一种治疗哮喘的中药复方制剂及其制备工艺和质量控制方法
阅读说明：本技术 一种治疗哮喘的中药复方制剂及其制备工艺和质量控制方法 (A Chinese medicinal compound preparation for treating asthma, and its preparation method and quality control method ) 是由 张珂 孙仁宽 李国玉 刘丹妮 范乐之 卢立娜 于 2019-07-11 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种治疗哮喘的中药复方制剂及其制备工艺和质量控制方法,该配方由以下中药原料药制备而成：四季青,北沙参,丹参,甘草,沙棘,苦杏仁,天竺黄,本发明采用不同方法进行提取,制备成胶囊制剂,通过合理配伍,优选制备,使其作用上相辅相成,祛痰止咳,宣肺平喘,安全有效的治疗哮喘,本发明通过剂型制备工艺和质量控制研究,为该复方的临床用药增加了可选择剂型,有望扩展该中药复方的医疗价值和经济价值。(The invention relates to a Chinese medicinal compound preparation for treating asthma, a preparation process and a quality control method thereof, wherein the formula is prepared from the following Chinese medicinal raw materials: the invention adopts different methods for extraction, prepares capsule preparation, reasonably combines and optimally prepares the capsule preparation, makes the functions of the capsule preparation complement each other, eliminates phlegm and stops cough, ventilates and relieves asthma, safely and effectively treats asthma.)
技术领域
本发明涉中药制药技术领域，具体涉及以一种治疗哮喘的中药复方制剂及其制备工艺和质量控制方法。
背景技术
支气管哮喘(简称哮喘)，是全球最常见的慢性非传染性疾病之一，已成为全球性的社会健康问题。据不完全统计，全世界目前哮喘发病率为5～16％，6～7岁儿童发病率达11.6％，欧美等发达国家哮喘的发病率高达15～20％，我国哮喘的发病率约为2～4％。哮喘反复发作容易导致误工、误学，给患者、家庭及社会带来沉重的经济和社会负担。每年全球约有250000患者死于哮喘。哮喘作为一种复杂性质的疾病，其发病情况日益复杂，发病机制与遗传、免疫、神经、精神等多种因素有关。
中医学术把哮病的发生归为痰伏于肺，每因外邪侵袭、饮食不当、情志刺激、体虚劳倦等诱因引动伏痰而发，以致痰壅气道，肺气宣降功能失常。本病涉及肺、脾、肾三脏，总属邪实正虚之证，在治疗过程中急则治标，待症状缓解之后以调肺、脾、肾为本，正如朱丹溪所云:“未发以扶正气为主，既发以攻邪气为急”。中医药治疗哮喘具有良好的临床疗效，近年来中医药学者对中医药治疗哮喘的作用机制也进行了深入的研究。中药治疗效果明显，副作用小，具有重要的研究意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗哮喘的中药复方制剂及其制备工艺，该复方具有一定的止咳，平喘，润肺的功效，对治疗哮喘具有良好的疗效。
本发明另一目的在于提供该中药复方制剂的质量控制方法。
采用的技术方案是：
本发明的治疗哮喘的中药复方制剂由以下重量配比的中药原料药制备而成：四季青100-240g，北沙参80-160g，丹参80-160g，甘草40-80g，沙棘40-80g，苦杏仁40-80g，天竺黄10-40g。其最佳比例为6:4:4:2:2:2:1，即：四季青240g，北沙参160g，丹参160g，甘草80g，沙棘80g，苦杏仁80g，天竺黄40g，总重量为840g。
本发明的治疗哮喘的中药复方制剂制备工艺之一是将原料药材洗净烘干，取部分丹参和天竺黄粉碎，过100目筛，得细粉备用，其余诸药材破碎成片，放入铜制器皿中加80％乙醇反复煎煮2次，每次1小时，第一次溶剂体积为10倍，第二次溶剂体积为8倍，合并煎液，静置24h。过滤，滤液浓缩至相对密度为1.15-1.27(60℃)。加入上述细粉，混匀，干燥，研磨成细粉分装入0号胶囊，即得成药。
本发明的治疗哮喘的中药复方制剂制备工艺之二是将原料药材按照复方中质量配比备药：四季青240g，北沙参160g，丹参160g，甘草80g，沙棘80g，苦杏仁80g，天竺黄40g，总质量为840g。制法：将药材洗净烘干，取复方中的丹参采用10倍水提取两次，合并提取液，加入乙醇使其醇浓度为40％，溶液静止24小时，滤除沉淀，减压回收溶剂，真空干燥或者冷冻干燥成松散粉末得到丹参总酚酸，备用。其余诸药材破碎成片，放入铜制器皿中加80％乙醇反复煎煮2次，每次1小时，第一次溶剂体积为10倍，第二次溶剂体积为8倍，合并煎液，静置24h。过滤，滤液浓缩至相对密度为1.15-1.27(60℃)。加入上述细粉，混匀，干燥，研磨成细粉分装入0号胶囊，即得成药。
本发明的治疗哮喘的中药复方制剂制备工艺之三是将原料药材按照复方中质量配比备药：四季青240g，北沙参160g，丹参160g，甘草80g，沙棘80g，苦杏仁80g，天竺黄40g，总质量为840g。制法：将全部药材洗净烘干，破碎成片，放入铜制器皿中加80％乙醇反复煎煮2次，每次1小时，第一次溶剂体积为10倍，第二次溶剂体积为8倍，合并煎液，静置24h。过滤，减压回收溶剂，真空干燥或者冷冻干燥，制成细粉，分装入0号胶囊，即得成药。
本发明的治疗哮喘的中药复方制剂的治疗效果是通过卵清蛋白诱导的小鼠哮喘模型进行验证。具体内容如下：用卵清蛋白建立小鼠哮喘模型，以上述制备方法制备药物，给予小鼠为期14天药物治疗。通过苏木精-伊红染色法(HE染色)，马松染色(Masson)检测小鼠气管和肺组织病理状态。
检测结果表明：哮喘模型的小鼠肺部血管壁及支气管壁增厚，气管黏膜上皮细胞增生。哮喘模型小鼠细支气管单层柱状上皮细胞脱落，单层柱状上皮细胞转变为高层柱状上皮细胞。哮喘模型肺组织细胞排列紊乱，细胞变性，细胞核明显坏死，有炎症细胞浸润。通过本中药治疗的哮喘小鼠，肺部炎症浸润的情况有所改变，肺部细胞排列呈现正常态。气管上皮细胞减少凋落和坏死，状态趋于正常化。
本发明进一步提供本发明中药复方制剂的含量测定方法，所述方法，步骤如下：
(1)对照品溶液的制备：以甘草苷、刺甘草查尔酮、苦杏仁苷、丹酚酸B、补骨脂素、甘草查尔酮B、杜鹃素、槲皮苷为标准对照品，以甲醇为溶剂制备成不同浓度的对照品溶液，其中各溶液的浓度分别为甘草苷0.165mg/mL、刺甘草查尔酮0.08mg/mL、苦杏仁苷0.09mg/mL、丹酚酸B 0.085mg/mL、补骨脂素0.06mg/mL、甘草查尔酮B 0.08mg/mL、杜鹃素0.03mg/mL、槲皮苷0.10mg/mL，上述溶液过0.22μm滤膜后，即得各对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：取中药复方制剂，加入甲醇搅拌，离心取上清液，过0.22μm滤膜，即得供试品溶液；
(3)检测方法：分别取对照品溶液和供试品溶液，注入超高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图，计算中药复方制剂中甘草苷、刺甘草查尔酮、苦杏仁苷、丹酚酸B、补骨脂素、甘草查尔酮B、杜鹃素、槲皮苷的含量；
其中所述超高效液相色谱仪，色谱条件如下：
色谱柱:ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×100mm，1.7μm)，
流动相A:乙腈，流动相B:0.1％磷酸水溶液进行梯度洗脱，
流速:0.200mL·min-1，
检测波长:254nm，
柱温:30℃
梯度洗脱条件：
本发明的治疗哮喘的中药复方制剂的指纹图谱质量控制标准方法如下：
(1)对照品溶液的制备：分别精密称定对照品甘草苷3.30mg、刺甘草查尔酮1.60mg、苦杏仁苷1.80mg、丹酚酸B1.70mg、补骨脂素1.20mg、甘草查尔酮B1.60mg、杜鹃素0.60mg、槲皮苷2.00mg依次加入1mL甲醇超声溶解。分别吸取各对照品溶液50μL，加入甲醇稀释至1mL，得到各对照品溶液浓度分别为甘草苷0.165mg/mL、刺甘草查尔酮0.08mg/mL、苦杏仁苷0.09mg/mL、丹酚酸B0.085mg/mL、补骨脂素0.06mg/mL、甘草查尔酮B 0.08mg/mL、杜鹃素0.03mg/mL、槲皮苷0.10mg/mL，过0.22μm滤膜，即得各对照品溶液。
(2)供试品溶液的制备：精密称取由不同制备方法制得的中药复方制剂各1g，分别置于具塞三角瓶中，加入25mL色谱甲醇，称定重量，超声溶解30min，放置室温后补足减失重量。摇匀，吸取1mL，离心取上清液，过0.22μm滤膜，即得。
(3)检测方法：分别精密吸取对照品溶液1μL和供试品溶液5μL以超高效液相色谱仪法进行测定。色谱条件为色谱柱:ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×100mm，1.7μm)，以流动相A:乙腈，流动相B:0.1％磷酸水溶液进行梯度洗脱，流速:0.200mL·min-1，检测波长:254nm，柱温:30℃。得到该中药复方制剂的超高效液相色谱图。
梯度洗脱方法如下表：
(5)比较各对照品溶液的色谱图和供试品溶液的色谱图，用指纹图谱方法检测该供试品溶液，以监控本发明中药复方制剂的质量。
本发明采用超高效液相色谱构建该中药复方的指纹图谱，利用其指纹特征监控该中药复方制剂的质量。本发明以该中药复方制剂中主要有效成分作为对照品，代表着该中药复方中大部分药理活性，从而对该中药复方制剂中主要化学成分进行检测，有利于对其质量的控制。本发明的方法建立了该中药复方制剂的指纹图谱技术标准，通过指纹图谱和各对照品色谱图共有峰的特征，有效全面的监控该中药复方制剂的质量，保证了该中药复方制剂的稳定性，保证其质量的可控性。本发明的方法不仅控制该中药复方制剂的质量，并且操作简单，时间短，进样量少，具有一定的经济价值和实际意义。
附图说明
图1：小鼠气管HE染色，图中A正常组、B模型组、C中药低剂量(200mg/kg)、D中药中剂量(400mg/kg)、E中药高剂量(800mg/kg)、F阳性组(地塞米松)。
图2：小鼠肺组织HE染色，图中A正常组、B模型组、C中药低剂量(200mg/kg)、D中药中剂量(400mg/kg)、E中药高剂量(800mg/kg)、F阳性组(地塞米松)。
图3：小鼠肺组织Masson染色，图中A正常组、B模型组、C中药低剂量(200mg/kg)、D中药中剂量(400mg/kg)、E中药高剂量(800mg/kg)、F阳性组(地塞米松)。
图4：一种治疗哮喘的中药复方制剂的指纹图谱(制备工艺一)，图中峰号1、2、3、4、5、6、7、8依次指示为苦杏仁苷、甘草苷、槲皮苷、甘草查尔酮B、补骨脂素、丹酚酸B、刺甘草查尔酮、杜鹃素。
图5：一种治疗哮喘的中药复方制剂的指纹图谱(制备工艺二)，图中峰号1、2、3、4、5、6、7、8依次指示为苦杏仁苷、甘草苷、槲皮苷、甘草查尔酮B、补骨脂素、丹酚酸B、刺甘草查尔酮、杜鹃素。
图6：一种治疗哮喘的中药复方制剂的指纹图谱(制备工艺三)，图中峰号1、2、3、4、5、6、7、8依次指示为苦杏仁苷、甘草苷、槲皮苷、甘草查尔酮B、补骨脂素、丹酚酸B、刺甘草查尔酮、杜鹃素。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1：
四季青240g，北沙参160g，丹参总酚酸8g，甘草80g，沙棘80g，苦杏仁80g，天竺黄40g，总重量为688g。
实施例2：
四季青240g，北沙参160g，丹参160g，甘草80g，沙棘80g，苦杏仁80g，天竺黄40g，总重量为840g。
或
四季青100g，北沙参80g，丹参80g，甘草40g，沙棘40g，苦杏仁40g，天竺黄10g。
实施例3：
实施例1配方药物中，丹参总酚酸的制备：丹参采用10倍水提取两次，合并提取液，加入乙醇使其醇浓度为40％，溶液静止24小时，滤除沉淀，减压回收溶剂，真空干燥或者冷冻干燥成松散粉末，即得。
实施例4：
实施例2配方药物的制备：将药材洗净烘干，取部分丹参和天竺黄粉碎，过100目筛，得细粉备用，其余诸药材破碎成片，放入铜制器皿中加80％乙醇反复煎煮2次，每次1小时，第一次溶剂体积为10倍，第二次溶剂体积为8倍，合并煎液，静置24h。过滤，滤液浓缩至相对密度为1.15-1.27(60℃)。加入上述细粉，混匀，干燥，研磨成细粉分装入0号胶囊，即得成药。
实施例5：
实施例2配方药物的制备：将药材洗净烘干，取复方中的丹参采用10倍水提取两次，合并提取液，加入乙醇使其醇浓度为40％，溶液静止24小时，滤除沉淀，减压回收溶剂，真空干燥或者冷冻干燥成松散粉末，备用。其余诸药材破碎成片，放入铜制器皿中加80％乙醇反复煎煮2次，每次1小时，第一次溶剂体积为10倍，第二次溶剂体积为8倍，合并煎液，静置24h。过滤，滤液浓缩至相对密度为1.15-1.27(60℃)。加入上述细粉，混匀，干燥，研磨成细粉分装入0号胶囊，即得成药。
实施例6：
实施例2配方药物的制备：将全部药材洗净烘干，破碎成片，放入铜制器皿中加80％乙醇反复煎煮2次，每次1小时，第一次溶剂体积为10倍，第二次溶剂体积为8倍，合并煎液，静置24h。过滤，减压回收溶剂，真空干燥或者冷冻干燥，制成细粉，分装入0号胶囊，即得成药。
实施例7：
实施例2配方药物对哮喘的治疗作用。
1.实验方法
BALB/C小鼠，SPF级，6-8周龄，雌性，体重18-22克，84只小鼠随机分为A、B、C、D、E、F组，即正常组、模型组、中药低剂量治疗组、中药中剂量治疗组、中药高剂量治疗组，阳性药(地塞米松磷酸钠注射液)治疗组。
实验分组及给药剂量
OVA致敏液的配制方法：为GradeⅡ级OVA干粉100μgOVA、2mg氢氧化铝及200μL生理盐水，最终配置成0.5mg/mL的OVA致敏液；1％OVA激发雾化液为OVA100mg，溶解于10mL生理盐水中，充分溶解后用滤菌器过滤除菌后使用，每次使用前新鲜配制。
(1)B、C、D、E、F组小鼠分别于实验第1、14天按100uL/10g剂量腹腔注射卵清蛋白(OVA)致敏液致敏。A 组小鼠用等量的生理盐水代替OVA进行腹腔注射致敏及相应的雾化激发处理。
(2)C、D、E组各小鼠在实验第21天到34天给予不同浓度中药复方提取浸膏灌胃；A和B组各小鼠分别用100μL/10g生理盐水替代治疗组药物进行灌胃。F组小鼠用地塞米松2mg/Kg(2mg/10mL)进行腹腔注射。
(3)从实验开始第28天到34天，每天给药1h后，将小鼠置于自制密闭容器中，用1％OVA激发液20mL雾化激发，每天1次，每次30min。实验中注意观察小鼠出现的烦躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐、大小便失禁、频繁挠鼻、四肢无力等阳性反应。
(4)实验第35天，解剖动物，取血清，肺组织，肺泡灌洗液，分装储存为后期指标检测做准备。
2.病理指标检测
2.1肺组织、气管样本苏木精-伊红染色(HE)染色
小鼠于7％水合氯醛麻醉后，固定于木板上，快速精细取出小鼠的肺组织、气管器官，置于体积为器官体积2倍的10％多聚甲醛中，达到固定组织效果。固定24小时后进行石蜡包埋、切片，并行HE染色和免疫组化等，光镜观察各组织的病理学变化。具体过程如下：
a、组织石蜡包埋及切片
(1)将已经固定好的组织置于50％的酒精内12h；
(2)将组织标本分别置于70％酒精4h，80％酒精30min，90％酒精30min，95％酒精Ⅰ、95％酒精Ⅱ、100％酒精Ⅰ、以及100％酒精Ⅱ各45min；
(3)二甲苯透明；
(4)浸蜡、包埋；
(5)切片：切片机切片，片厚为4μm。
b、切片苏木精-伊红(HE)染色：
(1)切片常规二甲苯脱蜡；
(2)依次置于100％酒精2min→95％酒精1min→80％酒精1min→75％酒精1min→蒸馏水洗2min；
(3)苏木精染色5min；
(4)自来水冲洗10min；
(5)盐酸酒精分化30s；
(6)自来水浸泡15min；
(7)置于伊红染液2min；
(8)常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片：95％酒精(Ⅰ)1min→95％酒精(Ⅱ)1min→100％酒精(Ⅰ)1min→100％酒精(Ⅱ)1min→二甲苯石炭酸(3:1)1min→二甲苯(Ⅰ)1min→二甲苯(Ⅱ)1min→中性树胶封固。
2.2肺组织马松染色(Masson)
2.2.1检测原理：
Masson三色染色又称马松染色，是胶原纤维染色权威而经典的技术方法，所谓三色染色通常是指染胞核和能选择性的显示胶原纤维和肌纤维。该法染色原理与阴离子染料分子的大小和组织的渗透有关：分子的大小由分子量来体现，小分子量易穿透结构致密、渗透性低的组织；而大分子量则只能进入结构疏松的、渗透性高的组织，苯胺蓝的分子量很大，染色后肌纤维呈红色，胶原纤维呈蓝色，主要用于区分胶原纤维和肌纤维。
2.2.2试剂
2.2.3检测方法
1、组织固定于Bouin氏固定液(另购)或Zenker氏固定液(另购)或10％中性福尔马林固定液(另购)等，流水冲洗，常规脱水包埋；
2、切片常规脱蜡至水；
3、取适量的Weigert铁苏木素A液和Weigert铁苏木素B液等量混合,即为Weigert铁苏木素染色液，用Weigert铁苏木素染色液染色，流水稍洗；
4、酸性乙醇分化液分化数秒，流水冲洗数分钟；
5、蓝化液返蓝数秒，流水冲洗数分钟；
6、丽春红品红染色液染色数分钟，流水稍冲洗；
7、将蒸馏水:乙酸溶液按一定的比例配制乙酸工作液，用乙酸工作液洗切片；
8、磷钼酸溶液处理后，倾去玻片上磷钼酸溶液(不用水洗)；
9、苯胺蓝染色液复染，倾去玻片上染色液(不用水洗)；
10、用乙酸工作液处理切片，至切片无蓝色脱出(必要时镜下控制)；
11、95％乙醇迅速脱水，无水乙醇脱水数次后，二甲苯透明，中性树胶封固。
3检测结果
3.1肺组织、气管样本苏木精-伊红染色(HE)染色
根据图1，图2结果显示可以发现哮喘模型的小鼠肺部血管壁及支气管壁增厚，气管黏膜上皮细胞增生。哮喘模型小鼠细支气管单层柱状上皮细胞脱落，单层柱状上皮细胞转变为高层柱状上皮细胞。哮喘模型肺组织细胞排列紊乱，细胞变性，细胞核明显坏死，有炎症细胞浸润。通过本发明的中药复方治疗的哮喘小鼠，肺部炎症浸润的情况有所改变，肺部细胞排列呈现正常态。气管上皮细胞减少凋落和坏死，状态趋于正常化。该中药复方对哮喘有较明显的治疗效果。
3.2肺组织马松染色(Masson)
根据图3所示肺组织中胶原纤维、粘液、软骨呈蓝色，肌纤维、纤维素和红细胞呈红色，细胞核呈蓝黑色。哮喘模型的小鼠肺部细胞排列紊乱，纤维化严重。给药治疗后的小鼠肺组织中呈现红色的纤维部分减少，随着给药剂量的增加，纤维化程度减小，趋于正常化。该中药复方对哮喘引起的肺部炎症及损伤也具有一定的治疗作用。
实施例8：
指纹图谱分析方法建立。
1.仪器和试剂
Waters ACQUITY UPLC型超高效液相色谱，Empower 2.0色谱工作站，KQ3200B型超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)，BSA224S型电子天平(1/104g)(北京赛多利斯科学仪器有限公司)，TGL-16G型离心机(上海安亭科学仪器厂)，SZ-93型自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)，合成纤维过滤膜(孔径0.22μm)(济南舜腾生物技术有限公司)。
色谱级甲醇(美国J.K Baker公司)，色谱级乙腈(美国J.K Baker公司)，分析级磷酸(武汉化学试剂厂)，双重纯水(实验室自制)。
2.对照品和供试品的制备
2.1对照品溶液的制备：分别精密称定对照品甘草苷3.30mg、刺甘草查尔酮1.60mg、苦杏仁苷1.80mg、丹酚酸B1.70mg、补骨脂素1.20mg、甘草查尔酮B1.60mg、杜鹃素0.60mg、槲皮苷2.00mg依次加入1mL甲醇超声溶解。分别吸取各对照品溶液50μL，加入甲醇稀释至1mL，得到各对照品溶液浓度分别为甘草苷0.165mg/mL、刺甘草查尔酮0.08mg/mL、苦杏仁苷0.09mg/mL、丹酚酸B0.085mg/mL、补骨脂素0.06mg/mL、甘草查尔酮B 0.08mg/mL、杜鹃素0.03mg/mL、槲皮苷0.10mg/mL，过0.22μm滤膜，即得各对照品溶液。
2.2供试品溶液的制备：精密称取由不同制备方法制得的中药复方制剂各1g，分别置于具塞三角瓶中，加入25mL色谱甲醇，称定重量，超声溶解30min，放置室温后补足减失重量。摇匀，吸取1mL，离心取上清液，过0.22μm滤膜，即得。
3.色谱分析条件
色谱条件为色谱柱:ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×100mm，1.7μm)；以流动相A:乙腈，流动相B:0.1％磷酸水溶液进行梯度洗脱；流速:0.200mL·min-1；检测波长:254nm；柱温:30℃；进样量:对照品溶液1μL，供试品溶液5μL通过超高效液相色谱仪法进行测定。
梯度洗脱方法如下表：
4.检测结果
通过该中药复方制剂的超高效液相指纹图谱与各对照品色谱图进行比较，其中RT值为3.735min、23.456min、28.676min、32.647min、33.286min、34.945min、38.028min、45.889min的8个色谱峰经确证为苦杏仁苷、甘草苷、槲皮苷、甘草查尔酮B、补骨脂素、丹酚酸B、刺甘草查尔酮、杜鹃素，它们构成了该中药复方制剂的指纹特征，可作为该中药复方制剂质量控制的依据。本发明内容中通过三种制备工艺得到的该中药复方制剂，其对应的指纹图谱具体见图4、图5、图6。
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