猪瘟病毒重组抗原及其制备方法和应用

文档序号：1108178 发布日期：2020-09-29 浏览：36次 >En<

阅读说明：本技术 猪瘟病毒重组抗原及其制备方法和应用 (Classical swine fever virus recombinant antigen and preparation method and application thereof ) 是由曹文龙孔迪滕小锘易小萍张大鹤于 2020-06-15 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种猪瘟病毒重组抗原及其制备方法和应用,所述猪瘟病毒重组抗原为经过蛋白质改造的E2蛋白,所述蛋白质改造包括点突变,所述点突变为将E2蛋白的第166位氨基酸突变成天冬酰胺,且将第229位氨基酸突变成丙氨酸。本发明将E2蛋白关键的糖基化位点第229位的Asn氨基酸突变成Ala,能够去掉糖基化,并且将第166位的Asp氨基酸突变成Asn,引入一个新的糖基化位点,从而能够在增加蛋白的免疫原性的同时降低其过敏反应。(The invention relates to a classical swine fever virus recombinant antigen and a preparation method and application thereof, wherein the classical swine fever virus recombinant antigen is E2 protein modified by protein, the protein modification comprises point mutation, and the point mutation is to change the 166 th amino acid of the E2 protein into asparagine and change the 229 th amino acid into alanine. The invention changes the Asn amino acid at 229 th position of the key glycosylation site of the E2 protein into Ala to remove glycosylation, and changes the Asp amino acid at 166 th position into Asn to introduce a new glycosylation site, thereby increasing the immunogenicity of the protein and reducing the anaphylactic reaction.)

猪瘟病毒重组抗原及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，特别是涉及一种猪瘟病毒重组抗原及其制备方法和应用。

背景技术

猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fevervirus，CSFV)引起的一种急性、热性和高度接触性传染病，以高热、出血为主要症状，其病理原因主要是小血管壁变性，导致内脏器官出血、梗塞甚至坏死。传播途径主要有接触传播，消化道传播或呼吸道传播。该病能引起急性、亚急性、慢性乃至迟发性的感染，同时也能够造成不发病的亚临床症状。由于不同日龄、性别和品种的猪均可感染发病，因此猪瘟给养猪业造成了巨大的经济损失。该疾病分布在许多国家和地区，世界动物卫生组织(OIE)将猪瘟确定为《国际动物卫生法典》中的A类法定疫病，我国将其列为一类传染病，是猪病中最受重视且危害最高的传染病之一。

CSFV是一种有囊膜的正义单链RNA病毒，病毒粒子呈圆形，被归类为黄病毒科瘟病毒属。有研究表明，病毒粒子的直径为30～50nm，外披蛋白囊膜，囊膜上有6～8nm的糖蛋白突起。CSFV基因组长度大约为12.3kb，包括一个大的开放阅读框(ORF)，旁边是一个5’非编码区(5’-UTR)和一个3’非编码区(3’-UTR)。开放阅读框(ORF)编码一个含有3898个氨基酸残基(aa)的多聚蛋白，该蛋白在宿主细胞和病毒蛋白酶的作用下被加工成成熟的病毒蛋白，裂解成四种结构蛋白(C、E2、Erns、E1)和八种非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B、Npro、P7)。E2糖蛋白是猪瘟病毒最重要的囊膜蛋白之一，由373个氨基酸组成，大小约为55kDa，含有6个N-连接和1个O-连接的特定糖基化位点。E2蛋白的抗原上存在4个抗原区，分别为A区、B区、C区、D区，这4个抗原区的位置在E2蛋白N端氨基酸残基690～866之间，说明此部分可能是E2蛋白表现抗原性的重要区域。E2蛋白是参与CSFV复制最重要的结构蛋白，可诱导病毒感染宿主细胞。CSFV感染宿主细胞过程中，E2蛋白依靠半胱氨酸间的二硫键连接成同源或异源二聚体分布于病毒粒子表面，二硫键形成的结构域维持了E2蛋白抗原结构的稳定，二聚体能有效刺激动物体内产生针对CSFV的中和抗体。

采用免疫接种是目前我国控制猪瘟的主要措施，疫苗质量的好坏直接影响疫病免疫防治效果。自50年代以来，我国自行研发的猪瘟兔化弱毒疫苗(“C”株)被广泛应用，然而猪瘟兔化弱毒疫苗的长期使用并未能有效控制猪瘟的发生和传播，其免疫原性较低，已不能满足现代防控和根除猪瘟的需求了。

发明内容

基于此，有必要提供一种免疫原性较好、安全性较高、易于表达的猪瘟病毒重组抗原。

一种猪瘟病毒重组抗原，所述猪瘟病毒重组抗原为经过蛋白质改造的E2蛋白，所述蛋白质改造包括点突变，所述点突变为将E2蛋白的第166位氨基酸突变成天冬酰胺，且将第229位氨基酸突变成丙氨酸。

在其中一个实施例中，所述蛋白质改造还包括在E2蛋白的C端添加T4噬菌体纤维蛋白三聚化结构域。

在其中一个实施例中，所述猪瘟病毒重组抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

在其中一个实施例中，所述猪瘟病毒重组抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

在其中一个实施例中，所述猪瘟病毒重组抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供了一种表达基因，其能够表达上述猪瘟病毒重组抗原。

在其中一个实施例中，其核酸序列如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8所示。

本发明还提供了一种表达载体，其含有上述表达基因。

本发明还提供了一种宿主细胞，其基因组中掺有上述表达基因。

在其中一个实施例中，所述宿主细胞为CHO细胞。

本发明还提供了一种猪瘟病毒重组抗原的制备方法，包括以下步骤：在适宜的条件下培养所述宿主细胞，收集培养液和/或所述宿主细胞的裂解液，然后进行分离纯化得到所述猪瘟病毒重组抗原。

本发明还提供了一种上述猪瘟病毒重组抗原、表达基因、表达载体或宿主细胞在制备用于防治猪瘟的产品中的应用。

本发明还提供了一种猪瘟疫苗，包括上述猪瘟病毒重组抗原和药学上可接受的佐剂。

E2蛋白是单亚基蛋白，其单独表达免疫原性差，而重组表达的E2蛋白的免疫原性和其糖基化水平相关，且不同的表达系统糖基化修饰水平和糖链的结构不完全一致，导致蛋白的抗原性不同。本发明通过理性的突变改变糖基化结构，具体为将E2蛋白关键的糖基化位点第229位的Asn氨基酸突变成Ala，能够去掉糖基化，并且将第166位的Asp氨基酸突变成Asn，引入一个新的糖基化位点，从而能够在增加蛋白的免疫原性的同时降低其过敏反应。经免疫实验和耐受性实验证明，改造后的E2蛋白免疫原性显著提高，并且降低了其对猪的过敏应激反应，安全性更高。用本发明的猪瘟病毒重组抗原制备的亚单位疫苗免疫原性好，安全高效，且细胞表达量非常高，可供大规模批量生产，质控容易，批次间稳定，生产成本低。

附图说明

图1为NE2基因PCR扩增后所获PCR产物进行凝胶电泳的结果；其中1为NE2基因；2为阴性对照；M为分子量标记；

图2为多个NE2蛋白基因转化的菌落样品的PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳的结果；其中1～6均为NE2基因转化的菌落样品PCR扩增后的产物，7为阴性对照，M为分子量标记；

图3为构建好的真核表达载体PCI-NE2-GS的图谱；

图4为实施例2中的细胞培养物上清进行SDS-PAGE凝胶电泳的结果，其中1～5分别为NE2组、E2-1组、E2-2组、E2-3组、E2-4组的细胞培养物上清；6～8分别为使用糖苷内切酶Endo H_f处理后的NE2组、E2-1组、E2-2组的细胞培养物上清；9为阴性对照；M为分子量标记；

图5为实施例3中表达蛋白重组CHO上清样品Western Blot检测结果，其中1～5为分别为NE2组、E2-1组、E2-2组、E2-3组、E2-4组蛋白重组CHO上清样品；6～8分别为使用糖苷内切酶Endo H_f处理后的NE2组、E2-1组、E2-2组蛋白重组CHO上清样品；9为阴性对照；M为分子量标记；

图6为实施例4中的Ni纯化结果图；其中，1为上样，2为流穿，3为50mM咪唑洗脱杂质，4为300mM咪唑洗脱目的蛋白，M为分子量标记；

图7为实施例4中NE2组的分子筛层析结果图；

图8为实施例4中E2-1组的分子筛层析结果图；

图9为实施例4中NE2组蛋白的电镜结果图；

图10为实施例7中中和抗体滴度结果图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明一实施例的猪瘟病毒重组抗原，其为经过蛋白质改造的E2蛋白，所述蛋白质改造包括点突变，该点突变为将E2蛋白的第166位氨基酸突变成天冬酰胺，且将第229位氨基酸突变成丙氨酸。

术语“抗原”是指所有能诱导机体发生免疫应答的物质，即能被T/B淋巴细胞表面的抗原受体(TCR/BCR)特异性识别与结合，活化T/B细胞，使之增殖分化，产生免疫应答产物(致敏淋巴细胞或抗体)，并能与相应产物在体内外发生特异性结合的物质。因此，抗原物质具备两个重要特性：免疫原性(immunogenicity)和免疫反应性(immunoreactivity)。免疫原性即指抗原诱导机体发生特异性免疫应答，产生抗体和/或致敏淋巴细胞的能力；免疫反应性是指能与相应的免疫效应物质(抗体或致敏淋巴细胞)在体内外发生特异性结合反应的能力。

在一个具体示例中，上述蛋白质改造还包括在E2蛋白的C端添加T4噬菌体纤维蛋白三聚化结构域。通过在E2蛋白的C端添加T4噬菌体纤维蛋白三聚化结构域(T4 fibritintrimerization domain)，可以形成三聚体的复杂结构，进一步增加免疫原性。而且，由于E2蛋白糖基化位点第229位的Asn氨基酸的存在阻止了三聚体的形成，因此需在E2蛋白第229位的Asn氨基酸突变成Ala的基础上，在其C端添加T4噬菌体纤维蛋白三聚化结构域，方可引入复杂的三聚体结构，从而显著提高抗原免疫原性。

在一个具体示例中，上述蛋白质改造还包括在E2蛋白中***经过上述点突变改造的E2蛋白的串联重复抗原表位，改造后蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。通过在E2蛋白中***一个串联重复抗原表位，且串联重复的表位含有如前所述的点突变引入的第166位Asn，能够一步增加免疫原性。

术语“抗原表位”指抗原决定簇，是抗原物质分子表面或其他部位，具有一定组成和结构的特殊化学基团，能与其相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合的结构，结构已经确定的抗原决定簇称为抗原表位。

在一个具体示例中，上述蛋白质改造还包括在E2蛋白中***Erns蛋白的抗原表位，改造后蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。Erns蛋白在病毒粒子中以同源二聚体的形式存在，Erns进入机体后，能够刺激机体产生中和抗体，能使免疫猪获得对CSFV的保护力。Erns具有RNase活性，这种RNase活性可能在CSFV的复制中发挥着重要作用，与CSFV在宿主中感染的持续性有关。通过在E2蛋白中添加Erns蛋白的抗原表位，一方面可以使抗原性得到增加，另一方面由于不是使用全长的Erns蛋白，从而可以通过检测Erns其他表位的抗体来区分免疫猪和感染病毒猪，以便用于猪场的净化。

在一个具体示例中，猪瘟病毒重组抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其效果最佳。

本发明一实施例的表达基因，其能够表达上述猪瘟病毒重组抗原。

在一个具体示例中，表达基因的核酸序列如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6或SEQ ID NO：8所示。可以理解，由于密码子的简并性，能够表达同一蛋白的核酸序列具有多种形式，以上为经过密码子优化的核酸序列，但不限于此。

本发明一实施例的表达载体，其含有上述表达基因。

术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸***其中的一种核酸运载工具。当载体能使***的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、***瘤病毒、***多瘤空泡病毒(如SV40)。在一些实施方式中，本发明的载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等)。在一个具体的实施方式中，表达载体可以是pSV2-GS、pCI-GS、pcDNA4-GS等，优选为pCI-GS。

本发明一实施例的宿主细胞，其基因组中掺有上述表达基因。

术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。

在一个具体示例中，宿主细胞为CHO细胞。具体地，CHO细胞系可以是为DG44、DXB11、CHO-K1、CHO-S细胞株等，优选为CHO-S。使用CHO细胞表达改造后的猪瘟病毒重组抗原蛋白，使用真核表达，蛋白糖基化充分，抗原蛋白免疫原性好，并且表达量非常高，达到3g/L～4g/L，重组细胞能够大规模悬浮培养，大大降低了疫苗制备的复杂程度，降低了生产成本。

本发明一实施例的一种猪瘟病毒重组抗原的制备方法，包括以下步骤：在适宜的条件下培养上述宿主细胞，收集培养液和/或宿主细胞的裂解液，然后进行分离纯化得到猪瘟病毒重组抗原。

在一个具体示例中，分离纯化的方法包括镍柱亲和层析、分子筛层析等，不限于此，可根据需要选择。

本发明一实施例的猪瘟疫苗，其包括上述猪瘟病毒重组抗原和药学上可接受的佐剂。

在一个具体示例中，佐剂可以是白油、硬脂酸铝、司本、吐温中的一种或者两种以上的组合，优选使用白油佐剂。

下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例1

(一)、重组真核表达载体pCI-NE2-GS的构建

1、NE2基因扩增与纯化

在上海桑尼生物科技有限公司合成了密码子优化后的NE2基因(SEQ ID NO:1)并克隆到pUC-57载体上，得到pUC-NE2质粒载体。以pUC-NE2作为模板，NE2-F、NE2-R作为引物进行PCR扩增，扩增体系见表1。反应条件为：94℃预变性5分钟；95℃变性45秒，60℃复性45秒，72℃延伸2分钟，30个循环；72℃延伸10分钟，4℃保藏。

NE2-F：ATACTCGAGGCCGCCACCATGGAAACAGATACACTCCTCCTCTGGG

NE2-R：ATAGGTACCTCATCAATGGTGATGATGGTGGTGGGCGGGGCTCAGAA

表1 NE2基因扩增体系

将PCR产物进行凝胶电泳鉴定目的基因大小，如图1所示，在1.4kbp附近的位置出现条带，目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。

2、酶切

将pCI-GS质粒和纯化后的NE2基因PCR产物分别使用Xho Ⅰ、Kpn Ⅰ37℃酶切3小时，反应体系见表2、表3。酶切产物凝胶电泳后分别回收，用凝胶回收纯化试剂盒进行纯化。

表2 NE2基因酶切反应体系

反应成分	单位(μL)
		纯化后的NE2基因PCR产物	10
反应Buffer	5
		Kpn Ⅰ酶	2
Xho Ⅰ酶	2
		ddH<sub>2</sub>O	31

表3 pCI-GS质粒酶切反应体系

反应成分	单位(μL)
		pCI-GS质粒	5
反应Buffer	5
		Kpn Ⅰ酶	2
Xho Ⅰ酶	2
		ddH<sub>2</sub>O	36

3、连接

将酶切过的pCI-GS质粒和NE2基因酶切产物使用T4 DNA连接酶16℃水浴连接过夜，连接体系见表4。

表4 NE2基因与pCI-GS质粒连接体系

反应成分	单位(μL)
		酶切产物	5
酶切质粒	2
		反应Buffer	1
T4连接酶	2

4、转化

取10μL连接产物加入100μL的DH5α感受态细胞，混匀，42℃热休克90秒，冰浴2分钟，加入900μL不含Amp的LB培养基，37℃培养1小时。取1.0mL菌液离心浓缩成100μL涂布于含有Amp的LB固体培养基上，37℃培养16小时。

5、菌落PCR和测序鉴定

挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，NE2-F和NE2-R作为引物进行菌落PCR。将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图2所示，出1.4kbp附近条带的样品为阳性样品。将菌落PCR鉴定阳性的菌液送测序公司测序，选择测序正确的菌液进行保存，得到真核表达载体pCI-NE2-GS，构建好的载体图谱如图3所示。

(二)、表达NE2蛋白的重组CHO细胞的构建与筛选

1、细胞转染

1.1准备细胞

取对数生长期的CHO细胞，取样计数，以1×10⁶cells/mL的细胞密度继续传代，维持种子，剩余细胞离心，1000rpm离心4分钟后，弃上清，用20mL左右的新鲜CHO-WM培养基重悬，再次离心，1000rpm离心4分钟，弃上清后用少量培养基重悬计数，最终将细胞密度调整为1.43×10⁷cells/mL。

1.2质粒与细胞混合

取步骤(一)中pCI-NE2-GS质粒载体5μg，加入至EP管中，添加0.7mL细胞，混合均匀后，静置15分钟。

1.3电转

280V 20ms电击2个脉冲，电击完成后，立刻将细胞转入至摇瓶中，悬浮培养，48h后观察细胞状态，换液培养，等细胞密度生长到0.6×10⁶cells/mL时，添加50μM MSX(L-methionine sulphoximine)加压筛选。

2、单克隆筛选

2.1用苏州沃美生物技术有限公司的CHO细胞无血清无蛋白培养基CHO-WM细胞培养基+50μM MSX重新悬浮细胞，计数。

2.2稀释细胞至5个/mL，取200μL混匀的细胞加入到96孔板中，放置到37℃，5％CO₂细胞培养箱中孵育4～6h，记录单个细胞的孔。

2.3待96孔板中单个细胞的孔长起来时，弃掉培养基，PBS洗一次，100μL 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，加入2mL CHO-WM培养基(含10％FBS+50μM MSX)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。将细胞转移至12孔板，待12孔板长满时，取上清，Elisa检测克隆是否为阳性，高效表达的阳性克隆继续扩大培养，冻存。

3、细胞摇瓶发酵

3.1传代培养基的配置：使用CHO-WM培养基添加50μM MSX作为传代培养基，置于37℃水浴锅预热至37℃。

3.2从CO₂恒温摇床取出摇瓶细胞，进行计数。

3.3稀释细胞至(2.5～3.5)×10⁵个细胞/mL接种30mL培养基于一个125mL摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％CO₂恒温摇床中100rpm/min孵育过夜。

3.4每隔24h计数细胞密度以及活力，测葡萄糖，当糖低于2g/L的时候，添加葡萄糖到4g/L；每天取1mL样品，上清用于检测蛋白表达情况。

另外按照以上方法构建表达如表5所示其他抗原蛋白的细胞株。

表5

NE2氨基酸序列(Seq ID NO:1)：

METDTLLLWVLLLWVPGSTGRLACKEDYRYAISSTDEIGLLGAGGLTTTWKEYNHDLQLNDGTVKASCVAGSFKVTALNVVSRRYLASLHKKALPTSVTFELLFDGTNPSTEEMGDDFRSGLCPYDTSPVVKGKYNTTLLNGSAFYLVCPIGWTGVIECTAVSPTTLRTEVVKTFRRDKPFPHRMNCVTTIFRRDKPFPHRMNCVTTIVENEDLFYCKLGGNWTCVKGEPVVYTGGVVKQCRWCGFDFDGPDGLPHYPIGKCILAAETGYRIVDSTDCNRDGVVISTEGSHECLIGNTTVKVHASDERLGPMPCRPKEIVSSAGPVKKTSCTFNYTKTLKNRYYEPRDSYFQQYMLKGEYQYWFDLDACNFNVSVEDTLYGDHECGSLLQDAALYLVDGMTNTIENARQGAARVTSWLGRQLSTAGKRLEGRSKTWFGAYAGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLSPAHHHHHH

NE2基因序列(Seq ID NO:2)：

GCCGCCACCATGGAAACAGATACACTCCTCCTCTGGGTGCTGCTCCTCTGGGTGCCAGGATCTACAGGACGGCTAGCCTGCAAGGAAGATTACAGGTACGCAATATCGTCAACCGATGAGATAGGGCTACTTGGGGCCGGAGGTCTCACCACCACCTGGAAGGAATACAACCACGATTTGCAACTGAATGACGGGACCGTCAAGGCCAGTTGCGTGGCAGGTTCCTTTAAAGTCACAGCACTTAATGTGGTCAGTAGGAGGTATTTGGCGTCATTGCATAAGAAGGCTTTACCCACTTCCGTGACATTCGAGCTCCTGTTCGACGGGACCAACCCATCAACTGAGGAAATGGGAGATGACTTCAGGTCCGGGCTGTGCCCGTATGATACGAGTCCTGTTGTTAAGGGAAAGTACAATACGACCTTGTTGAACGGTAGTGCTTTCTATCTTGTCTGCCCAATAGGGTGGACGGGTGTCATAGAGTGCACAGCAGTGAGCCCAACAACTCTGAGGACAGAAGTGGTAAAGACCTTCAGGAGAGACAAGCCCTTTCCGCACAGAATGAATTGTGTGACCACCATATTCAGGAGAGACAAGCCCTTTCCGCA CAGAATGAATTGTGTGACCACCATAGTGGAAAATGAAGATTTATTCTATTGTAAGCTGGGGGGCAACTGGACATGTGTGAAAGGCGAGCCAGTGGTCTACACAGGGGGGGTAGTAAAACAATGTAGATGGTGTGGCTTCGACTTCGATGGGCCTGACGGACTCCCGCATTACCCCATAGGTAAGTGCATTTTGGCAGCAGAGACAGGTTACAGAATAGTAGATTCAACGGACTGTAACAGAGATGGCGTTGTAATCAGCACAGAGGGGAGTCATGAGTGCTTGATCGGTAACACGACCGTCAAGGTGCATGCATCAGATGAAAGACTGGGCCCTATGCCATGCAGACCTAAAGAGATTGTCTCTAGTGCTGGTCCTGTAAAGAAAACCTCCTGTACATTCAACTACACAAAAACTTTGAAGAACAGGTACTATGAGCCCAGGGACAGCTACTTCCAGCAATATATGCTTAAGGGTGAGTATCAGTACTGGTTTGACCTGGATGCGTGCAACTTCAACGTGTCCGTGGAGGACACCCTGTACGGCGACCACGAGTGCGGTTCTCTGCTGCAGGACGCTGCCCTGTACCTCGTGGACGGCATGACCAACACAATCGAGAACGCCAGGCAGGGCGCTGCTAGGGTGACAAGCTGGCTGGGCAGGCAACTGTCCACCGCTGGCAAGAGGCTGGAGGGCAGGAGCAAGACCTGGTTCGGCGCTTACGCCGGATATATCCCCGAGGCTCCCAGAGACGGCCAGGCCTATGTGAGAAAGGACGGAGAGTGGGTGCTGCTGAGCACCTTTCTGAGCCCCGCCCACCACCATCATCACCATTGATGA

E2-1氨基酸序列(Seq ID NO:9)：

METDTLLLWVLLLWVPGSTGRLACKEDYRYAISSTDEIGLLGAGGLTTTWKEYNHDLQLNDGTVKASCVAGSFKVTALNVVSRRYLASLHKKALPTSVTFELLFDGTNPSTEEMGDDFRSGLCPYDTSPVVKGKYNTTLLNGSAFYLVCPIGWTGVIECTAVSPTTLRTEVVKTFRRDKPFPHRMNCVTTIFRRDKPFPHRMNCVTTIVENEDLFYCKLGGNWTCVKGEPVVYTGGVVKQCRWCGFDFDGPDGLPHYPIGKCILANETGYRIVDSTDCNRDGVVISTEGSHECLIGNTTVKVHASDERLGPMPCRPKEIVSSAGPVKKTSCTFNYTKTLKNRYYEPRDSYFQQYMLKGEYQYWFDLDACNFNVSVEDTLYGDHECGSLLQDAALYLVDGMTNTIENARQGAARVTSWLGRQLSTAGKRLEGRSKTWFGAYAGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLSPAHHHHHH

E2-1基因序列(Seq ID NO:10)：

gccgccaccATGGAAACAGATACACTCCTCCTCTGGGTGCTGCTCCTCTGGGTGCCAGGATCTACAGGACGGCTAGCCTGCAAGGAAGATTACAGGTACGCAATATCGTCAACCGATGAGATAGGGCTACTTGGGGCCGGAGGTCTCACCACCACCTGGAAGGAATACAACCACGATTTGCAACTGAATGACGGGACCGTCAAGGCCAGTTGCGTGGCAGGTTCCTTTAAAGTCACAGCACTTAATGTGGTCAGTAGGAGGTATTTGGCGTCATTGCATAAGAAGGCTTTACCCACTTCCGTGACATTCGAGCTCCTGTTCGACGGGACCAACCCATCAACTGAGGAAATGGGAGATGACTTCAGGTCCGGGCTGTGCCCGTATGATACGAGTCCTGTTGTTAAGGGAAAGTACAATACGACCTTGTTGAACGGTAGTGCTTTCTATCTTGTCTGCCCAATAGGGTGGACGGGTGTCATAGAGTGCACAGCAGTGAGCCCAACAACTCTGAGGACAGAAGTGGTAAAGACCTTCAGGAGAGACAAGCCCTTTCCGCACAGAATGAATTGTGTGACCACCATATTCAGGAGAGACAAGCCC TTTCCGCACAGAATGAATTGTGTGACCACCATAGTGGAAAATGAAGATTTATTCTATTGTAAGCTGGGGGGCAACTGGACATGTGTGAAAGGCGAGCCAGTGGTCTACACAGGGGGGGTAGTAAAACAATGTAGATGGTGTGGCTTCGACTTCGATGGGCCTGACGGACTCCCGCATTACCCCATAGGTAAGTGCATTTTGGCAAATGAGACAGGTTACAGAATAGTAGATTCAACGGACTGTAACAGAGATGGCGTTGTAATCAGCACAGAGGGGAGTCATGAGTGCTTGATCGGTAACACGACCGTCAAGGTGCATGCATCAGATGAAAGACTGGGCCCTATGCCATGCAGACCTAAAGAGATTGTCTCTAGTGCTGGTCCTGTAAAGAAAACCTCCTGTACATTCAACTACACAAAAACTTTGAAGAACAGGTACTATGAGCCCAGGGACAGCTACTTCCAGCAATATATGCTTAAGGGTGAGTATCAGTACTGGTTTGACCTGGATGCGTGCAACTTCAACGTGTCCGTGGAGGACACCCTGTACGGCGACCACGAGTGCGGTTCTCTGCTGCAGGACGCTGCCCTGTACCTCGTGGACGGCATGACCAACACAATCGAGAACGCCAGGCAGGGCGCTGCTAGGGTGACAAGCTGGCTGGGCAGGCAACTGTCCACCGCTGGCAAGAGGCTGGAGGGCAGGAGCAAGACCTGGTTCGGCGCTTACGCCGGATATATCCCCGAGGCTCCCAGAGACGGCCAGGCCTATGTGAGAAAGGACGGAGAGTGGGTGCTGCTGAGCACCTTTCTGAGCCCCGCCCACCACCATCATCACCATtgatga

E2-2氨基酸序列(Seq ID NO:11)：

METDTLLLWVLLLWVPGSTGRLACKEDYRYAISSTDEIGLLGAGGLTTTWKEYNHDLQLNDGTVKASCVAGSFKVTALNVVSRRYLASLHKKALPTSVTFELLFDGTNPSTEEMGDDFRSGLCPYDTSPVVKGKYNTTLLNGSAFYLVCPIGWTGVIECTAVSPTTLRTEVVKTFRRDKPFPHRMDCVTTIFRRDKPFPHRMDCVTTIVENEDLFYCKLGGNWTCVKGEPVVYTGGVVKQCRWCGFDFDGPDGLPHYPIGKCILAAETGYRIVDSTDCNRDGVVISTEGSHECLIGNTTVKVHASDERLGPMPCRPKEIVSSAGPVKKTSCTFNYTKTLKNRYYEPRDSYFQQYMLKGEYQYWFDLDACNFNVSVEDTLYGDHECGSLLQDAALYLVDGMTNTIENARQGAARVTSWLGRQLSTAGKRLEGRSKTWFGAYAGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLSPAHHHHHH

E2-2基因序列(Seq ID NO:12)：

gccgccaccATGGAAACAGATACACTCCTCCTCTGGGTGCTGCTCCTCTGGGTGCCAGGATCTACAGGACGGCTAGCCTGCAAGGAAGATTACAGGTACGCAATATCGTCAACCGATGAGATAGGGCTACTTGGGGCCGGAGGTCTCACCACCACCTGGAAGGAATACAACCACGATTTGCAACTGAATGACGGGACCGTCAAGGCCAGTTGCGTGGCAGGTTCCTTTAAAGTCACAGCACTTAATGTGGTCAGTAGGAGGTATTTGGCGTCATTGCATAAGAAGGCTTTACCCACTTCCGTGACATTCGAGCTCCTGTTCGACGGGACCAACCCATCAACTGAGGAAATGGGAGATGACTTCAGGTCCGGGCTGTGCCCGTATGATACGAGTCCTGTTGTTAAGGGAAAGTACAATACGACCTTGTTGAACGGTAGTGCTTTCTATCTTGTCTGCCCAATAGGGTGGACGGGTGTCATAGAGTGCACAGCAGTGAGCCCAACAACTCTGAGGACAGAAGTGGTAAAGACCTTCAGGAGAGACAAGCCCTTTCCGCACAGAATGGATTGTGTGACCACCATATTCAGGAGAGACAAGCCC TTTCCGCACAGAATGGATTGTGTGACCACCATAGTGGAAAATGAAGATTTATTCTATTGTAAGCTGGGGGGCAACTGGACATGTGTGAAAGGCGAGCCAGTGGTCTACACAGGGGGGGTAGTAAAACAATGTAGATGGTGTGGCTTCGACTTCGATGGGCCTGACGGACTCCCGCATTACCCCATAGGTAAGTGCATTTTGGCAgcaGAGACAGGTTACAGAATAGTAGATTCAACGGACTGTAACAGAGATGGCGTTGTAATCAGCACAGAGGGGAGTCATGAGTGCTTGATCGGTAACACGACCGTCAAGGTGCATGCATCAGATGAAAGACTGGGCCCTATGCCATGCAGACCTAAAGAGATTGTCTCTAGTGCTGGTCCTGTAAAGAAAACCTCCTGTACATTCAACTACACAAAAACTTTGAAGAACAGGTACTATGAGCCCAGGGACAGCTACTTCCAGCAATATATGCTTAAGGGTGAGTATCAGTACTGGTTTGACCTGGATGCGTGCAACTTCAACGTGTCCGTGGAGGACACCCTGTACGGCGACCACGAGTGCGGTTCTCTGCTGCAGGACGCTGCCCTGTACCTCGTGGACGGCATGACCAACACAATCGAGAACGCCAGGCAGGGCGCTGCTAGGGTGACAAGCTGGCTGGGCAGGCAACTGTCCACCGCTGGCAAGAGGCTGGAGGGCAGGAGCAAGACCTGGTTCGGCGCTTACGCCGGATATATCCCCGAGGCTCCCAGAGACGGCCAGGCCTATGTGAGAAAGGACGGAGAGTGGGTGCTGCTGAGCACCTTTCTGAGCCCCGCCCACCACCATCATCACCATtgatga

E2-3氨基酸序列(Seq ID NO:3)：

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E2-3基因序列(Seq ID NO:4)：

gccgccaccATGGAAACAGATACACTCCTCCTCTGGGTGCTGCTCCTCTGGGTGCCAGGATCTACAGGACGGCTAGCCTGCAAGGAAGATTACAGGTACGCAATATCGTCAACCGATGAGATAGGGCTACTTGGGGCCGGAGGTCTCACCACCACCTGGAAGGAATACAACCACGATTTGCAACTGAATGACGGGACCGTCAAGGCCAGTTGCGTGGCAGGTTCCTTTAAAGTCACAGCACTTAATGTGGTCAGTAGGAGGTATTTGGCGTCATTGCATAAGAAGGCTTTACCCACTTCCGTGACATTCGAGCTCCTGTTCGACGGGACCAACCCATCAACTGAGGAAATGGGAGATGACTTCAGGTCCGGGCTGTGCCCGTATGATACGAGTCCTGTTGTTAAGGGAAAGTACAATACGACCTTGTTGAACGGTAGTGCTTTCTATCTTGTCTGCCCAATAGGGTGGACGGGTGTCATAGAGTGCACAGCAGTGAGCCCAACAACTCTGAGGACAGAAGTGGTAAAGACCTTCAGGAGAGACAAGCCCTTTCCGCACAGAATGAATTGTGTGACCACCATAGTGGAAAATGAAGATTTATTCTATTGTAAGCTGGGGGGCAACTGGACATGTGTGAAAGGCGAGCCAGTGGTCTACACAGGGGGGGTAGTAAAACAATGTAGATGGTGTGGCTTCGACTTCGATGGGCCTGACGGACTCCCGCATTACCCCATAGGTAAGTGCATTTTGGCAgcaGAGACAGGTTACAGAATAGTAGATTCAACGGACTGTAACAGAGATGGCGTTGTAATCAGCACAGAGGGGAGTCATGAGTGCTTGATCGGTAACACGACCGTCAAGGTGCATGCATCAGATGAAAGACTGGGCCCTATGCCATGCAGACCTAAAGAGATTGTCTCTAGTGCTGGTCCTGTAAAGAAAACCTCCTGTACATTCAACTACACAAAAACTTTGAAGAACAGGTACTATGAGCCCAGGGACAGCTACTTCCAGCAATATATGCTTAAGGGTGAGTATCAGTACTGGTTTGACCTGGATGCGTGCAACTTCAACGTGTCCGTGGAGGACACCCTGTACGGCGACCACGAGTGCGGTTCTCTGCTGCAGGACGCTGCCCTGTACCTCGTGGACGGCATGACCAACACAATCGAGAACGCCAGGCAGGGCGCTGCTAGGGTGACAAGCTGGCTGGGCAGGCAACTGTCCACCGCTGGCAAGAGGCTGGAGGGCAGGAGCAAGACCTGGTTCGGCGCTTACGCCGGATATATCCCCGAGGCTCCCAGAGACGGCCAGGCCTATGTGAGAAAGGACGGAGAGTGGGTGCTGCTGAGCACCTTTCTGAGCCCCGCCCACCACCATCATCACCATtgatga

E2-4氨基酸序列(Seq ID NO:5)：

E2-4基因序列(Seq ID NO:6)：

gccgccaccATGGAAACAGATACACTCCTCCTCTGGGTGCTGCTCCTCTGGGTGCCAGGATCTACAGGACGGCTAGCCTGCAAGGAAGATTACAGGTACGCAATATCGTCAACCGATGAGATAGGGCTACTTGGGGCCGGAGGTCTCACCACCACCTGGAAGGAATACAACCACGATTTGCAACTGAATGACGGGACCGTCAAGGCCAGTTGCGTGGCAGGTTCCTTTAAAGTCACAGCACTTAATGTGGTCAGTAGGAGGTATTTGGCGTCATTGCATAAGAAGGCTTTACCCACTTCCGTGACATTCGAGCTCCTGTTCGACGGGACCAACCCATCAACTGAGGAAATGGGAGATGACTTCAGGTCCGGGCTGTGCCCGTATGATACGAGTCCTGTTGTTAAGGGAAAGTACAATACGACCTTGTTGAACGGTAGTGCTTTCTATCTTGTCTGCCCAATAGGGTGGACGGGTGTCATAGAGTGCACAGCAGTGAGCCCAACAACTCTGAGGACAGAAGTGGTAAAGACCTTCAGGAGAGACAAGCCCTTTCCGCACAGAATGAATTGTGTGACCACCATATTCAGGAGAGACAAGCCC TTTCCGCACAGAATGAATTGTGTGACCACCATAGTGGAAAATGAAGATTTATTCTATTGTAAGCTGGGGGGCAACTGGACATGTGTGAAAGGCGAGCCAGTGGTCTACACAGGGGGGGTAGTAAAACAATGTAGATGGTGTGGCTTCGACTTCGATGGGCCTGACGGACTCCCGCATTACCCCATAGGTAAGTGCATTTTGGCAgcaGAGACAGGTTACAGAATAGTAGATTCAACGGACTGTAACAGAGATGGCGTTGTAATCAGCACAGAGGGGAGTCATGAGTGCTTGATCGGTAACACGACCGTCAAGGTGCATGCATCAGATGAAAGACTGGGCCCTATGCCATGCAGACCTAAAGAGATTGTCTCTAGTGCTGGTCCTGTAAAGAAAACCTCCTGTACATTCAACTACACAAAAACTTTGAAGAACAGGTACTATGAGCCCAGGGACAGCTACTTCCAGCAATATATGCTTAAGGGTGAGTATCAGTACTGGTTTGACCTGGATGCGGGATATATCCCCGAGGCTCCCAGAGACGGCCAGGCCTATGTGAGAAAGGACGGAGAGTGGGTGCTGCTGAGCACCTTTCTGAGCCCCGCCCACCACCATCATCACCATtgatga

E2-5氨基酸序列(Seq ID NO:7)：

METDTLLLWVLLLWVPGSTGRLACKEDYRYAISSTDEIGLLGAGGLTTTWKEYNHDLQLNDGTVKASCVAGSFKVTALNVVSRRYLASLHKKALPTSVTFELLFDGTNPSTEEMGDDFRSGLCPYDTSPVVKGKYNTTLLNGSAFYLVCPIGWTGVIECTAVSPTTLRTEVVKTFRRDKPFPHRMNCVTTIVENEDLFYCKLGGNWTCVKGEPVVYTGGVVKQCRWCGFDFDGPDGLPHYPIGKCILAAETGYRIVDSTDCNRDGVVISTEGSHECLIGNTTVKVHASDERLGPMPCRPKEIVSSAGPVKKTSCTFNYTKTLKNRYYEPRDSYFQQYMLKGEYQYWFDLDAHHHHHH

E2-5基因序列(Seq ID NO:8)：

gccgccaccATGGAAACAGATACACTCCTCCTCTGGGTGCTGCTCCTCTGGGTGCCAGGATCTACAGGACGGCTAGCCTGCAAGGAAGATTACAGGTACGCAATATCGTCAACCGATGAGATAGGGCTACTTGGGGCCGGAGGTCTCACCACCACCTGGAAGGAATACAACCACGATTTGCAACTGAATGACGGGACCGTCAAGGCCAGTTGCGTGGCAGGTTCCTTTAAAGTCACAGCACTTAATGTGGTCAGTAGGAGGTATTTGGCGTCATTGCATAAGAAGGCTTTACCCACTTCCGTGACATTCGAGCTCCTGTTCGACGGGACCAACCCATCAACTGAGGAAATGGGAGATGACTTCAGGTCCGGGCTGTGCCCGTATGATACGAGTCCTGTTGTTAAGGGAAAGTACAATACGACCTTGTTGAACGGTAGTGCTTTCTATCTTGTCTGCCCAATAGGGTGGACGGGTGTCATAGAGTGCACAGCAGTGAGCCCAACAACTCTGAGGACAGAAGTGGTAAAGACCTTCAGGAGAGACAAGCCCTTTCCGCACAGAATGAATTGTGTGACCACCATAGTGGAAAATGAAGATTTATTCTATTGTAAGCTGGGGGGCAACTGGACATGTGTGAAAGGCGAGCCAGTGGTCTACACAGGGGGGGTAGTAAAACAATGTAGATGGTGTGGCTTCGACTTCGATGGGCCTGACGGACTCCCGCATTACCCCATAGGTAAGTGCATTTTGGCAgcaGAGACAGGTTACAGAATAGTAGATTCAACGGACTGTAACAGAGATGGCGTTGTAATCAGCACAGAGGGGAGTCATGAGTGCTTGATCGGTAACACGACCGTCAAGGTGCATGCATCAGATGAAAGACTGGGCCCTATGCCATGCAGACCTAAAGAGATTGTCTCTAGTGCTGGTCCTGTAAAGAAAACCTCCTGTACATTCAACTACACAAAAACTTTGAAGAACAGGTACTATGAGCCCAGGGACAGCTACTTCCAGCAATATATGCTTAAGGGTGAGTATCAGTACTGGTTTGACCTGGATGCGCACCACCATCATCACCATtgatga

实施例2SDS-PAGE检测

将实施例1中收获的NE2组、E2-1组、E2-2组、E2-3组和E2-4组的细胞培养物上清进行SDS-PAGE检测，同时将NE2组、E2-1组和E2-2组使用糖苷内切酶EndoH_f处理后进行SDS-PAGE检测，并使用空的CHO细胞作为阴性对照。具体操作如下：取40μL收获的细胞培养物，加入10μL的5×上样缓冲液，沸水浴5分钟，12000r/min离心1分钟，取上清进行SDS-PAGE凝胶(12％浓度凝胶)电泳，电泳后取凝胶经染色、脱色后观察目的条带。

检测结果如图4所示，NE2组、E2-1组、E2-2组、E2-3组和E2-4组在分子量约60kDa、62kDa、58kDa、57kDa和53kDa附近出现目的条带，使用糖苷内切酶EndoH_f处理后的NE2组、E2-1组和E2-2组都在分子量约52kDa附近出现目的条带，阴性对照在对应位置没有条带，说明目的抗原蛋白在重组CHO细胞中得到正确表达。使用糖苷内切酶EndoH_f处理后的NE2组、E2-1组和E2-2组在糖链去除后分子量一致，说明将E2蛋白氨基酸229N位点突变成A，减去了一个N-糖链糖基化位点，而166D位点突变成N，引入了一个N-糖链糖基化位点。

实施例3WesternBlot检测

将实施例2中SDS-PAGE电泳后的产物分别转印到NC(硝酸纤维素)膜上，用5％脱脂牛奶封闭2小时，猪源抗CSFV阳性血清孵育2小时，漂洗，HRP标记的羊抗猪多克隆抗体二抗孵育2小时，漂洗，然后滴加增强型化学发光荧光底物，使用化学发光成像仪拍照。结果如图5所示，图中重组CHO上清样品有细胞条带，阴性对照没有目的条带，说明目的抗原蛋白在重组CHO细胞中得到正确表达。

实施例4蛋白纯化

1、本实施例中的目的蛋白含有his标签，使用镍柱亲和层析纯化NE2目的蛋白。

1.1Ni柱的再生和平衡

0.5mol/L的NaOH反向冲洗Ni柱10min，冲洗结束后，用超纯水正向冲洗。

50mol/L的NiSO₄冲洗5个柱体积。结束后，用超纯水正向冲洗。

用含有300mM咪唑PBS(pH＝7.4)缓冲液冲洗3个柱体积后继续用PBS缓冲液冲洗平衡5个柱体积。

1.2Ni纯化过程

PBS平衡Ni柱后，取培养的上清上样，上样结束后用PBS洗涤5个柱体积至基线平衡。然后分别使用含有50mM、300mM以及500mM咪唑的PBS进行洗脱。结果如图6所示，在300mM咪唑浓度的PBS溶液中洗脱出NE2目的蛋白。以同样的方法纯化得到E2-1蛋白。

2、分子筛层析

以2个层析柱体积分子筛层析缓冲液(0.1mmol/LPB pH7.0)平衡分子筛色谱柱(xk50/100)，分别将上一步纯化的NE2以及E2-1蛋白样品按柱体积的5％上样，用ElutionBuffer(0.1mmol/LPB pH7.0)进行洗脱，流速设为10mL/min，收集目的蛋白所在的主峰，如图7和图8所示。

使用磷钨酸负染观察收集的产物，电镜下观察到NE2组蛋白能够形成三聚体，而E2-1组没有观察到蛋白聚体结构，说明E2蛋白氨基酸229N位点影响了三聚体的形成，所以需将这个位点进行突变，减去一个糖基化位点，电镜结果见图9。

实施例5蛋白含量与琼扩检测

将实施例1中收获的CHO细胞培养上清液中NE2蛋白含量使用Elisa方法检测。操作方式如下：用包被缓冲液稀释猪抗CSFV阳性血清至合适浓度，每孔100μL，4℃过夜，PBST洗涤三次，1％BSA封闭1h。加入不同浓度的抗原标准品(通过镍柱亲和层析，分子筛层析纯化得到的蛋白)和梯度稀释待检样品，37℃孵育1小时，PBST洗三次。每孔加入检测NE2蛋白单克隆抗体，37℃孵育1小时，PBST洗三次。每孔加入二抗-即HRP标记的羊抗猪IgG，37℃孵育1小时，PBST洗三次。TMB显色10分钟，2MH₂SO₄终止反应。酶标仪读数，通过标准曲线计算待检样品中NE2蛋白的量。

按照实施例1大规模制备的NE2蛋白，Elisa检测结果如下，疫苗原液中蛋白的平均含量达到3.7mg/mL。

使用琼扩方法检测表达的NE2蛋白效价，在琼脂糖凝胶板上打梅花孔，在梅花孔中间加入CSFV琼扩检测标准血清，周围分别加入稀释了2的0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次方的表达抗原。倒置孵育72h后观察沉淀线。出现沉淀线的最大稀释比例为其琼扩效价，琼扩效价检测结果显示NE2蛋白琼扩效价为1:512。

实施例6疫苗制备

将实施例1中收获的实验组NE2蛋白细胞培养物上清使用生理盐水进行稀释，使实验组NE2蛋白的浓度达到50μg/mL，然后将上述稀释蛋白按照水油比85：15的比例加入15VG佐剂中，使用搅拌桨1000rpm搅拌5min，质检合格后置于4℃保存。以同样的方法将实施例1中的E2-1组、E2-2组、E2-3组、E2-4组和E2-5组分别制备亚单位疫苗。

实施例7免疫实验

试验一：

用4～5周龄健康易感仔猪70头，随机分为7组，其中6组为免疫组，分别颈部肌肉注射实施例6中制备的6种亚单位疫苗50μg，另外1组为阴性对照组，肌肉注射生理盐水作为对照。首次免疫3周后以相同剂量和途径加强免疫一次。首免后第7、14、21天以及二免后7、14、21天分别进行前腔静脉采血，分离血清，并56℃水浴30min灭活血清，用分离的血清做中和试验。方法如下：将加热灭活完全的血清进行2¹至2¹¹次方的稀释，然后取每个稀释度的每组血清分别加入96孔板中，50μL/孔，每个平行组设3个复孔，然后每个血清稀释空中加入50μL(100TCID₅₀/50μL)CSFV石门株病毒液，振荡混匀，37℃、5％CO₂条件下反应1h后将1.0×10⁴个PK15细胞加入96孔板中，轻轻振荡混匀后，细胞在37℃、5％CO₂条件下静置培养3天，丙酮固定过夜。用PBS漂洗3遍，吸干，然后用CSFV荧光抗体液染色检测，有典型绿色荧光信号的孔表示未中和。中和抗体滴度结果见图10。

试验二：

六孔板中分别包被纯化的Erns全长蛋白以及其N端片段(氨基酸序列：RSLHGIWPGKICKGVPTHLATDVELKEIQGMMDASEGTNYTCCKLQRHEWNKHGWCNW HNIDPWIQLMNRTQADLAEGPPVKECAVTCRYDKDADINVVTQARNRPTTLTGCKKGKNF SFAGTVIESP)，每孔0.5μg，将试验一中免疫35天后采血分离的NE2组和E2-4组血清稀释500倍，每孔100μL加入酶标板中，平行加样3个孔，同时设置阴性对照组以及阳性对照组。轻振酶标板混匀空中样品，37℃孵育1小时。弃去孔中溶液，PBST洗涤液清洗3～5次。然后每孔加入HRP标记的羊抗猪二抗(0.5ug/mL)酶结合物100μL，37℃孵育1小时。再弃去溶液、清洗，每孔加入酶显色底物100μL，室温避光反应10～15分钟。每孔加入100μL终止液，将酶标板置于酶标仪测定450nm吸光度值(OD_450nm)，计算Elisa效价((样品-阴性对照)/(阳性对照-阴性对照))，结果如表6所示。

表6

结论：NE2组样品使用Erns全长蛋白作为包被抗原检测出抗体阳性；而E2-4组检测结果为阴性，没有检测出抗体。当使用Erns蛋白的N端片段作为包被抗原时，两组样品的血清都是抗体阴性。

实施例8耐受性实验

用4～5周龄健康仔猪150头，随机分为3组，分别免疫实施例6中制备的NE2、E2-1、E2-2组亚单位疫苗。每组分为5小组，每小组10只，分别以500μg/头、200μg/头、100μg/头、50μg/头、25μg/头的剂量颈部肌肉注射仔猪。注射后连续观察15日，观察各组仔猪情况，发现NE2组疫苗免疫仔猪都无任何不良反应，其余各组疫苗的免疫剂量到达一定剂量时，部分仔猪出现全身颤抖、呕吐、身体通红、站立不稳、呼吸困难等症状，诊断为因注射疫苗引发的过敏反应。具体结果见表7。

表7

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 苏州世诺生物技术有限公司

<120> 猪瘟病毒重组抗原及其制备方法和应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 477

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Arg Leu Ala Cys Lys Glu Asp Tyr Arg Tyr Ala Ile

20 25 30

Ser Ser Thr Asp Glu Ile Gly Leu Leu Gly Ala Gly Gly Leu Thr Thr

35 40 45

Thr Trp Lys Glu Tyr Asn His Asp Leu Gln Leu Asn Asp Gly Thr Val

50 55 60

Lys Ala Ser Cys Val Ala Gly Ser Phe Lys Val Thr Ala Leu Asn Val

65 70 75 80

Val Ser Arg Arg Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys Lys Ala Leu Pro Thr

85 90 95

Ser Val Thr Phe Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr Asn Pro Ser Thr Glu

100 105 110

Glu Met Gly Asp Asp Phe Arg Ser Gly Leu Cys Pro Tyr Asp Thr Ser

115 120 125

Pro Val Val Lys Gly Lys Tyr Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Ser Ala

130 135 140

Phe Tyr Leu Val Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Val Ile Glu Cys Thr

145 150 155 160

Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val Val Lys Thr Phe Arg

165 170 175

Arg Asp Lys Pro Phe Pro His Arg Met Asn Cys Val Thr Thr Ile Phe

180 185 190

Arg Arg Asp Lys Pro Phe Pro His Arg Met Asn Cys Val Thr Thr Ile

195 200 205

Val Glu Asn Glu Asp Leu Phe Tyr Cys Lys Leu Gly Gly Asn Trp Thr

210 215 220

Cys Val Lys Gly Glu Pro Val Val Tyr Thr Gly Gly Val Val Lys Gln

225 230 235 240

Cys Arg Trp Cys Gly Phe Asp Phe Asp Gly Pro Asp Gly Leu Pro His

245 250 255

Tyr Pro Ile Gly Lys Cys Ile Leu Ala Ala Glu Thr Gly Tyr Arg Ile

260 265 270

Val Asp Ser Thr Asp Cys Asn Arg Asp Gly Val Val Ile Ser Thr Glu

275 280 285

Gly Ser His Glu Cys Leu Ile Gly Asn Thr Thr Val Lys Val His Ala

290 295 300

Ser Asp Glu Arg Leu Gly Pro Met Pro Cys Arg Pro Lys Glu Ile Val

305 310 315 320

Ser Ser Ala Gly Pro Val Lys Lys Thr Ser Cys Thr Phe Asn Tyr Thr

325 330 335

Lys Thr Leu Lys Asn Arg Tyr Tyr Glu Pro Arg Asp Ser Tyr Phe Gln

340 345 350

Gln Tyr Met Leu Lys Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp Leu Asp Ala

355 360 365

Cys Asn Phe Asn Val Ser Val Glu Asp Thr Leu Tyr Gly Asp His Glu

370 375 380

Cys Gly Ser Leu Leu Gln Asp Ala Ala Leu Tyr Leu Val Asp Gly Met

385 390 395 400

Thr Asn Thr Ile Glu Asn Ala Arg Gln Gly Ala Ala Arg Val Thr Ser

405 410 415

Trp Leu Gly Arg Gln Leu Ser Thr Ala Gly Lys Arg Leu Glu Gly Arg

420 425 430

Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro

435 440 445

Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu

450 455 460

Ser Thr Phe Leu Ser Pro Ala His His His His His His

465 470 475

<210> 2

<211> 1446

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gccgccacca tggaaacaga tacactcctc ctctgggtgc tgctcctctg ggtgccagga 60

tctacaggac ggctagcctg caaggaagat tacaggtacg caatatcgtc aaccgatgag 120

atagggctac ttggggccgg aggtctcacc accacctgga aggaatacaa ccacgatttg 180

caactgaatg acgggaccgt caaggccagt tgcgtggcag gttcctttaa agtcacagca 240

cttaatgtgg tcagtaggag gtatttggcg tcattgcata agaaggcttt acccacttcc 300

gtgacattcg agctcctgtt cgacgggacc aacccatcaa ctgaggaaat gggagatgac 360

ttcaggtccg ggctgtgccc gtatgatacg agtcctgttg ttaagggaaa gtacaatacg 420

accttgttga acggtagtgc tttctatctt gtctgcccaa tagggtggac gggtgtcata 480

gagtgcacag cagtgagccc aacaactctg aggacagaag tggtaaagac cttcaggaga 540

gacaagccct ttccgcacag aatgaattgt gtgaccacca tattcaggag agacaagccc 600

tttccgcaca gaatgaattg tgtgaccacc atagtggaaa atgaagattt attctattgt 660

aagctggggg gcaactggac atgtgtgaaa ggcgagccag tggtctacac agggggggta 720

gtaaaacaat gtagatggtg tggcttcgac ttcgatgggc ctgacggact cccgcattac 780

cccataggta agtgcatttt ggcagcagag acaggttaca gaatagtaga ttcaacggac 840

tgtaacagag atggcgttgt aatcagcaca gaggggagtc atgagtgctt gatcggtaac 900

acgaccgtca aggtgcatgc atcagatgaa agactgggcc ctatgccatg cagacctaaa 960

gagattgtct ctagtgctgg tcctgtaaag aaaacctcct gtacattcaa ctacacaaaa 1020

actttgaaga acaggtacta tgagcccagg gacagctact tccagcaata tatgcttaag 1080

ggtgagtatc agtactggtt tgacctggat gcgtgcaact tcaacgtgtc cgtggaggac 1140

accctgtacg gcgaccacga gtgcggttct ctgctgcagg acgctgccct gtacctcgtg 1200

gacggcatga ccaacacaat cgagaacgcc aggcagggcg ctgctagggt gacaagctgg 1260

ctgggcaggc aactgtccac cgctggcaag aggctggagg gcaggagcaa gacctggttc 1320

ggcgcttacg ccggatatat ccccgaggct cccagagacg gccaggccta tgtgagaaag 1380

gacggagagt gggtgctgct gagcaccttt ctgagccccg cccaccacca tcatcaccat 1440

tgatga 1446

<210> 3

<211> 460

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Arg Leu Ala Cys Lys Glu Asp Tyr Arg Tyr Ala Ile

20 25 30

Ser Ser Thr Asp Glu Ile Gly Leu Leu Gly Ala Gly Gly Leu Thr Thr

35 40 45

Thr Trp Lys Glu Tyr Asn His Asp Leu Gln Leu Asn Asp Gly Thr Val

50 55 60

Lys Ala Ser Cys Val Ala Gly Ser Phe Lys Val Thr Ala Leu Asn Val

65 70 75 80

Val Ser Arg Arg Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys Lys Ala Leu Pro Thr

85 90 95

Ser Val Thr Phe Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr Asn Pro Ser Thr Glu

100 105 110

Glu Met Gly Asp Asp Phe Arg Ser Gly Leu Cys Pro Tyr Asp Thr Ser

115 120 125

Pro Val Val Lys Gly Lys Tyr Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Ser Ala

130 135 140

Phe Tyr Leu Val Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Val Ile Glu Cys Thr

145 150 155 160

Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val Val Lys Thr Phe Arg

165 170 175

Arg Asp Lys Pro Phe Pro His Arg Met Asn Cys Val Thr Thr Ile Val

180 185 190

Glu Asn Glu Asp Leu Phe Tyr Cys Lys Leu Gly Gly Asn Trp Thr Cys

195 200 205

Val Lys Gly Glu Pro Val Val Tyr Thr Gly Gly Val Val Lys Gln Cys

210 215 220

Arg Trp Cys Gly Phe Asp Phe Asp Gly Pro Asp Gly Leu Pro His Tyr

225 230 235 240

Pro Ile Gly Lys Cys Ile Leu Ala Ala Glu Thr Gly Tyr Arg Ile Val

245 250 255

Asp Ser Thr Asp Cys Asn Arg Asp Gly Val Val Ile Ser Thr Glu Gly

260 265 270

Ser His Glu Cys Leu Ile Gly Asn Thr Thr Val Lys Val His Ala Ser

275 280 285

Asp Glu Arg Leu Gly Pro Met Pro Cys Arg Pro Lys Glu Ile Val Ser

290 295 300

Ser Ala Gly Pro Val Lys Lys Thr Ser Cys Thr Phe Asn Tyr Thr Lys

305 310 315 320

Thr Leu Lys Asn Arg Tyr Tyr Glu Pro Arg Asp Ser Tyr Phe Gln Gln

325 330 335

Tyr Met Leu Lys Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp Leu Asp Ala Cys

340 345 350

Asn Phe Asn Val Ser Val Glu Asp Thr Leu Tyr Gly Asp His Glu Cys

355 360 365

Gly Ser Leu Leu Gln Asp Ala Ala Leu Tyr Leu Val Asp Gly Met Thr

370 375 380

Asn Thr Ile Glu Asn Ala Arg Gln Gly Ala Ala Arg Val Thr Ser Trp

385 390 395 400

Leu Gly Arg Gln Leu Ser Thr Ala Gly Lys Arg Leu Glu Gly Arg Ser

405 410 415

Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg

420 425 430

Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser

435 440 445

Thr Phe Leu Ser Pro Ala His His His His His His

450 455 460

<210> 4

<211> 1395

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4