一种辣椒疫霉侵染植物相关蛋白及其应用
阅读说明：本技术 一种辣椒疫霉侵染植物相关蛋白及其应用 (Phytophthora capsici infected plant-related protein and application thereof ) 是由 张修国 李京 朱春原 艾聪聪 于 2019-08-21 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物技术领域,具体的说涉及一种辣椒疫霉侵染植物相关蛋白及其应用。所述蛋白质,是如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：A1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质或氨基酸序列是序列表1中第19-384位的蛋白质；A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且与叶片细胞坏死和/或辣椒疫霉侵染相关的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。所述蛋白质及其应用能够为有效利用植物的抗病机制设计防治辣椒疫病的新策略提供了理论依据。(The invention relates to the technical field of biology, in particular to phytophthora capsici infected plant related protein and application thereof. The protein is the protein of A1), A2) or A3) as follows: A1) the protein of which the amino acid sequence is the sequence 1 in the sequence table or the protein of which the amino acid sequence is the 19 th to 384 th sites in the sequence table 1; A2) protein which is obtained by substituting and/or deleting and/or adding one or more amino acid residues of the amino acid sequence shown in the sequence 1 in the sequence table, has more than 90% of identity with the protein shown in A1), and is related to leaf cell necrosis and/or phytophthora capsici infection; A3) a fusion protein obtained by connecting protein tags at the N-terminal or/and the C-terminal of A1) or A2). The protein and the application thereof can provide theoretical basis for designing a new strategy for preventing and treating the pepper phytophthora blight by effectively utilizing the disease resistance mechanism of plants.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的说涉及一种辣椒疫霉侵染植物相关蛋白及其应用。
背景技术
辣椒疫霉菌属于卵菌，是一种带有破坏性的丝状植物病原体，对植物特别是双子叶植物有比较强的致病性(Margulis and Schwartz.,2000)。
辣椒疫霉属于卵菌门卵菌纲霜霉目疫霉科疫霉属，
辣椒疫霉病原菌通常以卵孢子在土壤中或病残体中进行越冬，借助风、水及其他农事活动传播病害(郑玲等,2007)。发病后能够产生新的孢子囊，形成游动孢子进行 再侵染。病菌生育温度范围为10-37℃，最适宜温度为20-30℃。在重茬、低洼地、排 水不良等坏境下，密度过大、植株衰弱等地区均有利于该病的发生和蔓延。
辣椒疫病的病原物卵孢子存活的时间最高可达到3年左右，病原菌主要以卵孢子的形式在土壤中和病残体上越冬，以便度过温度较低、环境不适宜的季节。春天到来 后，在适宜的温度和湿度条件下卵孢子将会开始萌发，能较快的产生游动孢子，侵入 辣椒的根部、茎基部和叶部等(Lamour and Hausbeck.,2001)。在辣椒植株的生长期 间，病原菌将陆续产生孢子囊和游动孢子，借助风、雨水、土壤等传播，进行多次再 侵染(Ristaino etal.,1991；Ristain et al.,1992；Ristain0et al.,1993；Schlub et al., 1983；Springeret al.,1982)。
当前辣椒疫病的防治工作仍以传统的化学药剂防治为主。防治辣椒疫霉引起的重金属超标及农药残留这一些列问题给人类健康、环境安全带来了巨大的威胁。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是如何抑制辣椒疫霉侵染植物和/或提供辣椒疫霉侵染植物相关蛋白。
本发明提供一种蛋白质，是如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：
A1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；
A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且与叶片细胞坏 死和/或辣椒疫霉侵染相关的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
其中，所述A2为如下A21、A22、A23、A24、A25或A26，其中：
A21、氨基酸序为序列3所示的氨基酸序列的蛋白质；
A22、氨基酸序为序列3中第19-384位所示的氨基酸序列的蛋白质；
A23、氨基酸序为序列3所示的氨基酸序列的蛋白质；
A24、氨基酸序为序列3中第19-384位所示的氨基酸序列的蛋白质；
A25、氨基酸序为序列3所示的氨基酸序列的蛋白质；
A26、氨基酸序为序列3中第19-384位所示的氨基酸序列的蛋白质。
所述A21为将序列1中第34-36位的氨基酸由GAL替换为DTD，将第41位的氨 基酸由T替换为A，将第46位的氨基酸由T替换为N，将第93位的氨基酸由K替换 为R，将第320位的氨基酸由M替换为P，保持序列1的其他氨基酸序列不变；
所述A23为将序列1中第34-36位的氨基酸由GAL替换为DTD，将第41位的氨 基酸由T替换为A，将第46位的氨基酸由T替换为N，将第93位的氨基酸由K替换 为R，保持序列1的其他氨基酸序列不变；
所述A25为将序列1中第34-36位的氨基酸由GAL替换为DTD，将第41位的氨 基酸由T替换为A，将第46位的氨基酸由T替换为N，将第93位的氨基酸由K替换 为R；将第221位的氨基酸由K替换为E，将第284位的氨基酸由Q替换为R，保持 序列1的其他氨基酸序列不变。
其中，所述A3中的融合蛋白为如下A31、A32、A33或A34，其中：
A31、氨基酸序为序列9所示的氨基酸序列的蛋白质；
A32、氨基酸序为序列9中第19-394位所示的氨基酸序列的蛋白质；
A33、氨基酸序为序列11所示的氨基酸序列的蛋白质；
A34、氨基酸序为序列11中第19-398位所示的氨基酸序列的蛋白质。
本发明还提供了与所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B9)中的任一种：
B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生 物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转 基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基 因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因 植物器官。
其中，B1)所述核酸分子为核苷酸为R如下B101、B102、B103、B104、B105、B106、B107、B108、B109、B109、B110、B111、B112：
B101、序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；
B102、序列表中序列2中第55-1152位的cDNA分子或DNA分子；
B103、序列表中序列4的cDNA分子或DNA分子；
B104、是序列表中序列4中第55-1152位的cDNA分子或DNA分子；
B105、序列表中序列6的cDNA分子或DNA分子；
B106、序列表中序列6中第55-1152位的cDNA分子或DNA分子；
B107、序列表中序列8的cDNA分子或DNA分子；
B108、序列表中序列8中第55-1152位的cDNA分子或DNA分子；
B109、序列表中序列10的cDNA分子或DNA分子；
B110、序列表中序列10中第55-1182的cDNA分子或DNA分子；
B111、序列表中序列12的cDNA分子或DNA分子；
B112、序列表中序列10中第55-1194的cDNA分子或DNA分子。
所述蛋白质、所述生物材料的下述P1-P9中的任一种应用也应在本发明的保护范围之中：
P1、权利要求1所述蛋白质、或权利要求2或3所述生物材料在调控植物叶片细 胞坏死中的应用；
P2、权利要求1所述蛋白质、或权利要求2或3所述生物材料在制备减少植物叶 片坏死的产品中的应用；
P3、权利要求1所述蛋白质、或权利要求2或3所述生物材料在培育减少植物叶 片坏死植物中的应用；
P4、权利要求1所述蛋白质、或权利要求2或3所述生物材料在制备减少植物叶 片坏死产品中的应用；
P5、权利要求1所述蛋白质、或权利要求2或3所述生物材料在调控植物辣椒疫 霉侵染中的应用；
P6、权利要求1所述蛋白质、或权利要求2或3所述生物材料在制备提高植物抗 辣椒疫霉侵染的产品中的应用；
P7、权利要求1所述蛋白质、或权利要求2或3所述生物材料在培育抗辣椒疫霉 侵染植物中的应用；
P8、权利要求1所述蛋白质、或权利要求2或3所述生物材料在制备植物抗辣椒 疫霉侵染产品中的应用；
P9、权利要求1所述蛋白质、或权利要求2或3所述生物材料在植物育种中的应 用。
其中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
其中，权利要求4中所述植物为本氏烟或者辣椒。
本发明的有益效果在于，本发明中的RxLR23不仅能在本氏烟上引起轻微的细胞坏死，在辣椒上也能引起比较明显的坏死，从后续的一些实验结果看，RxLR23在本 氏烟、辣椒瞬时表达后1-3d左右开始出现坏死的症状，3-5d左右就可以在辣椒叶片上 形成灰褐色的坏死斑，并且坏死斑没有扩大，属于比较明显的细胞死亡反应。RxLR23 的同源基因RxLR3-1、RxLR6-2和RxLR8-2也能引起本氏烟和辣椒叶片的坏死，但因 为个别氨基酸位点的改变，其功能与RxLR23存在着一些差别；RxLR23同源基因因 为前段氨基酸序列的改变，导致其亚细胞定位发生了一定的变化；效应因子RxLR23 在植株中前期表达量比较高。RxLR23引发细胞坏死的功能主要集中在细胞核里， RxLR23核定位的不同对辣椒疫霉的侵染有影响，对应的其融合蛋白RxLR23NLS和 RxLR23NES的差异对辣椒疫霉的侵染也有一定的影响，例如融合蛋白RxLR23NLS能 够抑制辣椒疫霉的侵染。从而为有效利用植物的抗病机制设计防治辣椒疫病的新策略 提供了理论依据。
附图说明
图1为PCR电泳结果图，其中M：marker 2000；泳道1-2：RxLR23；泳道3-4：RxLR3-1；泳道5-6：RxLR6-2；泳道7-8：RxLR8-2；
图2PCR电泳结果图，其中，M：marker 2000；泳道1-2：RxLR23；泳道3-4：RxLR3-1；泳道5-6：RxLR6-2；泳道7-8：RxLR8-2；泳道9-10：RxLR23:NES；
图3.RxLR23的表达模式分析图；
图4.Western blot检测效应基因的蛋白表达图；
图5.RxLR效应因子在本氏烟上的致病性功能分析，其中，图a：1：RxLR3-1，2：RxLR23，3：INF1，4：空载GFP，5：MgCl2；图b：1：RxLR6-2，2：RxLR23，3： INF1，4：空载GFP，5：MgCl2；图c：1：RxLR8-2，2：INF1，3：空载GFP，4： MgCl2；
图6.效应因子接种本氏烟叶片坏死面积统计；
图7.RxLR效应因子在辣椒上的致病性功能研究图，其中，图a：1：RxLR23，2：INF1，3：pBIN-GFP，4：MgCl2；图b：1：RxLR3-1，2：RxLR23，3：INF1，4：空载GFP，5： MgCl2；图c：1：RxLR6-2，2：RxLR23，3：INF1，4：GFP；5：MgCl2；图d：1：RxLR8-2， 2：RxLR23，3：INF1，4：pBIN-GFP，5：MgCl2；
图8.效应因子接种辣椒叶片坏死面积统计；
图9.效应因子对辣椒疫霉侵染状况的影响；
图10.效应因子游动孢子侵染面积统计
图11.效应因子对辣椒疫霉侵染的荧光定量分析q-pcr；
图12.RxLR效应因子在辣椒上的致病性功能研究，其中，图e：1：RxLR:NLS，2：RxLR23，3：INF1，4：pBIN-GFP，5：MgCl2。图f：1：RxLR:NES，2：RxLR23，3： INF1，4：pBIN-GFP，5：MgCl2；
图13.效应因子接种辣椒叶片坏死面积统计；
图14.Western blot检测效应基因的蛋白表达；
图15.效应因子对辣椒疫霉侵染的影响；
图16.效应因子对辣椒疫霉侵染的面积统计；
图17.效应因子对辣椒疫霉侵染的荧光定量分析q-pcr。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域 普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用 的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
载体和菌株
实验所用的克隆载体pEASY-T3 clone Vector购自北京全式金生物技术有限公司， 植物表达载体pBIN-GFP2(在“A Virulence Essential CRN Effector ofPhytophthora capsici Suppresses Host Defense and Induces Cell Death inPlantNucleus”文献中公开过， 公众可以从窦道龙教授实验室获得)，pYF2-PsNLS-hSpCas9、pYF2.3G-Ribo-sgRNA (在“A Phytophthora capsici Effector Targets ACD11Binding Partners that Regulate ROS-Mediated Defense Response inArabidopsis”文献中公开过，可以从窦道龙教授实验 室获得)，pBluescriptII KS+载体购自铂尚生物技术有限公司。
大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司， 农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101购自TransGen Biotechcorporation 公司。
辣椒疫霉菌株SD33(辣椒疫霉菌SD33)(Yong Jian Jia,Bao Zhen Feng,Wen XiuSun andXiu Guo Zhang，J.Phytopathol,157:585-591,2009)，公众可从山东农业大学获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使 用。
辣椒疫霉菌Jul0201、辣椒疫霉菌Aug0202、辣椒疫霉菌Jul0306(Geneticdiversity in phytophthora capsici from eastern China，2008)公众可从山东农业大学获得该 生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
本发明中的具体实施例中涉及的引物如表1所示：
表1引物表：
实施例1、RxLR23基因、RxLR3-1基因、RxLR6-2基因和RxLR8-2基因的克隆
1、辣椒疫霉RxLR效应分子的生物信息学分析及基本理化性质分析
2012年KurtH.Lamour教授通过生物信息学分析预测了辣椒疫霉中大约有357个效应因子，其中大多数具有高度的多态性。根据辣椒疫霉全基因组数据库 (http://genome.jgi-psf.org/PhycaF7/PhycaF11.download.html)以及他们的保守基序 RxLR来筛选RxLR效应分子，从公布的辣椒疫霉的全基因组中 (http://genome.jgi-psf.org/PhycaF7/PhycaF11.download.html)选择了其中的RxLR84、RxLR23、RxLR3-1、RxLR6-2、RxLR8-2等效应因子，分别利用DNAMAN将这5个 RxLR效应因子进行了序列比对，确定了在辣椒疫霉的基因组中，这五个RxLR效应 因子是唯一的，并且，RxLR3-1、RxLR6-2、RxLR8-2这三个效应因子与RxLR23具有 同源性，为此，我们开展实验进行研究。
2、RxLR23基因、RxLR3-1基因、RxLR6-2基因和RxLR8-2基因的克隆 RxLR23基因的克隆：以本实验室保存的辣椒疫霉SD33菌株的总DNA为模板，设计 特异性的引物(引物F和引物R)，利用引物F(5′-ATGCGTCTTCATTATATCGTTG-3′)和 引物R(5′-CTACGCCGCCGCCTTATA-3′)PCR扩增RxLR23基因，将反应的PCR产物用 1.2％的琼脂糖凝胶进行电泳。
RxLR3-1基因的克隆：以本实验室保存的辣椒疫霉菌Jul0201的总DNA为模板， 设计特异性的引物(引物F和引物R)，利用引物F(5′-ATGCGTCTTCATTATATCGTTG-3′) 和引物R(5′-CTACGCCGCCGCCTTATA-3′)PCR扩增RxLR3-1基因，将反应的PCR产 物用1.2％的琼脂糖凝胶进行电泳。
RxLR6-2基因的克隆：以本实验室保存的辣椒疫霉菌Aug0202的总DNA为模板， 设计特异性的引物(引物F和引物R)，利用引物F(5′-ATGCGTCTTCATTATATCGTTG-3′) 和引物R(5′-CTACGCCGCCGCCTTATA-3′)PCR扩增RxLR6-2基因，将反应的PCR产 物用1.2％的琼脂糖凝胶进行电泳。
RxLR8-2基因的克隆：以本实验室保存的辣椒疫霉菌Jul0306的总DNA为模板， 设计特异性的引物(引物F和引物R)，利用引物F(5′-ATGCGTCTTCATTATATCGTTG-3′) 和引物R(5′-CTACGCCGCCGCCTTATA-3′)PCR扩增RxLR8-2基因，将反应的PCR产 物用1.2％的琼脂糖凝胶进行电泳。
电泳结果如图1所示，图1中，M表示标志物，1-8均为扩正产物的电泳条带， 电泳结果显示得到大小为1500bp左右的目的条带。
将目的条带切下放入1.5mL离心管中进行胶回收，将回收产物连接到pEASY-T3 载体上得到重组载体，将重组载体分别转化大肠杆菌DH5α，12-16h后，长出单克隆 菌斑，挑单斑进行菌液PCR验证，将目的条带大小正确的菌液送去测序。测序回来， 序列结果比对正确后，吸取菌液进行扩大培养。然后进行菌液的保存以及质粒的提取， 得到连接pEASY-T3重组载体的cDNA质粒，将含有RxLR23的pEASY-T3重组质粒 命名为pEASY-T3-RxLR23，将含有RxLR3-1的pEASY-T3重组质粒命名为 pEASY-T3-RxLR3-1，将含有RxLR6-2的pEASY-T3重组质粒命名为 pEASY-T3-RxLR6-2，将含有RxLR8-2的pEASY-T3重组质粒命名为 pEASY-T3-RxLR8-2。
测序结果表明，RxLR23基因的核苷酸序列如序列2所示，编码氨基酸序列如序 列1所示的RxLR23的氨基酸序列如序列1所示，其对应的编码基因的DNA序列如 序列2所示，辣椒疫霉效应因子RxLR23的核苷酸序列全长1155bp，最大开放阅读 框ORF有1155bp，编码区有一个384个氨基酸的蛋白质，软件预测蛋白质大小约为 42kDa，利用信号肽网站进行预测(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，效应因子 RxLR23的信号肽为序列1的1-18个氨基酸。序列1的第19-384位为成熟蛋白质的氨 基酸序列。
所述辣椒疫霉效应因子RxLR3-1的核苷酸序列全长1182bp，最大开放阅读框ORF有1182bp，编码有一个393个氨基酸的蛋白质，软件预测蛋白质大小约为42kDa，利 用信号肽网站进行预测(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，效应因子RxLR3-1的 信号肽为前端1-22个氨基酸。所述RxLR3-1的成熟蛋白的氨基酸序列为
所述辣椒疫霉效应基因RxLR6-2的核苷酸序列全长1158bp，最大开放阅读框ORF有1158bp，编码有385个氨基酸的蛋白质，软件预测蛋白质大小约为42kDa，利用信 号肽网站进行预测。(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，效应基因RxLR6-2的信 号肽为前端1-14个氨基酸。所述RxLR3-1的成熟蛋白的氨基酸序列为
效应基因RxLR8-2的核苷酸序列全长为1173bp，最大开放阅读框ORF有1173bp， 编码有390个氨基酸的蛋白质，利用软件预测的蛋白质大小约为42kDa，用信号肽网 站预测(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，发现前端1-19个氨基酸是信号肽。所 述RxLR3-1的成熟蛋白的氨基酸序列为
4、RxLR23表达模式分析：分别提取辣椒疫霉标准菌株SD33在辣椒中侵染的各 个时期的cDNA为模板，用辣椒疫霉菌丝(MY)作为对照，PcActin为参比，检测 RxLR23在1.5h、3h、6h、12h、24h、48h和72h的表达量，结果如图3所示，结果显 示，RxLR23在前期1.5h有一个比较高的表达量，之后明显的下调，3h后又开始出现 一个比较明显的上调，并且在12h的时候表达量达到最大，随后表达量又开始下调， 并且在72h的时候达到检测时间段的最低值，效应因子的表达模式分析为接下来的实 验提供了重要的依据。
5、表达载体的构建
以pEASY-T3-RxLR23为模板，以pBIN-RxLR23-F-Kpnl、pBIN-RxLR23-R-BamH I为引物，扩增成熟基因，将扩增后的产物进行电泳，并回收，得到胶回收产物，对 胶回收产物和pBIN-GFP2载体使用Kpn I和BamH I内切酶进行酶切，然后用SolutionI 进行连接。得到含有RxLR23成熟基因的pBIN-GFP2重组载体，将其命名为 pBIN-GFP2-RxLR23重组载体。pBIN-GFP2-RxLR23是将pBIN-GFP2的Kpn I和BamH I识别位点识别位点间的片段替换为RxLR23成熟基因(编码序列表中序列1中第 19-384位氨基酸组成的成熟蛋白质)并保持pBIN-GFP2的其它序列不变得到的重组 表达载体。
以pEASY-T3-RxLR3-1为模板，以pBIN-RxLR3-1-F-Kpnl、 pBIN-RxLR3-1-R-BamH I为引物，扩增-RxLR3-1成熟基因，将扩增后的产物进行电泳， 并回收，得到胶回收产物，对胶回收产物和pBIN-GFP2载体使用Kpn I和BamH I内 切酶进行酶切，然后用SolutionI进行连接。得到含有RxLR3-1成熟基因的pBIN-GFP2 重组载体，将其命名为pBIN-GFP2-RxLR3-1重组载体。pBIN-GFP2-RxLR3-1是将 pBIN-GFP2的Kpn I和BamH I识别位点识别位点间的片段替换为RxLR3-1成熟基因 (编码序列表中序列3中第19-384位氨基酸组成的成熟蛋白质)并保持pBIN-GFP2 的其它序列不变得到的重组表达载体。
以pEASY-T3-RxLR6-2为模板，以pBIN-RxLR6-2-F-Kpnl、 pBIN-RxLR6-2-R-BamH I为引物，扩增RxLR6-2成熟基因，将扩增后的产物进行电泳， 并回收，得到胶回收产物，对胶回收产物和pBIN-GFP2载体使用Kpn I和BamH I内 切酶进行酶切，然后用SolutionI进行连接。得到含有RxLR6-2成熟基因的pBIN-GFP2 重组载体，将其命名为pBIN-GFP2-RxLR6-2重组载体。pBIN-GFP2-RxLR6-2是将 pBIN-GFP2的Kpn I和BamH I识别位点识别位点间的片段替换为RxLR6-2成熟基因 (编码序列表中序列5中第19-384位氨基酸组成的成熟蛋白质)并保持pBIN-GFP2 的其它序列不变得到的重组表达载体。
以pEASY-T3-RxLR8-2为模板，以pBIN-RxLR8-2-F-Kpnl、 pBIN-RxLR8-2-R-BamH I为引物，扩增RxLR8-2成熟基因，将扩增后的产物进行电泳， 并回收，得到胶回收产物，对胶回收产物和pBIN-GFP2载体使用Kpn I和BamH I内 切酶进行酶切，然后用SolutionI进行连接。得到含有RxLR8-2成熟基因的pBIN-GFP2 重组载体，将其命名为pBIN-GFP2-RxLR8-2重组载体。pBIN-GFP2-RxLR8-2是将 pBIN-GFP2的Kpn I和BamH I识别位点识别位点间的片段替换为RxLR8-2成熟基因 (编码序列表中序列7中第19-384位氨基酸组成的成熟蛋白质)并保持pBIN-GFP2 的其它序列不变得到的重组表达载体。
以pEASY-T3-RxLR23为模板，以pBIN-RxLR23NLS-F-Kpnl、 pBIN-RxLR23NLS-R-Kpnl为引物，扩增RxLR23成熟基因，将扩增后的产物进行电泳， 并回收，得到胶回收产物，对胶回收产物和pBIN-GFP2载体使用Kpn I和BamH I内切 酶进行酶切，然后用SolutionI进行连接。得到含有RxLR23NLS融合蛋白编码基因的 pBIN-GFP2重组载体，将其命名为pBIN-GFP2-RxLR23NLS重组载体。 pBIN-GFP2-RxLR23NLS是将pBIN-GFP2的Kpn I和BamH I识别位点识别位点间的片段 替换为带有序列10第55-1182位的核苷酸序列(编码序列表中序列9中第19-394位 氨基酸组成的融合蛋白质)并保持pBIN-GFP2的其它序列不变得到的重组表达载体。
以pEASY-T3-RxLR23为模板，以pBIN-RxLR23NES-F-Kpnl、 pBIN-RxLR23NES-R-Kpnl为引物，扩增RxLR23成熟基因，将扩增后的产物进行电泳， 并回收，得到胶回收产物，对胶回收产物和pBIN-GFP2载体使用Kpn I和BamH I内切 酶进行酶切，然后用SolutionI进行连接。得到含有RxLR23NES融合蛋白编码基因的 pBIN-GFP2重组载体，将重组载体命名为pBIN-GFP2-RxLR23NES。pBIN-GFP2-RxLR23NES 是将pBIN-GFP2的Kpn I和BamH I识别位点识别位点间的片段替换为带有序列12中 第55-1194(编码序列表中序列11中第19-398位氨基酸组成的融合蛋白质)并保持 pBIN-GFP2的其它序列不变得到的重组表达载体。
6、农杆菌介导的辣椒疫霉RxLR效应分子瞬时表达
瞬时表达载体的构建
将制备好的重组载体pBIN-GFP2-RxLR2导入农杆菌GV3101感受态中，得到重组 农杆菌，将其命名为农杆菌-RxLR23。
将制备好的重组载体pBIN-GFP2-RxLR3-1导入农杆菌GV3101感受态中，得到重 组农杆菌，将其命名为农杆菌-RxLR3-1。
将制备好的重组载体pBIN-GFP2-RxLR6-2导入农杆菌GV3101感受态中，得到重 组农杆菌，将其命名为农杆菌-RxLR6-2。
将制备好的重组载体pBIN-GFP2-RxLR8-2导入农杆菌GV3101感受态中，得到重 组农杆菌，将其命名为农杆菌-RxLR8-2。
将制备好的重组载体pBIN-GFP2-RxLR23NLS导入农杆菌GV3101感受态中，得到 重组农杆菌，将其命名为农杆菌-RxLR23NLS。
将制备好的重组载体pBIN-GFP2-RxLR23NE导入农杆菌GV3101感受态中，得到重组农杆菌，将其命名为农杆菌-RxLR23NE。
7、效应基因的Western Blot检测：分别将含有空载体pBIN-GFP2的农杆菌、农杆菌-RxLR23、农杆菌-RxLR3-1、农杆菌-RxLR6-2和农杆菌-RxLR8-2注射本氏烟和辣 椒叶片，瞬时表达效应基因与GFP的融合蛋白，得到接种农杆菌的本氏烟和辣椒叶片。 提取叶片的蛋白，进行Western Blot检测实验，利用一抗：GFP，二抗：羊抗鼠-HRP 进行检测，内参选用Action基因。图4的Western blot结果显示，在PVDF膜上，能 检测到跟RxLR23、RxLR3-1、RxLR6-2、RxL8-2预测蛋白大小差不多的目的条带， 说明这几个效应因子均能在辣椒本氏烟中正确表达。
实施例2
1.对本氏烟叶片细胞坏死的影响
以空载GFP、INF1、MgCl2等作对照，在本氏烟上瞬时表达RxLR23、RxLR3-1、 RxLR6-2和RxLR8-2这4个效应因子进行观察分析。将含有空载体pBIN-GFP2的农杆 菌以及实施例1中的农杆菌-RxLR23、农杆菌-RxLR3-1、农杆菌-RxLR6-2和农杆菌 -RxLR8-2接种至本氏烟叶片上，之后将合格的本氏烟叶片进行拍照记录，并用台盼蓝 染色液进行染色，用水合氯醛和酒精进行脱色处理。结果如图5所示，图5为各个效 应因子瞬时表达后的叶片症状，其中，图5a中，1-5分别表示RxLR3-1、RxLR23、INF1、 空载GFP和MgCl2：图5b中1：RxLR6-2，2：RxLR23，3：INF1，4：空载GFP，5：MgCl2。 图5c中：1：RxLR8-2，2：INF1，3：空载GFP，4：MgCl2。。效应因子接种本氏烟叶 片坏死面积统计，统计结果如图6所示。由图5和6可以看出，RxLR23能引起本氏 烟叶片细胞的轻微褪绿坏死，RxLR6-2、RxLR8-2同样能引起本氏烟叶片的轻微坏死， RxLR3-1基本不引起本氏烟叶片的坏死。
与阴性对照GFP比对发现，瞬时表达RxLR23、RxLR6-2、RxLR8-2的接种部分， 肉眼能够看到本氏烟叶片细胞的轻微褪绿坏死，台盼蓝染色后出现浅浅的蓝色，表示 效应因子坏死程度比较轻；瞬时表达RxLR3-1后，肉眼看不到接种部分褪绿坏死，染 色后也不呈现出蓝色，表明效应因子基本不引起坏死；阳性对照INF1接种部分呈现 出深蓝色，表明INF1正常引起了烟草叶片PTI。
2.对辣椒叶片细胞坏死的影响
以空载GFP、INF1、MgCl2等作对照，在辣椒叶片上瞬时表达RxLR23、RxLR3-1、RxLR6-2和RxLR8-2这4个效应因子进行观察分析。
将含有空载体pBIN-GFP2的农杆菌以及实施例1中的农杆菌-RxLR23、农杆菌 -RxLR3-1、农杆菌-RxLR6-2和农杆菌-RxLR8-2接种至本氏烟叶片上，之后将合格的 本氏烟叶片进行拍照记录，并用台盼蓝染色液进行染色，用水合氯醛和酒精进行脱色 处理。结果如图7所示，图7是以上几个效应因子瞬时表达之后的叶片症状，其中图 a：1：RxLR23，2：INF1，3：pBIN-GFP，4：MgCl2；图b：1：RxLR3-1，2：RxLR23， 3：INF1，4：空载GFP，5：MgCl2；图c：1：RxLR6-2，2：RxLR23，3：INF1，4：GFP； 5：MgCl2；图d：1：RxLR8-2，2：RxLR23，3：INF1，4：pBIN-GFP，5：MgCl2。图8 为效应因子接种辣椒叶片坏死面积统计。接种农杆菌后，发现RxLR23能很快引起辣 椒叶片细胞的坏死，RxLR6-2、RxLR8-2同样能引起辣椒叶片的坏死，RxLR3-1相比 于以上3个效应基因，坏死程度轻，且致死效果慢。与阴性对照GFP对比发现，瞬时 表达RxLR23、RxLR6-2和RxLR8-2的接种部分，肉眼能够看到本氏烟叶片细胞的轻 微褪绿坏死，台盼蓝染色后出现浅浅的蓝色，表示效应因子坏死程度比较轻；瞬时表 达RxLR3-1，肉眼看不到接种部分褪绿坏死，染色后也不呈现出蓝色，表明效应因子 基本不引起坏死；阳性对照INF1接种部分呈现出深蓝色，表明INF1正常引起了烟草 叶片PTI。
实施例3调控植物的辣椒疫霉侵染能力
侵染烟草叶片实验：
按照步骤2中方法制备接种含有空载体pBIN-GFP2的农杆菌(对照)、农杆菌 -RxLR23、农杆菌-RxLR3-1和农杆菌-RxLR6-2的本氏烟叶片，并以将大培养皿底部铺 上2层滤纸，倒入少量山泉水浸湿，用细针在接种过的烟草叶片轻轻划几道痕迹，然 后滴入15μL，放入到大培养皿中，放入25℃培养箱黑暗处理3d左右。待侵染情况稳 定后，先在紫外灯下拍照，后再进行拍照染色。结果如图9所示。统计各个效应因子 的侵染情况后，结果如图10所示，实验结果显示，与空载GFP相比，RxLR23、RxLR6-2 能够促进辣椒疫霉SD33游动孢子的侵染，RxLR3-1一定程度上抑制辣椒疫霉游动孢 子的侵染。研究表明，RxLR3-1与RxLR23上氨基酸位点的不同可能会在功能上起到 关键的作用。
之后分别提取辣椒疫霉游动孢子侵染叶片的DNA，以此为模板，分别以以 pBIN-RxLR23-F-KpnI和pBIN-RxLR23-R-BamH I、pBIN-RxLR3-1-F-KpnI和 pBIN-RxLR3-1-R-BamHI、pBIN-RxLR6-2-F-KpnI和pBIN-RxLR6-2-R-BamH I为引 物，用本氏烟的Action作为参比，做了荧光定量分析。结果如图11所示。
实施例4
1.融合蛋白RxLR23NLS和RxLR23NES调控植物细胞坏死的能力：
以空载GFP、INF1、MgCl2等作对照，在辣椒叶片上瞬时表达RxLR23NLS和RxLR23NES这2个效应因子，5-7d后进行观察分析。
将含有空载体pBIN-GFP2的农杆菌以及实施例1中的农杆菌-RxLR23、农杆菌 -RxLRNLS、农杆菌-RxLRNES\接种至本氏烟叶片上，之后将合格的本氏烟叶片进行 拍照记录，并用台盼蓝染色液进行染色，用水合氯醛和酒精进行脱色处理。结果如图 12所示，图12是各个效应因子农杆菌瞬时表达后的叶片症状，其中图e：1：RxLR:NLS， 2：RxLR23，3：INF1，4：pBIN-GFP，5：MgCl2；图f：1：RxLR:NES，2：RxLR23，3： INF1，4：pBIN-GFP，5：MgCl2。叶片坏死面积统计图如图13所示。
结果发现，RxLR23NLS能引起辣椒叶片的坏死；RxLR23NES基本不引起辣椒叶 片的坏死。与阴性对照GFP比对发现，瞬时表达RxLR23NLS的接种部分，肉眼能够 看到辣椒叶片细胞的坏死，台盼蓝染色后出现深蓝色，表明坏死程度比较重；瞬时表 达RxLR23NES后，肉眼看到接种部分褪绿或轻微坏死，染色后呈现出蓝色或浅蓝色， 表明轻微坏死或不坏死。即，RxLR23:NLS能引起辣椒叶片坏死，RxLR23:NES基本 不能引起辣椒叶片的坏死，与RxLR23的功能比较之后发现，核定位并未影响效应因 子功能；效应因子带有核输出信号后，RxLR23的功能发生了变化。所以效应因子 RxLR23引发细胞坏死主要集中在细胞核里。
2.融合蛋白RxLR23NLS和RxLR23NES的Western blot检测：
分别将含有空载体pBIN-GFP2的农杆菌、农杆菌-RxLR23、农杆菌-RxLRNES和 农杆菌-RxLRNLS注射本氏烟和辣椒叶片，瞬时表达效应基因与GFP的融合蛋白，得 到接种农杆菌的本氏烟和辣椒叶片。提取叶片的蛋白，进行Western Blot检测实验， 利用一抗：GFP，二抗：羊抗鼠-HRP进行检测，内参选用Action基因。图14的Western blot结果显示，在PVDF膜上，能检测到跟RxLR23、RxLRNES、RxLRNLS预测蛋白 大小差不多的目的条带，结果显示RxLR23NLS和RxLR23NES都能够正常表达。
实施例5
1.融合蛋白RxLR23NLS和RxLR23NES的对辣椒疫霉侵染状况的调控
将含有空载体pBIN-GFP2的农杆菌以及实施例1中的农杆菌-RxLR23、农杆菌 -RxLRNLS、农杆菌-RxLRNES接种至本氏烟叶片上，24h后，将诱导制备的辣椒疫霉 SD33菌株的游动孢子悬浮液滴于同一接种的叶片中央(每个叶片的游动孢子量要一 致)，然后放到25℃培养箱中黑暗处理，72h后，将本氏烟叶片取出，先在紫外灯下 进行拍照，然后在白光灯下拍照，最后用台盼蓝染液进行染色，染色结果如图15所示， 统计各个效应基因的侵染情况后，统计结果如图16所示。实验结果显示，与空载GFP 和RxLR23相比，RxLR23NLS能够抑制辣椒疫霉的侵染，RxLR23NES能够促进辣椒 疫霉的侵染。说明RxLR23促进辣椒疫霉侵染的功能主要集中在细胞质中。
之后分别提取辣椒疫霉游动孢子侵染叶片的DNA，以此为模板，分别以以 pBIN-RxLR23-F-KpnI和pBIN-RxLR23-R-BamH I、pBIN-RxLR23NES-F-KpnI和 pBIN-RxLR23NES-R-BamH I、pBIN-RxLR23NLS-F-KpnI和 pBIN-RxLR23NLS-R-BamH I为引物，用本氏烟的Action作为参比，做了荧光定量分 析，统计结果如图17所示。
由上述试验可知，效应蛋白RxLR23不仅能在本氏烟上引起轻微的细胞坏死，在 辣椒上也能引起比较明显的坏死，从后续的一些实验结果看，RxLR23在本氏烟、辣 椒瞬时表达后1-3d左右开始出现坏死的症状，3-5d左右就可以在辣椒叶片上形成灰褐 色的坏死斑，并且坏死斑没有扩大，属于比较明显的HR反应。但是对于效应因子引 起的这种死亡机制并不能够完全确定，所以猜测可能是植物体内存在抗性R蛋白能够 相互识别，但是需要通过酵母双杂技术对互作蛋白进行筛选，找到RxLR23效应基因 的靶标以及之间可能存在的相互作用关系，来进一步探索RxLR效应因子侵染寄主植 物的机制。
效应蛋白RxLR23在不同的辣椒疫霉菌株中存在序列的多态性，这些效应因子也能引起本氏烟和辣椒叶片的坏死，但因为个别氨基酸位点的改变，其功能与RxLR23 存在着一些差别；RxLR23同源基因因为前段氨基酸序列的改变，导致其亚细胞定位 发生了一定的变话；效应因子RxLR23在植株中前期表达量比较高，能较快的引起HR 反应；RxLR23引发细胞坏死的功能主要集中在细胞核里，RxLR23核定位的不同对辣 椒疫霉的侵染有影响，同源基因氨基酸序列的差异对辣椒疫霉的侵染也有一定的影响。
序列表
<110> 山东农业大学
<120> 一种辣椒疫霉侵染植物相关蛋白及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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