阅读说明：本技术 一种用于治疗晚期胃癌的抗cldn18全人源化抗体 (anti-CLDN 18 fully humanized antibody for treating advanced gastric cancer ) 是由 许铮 李响 刘影 熊国裕 李峰 史继峰 上官丽娟 于 2020-07-13 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种用于治疗晚期胃癌的抗Claudin18.2全人源单克隆抗体,相对于Ganymed现有Claudin18.2抗体IMAB362,人源化程度更高,具有相对更低的免疫原性,选择性结合CLDN18.2,相对具有更高亲和力。(The invention relates to an anti-Claudin 18.2 fully human monoclonal antibody for treating advanced gastric cancer, which has higher humanization degree, relatively lower immunogenicity, selective binding to CLDN18.2 and relatively higher affinity compared with the existing Claudin18.2 antibody IMAB362 of Ganyed.)

一种用于治疗晚期胃癌的抗CLDN18全人源化抗体

技术领域

本发明涉及一种用于治疗晚期胃癌的抗CLDN18.2(Claudin18.2)全人源化抗体，属于生物技术领域。

背景技术

胃癌在全世界范围内是发病率最高的癌症之一，是中国的第二大常见肿瘤。据2017年4月在北京召开的第12届国际胃癌大会上披露，中国胃癌每年新发现病例约为68万例，占全球发病总数的一半左右，同比2012年公布的44.65万例，年平均增长率超过了13％。中国胃癌死亡率是欧美发达国家的4～8倍，约每2～3分钟就有1名中国人死于胃癌。相比其他国家，中国的胃癌形势更加严峻。

中国大部分胃癌患者确诊时，病情已经进入中晚期，手术后效果极不理想，且预后极差，是临床上极为棘手的恶性肿瘤。

细胞间紧密连接(tight junction，TJs)是一种跨膜蛋白复合体，紧密连接的稳定需要几种不同蛋白的协调活动来维持，而Claudin蛋白是保证紧密连接渗透性具有特异性的主要蛋白。迄今在哺乳动物中已发现27个Claudin家族成员。Claudin蛋白家族分子量为20～27KD，结构中包括4个跨膜区域、两个细胞外环和一个细胞内环，其N端和C末端在胞浆内。两个细胞外环使其成为理想的抗体靶点。Claudin蛋白是构成紧密连接结构的骨架蛋白，位于相临细胞间隙顶侧，其分布具有组织器官特异性，功能主要为细胞间粘附、维持细胞极性、调节细胞旁通透性及参与细胞增殖、分化调节。

Claudin18蛋白分子量约为26KD，可以通过选择性剪切使Claudin蛋白变成具有不同特性的Claudin亚型：Claudin18.1和Claudin18.2。Claudin18.1和Claudin18.2的第一胞外结构域之间虽然只有八个氨基酸的差异，但表达分布却不同，Claudin18.1在正常肺和胃的上皮中选择性表达，Claudin18.2只在短暂分化的胃上皮细胞上表达，在任何其他正常人器官中完全检测不到，但是Claudin18.2在多种恶性肿瘤中有显著上调，包括80％的胃肠道腺瘤、60％的胰腺肿瘤、30％食道癌以及25％非小细胞肺癌。在肿瘤中，细胞间的紧密连接遭到破坏，Claudin18.2无法发挥其正常功能。因此，Claudin18.2是一个合适的肿瘤治疗靶标。

Claudin18基因具有2个不同的第一外显子，所以可以产生两种亚基Claudin18.1和Claudin18.2。这两个分子的N端69个氨基酸的结构不同，其位于第一个胞外区的环状结构内。Claudin18的两种亚型分别在不同的组织中进行转录扩增，其中，Claudin18.1主要表达在肺组织，而Claudin18.2则特异性表达于胃组织。

2006年，Sanada等发现Claudin18基因在57％的胃癌中表达下调，通过免疫组化分析，正常胃粘膜和十二指肠潘氏细胞的细胞膜上表达Claudin18，但在一些肠化和90％的微腺瘤中，Claudin18表达减少，同时在肠型胃癌中表达减少较其他型胃癌更常见，推测其可能参与了早期胃癌的发生。生存分析表明，胃癌中Claudin18表达减少与晚期患者的预后差有关，认为Claudin18表达减少是胃癌患者预后不佳的因素。

2008年，Sahin等研究证实77％原发性胃腺癌组织中存在Claudin18.2的表达，极为重要的是其中56％的组织表达量达到60％以上。与上述研究结构一致的是肠型胃癌中Claudin18.2蛋白表达萧条，而弥散性胃癌中Claudin18.2蛋白的表达较高。但是，胰腺、食道、卵巢等组织在正常状态下没有Claudin18.2蛋白表达，而相应的肿瘤组织中可以大量表达Claudin18.2蛋白。所以，Claudin18.2蛋白可以作为临床肿瘤诊断和治疗的靶位。

紧密连接分子密蛋白18剪变体2(密蛋白18.2(CLDN18.2))是紧密连接蛋白质之密蛋白家族中的一员。CLDN18.2为27.8kDa的跨膜蛋白质，其包含4个具有两个小的胞外环的跨膜结构域。

在正常组织中(除胃外)，通过RT-PCR检测不到CLDN18.2的表达。CLDN18.2特异性抗体的免疫组织化学显示胃为唯一的阳性组织。

CLDN18.2为只在短暂分化的胃上皮细胞上表达的高度选择性胃普系抗原。CLDN18.2保持在恶性转化的过程中，因此频繁在人胃癌细胞的表面上展示，此外，在食管、胰腺和肺腺癌中，以显著水平异位活化该泛肿瘤抗原。CLDN18.2蛋白还位于胃癌腺癌的***转移瘤以及特别是卵巢中的远处转移瘤(克鲁肯伯格氏肿瘤)中。

Ganymed Pharmaceuticals AG已开发出针对CLDN18.2的IgG1嵌合抗体IMAB362。IMAB362以高亲和力和特异性识别CLDN18.2的第一胞外结构域(ECD1)。IMAB362不与任何其它密蛋白家族成员结合，包括紧密相关的密蛋白18剪接变体1(CLDN18.1)。IMAB362表现出精确的肿瘤细胞特异性，并且组合了四中独立的高度有效的作用机制。靶标结合后，IMAB362通过ADCC、CDC、诱导通过肿瘤细胞表面上的靶标交联诱导的凋亡以及直接一直增殖来介导细胞杀伤。因此，IMAB362有效裂解CLDN18.2阳性细胞，包括体外和体内的人胃癌细胞系。具有CLDN18.2阳性癌细胞系的小鼠具有生存益处，并且当用IMAB362处理时，多至40％的小鼠表现出其肿瘤的退化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗CLDN18.2全人源化抗体，在保证人源化程度更高的同时，获得具有相对更高的针对CLDN18.2的亲和性。

本发明所述的抗CLDN18.2全人源化抗体，所述抗体具有如下所述的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)序列，

氨基酸序列为SEQ ID NO：1、3或5所示的VH，以及

氨基酸序列为SEQ ID NO：2、4或6所示的VL。

具体地，本发明所述抗体VH和VL为：氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的VH，和氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的VL(KW-1)；或，氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示的VH，和氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示的VL(KW-2)；或，氨基酸序列为SEQ ID NO：5所示的VH，和氨基酸序列为SEQ ID NO：6所示的VL(KW-3)。

一个优选的实施方案中，所述抗体具有氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示的VH，以及氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示的VL。

本发明所述的抗CLDN18.2全人源化抗体，其中所述重链的恒定区选自人IgG系列，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，优选IgG1；所述轻链的恒定区选自κ或λ链。

本发明还涉及一种分离的核酸分子，其编码本发明所述的抗CLDN18.2全人源化抗体；以及一种表达载体，含有本发明所述核酸分子，以及包含本发明所述的表达载体的宿主细胞，优选真核细胞。

本发明还提供了一种制备本发明所述的抗CLDN18.2全人源化抗体的方法，该方法包括在有利于本发明所述的抗体表达的条件下表达本发明所述的核酸分子，并回收表达的抗体或其抗原结合片段。

用来培养细胞的培养基可以是用于培养该宿主细胞的任何常规培养基，如基本培养基或含有适宜添加物的复合培养基。可以通过市售得到适宜的培养基，或根据已公开的制法制备适宜的培养基。然后可以通过常规方法从培养基中回收由所述宿主细胞产生的多肽，例如用盐如硫酸铵沉淀上清液或滤液中的蛋白质成分，根据目的肽的种类而选用各种层析方法如例子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等进行进一步纯化。

可以将上述编码DNA序列***任何适当的载体中。通常，载体的选择常常取决于该载体将要被引入的宿主细胞，因此，载体可以是一种自主复制型载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，如质粒。或者，载体可以是这样一种类型，当将其引入宿主细胞时，它将整合到宿主细胞基因组中，并与它所整合入的染色体一起复制。

载体优选是一种表达载体，其内编码所述肽的DNA序列与该DNA转录所需的其它区段(如启动子)有效相连。本领域熟知适合于在多种宿主细胞中指导编码本发明肽的DNA进行转录的启动子例子，参见例如Sambrook，J，Fritsch，EF和Maniatis，T，分子克隆：实验操作指南，Cold Spring Harbor Laboratory Press，纽约，1989中所述。

载体还可以含有选择标记，如可以是这样的一种基因，其基因产物将弥补宿主细胞内的一个缺陷，或者能赋予对药物如氨苄青霉素、阿霉素、四环素、氯霉素、新霉素、链霉素或氨甲喋呤等的抗性。

为将本发明表达的肽引入宿主细胞的分泌途径，可以在重组载体中提供分泌信号序列(也称之为前导序列)。分泌信号序列以正确读框与编码该肽的DNA序列连接。分泌信号序列通常位于编码该肽的DNA序列的5’侧。分泌信号序列可以是正常地与该肽连接的分泌信号序列，或可以源于编码另一种分泌蛋白质的基因。

用于分别连接编码本发明肽的DNA序列，启动子和可选择的终止子和/或分泌信号肽序列，并将其***到适宜的含有复制所必需的信息的载体中的方法，对本领域的技术人员是已知的。

用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其他多细胞生物的成核细胞)中的表达载体还将包含终止转录和稳定mRNA所需的序列，这种个序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA的5’和(偶尔的)3’末翻译区获得。这些区域包含作为编码结合Claudin18.2的人源化抗体的mRNA的未翻译部分中的多腺苷酸化片段转录的核苷酸区段。

将导入DNA序列或重组载体的宿主细胞可以是能够产生本发明肽的任何细胞，包括细菌、病毒、酵母、真菌和高等真核生物细胞。本领域技术人员熟知并使用的适宜的宿主的例子包括但不限病毒。

可以从培养基或宿主细胞裂解液回收多种形式的本发明抗体或抗原结合片段，如果是膜结合的，则可以使用合适的去垢剂溶液(例如Triton-X 100)或通过酶切来使其从膜释放，可以通过多种物理或化学方法如冻融循环、超声、机械破碎或细胞裂解试剂来破裂用于表达本发明所述结合Claudin18.2的抗体的细胞。

可能需要的是从重组细胞蛋白纯化本发明抗体或抗原结合片段，以下方法是合适纯化方法的示例：通过在离子交换柱上的分部分离；乙醇沉淀；反相HPLC；在二氧化硅或在阳离子交换树脂如DEAE上的层析；色谱聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤；除去污染物如IgG的蛋白A Sepharose柱。

本发明的第三方面，提供了及一种药物组合物，其包含本发明所述的抗体或其抗原结合片段和可药用载体。

适合的可药用载体，包括但不限于：抗氧化剂(例如抗坏血酸和硫酸氢钠)、防腐剂(例如苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、羟基苯酸乙酯或正丙酯)、乳化剂、助悬剂、分散剂、溶剂、填充剂、膨胀剂、缓冲剂、载体、稀释剂和/或佐剂。例如，适合的载体可以是生理盐水溶液或柠檬酸盐缓冲盐水，其可能补充了在肠外施用药物组合物中常见的其它材料。中兴缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是其它的示例性载体。本领域那些技术人员将容易地分辨可以在本发明中使用的药物组合物和剂量形式中使用的多种缓冲剂。典型的缓冲剂包括但不限于，药物可用的弱酸、弱碱或其混合物。缓冲液组分还包括水溶性材料，如磷酸、酒石酸、乳酸、丁二酸、柠檬酸、乙酸、抗坏血栓、门冬氨酸、谷氨酸及其盐。

药物组合物和可以作为溶液、混悬液、凝胶、乳浊液、固体或者脱水或冷冻干燥的粉末保存在无菌小瓶中。这些组合物可以作为即可使用的形式、使用前需要复原的冷冻干燥形式、使用前需要稀释的液体形式或其它可用形式存储。

另一方面，本发明涉及抗体或其抗原结合片段在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗癌症相关的疾病，尤其是胃癌。

本发明的第五方面，提供了一种预防或治疗癌症药的方法，包括给药受试本发明所述的结合Claudin18.2的抗体；其中所述癌症例如可以是包括胃肠道癌、胰腺癌、食道癌或非小细胞肺癌；所述胃肠道癌优选为晚期胃癌。

本发明的第六方面，提供了一种制品或药盒，包含容器和包装插页，其中所述容器中装有本发明所述的抗体或其抗原结合片段，或者本发明所述的药物组合物，所述包装插页上载有药物的使用说明书。在一个优选实施方案中，该制品或药盒进一步包含一个或多个容器，该容器中装有一种或多种预防或治疗癌症的其它药物。

合适的容器包括例如安瓿、针剂药水瓶、注射器等。容器可由多种物质(如玻璃或塑料)形成，容器盛有或容纳对于治疗由小的组合物并且可以具有无菌接入端(例如该容器可以是静脉溶液包或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的瓶)。组合物中的至少一种活性药剂是本发明抗体或抗原结合片段。标签或药品说明书表明该组合物在关于抗体和提供的任何其它药物的用药量的间隔时间的具体指导下被用于治疗遭受代谢相关的疾病、病症或症状的个体的代谢相关疾病、病症或症状。该制品还可以包括第二容器、所述第二容器包含药用稀释缓冲液、加注射用抑菌水、磷酸盐缓冲液、Ringer氏溶液和葡萄糖溶液。该制品还可以包括从商业和使用者角度看是需要的其它物质，包括其它缓冲、稀释剂、过滤器、针头和注射器。使用“药品说明书”通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其包含关于指示、用法、剂量、给药、禁忌、与所包装产品结合的其它治疗产品和/或关于使用这些治疗产品的警告等的信息。

制品还可以包括其它组分，制品的每种组分可以包装在单个容器内并且可以将所有多个容器放置在单个包装内。

本发明所述全人源化抗体，相对于Ganymed Pharmaceuticals AG公司的嵌合抗CLDN18.2抗体IMAB362，对CLDN18.2具有更为优异的亲和性。

附图说明

图1为抗CLDN18.2抗体筛选-细胞ELISA结合活性S型曲线图。。

图2为各抗CLDN18.2抗体的相对结合活性比较柱状图。

具体实施方式

实施例1表达Claudin18.1及Claudin18.2抗原的HEK293细胞的构建

将编码人Claudin18.1及Claudin18.2抗原的pcDNA3.1载体(购自Invitrogen公司)转染HEK293细胞(购自ATCC)，采用200μg/mL的遗传霉素作为筛选压力得到稳定表达Claudin18.1及Claudin18.2抗原的HEK293细胞。以Ganymed公司的Claudin18.2抗体IMAB362(自制，CHO-S细胞瞬转表达，并进一步层析纯化，参考实施例2及3，本发明中记为ch163)为阳性抗体，通过FACS方法筛选稳定表达人Claudin18.1及Claudin18.2抗原的HEK293细胞。

实施例2候选抗体KW-2表达载体的构建

将HindIII酶切位点(AAGCTT)、KoZAK序列(GCCGCCACC)、ATG、信号肽基因GAGAGAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGT和抗体的重链编码基因(包括重链可变区编码基因SEQ ID NO：11和恒定区IgG1编码基因SEQ ID NO：17)、终止码TAA和EcoRI编码基因GAATTC依次串联融合，并使用化学合成的方式获得基因片段。通过EcoRI和HindIII位点，将上述片段***真核表达质粒pCDNA 3.4(+)((购自Invitrogen公司))中并测序验证，得到抗体重链的表达质粒PCDNA3.4(+)-BY6-4。

将HindIII酶切位点(AAGCTT)、KoZAK序列(GCCGCCACC)、ATG、信号肽基因GAGAGAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGT和抗体的轻链编码基因(包括轻链可变区编码基因SEQ ID NO：12和恒定区κ编码基因SEQ ID NO:18)、终止码TAA和EcoRI编码基因GAATTC依次串联融合，并使用化学合成的方式获得基因片段。通过EcoRI和HindIII位点，将上述片段***真核表达质粒pCDNA 3.4(+)中并测序验证，得到抗体轻链的表达质粒PCDNA3.4(+)-BY6-4。

将KW-1的重链编码基因(SEQ ID NO：9)和轻链编码基因(SEQ ID NO：10)、KW-3的重链编码基因(SEQ ID NO：13)和轻链编码基因(SEQ ID NO：14)、Ch163的重链编码基因(SEQ ID NO：15)和轻链编码基因(SEQ ID NO：16)，替换KW-2的重轻链编码基因，可得到相应的重轻链表达质粒。

各抗体的重链恒定区均为IgG1，轻链恒定区为κ。

实施例3抗Claudin18.2抗体的表达、纯化

使用实施例2所述DNA构建体，分别瞬转至CHO-S细胞(购自Invitrogen公司)，表达目的抗体，按照CHO-S细胞操作手册(Freedom^TMCHO-S^TMKitUSER GUIDE)，在质粒转染前一天将细胞密度调整至1x10⁶个/毫升。在质粒转染当天，与转染试剂混合后加入EXPICHOEXPRESSION MEDIUM细胞培养基(购自Invitrogen公司)中，37℃，8％CO2持续培养至第8天后收集细胞液，采用离心方式去除细胞，0.2μm过滤后，ProteinA亲和层析纯化，收集的样品的pH调至5.5，2～8℃保存。纯化后的抗体进行SDS PAGE、SEC检测，纯度在95％以上。

实施例4特异性与亲和力鉴定

以Claudin18.2 N端胞外结构域的合成肽部分为抗原，通过ELISA包被稳转Claudin18.2及Claudin18.1的HEK293细胞对抗体进行ELISA筛选，采用双抗体夹心法检测(以0.1mg/mL的多聚赖氨酸包被96孔细胞培养板，5min后，除去包被液，加入5×10⁴/孔HEK293-Claudin18.2或HEK293-Claudin18.1细胞，细胞在37℃、5％CO₂培养箱中培养24h贴壁后，去上清，每孔加PBST洗涤细胞3次，以100μl/孔加入梯度稀释抗体溶液，37℃2小时，用洗涤液洗板3次；稀释液(使用洗涤液配置2％牛血清白蛋白溶液)1/5000稀释HRP标记二抗(编号ab6858，产品来源于Abcam公司)，以100μl/孔加至酶标板内，37℃1小时；用洗涤液洗板3次；以100μ1/孔加入TMB显色液，置室温避光反应5～10分钟，以50μl/孔加人终止液终止反应，并在波长4 5 0nm处测定吸光度)，测定各候选抗体与Claudin18.2的EC50值，并以Ch163的EC50值为基准，计算各候选抗体的相对结合活性(结果见表1、图2)。计算方法如下，相对结合活性＝参考品Ch163的EC50/各候选抗体的EC50值。

表1各候选抗体的相对结合活性

样品	相对结合活性	样品	相对结合活性
				Ch163	100％	KW-2	243.8％
KW-1	62.7％	KW-3	102.4％

细胞ELISA结合活性结果表明，候选抗体的特异性较好，与Claudin18.1均不结合，但是与Claudin18.2结合活性有显著差异，其中KW-2与Claudin18.2的结合活性较优，是对照抗体Ch163(抗体IMAB362)的2.4倍多，KW-3与CLDN的结合活性与对照抗体Ch163相当，而KW-1的结合活性则明显低于对照抗体。

序列表

<110> 北京凯因科技股份有限公司

<120> 一种用于治疗晚期胃癌的抗CLDN18全人源化抗体

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

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1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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20 25 30

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50 55 60

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Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

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Lys

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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Leu Val Thr Val Ser Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

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Lys

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe

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65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

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Leu Val Thr Val Ser Ser

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<210> 6

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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Glu Arg Ala Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

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Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

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Lys

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<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

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Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

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Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

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<211> 113

<212> PRT

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Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

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50 55 60

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aagcttgccg ccaccatgga gagagacaca ctcctgctat gggtagagct gctctgggtt 60

ccaggttcca ctggtcaggt gcagctggtg cagagcggca gcgagctgaa gaagcccggc 120

gccagctgga aggtgagctg caaggccagc ggctacacct tcaccaacta cggcatgaac 180

tgggtgaggc aggcccccgg ccagggcctg aagtggatgg gctggatcaa caccaacacc 240

ggcgagccca cctacgccga ggagttcaag ggcaggttcg tgttcagcct ggacaccagc 300

gtgagcaccg cctacctgca gatcagcagc ctgaaggccg aggacaccgc cgtg 354

<210> 10

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aagcttgccg ccaccatgga gagatggaca ctcctgctat gggtactgct gctctgggtt 60

ccaggttcca ctggtgacat cgtgatgacc cagagccccg acagcctggc cgtgagcctg 120

ggcgagaggg ccaccatcaa ctgcaagagc agccagagcc tgctgaacag cggcaaccag 180

aagaactacc tgacctggta ccagcagaag cccggccagc cccccaagct gctgatctac 240

tgggccagca ccagggagag cggcgtgccc gacaggttca gcggcagcgg cagcggcacc 300

gacttcaccc tgaccatcag cagcctgcag gccgaggac 339

<210> 11

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aagcttgccg ccaccatgga gagagccaca ctcctgctat gggtactgct gctctggggc 60

ccaggttcca ctggtcaggt gcagctggtg cagagcggca gcgagctgaa gaagcccggc 120

gccagcgtga aggtgagctg caaggccagc ggctacacct tcaccaacta cggcatgaac 180

tgggtgaggc aggcccccgg ccagggcctg aagtggatgg gctggatcaa caccaacacc 240

ggcgagccca cctacgccga ggagttcaag ggcaggttcg tgcagagcct ggacaccagc 300

gtgagcaccg cctacctgca gatcagcagc ctgaaggccg aggacaccgc cgtg 354

<210> 12

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aagcttgccg ccaccatgga gagagacaca ctcctgctat gggtactgct gctctgggtt 60

agcggttcca ctggtgacat cgtgatgacc cagagccccg acagcctggc cgtgagcctg 120

ggcgagaggg ccaccatcaa ctgcaagagc agccagagcc tgctgaacag cggcaaccag 180

aagaactacc tgacctggta ccagcagaag cccggccagc cccccaagct gctgatctac 240

tgggccagca ccagggagag cggcgtgccc gacaggttca gcggcagcgg cagcggcacc 300

gacttcaccc tgaccatcag cagcctgcag gccgaggac 339

<210> 13

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aagcttgccg ccaccatgga gagagccaca ctcctgctat gggtactgct gctctgggag 60

ccaggttcca ctggtcaggt gcagctggtg cagagcggca gcgagctgaa gaagcccggc 120

gccagctgga aggtgagctg caaggccagc ggctacacct tcaccaacta cggcatgaac 180

tgggtgaggc aggcccccgg ccagggcctg aagtggatgg gctggatcaa caccaacacc 240

ggcgagccca cctacgccga ggagttcaag ggcaggttcg tgcagagcct ggacaccagc 300

gtgagcaccg cctacctgca gatcagcagc ctgaaggccg aggacaccgc cgtg 354

<210> 14

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aagcttgccg ccaccatgga gagatggaca ctcctgctat gggtactgct gctctgggtt 60

agcggttcca ctggtgacat cgtgatgacc cagagccccg acagcctggc cgtgagcctg 120

ggcgagaggg ccaccatcaa ctgcaagagc agccagagcc tgctgaacag cggcaaccag 180

aagaactacc tgacctggta ccagcagaag cccggccagc cccccaagct gctgatctac 240

tgggccagca ccagggagag cggcgtgccc gacaggttca gcggcagcgg cagcggcacc 300

gacttcaccc tgaccatcag cagcctgcag gccgaggac 339

<210> 15

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cagatccagc tggtgcagag cggccccgag ctgaagaagc ccggcgagac cgtgaagatc 60

agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggca tgaactgggt gaagcaggcc 120

cccggcaagg gcctgaagtg gatgggctgg atcaacacca acaccggcga gcccacctac 180

gccgaggagt tcaagggcag gttcgccttc agcctggaga ccagcgccag caccgcctac 240

ctgcagatca acaacctgaa gaacgaggac accgccacct acttctgcgc caggctgggc 300

ttcggcaacg ccatggacta ctggggccag ggcaccagcg tgaccgtgag cagc 354

<210> 16

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gacatcgtga tgacccagag ccccgacagc ctggccgtga gcctgggcga gagggccacc 60

atcaactgca agagcagcca gagcctgctg aacagcggca accagaagaa ctacctgacc 120

tggtaccagc agaagcccgg ccagcccccc aagctgctga tctactgggc cagcaccagg 180

gagagcggcg tgcccgacag gttcagcggc agcggcagcg gcaccgactt caccctgacc 240

atcagcagcc tgcaggccga ggacgtggcc gtgtactact gccagaacga ctacagctac 300

cccctgacct tcggcgccgg caccaagctg gagctgaag 339

<210> 17

<211> 990

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 17

gccagcacca agggccccag cgtgttcccc ctggccccca gcagcaagag caccagcggc 60

ggcaccgccg ccctgggctg cctggtgaag gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgagc 120

tggaacagcg gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 180

ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgacc gtgcccagca gcagcctggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggagccc 300

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cccagcgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatcag caggaccccc 420

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tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc ccagggagga gcagtacaac 540

agcacctaca gggtggtgag cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag 600

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ctggacagcg acggcagctt cttcctgtac agcaagctga ccgtggacaa gagcaggtgg 900

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<210> 18

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 18

aggaccgtgg ccgcccccag cgtgttcatc ttccccccca gcgacgagca gctgaagagc 60

ggcaccgcca gcgtggtgtg cctgctgaac aacttctacc ccagggaggc caaggtgcag 120

tggaaggtgg acaacgccct gcagagcggc aacagccagg agagcgtgac cgagcaggac 180

agcaaggaca gcacctacag cctgagcagc accctgaccc tgagcaaggc cgactacgag 240

aagcacaagg tgtacgcctg cgaggtgacc caccagggcc tgagcagccc cgtgaccaag 300

agcttcaaca ggggcgagtg c 321