invention is S- (4-fluorobenzyl) -N- (3,4, 5-trimethoxybenzoyl) -L-cysteine methyl ester, and the chemical structural formula is shown as a formula (I); the hydrogen sulfide donor (MTC) provided by the invention can effectively treat ischemic stroke diseases by activating a PI3K/AKT pathway, inhibiting a mitochondrial apoptosis signal pathway, reducing endoplasmic reticulum stress, activating an ERK-MEK signal pathway, increasing the survival rate of nerve cells or protecting neuronal ischemic injuryThe aim of effectively treating the cerebral arterial thrombosis is fulfilled by a plurality of treatment targets.)

一种硫化氢的供体及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种硫化氢的供体及其制备方法和用途，属于医药技术领域。

背景技术

脑梗死又称缺血性脑卒中，是由各种原因所致局部脑组织血液供应障碍，造成缺血性脑损伤，在细胞内激活了一系列的级联反应，包括各种信号通路，最终引起不可逆的脑组织损伤。目前临床上治疗脑卒中最有效的方法是快速疏通使其再灌注，即缺血再灌注，但脑缺血后的再灌注在某些情况下可导致脑组织损伤和功能障碍加重，即缺血/再灌注损伤。目前临床上治疗脑缺血的药物有β受体阻断剂、钙离子拮抗剂、他汀类药物、RAS阻断剂等，但治疗靶点较单一、消化道出血等的副作用。一些抗氧化剂药物，激素以及特异性钙通道阻断剂均在一定程度上对脑具有保护作用，但过去的几年中，许多药物在进入III期临床后都遭到失败，其原因不是由于疗效和安全性不够。因此如何减轻脑缺血/再灌注损伤成为全球临床医学亟待解决的热点问题，而其发生机制至今尚未完全被阐明，所以研究缺血性脑卒中损伤的治疗策略以及开发新的药物有着重要的理论和实践意义。

硫化氢(hydrogen sulfide,H₂S)已经被认为是继一氧化氮(nitric oxide,NO)和一氧化碳(carbon monoxide,CO)之后的第三种气体信号分子。近年来研究发现脑组织内有生理浓度的H₂S正常存在，内源性H₂S主要来源于半胱氨酸(cysteine,Cys)的脱硫作用。研究发现，H₂S在神经系统通过多种机制发挥神经保护作用，保护受损的神经元或胶质细胞，如H₂S可清除氧自由基，还可以通过降低凋亡蛋白的表达和激活抗凋亡蛋白而改善缺氧神经元功能。在中枢神经系统，生理浓度的H₂S通过促进cAMP的生成调节海马内的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体，增强NMDA受体介导的神经反应。研究结果表明，H2S抗神经元凋亡作用主要是因其能保护线粒体的完整性，即抑制线粒体的凋亡途径。H₂S通过调控线粒体功能、抑制ROS诱导的Caspase-3凋亡通路，削弱中风导致的认知障碍。目前，已知炔丙基半胱氨酸(SPRC)及其类似物，包括乙基半胱氨酸(SEC)、烯丙基半胱氨酸(SAC)、烯丙基巯基半胱氨酸(SAMC)、丁基半胱氨酸(SBC)及戊基半胱氨酸(SPEC)等均为硫化氢的供体。它们通过胱硫醚-β-合成酶(cystathionineβ-synthase，CBS)释放内源性硫化氢对缺血性脑卒中产生保护作用，但是它们在体内t1/2较短、易挥发，无法控制给药量，并且由于化合物结构中氨基的存在，在空气中易被氧化变质。

发明内容

没食子酸广泛存在于掌叶大黄、大叶桉、山茱萸等植物中，是一种天然无毒的多酚类化合物。据报道没食子酸具有抗氧化、抗炎、抑菌、抗自由基、抗肿瘤和心血管保护作用，在神经退化、神经毒性和氧化应激中具有神经保护作用。它的分子结构中存在3个酚羟基，具有较强的还原性，在空气中易被氧化，其酯类化合物作为抗氧化剂广泛应用于制药行业。通过缀合成一种两种互补的生物活性物质已广泛用于药物设计中。最近，研究人员试图整合没食子酸和甲基-L-亮氨酸的化学特征，以产生新的没食子酸-L-亮氨酸(GAL)缀合物。结果表明，GAL结合物可作为新型支架化合物用于开发新的抗炎药物。没食子酸-β-D-葡萄糖结合物(BGG)是余甘子药用植物的主要成分，对炎症性疾病特别是糖尿病眼病具有特异性抑制作用。没食子酸和利凡斯的明偶联物GA2有效地阻止了自身介导的Aβ聚集，作为抗阿尔茨海默病的新方法。

鉴于以上没食子酸及其衍生物和炔丙基半胱氨酸及其类似物的生物活性，本申请发明人根据化学杂交原理，设计合成了一系列炔丙基半胱氨酸类似物与没食子酸酯类化合物的结合物，通过筛选得到了活性较好的化合物MTC，MTC的化学名称为S-(4-氟苄基)-N-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-L-半胱氨酸甲酯。

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种化学名称为S-(4-氟苄基)-N-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-L-半胱氨酸甲酯，结构式如式(Ⅰ)所示的硫化氢的供体(MTC)，

另外，本发明提供上述硫化氢的供体(MTC)的制备方法。

另外，本发明提供一种药物制剂，所述药物制剂的有效成分包括上述式(Ⅰ)所示化合物。

另外，本发明提供上述硫化氢的供体(MTC)在制备治疗缺血性脑卒中药物中的用途。

另外，本发明提供上述硫化氢的供体(MTC)在制备激活PI3K/AKT通路、抑制线粒体凋亡信号通路或降低内质网应激的药物中的用途。

另外，本发明提供上述硫化氢的供体(MTC)在制备激活ERK-MEK信号通路、增加神经细胞的存活率或保护神经元缺血性损伤中的药物中的用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种硫化氢的供体(MTC)，所述硫化氢的供体的化学名称为S-(4-氟苄基)-N-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-L-半胱氨酸甲酯；所述硫化氢的供体的化学结构式如式(Ⅰ)所示：

本发明提供所述硫化氢的供体(MTC)的制备方法，包括如下步骤：

(1)将式(Ⅱ)所示化合物溶于氯化亚砜(SOCl₂)中，在70～80℃下回流反应(rf)至完全，薄层色谱跟踪反应至结束，减压旋干溶剂，得到中间产物式(Ⅲ)所示化合物；

(2)将步骤(1)所述的式(Ⅲ)所示化合物溶于二氯甲烷(DCM)中，然后加入三乙胺(TEA)在冰浴条件下搅拌反应10～30min，之后加入式(Ⅳ)所示化合物，继续搅拌至反应结束，减压旋干溶剂，残留物用硅胶柱层析分离，即可制得目标产物硫化氢的供体(MTC)；

所述式(Ⅱ)、式(Ⅲ)、式(Ⅳ)的结构式如下所示：

优选地，所述步骤(1)中，所述的式(Ⅱ)所示化合物与氯化亚砜的添加摩尔比为1:40～45；所述步骤(2)中，所述的式(Ⅲ)所示化合物、所述的二氯甲烷、所述的三乙胺与所述的式(Ⅳ)所示化合物的添加摩尔比为1:45～50:2～3:1。

本发明提供一种药物制剂，所述药物制剂的有效成分包括本发明所述式(Ⅰ)所示化合物。

优选地，所述式(Ⅰ)所示化合物在所述药物制剂中的百分含为1％～50％。

优选地，所述药物制剂还包括药学上可接受的辅料，所述辅料包括填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑助流剂。

优选地，以重量百分含量计，所述辅料的含量为：填充剂10％～80％、粘合剂1％～45％、崩解剂5％～20％、润滑助流剂0.1％～10％。

优选地，所述药物制剂的剂型为片剂、胶囊或颗粒剂。

优选地，所述填充剂选自乳糖、蔗糖、淀粉、预胶化淀粉、甘露醇、山梨醇、磷酸氢钙、硫酸钙、碳酸钙、微晶纤维素中的至少一种。

优选地，所述粘合剂选自糊精、聚维酮、羧甲基纤维素钠、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、聚乙二醇、药用乙醇中的至少一种。

优选地，所述崩解剂选自交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟甲基纤维素钠、交联羧甲基淀粉钠、羧甲基淀粉钠中的至少一种。

优选地，所述润滑助流剂选自硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、富马酸钠、十二烷基硫酸钠、山嵛酸甘油酯、滑石粉、二氧化硅、聚乙二醇、硬脂富马酸钠中的至少一种。

本发明提供所述硫化氢的供体(MTC)在制备治疗缺血性脑卒中的药物中的用途。

本发明提供所述硫化氢的供体(MTC)在制备激活PI3K/AKT通路、抑制线粒体凋亡信号通路或降低内质网应激的药物中的用途。

本发明提供所述硫化氢的供体(MTC)在制备激活ERK-MEK信号通路、增加神经细胞的存活率或保护神经元缺血性损伤中的药物中的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的化学名称为S-(4-氟苄基)-N-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-L-半胱氨酸甲酯的硫化氢的供体(MTC)，能有效治疗缺血性脑卒中的疾病；

(2)本发明提供的硫化氢的供体(MTC)能通过激活PI3K/AKT通路、抑制线粒体凋亡信号通路、降低内质网应激、激活ERK-MEK信号通路、增加神经细胞的存活率或保护神经元缺血性损伤的多种治疗靶点来实现有效治疗缺血性脑卒中的目的，且无消化道出血的副作用出现；

(3)在治疗缺血性脑卒中的药物中，本发明首次提出了本发明所述的硫化氢的供体(MTC)在神经系统的作用，为治疗缺血性脑卒中的疾病提供了新的药物选择。

附图说明

图1为7种化合物对缺血再灌注诱导PC12损伤细胞存活率的影响示意图。

图2为MTC对缺血神经元存活率有影响的示意图；其中，图2A为MTC对缺血再灌注诱导PC12损伤的细胞形态图；图2B为MTC对缺血再灌注诱导PC12损伤细胞存活率的影响。

图3为MTC对缺血再灌注诱导PC12损伤细胞核型的影响示意图。

图4为MTC对ROS和SOD生成量有影响的示意图；其中，图4A为MTC对缺血再灌注诱导PC12损伤ROS的影响；图4B为MTC对缺血再灌注诱导PC12损伤SOD的影响。

图5为MTC对缺血再灌注诱导PC12细胞损伤后PI3K、p-AKT和cleaved caspase-3蛋白水平的表达影响示意图；其中，图5A为Western blot分析表明MTC增加PI3K蛋白的表达；图5B为Western blot分析表明MTC激活p-AKT表达；图5C为Western blot分析表明MTC抑制cleaved caspase-3表达。

图6为不同浓度PD98059预处理+1μM的MTC对细胞存活率有影响的示意图；其中，图6A为不同浓度PD98059预处理2h、MTC处理24h对PC12细胞形态的影响；图6B为不同浓度PD98059预处理2h、MTC处理24h对PC12细胞存活率的影响。

图7为不同浓度PD98059预处理+1μM的MTC对细胞ROS和细胞核型有影响的示意图；其中，图7A为为不同浓度PD98059预处理+1μM的MTC对细胞核型的影响；图7B为不同浓度PD98059预处理+1μM的MTC对细胞ROS的影响。

图8为MTC对缺血诱导的PC12细胞内质网应激(ERS)Bim、capase-12和IP3等有影响的示意图；其中，图8A为Western blot分析表明MTC后处理抑制Bim、caspase-12、IP3蛋白的表达；图8B为Western blot分析表明MTC后处理抑制GRP78、CHOP的表达。

图9为MTC以及SCGF对缺血再灌注诱导PC12细胞损伤后轴突迁移的影响示意图。

图10为MTC通过提升p-ERK水平，对PC12细胞轴突再生示意图；其中，图10A为MTC处理24h对缺血再灌注诱导PC12细胞损伤后轴突生长的影响；图10B为Western blot分析表明MTC处理激活ERK的磷酸化。

图11为MTC对缺血再灌注诱导PC12细胞损伤后小鼠脑部海马区的影响。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

本实施例为本发明所述的硫化氢的供体(MTC)，其结构式如式(Ⅰ)所示：

上述硫化氢的供体(MTC)的制备方法，包括如下步骤：

(1)将1mmol式(Ⅱ)所示化合物溶于40mmol氯化亚砜(SOCl₂)中，在70℃下回流反应(rf)至完全，薄层色谱跟踪反应至结束，减压旋干溶剂，得到中间产物式(Ⅲ)所示化合物；

(2)将步骤(1)所述的1mmol式(Ⅲ)所示化合物溶于45mmol二氯甲烷(DCM)中，然后加入2mmol三乙胺(TEA)在冰浴条件下搅拌反应10min，之后加入1mmol式(Ⅳ)所示化合物，继续搅拌至反应结束，减压旋干溶剂，残留物用硅胶柱层析分离，即可制得目标产物硫化氢的供体(MTC)；

所述式(Ⅱ)、式(Ⅲ)、式(Ⅳ)的结构式如下所示：

本实施例进一步采用核磁共振光谱和质谱对本实施例的硫化氢的供体(MTC)进行表征，实验结果如下：¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.28–7.23(m,2H),7.04(s,2H),6.97(t,J＝7.8Hz,2H),6.89(d,J＝6.5Hz,1H),5.02–4.95(m,1H),3.91(dd,J＝3.8,2.1Hz,9H),3.79(d,J＝2.3Hz,3H),3.72(s,2H),3.06(ddd,J＝14.0,5.2,2.0Hz,1H),2.95(ddd,J＝14.1,5.9,2.1Hz,1H)。

¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ171.38,166.64,163.13,160.69,153.19,141.40,133.24,133.21,130.41,130.33,128.85,115.49,115.27,104.60,60.83,56.30,52.71,52.06,35.80,33.34。

实施例2

本实施例为本发明所述的硫化氢的供体(MTC)，其结构式如式(Ⅰ)所示：

上述硫化氢的供体(MTC)的制备方法，包括如下步骤：

(1)将1mmol式(Ⅱ)所示化合物溶于45mmol氯化亚砜(SOCl₂)中，在80℃下回流反应(rf)至完全，薄层色谱跟踪反应至结束，减压旋干溶剂，得到中间产物式(Ⅲ)所示化合物；

(2)将步骤(1)所述的1mmol式(Ⅲ)所示化合物溶于50mmol二氯甲烷(DCM)中，然后加入3mmol三乙胺(TEA)在冰浴条件下搅拌反应30min，之后加入1mmol式(Ⅳ)所示化合物，继续搅拌至反应结束，减压旋干溶剂，残留物用硅胶柱层析分离，即可制得目标产物硫化氢的供体(MTC)；

所述式(Ⅱ)、式(Ⅲ)、式(Ⅳ)的结构式同实施例1所述。

本实施例进一步采用核磁共振光谱和质谱对本实施例的硫化氢的供体(MTC)进行表征，实验结果同实施例1。

实施例3

本实施例为本发明所述的硫化氢的供体(MTC)，其结构式如式(Ⅰ)所示：

上述硫化氢的供体(MTC)的制备方法，包括如下步骤：

(1)将1mmol式(Ⅱ)所示化合物溶于43mmol氯化亚砜(SOCl₂)中，在75℃下回流反应(rf)至完全，薄层色谱跟踪反应至结束，减压旋干溶剂，得到中间产物式(Ⅲ)所示化合物；

(2)将步骤(1)所述的1mmol式(Ⅲ)所示化合物溶于48mmol二氯甲烷(DCM)中，然后加入2.5mmol三乙胺(TEA)在冰浴条件下搅拌反应20min，之后加入式1mmol(Ⅳ)所示化合物，继续搅拌至反应结束，减压旋干溶剂，残留物用硅胶柱层析分离，即可制得目标产物硫化氢的供体(MTC)；

所述式(Ⅱ)、式(Ⅲ)、式(Ⅳ)的结构式同实施例1所述。

本实施例进一步采用核磁共振光谱和质谱对本实施例的硫化氢的供体(MTC)进行表征，实验结果同实施例1。

实施例4

本实施例为本发明所述的硫化氢的供体(MTC)，其结构式如式(Ⅰ)所示：

上述硫化氢的供体(MTC)的制备方法，包括如下步骤：

(1)将1mmol式(Ⅱ)所示化合物溶于41mmol氯化亚砜(SOCl₂)中，在78℃下回流反应(rf)至完全，薄层色谱跟踪反应至结束，减压旋干溶剂，得到中间产物式(Ⅲ)所示化合物；

(2)将步骤(1)所述的1mmol式(Ⅲ)所示化合物溶于46mmol二氯甲烷(DCM)中，然后加入3mmol三乙胺(TEA)在冰浴条件下搅拌反应15min，之后加入1mmol式(Ⅳ)所示化合物，继续搅拌至反应结束，减压旋干溶剂，残留物用硅胶柱层析分离，即可制得目标产物硫化氢的供体(MTC)；

所述式(Ⅱ)、式(Ⅲ)、式(Ⅳ)的结构式同实施例1所述。

本实施例进一步采用核磁共振光谱和质谱对本实施例的硫化氢的供体(MTC)进行表征，实验结果同实施例1。

实施例5

本实施例为本发明所述的一种片剂，以重量百分含量计，所述药物制剂包括如下成分：

上述片剂的制备方法：将实施例1制备的活性成分MTC和辅料预先粉碎后过100目筛，称取主药加入过60目筛预处理的乳糖、预胶化淀粉、羧甲基纤维素钠、低取代羟甲基纤维素钠和微晶纤维素充分混合，加入质量浓度10％的聚维酮溶液，混合，制软材，过20目筛，制得湿粒，与50-60℃干燥后，加硬脂酸镁和滑石粉预先过筛，充分混合，检测，压片，即可制得所述片剂。

实施例6

本实施例为本发明所述的一种胶囊，以重量百分含量计，所述药物制剂包括如下成分：

上述胶囊的制备方法：将实施例1制备的活性成分MTC和辅料预先粉碎后过100目筛，加乳糖、乙二醇、二氧化硅和硬脂酸镁，充分混合，检测，灌装于胶囊。

实施例7

本实施例为本发明所述的一种颗粒剂，以重量百分含量计，所述药物制剂包括如下成分：

上述颗粒剂的制备方法：将实施例1制备的活性成分MTC和辅料预先粉碎后过100目筛，充分混合，再加入黏合剂制得软材，14目筛制粒，55℃干燥，12目筛整粒，检测，包装。

实施例8

本实施例为本发明所述的一种颗粒剂，以重量百分含量计，所述药物制剂包括如下成分：

上述颗粒剂的制备方法：将实施例1制备的活性成分MTC和辅料预先粉碎后过100目筛，充分混合，再加入黏合剂制得软材，14目筛制粒，55℃干燥，12目筛整粒，检测，包装。

实验例9

本实验例通过科学实验来说明本发明所述的硫化氢的供体有效治疗缺血性脑卒中的效果。

1.1 7种化合物对缺血再灌注诱导PC12损伤细胞存活率的影响

使用含有10％牛血清和2％双抗的DMEM(含青霉素和链霉素各100U/mL)培养基，在37℃，5％CO₂的潮湿条件下培养小鼠的PC12细胞。将生长状态处于对数期的细胞均分至96孔板中，建立空白对照组，缺血组，药物处理组(0.1、0.3、1μM)，药物处理组为7种化合物(Con、MI、MTC、D型-MTC、没食子酸、三甲氧基苯甲酸、S-(4-氟苄基)-L-半胱氨酸甲酯、S-(4-氟苄基)-D-半胱氨酸甲酯、SPRC)，每组平行做6个复孔。对于缺血组、药物处理组，弃原DMEM，PBS冲洗1次，用2-deoxyglucose(2-脱氧葡萄糖，最终浓度为20mM)，sodium lactate(乳酸钠,最终浓度为20mM)，Na₂S₂O₄(连二亚硫酸钠，最终浓度为2.5mM)，以1mL/孔的量处理小鼠的PC12细胞，37℃、5％CO₂条件下培养30min，撤去缺血液加入含有10％牛血清和2％双抗的DMEM培养基(含青霉素和链霉素各100U/mL)。药物处理24h后避光操作向每孔中加入10μL CCK-8溶液，继续在培养箱孵育2小时，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

实验结果如图1所示，在相同剂量下，7种化合物中，MTC处理组的PC12细胞存活率较高于其他MTC前体药物处理组，与缺血组相比差异显著(P＜0.05)。

1.2细胞形态学观察

将PC12细胞以1×10⁵个/孔的密度分至六孔板中，分为空白对照组，缺血组，缺血MTC后处理组，37℃持续孵育24h后，缺血组和缺血MTC后处理组中加入上述缺血液处理细胞30min后，缺血MTC后处理组分别加入最终浓度为0.1、0.3、1、3μM的MTC，24h后观察细胞形态变化。

实验结果如图2A所示，随着MTC浓度的增加，和缺血组比较，细胞数量逐渐增加，MTC浓度为1μM时，PC12细胞数量最多，存活率最大。

CCK-8检测细胞存活率

将PC12细胞以1×10⁵/孔接种到96孔板，37℃持续孵育24h，缺血组和缺血MTC后处理组加入上述缺血液处理细胞30min，缺血MTC后处理组加入不同浓度的MTC，使最终浓度为0.1、0.3、1、3μM，孵育22h后，按照试剂盒说明书每孔加入10μL cck-8工作液，继续在培养箱孵育，2h后在450nm处测量吸光度。

实验结果如图2B所示，与空白对照组相比缺血组的细胞存活率降低(66.40％±2.32％)，细胞存活率随着MTC浓度的增大而增大，浓度为1μM时细胞数量最多(90.28％±3.46％)，提示1uM MTC具有最佳浓度效应。

1.3运用Hoechst 33258荧光染色法检测MTC对缺血再灌注诱导PC12损伤细胞核型的影响

将PC12细胞以1×10⁵个/孔接种于6孔板，每孔体积为2mL。加药培养24h后弃去培养液，PBS清洗细胞一次，用4％多聚甲醛在4℃固定细胞10min，避光每孔加入0.5μg/mLHoechst 33258染色工作液1mL，避光室温染色25min，PBS洗涤3次，荧光显微镜下用400×的放大倍数进行观察、拍照。

实验结果如图3所示，缺血组PC12细胞显示出明显的细胞核缩聚，细胞膜起泡，细胞核破裂以及出现凋亡小体。不同浓度MTC后处理的PC12细胞其核型与缺血组相比无明显聚缩、破裂等现象发生，可见，MTC后处理能够有效防治细胞的非程序性凋亡，MTC后处理对缺血神经元有保护作用。

1.4 MTC对缺血再灌注诱导PC12损伤细胞ROS、SOD的影响

将PC12细胞以1×10⁵个/孔接种于6孔板，每孔体积为2mL。加药培养24h后弃去培养液，用4℃预冷PBS洗涤细胞一次，加入1ml DCFH-DA，37℃培养箱内孵育20min，用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，使用试剂盒检测ROS的活性。加药培养24h后弃去培养液，用4℃预冷PBS洗涤细胞一次，再加入PBS用细胞刮刀将细胞转移到相应的离心管中，5000rpm离心6min，弃去上清液，加入60-80μL的Lysis buffer适当吹打以充***解细胞，室温在水平摇床快速摇动30min后13200rpm离心10min取上清液至新的离心管，用BCA试剂盒测定蛋白浓度，使用试剂盒检测SOD的活性。

实验结果如图4所示：ROS和SOD生成量的分析，MTC对于细胞内ROS的释放有显著的抑制作用，对于细胞内SOD的释放有显著的促进作用，尤其是MTC终浓度为0.3μM、1μM时，与对照组(缺血组)相比有十分显著的抑制细胞内部氧化应激反应效果(P＜0.01)。

1.5 MTC对缺血再灌注诱导PC12细胞损伤后PI3K、p-AKT和cleaved caspase-3蛋白表达的影响

将PC12细胞以1×10⁵个/孔接种于6孔板，每孔体积为2mL。加药培养24h后弃去培养液，用4℃预冷PBS洗涤细胞一次，再加入PBS用细胞刮刀将细胞转移到相应的离心管中，5000rpm离心6min，弃去上清液，加入60-80μL的Lysisbuffer适当吹打以充***解细胞，室温在水平摇床快速摇动30min后13200rpm离心10min取上清液至新的离心管，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。按10μg的总蛋白量上样，进行SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜，在室温下用5％的牛奶封闭1小时，敷一抗4℃过夜，在室温下敷相应的二抗1.5小时，用ECL发光液在分子成像仪(ChemiDoc XPS+，Bio-Rad，Hercules，美国)分析了膜上蛋白条带的光密度。

实验结果如图5所示，已经证实缺血再灌注会诱导细胞凋亡，为了进一步探讨MTC对缺血再灌注诱导PC12细胞损伤后的作用信号机制，我们用不同浓度的MTC对PI3K等蛋白进行分析。与对照组相比，缺血组PI3K、p-AKT蛋白水平显著降低(P＜0.01)，MTC后处理组蛋白水平增加。与对照组相比，缺血组cleaved caspase-3蛋白水平显著增加(P＜0.01)，MTC后处理组蛋白水平减少。结果表明缺血损伤导致PC12细胞的PI3K通路被抑制，AKT蛋白磷酸化程度降低，同时线粒体凋亡通路被激活，细胞逐渐凋亡。而MTC处理后细胞的活性得到恢复，AKT磷酸化程度升高，凋亡通路被抑制。

1.6 PD98059预处理+MTC对细胞形态的影响

按照1.1的实验方法，建立空白对照组，缺血组，缺血MTC后处理组，PD98059预处理+MTC组。

MTC后处理组的处理方法是：按照1.1实验方法，建立缺血再灌注损伤的细胞模型后，分别加入不同浓度的MTC进行后处理，设置该后处理的MTC终浓度分别为0.3μM、1μM，加药后正常培养24h；

PD98059预处理+MTC组的处理方法是：按照PD98059终浓度为1μM、3μM，分别对细胞进行PD98059预处理10min，照1.1实验方法建立缺血再灌注损伤的细胞模型后，分别加入MTC，MTC的终浓度为1μM，加药后正常培养24h。

以缺血组为对照，如图6A所示，PD98059预处理+MTC对细胞形态的影响。可见PD98059部分抑制了MTC的保护作用，3μM的PD98059对MTC保护作用的抑制最明显。MTC对缺血再灌注损伤的细胞有明显的保护作用，1μM的MTC后处理使细胞存活率有大幅地上升。如图6B结果显示，与不进行PD98059预处理的1μM MTC后处理组别相比，PD98059浓度为1μM的预处理使细胞存活率下降至68.2％±2.5％，PD98059浓度为3μM的预处理使细胞存活率下降至62.6％±6.4％，与无PD98059预处理的组别相比细胞存活率有显著地降低。

1.7不同浓度PD98059预处理+1μM的MTC对细胞ROS和细胞核型的影响

按照1.1的实验方法，建立空白对照组，缺血组，缺血MTC后处理组，PD98059预处理+MTC组。按照1.3和1.4的实验方法，测定ROS的活性和观察细胞核型的变化。

实验结果如图7所示，PD98059预处理使细胞ROS释放量增加，氧化应激增强(与不经PD98059预处理的1μM MTC处理组相比，P＜0.01)。Hoechst 33258染色以测量PD98059预处理对MTC后处理的PC12细胞存活率的影响，以及用荧光显微镜放大400×倍观察其对细胞核形态的影响。缺血组PC12细胞显示出明显的细胞核缩聚，细胞膜起泡，细胞核破裂以及出现凋亡小体，PD98059随着浓度增大会显著抑制MTC的作用效果。

1.8 MTC对缺血再灌注诱导PC12细胞引起内质网应激相关蛋白水平的影响

按照1.5的实验方法，测量相关蛋白水平的表达情况。

实验结果如图8所示，MTC对PC12细胞Bim、capase-12、IP3等蛋白的影响。MTC通过激活Akt(PKB)、Bim等信号蛋白，抑制细胞凋亡。而缺血导致新合成的蛋白不能糖基化，在内质网中堆积，触发发内质网应激(ERS)。过度的ERS可激活caspase-12。MTC可能削弱缺血触发神经细胞内质网应激。

1.9 MTC和SCGF(神经生长因子)促使对机械损伤模拟缺血神经元损伤的轴突再生

1)2D模型的建立：单层培养PC12细胞，建立缺血再灌注模型，评定MTC对对受损神经元轴突再生的影响；

2)3D模型的建立：

A.采用水凝胶模拟细胞基质和取向的PLA纳米纤维层建立3D组织模型；已经证实了以水凝胶制作的3D支架能承载轴突路径的激活与抑制信号分子，可以模拟中枢神经系统和研究包括控制胶质瘢痕形成的多种病理学的现象，以及提高轴突的生长。已经被证实在损伤后，中枢神经系统的轴突可以在适宜的微环境内再生。作为中枢神经系统再生的有利的环境，需要多方面条件支撑：具有正常功能的胶质细胞，恰当的营养分配系统，为轴突生长和重新连接提供可行的物理路径，还需要为轴突再生提供均衡的抑制和促进性分子。本研究将采用杨博士(Keele university,UK)已建立实验方法，把PC12细胞培养在以层叠方式构建的3D胶原蛋白水凝胶和PLA纳米纤维支架上.

B.把MTC和SCGF(神经生长因子)，加入PLA纳米纤维或水凝胶中，评估MTC在3D组织模型中对于神经元的轴突再生的影响及适宜条件浓度。3D水凝胶和纳米纤维是很好的药物载体。因其具有完善的控制释药机制，这将会为长时间释放MTC，剂量优化问题提供可能的解决方案。因此，我们将先测试载有H₂S前体分子MTC的3D胶原蛋白水凝胶和PLA纳米纤维支架，它们的MTC的释放剂量与释放持续时间。成功优化这个模型后将会植入经过(机械损伤模拟缺血再灌注处理的PC12细胞。被损伤的PC12细胞的存活能力和其轴突的生长情况将会与未受损伤的PC12组作相互对照以作评估。另外，也会对加入SPRC的3D模型产生的保护效果进行一系列的评估测试。

实验结果如图9所示：MTC和3D纳米纤维层对PC12细胞损伤的轴突的促再生效应，图9A说明了3D纳米纤维层对缺血再灌注诱导PC12细胞损伤的轴突再生的趋向性增强效应；图B说明了MTC和SCGF(神经生长因子)促使3D纳米纤维层上机械损伤模拟缺血诱导PC12细胞损伤的轴突再生和趋向性效应，并且1uM MTC的效应和1uM SCGF相当。

1.10 MTC对缺血再灌注诱导PC12细胞损伤后p-ERK蛋白水平和细胞轴突的影响

按照1.1和1.5的实验方法，测量p-ERK蛋白水平的表达情况和轴突生长情况。

实验结果如图10所示，MTC处理后PCA12细胞的p-ERK上调，ERK蛋白磷酸化程度提高，表明MTC可能激活ERK蛋白磷酸化，诱导MTC处理后细胞增殖。

1.11 MTC对缺血再灌注诱导PC12细胞损伤小鼠脑部海马区的影响

小鼠脑部海马区冰冻切片4～8μm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3次。用3％过氧化氢孵育5～10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗，5分钟×2次。5～10％正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1～2小时或4℃过夜。5～10％正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1～2小时或4℃过夜。滴加滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育30分钟。PBS冲洗，5分钟×3次。滴加滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育30分钟。PBS冲洗，5分钟×3次。滴加滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育30分钟。PBS冲洗，5分钟×3次。

从图11中可以看出：大鼠缺血模型的海马组织切片：缺血组与空白对照组相比较，细胞周围间隙增宽，凋亡特征明显，神经元数量减少；加药组与缺血相比较，细胞周围间隙减短，神经元数量增加。

综上，本发明通过细胞水平和动物水平建立MTC后处理脑缺血再灌注损伤模型，发现MTC对缺血性脑卒中后残存神经元轴突生长有促进作用。MTC通过调控线粒体功能，MTC可以通过使ROS降低、SOD升高从而提高抗氧化效果，MTC抑制ROS诱导的Caspase-3凋亡通路，以及调控PI3K/AKT信号通路，削弱缺血性脑卒中导致的神经元损伤，并且通过降低ERS内质网应激，在以上共同作用下，增加神经细胞的存活率，保护神经元。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。