阅读说明：本技术 包含非结构蛋白的寨卡病毒嵌合多表位及其在免疫原性组合物中的用途 (Chimeric polyepitopes of Zika virus comprising non-structural proteins and their use in immunogenic compositions ) 是由 C·罗特 E·西蒙-洛列里 A·撒金塔巴伊 F·德尔加多 于 2018-11-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种包含非结构蛋白的寨卡病毒(ZIKV)嵌合多表位及其在免疫原性组合物中的用途。本发明提供了工具,尤其是表达嵌合多表位的多核苷酸、载体和细胞。本发明还涉及包含所述多表位、多核苷酸、载体或宿主细胞中的至少一种的组合物或疫苗,其用于预防人对象的ZIKV感染或用于预防人对象的ZIKV和登革热病毒(DENV)感染。(The present invention relates to a ZIKV chimeric multi-epitope comprising a non-structural protein and its use in immunogenic compositions. The invention provides means, in particular polynucleotides, vectors and cells expressing the chimeric polyepitopes. The invention also relates to a composition or vaccine comprising at least one of said polyepitope, polynucleotide, vector or host cell for use in preventing ZIKV infection or for preventing ZIKV and dengue virus (DENV) infection in a human subject.)

包含非结构蛋白的寨卡病毒嵌合多表位及其在免疫原性组合 物中的用途

本发明涉及一种包含非结构蛋白的寨卡病毒(ZIKV)嵌合多表位及其在免疫原性组合物中的用途。本发明提供了工具(mean)，尤其是表达所述嵌合多表位的多核苷酸、载体和细胞。本发明还涉及包含所述多表位、多核苷酸、载体或宿主细胞中的至少一种的组合物或疫苗，其用于预防人对象的ZIKV感染或用于预防人对象的ZIKV和登革热病毒(DENV)感染。

寨卡病毒(ZIKV)是一种由伊蚊属(Aedes)蚊子传播的黄病毒，它是与黄热病病毒、登革热病毒(DENV)和西尼罗病毒密切相关的单股正链RNA病毒(Kuno G et al.，1998，JVirol.72(1)：73-83)。它最初于1947年在乌干达的寨卡森林中被分离(Dick GW et al.，1952，Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 46(5)：509-520)，在Federated States of Micronesia的Yap Island首次引起***性爆发(Duffy MR，et al.2009，The New England journal of medicine 360(24)：2536-2543)。随后的爆发在2013-2014年发生于法属波利尼西亚和其他南太平洋群岛以及最近发生于美洲，并有较高的病例数(Cao-Lormeau VM，et al.2014，Emerging infectious diseases 20(6)：1085-1086；Campos GS，et al.2015，Emerging infectious diseases 21(10)：1885-1886；Dupont-Rouzeyrol M，et al.2015，Emerging infectious diseases 21(2)：381-382；Zanluca C，et al.2015，Mem Inst Oswaldo Cruz 110(4)：569-572；Pacheco O，etal.2016，Zika Virus Disease in Colombia-Preliminary Report.The New Englandjournal of medicine)。尽管最初被认为仅会导致轻度自限性疾病，但直到最近随着在2013年和2015年在法属波利尼西亚和巴西爆发，才确定ZIKV与神经系统并发症(例如格林-巴利综合征或先天性畸形)之间的因果关系(Oehler E，et al.2014Euro Surveill 19(9)；Cao-Lormeau VM，et al.2016，Lancet 387(10027)：1531-1539；Cauchemez S，etal.2016，Lancet 387(10033)：2125-2132；Soares de Araujo JS，et al.2016，Bull World HealthOrgan 94(11)：835-840)。

除了由于NS1中的自发突变导致ZIKV的亚洲谱系(Asian lineage)的感染力增强之外(LiuY，et al.2017，Nature 545(7655)：482-486)，这可以解释其最近在美洲的重新出现(Enfissi A et al.，Lancet 387(10015)：227-228)，如今最重要的问题之一涉及ZIKV流行地区高水平的DENV血清阳性率(Katzelnick LC，et al.，The Lancet.Infectiousdiseases 17(3)：e88-e100)。实际上，最近的研究表明，抗DENV预先存在的抗体可以增强ZIKV感染并增加疾病严重性(Dejnirattisai W，et al.2016Nat Immunol 17(9)：1102-1108；Stettler K，et al.2016Science 353(6301)：823-826；Paul LM，et al.2016DengueVirus Antibodies Enhance Zika Virus Infection.BioRxiv；Priyamvada L，etal.2016，Proc Natl Acad Sci U S A 113(28)：7852-7857；Bardina SV，et al.2017，Science 356(6334)：175-180)。考虑到这些限制因素，以及缺乏针对ZIKV感染的适当治疗，迫切需要开发针对这种传染病的疫苗。

虽然针对DENV或ZIKV的E蛋白的抗体显示出高度的交叉反应性，但是T细胞是否可交叉反应，取决于靶向的肽。在针对这些病毒之一免疫的人类供体中确实观察到低程度的DENV和ZIKV之间的CD4 T细胞交叉反应性(Stettler K，et al.2016，Science 353(6301)：823-826)，而用ZIKV攻击后，在DENV免疫小鼠中鉴定出DENV/ZIKV交叉反应性和保护性CD8T细胞(Wen J，et al.2017，Nat Microbiol 2：17036)。考虑DENV和ZIKV之间衣壳和包膜结构蛋白以及非结构蛋白NS3和NS5(分别代表DENV特异性CD4和CD8 T细胞的主要靶)的序列相同性，以及DENV-特异性T细胞的保护作用(Weiskopf D et al.，Proc Natl Acad SciUSA 2013，110(22)：E2046-2053；Weiskopf D et al.，Proc Natl Acad Sci USA 2015，112(31)：E4256-4263，Rivino L&Lim MQ，2016，Immunology 150(2)：146-154)，因此目前的工作方向是T细胞表位作图，以设计针对ZIKV的新型更有效的疫苗。通过建模可能结合ZIKV蛋白质组中不同的HLA I类或II类等位基因的潜在表位，并通过分析表达人HLA-B*0702和HLA-A*0101分子的转基因小鼠中离体T细胞应答，来进行对T细胞抗原的预测(Wen J，etal.2017，Nat Microbiol 2：17036，23-25)。令人惊讶的是，在这些DENV免疫小鼠中鉴定出DENV/ZIKV交叉反应性T细胞，这可以介导针对ZIKV感染的保护作用(Wen J，et al.2017，Nat Microbiol 2∶17036，23-25)。该结果与伴随的研究相一致，证明CD8+T细胞在小鼠针对ZIKV的免疫保护中的保护作用(Elong Ngono A，et al.2017，Cell host&microbe 21(1)：35-46)。然而，虽然这些研究表明CD8+T细胞在小鼠中针对ZIKV感染的保护作用，并且虽然在DENV初次和DENV预先暴露的供体中已鉴定出几种衍生自ZIKV的肽(Grifoni A，etal.2017，J.Virol.DOI：10.1128/JVI.01469-17，于2017年10月4日在线发布)，对于ZIKV特有的或与DENV共享的人T细胞表位的精确鉴定仍然不完整。在本研究中，发明人从仅有ZIKV感染或有DENV和ZIKV感染史的献血者中鉴定了这些表位。

使用来自具有先前的ZIKV感染的哥伦比亚献血者的PBMC，通过酶联免疫吸附斑点(ELISPOT)测定，量化针对覆盖整个ZIKV蛋白质组序列的肽的离体IFNγ应答，发明人建立了ZIKV T细胞表位分布的第一张作图。测量针对这些肽的T细胞应答(由CD4和/或CD8 T细胞介导)的强度，可以鉴定出免疫显性表位，这些免疫显性表位在携带特定HLA等位基因的供体中诱导强烈应答。更具体地说，发明人表明结构蛋白C和E以及非结构(NS)蛋白NS 1、NS3、NS4B和NS5，尤其是非结构蛋白NS1、NS3和NS5，含有大部分的免疫显性表位，该免疫显性表位诱导强烈的T细胞应答。在有DENV感染史的供体中，最强的T细胞应答针对的是与DENV的四种血清型具有高度氨基酸相同性的肽，并且某些与先前描述的DENV CD8+T细胞表位相匹配，表明交叉反应性T细胞的活化。发明人的结果为T细胞对ZIKV的应答提供了新的见解，并首次在免疫个体中鉴定了可用于将来的ZIKV和DENV候选疫苗的T细胞表位。

因此，本发明涉及嵌合多表位，其包含(i)至少以下(a)和(b)的T细胞表位，或(ii)至少以下(a)和(c)的T细胞表位，或(iii)至少以下(b)和(c)的T细胞表位，或者其T细胞表位变体：

(a)寨卡病毒(ZIKV)的非结构(NS)NS1蛋白的T细胞表位，其包含选自SEQ ID NO：10-12、14、15、17-19、23、24和78-83的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO：10-12、14、15、17-19、23、24和78-83的氨基酸序列组成，

(b)ZIKV的NS3蛋白的T细胞表位，其包含选自SEQ ID NO：28、29、31、33-35、84和85的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO：28、29、31、33-35、84和85的氨基酸序列组成，

(c)ZIKV的NS5蛋白的T细胞表位，其包含选自SEQ ID NO：46、48-50、52-55、57-60、62、64、67、69、72、73和86-91的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO：46、48-50、52-55、57-60、62、64，67、69、72、73和86-91的氨基酸序列组成，

所述T细胞表位变体通过一个或多个氨基酸残基的点突变而不同于(a)、(b)或(c)T细胞表位的原始氨基酸序列，并且与所述原始序列具有至少90％的序列相同性或超过95％的序列相同性或99％的序列相同性。

在本发明的特定实施方案中，嵌合多表位包含(i)至少以下(a)和(b)的T细胞表位，或(ii)至少以下(a)和(c)的T细胞表位，或(iii)至少以下(b)和(c)的T细胞表位，或者其T细胞表位变体：

(a)ZIKV的NS1蛋白的T细胞表位，其包含选自SEQ ID NO：10-12、14、15、17-19、23、24和78-83的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO：10-12、14、15、17-19、23、24和78-83的氨基酸序列组成，

(b)ZIKV的NS3蛋白的T细胞表位，其包含选自SEQ ID NO：28、31、33-35、84和85的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO：28、31、33-35、84和85的氨基酸序列组成，

(c)ZIKV的NS5蛋白的T细胞表位，其包含选自SEQ ID NO：46、52-55、57、59、60、62、64、67、69、72、73和86、87、89-91的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO：46、52-55、57、59、60、62、64、67、69、72、73和86、87、89-91的氨基酸序列组成，

所述T细胞表位变体通过一个或多个氨基酸残基的点突变而不同于(a)、(b)或(c)T细胞表位的原始氨基酸序列，并且与所述原始序列具有至少90％的序列相同性或超过95％的序列相同性或99％的序列相同性。

如本文所定义，术语“多表位”是指嵌合分子或重组分子，尤其是具有在ZIKV蛋白中鉴定出的至少2个、特别是至少3个、优选至少5个、更优选10个或超过10个、或15个或超过15个T细胞表位的嵌合多肽或重组多肽，全长或天然ZIKV蛋白除外，尤其是在ZIKV的非结构蛋白NS1、NS3或NS5中，ZIKV的全长或天然NS1、NS3或NS5蛋白除外。

如本文所定义，“表位”是抗原决定簇的肽或多肽，即被免疫系统的细胞(免疫细胞)识别的肽位点，特别是引起免疫应答所必需的位点。术语表位包括线性表位(被免疫细胞识别的连续的氨基酸(从9到15，特别是8、9、10或15，更优选9或15))和构象表位(免疫细胞识别氨基酸达到它们采用适当构型或构象的程度)。因此，在某些表位中，构象(三维结构)与氨基酸序列(一级结构)同等重要。

如本文所定义，“T细胞表位”是任何肽或多肽，所述肽或多肽涉及诱导针对ZIKV、或ZIKV和DENV，特别是针对DENV1、DENV2、DENV3、DENV4中的任意一种或针对多种，尤其是所有DENV血清型的T细胞免疫应答。尤其是，所述T细胞表位与I类MHC(主要组织相容性复合物)分子缔合而被识别(例如靶细胞是CD8+T淋巴细胞的表位)，或与II类MHC分子缔合而被识别的T表位(例如靶细胞是CD4+T淋巴细胞的那些)。

如本文所定义，术语“其变体”是指通过一个或多个氨基酸残基(尤其通过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基)的点突变，而与(a)、(b)或(c)的T细胞表位的原始氨基酸序列不同的T细胞表位，其与所述原始序列具有至少90％的序列相同性或超过95％的序列相同性或99％的序列相同性。定义T细胞表位变体的(一个或多个)突变可以是(一个或多个)缺失(特别包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多氨基酸残基的(一个或多个)点缺失)，或可以是(一个或多个)取代(特别是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸残基的(一个或多个)保守取代)。T细胞表位的所述变体可以具有氨基酸序列，所述氨基酸序列的长度与(a)、(b)或(c)的T细胞表位的原始氨基酸序列的长度相同。

如本文所定义，术语“嵌合多表位”是指包含不同ZIKV蛋白，特别是不同的ZIKV NS蛋白，优选选自NS1、NS3和NS5蛋白的不同的ZIKV NS蛋白的亚部分或片段的任何多表位多肽。所述嵌合多表位不包含全长或天然ZIKV蛋白，尤其是不包含全长或天然ZIKV NS蛋白，优选地不包含选自NS1、NS3和NS5蛋白的全长或天然ZIKV NS蛋白。

在本发明的特定实施方案中，嵌合多表位包含少于30个ZIKV T细胞表位，尤其是少于25个ZIKVT细胞表位，优选少于20个ZIKVT细胞表位。

在本发明的特定实施方案中，整体上获得的ZIKV蛋白的T细胞表位的氨基酸序列不同于另一个ZIKV蛋白的任何其他表位(特别是另一个ZIKV蛋白的任何其他ZIKV T细胞表位)的氨基酸序列。

在本发明的另一特定实施方案中，ZIKV T细胞表位的氨基酸序列可以与其他表位，特别是其他ZIKVT细胞表位的氨基酸序列相差一个或多个氨基酸，和/或可以具有重叠序列，并因此共享一些氨基酸。

本发明的嵌合多表位包含ZIKV的NS1和NS3蛋白的至少T细胞表位，或ZIKV的NS1和NS5蛋白的至少T细胞表位，或ZIKV的NS3和NS5蛋白的至少T细胞表位，全长或天然ZIKV蛋白除外。优选地，本发明的嵌合多表位由ZIKV的NS 1和NS3蛋白的T细胞表位、或ZIKV的NS1和NS5蛋白的T细胞表位、或ZIKV的NS3和NS5蛋白的T细胞表位组成，全长或天然ZIKV蛋白除外。

在本发明的优选的实施方案中，嵌合多表位包含ZIKV的NS1、NS3和NS5蛋白的至少T细胞表位，全长或天然ZIKV蛋白除外。

在本发明的另一个优选实施方案中，嵌合多表位由ZIKV的NS1、NS3和NS5蛋白的T细胞表位组成，全长或天然ZIKV蛋白除外。

在本发明的特定实施方案中，嵌合多表位包含来自相同ZIKV蛋白(尤其是ZIKV的NS蛋白，优选ZIKV的NS1、NS3或NS5蛋白)的不同多表位的亚部分或片段或甚至来自不同ZIKV蛋白的相同多表位(尤其是ZIKV的NS蛋白，优选地是ZIKV的NS1、NS3和NS5蛋白)的亚部分或片段。本发明的多表位包括多表位变体。因此，除非在技术上不相关，否则本文公开的每个定义或实施方案均适用于变体多表位。

如本文所定义，术语“片段”是指ZIKV蛋白的一部分或部分，优选为ZIKV的NS蛋白(即NS1、NS3或NS5蛋白)的一部分或部分，其长度短于该蛋白的长度，该蛋白优选为起源于其的NS蛋白(即NS1、NS3或NS5蛋白)。每个片段均可包含多个表位，所述表位适合于引发免疫应答，特别是针对ZIKV感染或针对ZIKV和DENV感染的免疫T细胞应答。每个片段均对应于连续氨基酸的序列。

在本发明的一个优选的实施方案中，嵌合多表位至少包含如上文所定义的(a)、(b)和(c)的T细胞表位，或其T细胞表位变体。

在本发明的另一个优选实施方案中，嵌合多表位由以下组成：(i)如上定义的(a)和(b)的T细胞表位，或(ii)如上定义的(a)和(c)的T细胞表位，或(iii)如上定义的(b)和(c)的T细胞表位，或(iv)如上定义的(a)、(b)和(c)的T细胞表位，或其T细胞表位变异体。

在本发明的另一个优选实施方案中，(a)的T细胞表位包含选自SEQ ID NO：17、23和78-83的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO：17、23和78-83的氨基酸序列组成，(b)的T细胞表位包含选自SEQ ID NO：31、33、84和85的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO：31、33、84和85的氨基酸序列组成，并且(c)的T细胞表位包含选自SEQ ID NO：46、48、52、57、62、64、67和86-91(优选SEQ ID NO：46、52、57、62、64、67、86、87和89-91)的氨基酸序列或由选自SEQ IDNO：46、48、52、57、62、64、67和86-91(优选SEQ ID NO：46、52、57、62、64、67、86、87和89-91)的氨基酸序列组成。所述T细胞表位序列的每个均包含15个氨基酸残基，即是15聚体表位，其单独和/或一起诱导T细胞免疫应答。这些15聚体表位中的每个单独和/或一起包括至少9聚体表位，其也诱导T细胞免疫应答。例如，SEQ ID NO：17(FHTSVWLKVREDYSL)的ZIKV的NS1蛋白(NS1_163-177)中的15-聚体表位的序列包括SEQ ID NO：18(VWLKVREDY)的9-聚体表位的序列和SEQ ID NO：19(WLKVREDYS)的9-聚体表位的序列。这表明上述15-聚体表位包含至少9-聚体表位，但也可以包含9-聚体或更多的其他表位。

在本发明的另一个优选的实施方案中，(a)的T细胞表位包含SEQ ID NO：11、12、17-19、23、24、78、80和83的氨基酸序列或由SEQ ID NO：11、12、17-19、23、24、78、80和83的氨基酸序列组成，(b)的T细胞表位包含SEQ ID NO：28、31、33、34、84和85的氨基酸序列或由SEQ ID NO：28、31、33、34、84和85的氨基酸序列组成，并且(c)的T细胞表位包含SEQ ID NO：48-50、52-55、57、58、60、62、67、88、89和90(优选SEQ ID NO：52-55、57、60、62、67、89和90)的氨基酸序列或由SEQ ID NO：48-50、52-55、57、58、60、62、67、88、89和90(优选SEQ ID NO：52-55、57、60、62、67、89和90)的氨基酸序列组成。

在本发明的另一个特定的实施方案中，嵌合多表位还包含选自以下的ZIKV蛋白的至少一个T细胞表位：

(i)ZIKV的衣壳(C)蛋白的T细胞表位，其包含选自SEQ ID NO：1、2、4-6和75的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO：1、2、4-6和75的氨基酸序列组成，

(ii)ZIKV的E蛋白的T细胞表位，其包含选自SEQ ID NOs：7、76和77的氨基酸序列或由选自SEQ ID NOs：7、76和77的氨基酸序列组成，

(iii)ZIKV的NS2B蛋白的T细胞表位，其包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列或由SEQID NO：25的氨基酸序列组成，

(iv)ZIKV的NS4A蛋白的T细胞表位，其包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列或由SEQID NO：36的氨基酸序列组成，以及

(v)ZIKV的NS4B蛋白的T细胞表位，其包含选自SEQ ID NO：40-43的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO：40-43的氨基酸序列组成。

在本发明的优选的实施方案中，嵌合多表位包含至少2种，优选至少3种或4种，更优选至少5种、6种、7种、8种、9种、10种或11种不同的ZIKV蛋白的T细胞表位。

在本发明的另一优选的实施方案中，嵌合多表位还包含ZIKV的C蛋白的T细胞表位和ZIKV的NS4B蛋白的T细胞表位，所述C蛋白的T细胞表位包含选自SEQ ID NO：1、2、4-6和75的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO：1、2、4-6和75的氨基酸序列组成，所述NS4B蛋白的T细胞表位包含选自SEQ ID NO：40-43的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO：40-43的氨基酸序列组成。

因此，嵌合多表位包含ZIKV的C、NS1、NS3、NS4B和NS5蛋白的至少T细胞表位，所述全长或天然ZIKV蛋白除外。尤其是，嵌合多表位包含至少以下T细胞表位，或者其T细胞表位变体：

(i)ZIKV的C蛋白的T细胞表位，其包含选自SEQ ID NO：1、2、4-6和75(优选SEQ IDNO：1、4和75)的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO：1、2、4-6和75(优选SEQ ID NO：1、4和75)的氨基酸序列组成，

(ii)ZIKV的NS1蛋白的T细胞表位，其包含选自SEQ ID NO：10-12、14、15、17-19、23、24和78-83(优选SEQ ID NO：17、23和78-83)的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO：10-12、14、15、17-19、23、24和78-83(优选SEQ ID NO：17、23和78-83)的氨基酸序列组成，

(iii)ZIKV的NS3蛋白的T细胞表位，其包含选自SEQ ID NO：28、29、31、33-35、84和85(优选SEQ ID NO：28、31、33-35、84和85，更优选SEQ ID NO：31、33、84和85)的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO：28、29、31、33-35、84和85(优选SEQ ID NO：28、31、33-35、84和85，更优选SEQ ID NO：31、33、84和85)的氨基酸序列组成，

(iv)ZIKV的NS4B蛋白的T细胞表位，其包含选自SEQ ID NO：40-43的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO：40-43的氨基酸序列组成，

(v)ZIKV的NS5蛋白的T细胞表位，其包含选自SEQ ID NO：46、48-50、52-55、57-60、62、64、67、69、72、73和86-91(优选SEQ ID NO：46、52-55、57、59、60、62、64、67、69、72、73和86、87和89-91)的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO：46、48-50、52-55、57-60、62、64、67、69、72、73和86-91(优选SEQ ID NO：46、52-55、57、59、60、62、64、67、69、72、73和86、87和89-91)组成，或包含选自SEQ ID NO：46、48、52、57、62、64、67和86-91(优选SEQ ID NO：46、52、57、62、64、67、86、87和89-91)的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO：46、48、52、57、62、64、67和86-91(优选SEQ ID NO：4652、57、62、64、67、86、87和89-91)的氨基酸序列组成，

所述T细胞表位变体通过一个或多个氨基酸残基的点突变而不同于(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(v)T细胞表位的原始氨基酸序列，并且与所述原始序列具有至少90％的序列相同性或超过95％的序列相同性或99％的序列相同性。

在本发明的另一优选的实施方案中，在上述嵌合多表位中：

(i)ZIKV的C蛋白的T细胞表位包含SEQ ID NO：4、5、6和75的氨基酸序列或由SEQID NO：4、5、6和75的氨基酸序列组成，

(ii)ZIKV的NS1蛋白的T细胞表位包含SEQ ID NO：11、12、17-19、23、24、78、80和83的氨基酸序列或由SEQ ID NO：11、12、17-19、23、24、78、80和83的氨基酸序列组成，

(iii)ZIKV的NS3蛋白的T细胞表位包含SEQ ID NO：28、31、33、34、84和85的氨基酸序列或由SEQ ID NO：28、31、33、34、84和85的氨基酸序列组成，

(iv)ZIKV的NS4B蛋白的T细胞表位包含SEQ ID NO：40和41的氨基酸序列或由SEQID NO：40和41的氨基酸序列组成，以及

(v)ZIKV的NS5蛋白的T细胞表位包含SEQ ID NO：48-50、52-55、57、58、60、62、67、88、89和90(优选SEQ ID NO：52-55、57、60、62、67、89和90)的氨基酸序列或由SEQ ID NO：48-50、52-55、57、58、60、62、67、88、89和90(优选SEQ ID NO：52-55、57、60、62、67、89和90)的氨基酸序列组成。

在本发明的另一优选实施方案中，嵌合多表位由ZIKV的C、NS1、NS3、NS4B和NS5蛋白的T细胞表位组成，全长或天然ZIKV蛋白除外。

上述针对ZIKV的NS1、NS3和NS5蛋白的所有定义也适用于ZIKV的其他蛋白，尤其是适用于ZIKV的C、E、NS1、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5蛋白。

在本发明的优选实施方案中，嵌合多表位是：(i)用于预防人对象的ZIKV感染；或(ii)用于预防人对象的ZIKV和登革热病毒(DENV)感染。

如本文所定义，术语“预防”是指一级、二级和三级预防。预防ZIKV感染或ZIKV和DENV感染意味着将所述(一种或多种)感染以及相关的危险因素最小化，即被阻止或延迟。尤其是，所述(一种或多种)感染可以在其发生之前预防或在其早期阶段被识别，从而可以减轻所述(一种或多种)感染的症状。

在本发明的更优选的实施方案中，当将多表位用于预防人对象的ZIKV感染时，T细胞表位是ZIKV特异性表位，其包含选自SEQ ID NO：1、2、5、10、11、19、27、31、40-43、46、72、73、75、78-80、82、84、85、87和91的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO：1、2、5、10、11、19、27、31、40-43、46、72、73、75、78-80、82、84、85、87和91的氨基酸序列组成。

在本发明的另一更优选的实施方案中，当多表位用于预防人对象的ZIKV和DENV感染时，T细胞表位是ZIKV-DENV交叉反应性表位，其包含选自SEQ ID NO：1、5、6、12、14、15、17-19、23、24、27、28、33-35、40、41、46、48-50、52-55，57、59、60、62、64、67、69、72、73、84、85和86-91(优选SEQ ID NO：1、5、6、12、14、15、17-19、23、24、27、28、33-35、40、41、46、52-55、57、59、60、62、64、67、69、72、73、84、85、86、87和89-91)的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO：1、5、6、12、14、15、17-19、23、24、27、28、33-35、40、41、46、48-50、52-55，57、59、60、62、64、67、69、72、73、84、85和86-91(优选SEQ ID NO：1、5、6、12、14、15、17-19、23、24、27、28、33-35、40、41、46、52-55、57、59、60、62、64、67、69、72、73、84、85、86、87和89-91)的氨基酸序列组成。

要注意的是，包含选自SEQ ID NO：1、5、19、27、40、41、46、72、73、84、85、87和91的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO：1、5、19、27、40、41、46、72、73、84、85、87和91的氨基酸序列组成的T细胞表位均能够在ZIKV供体和DENV/ZIKV供体中诱导T细胞免疫应答。

下表2和3提供了ZIKV T细胞表位，尤其是ZIKV特异性T细胞表位和/或ZIKV-DENV交叉反应性T细胞表位的非穷举列表。所述ZIKV T细胞表位包含定义为SEQ ID NO：1-91的氨基酸序列。

在本发明的特定实施方案中，嵌合多表位包含人白细胞抗原(HLA)限制性表位。表达“HLA-限制性”是指特定表位对该类型的HLA分子具有亲和力的能力。用于本发明的HLA分子包括I类分子(称为HLA-A、B或C)或II类分子(称为DRB)。

在本发明的另一特定实施方案中，嵌合多表位引发人白细胞抗原(HLA)限制性CD8+和/或CD4+T细胞应答，其(i)针对ZIKV，或(ii)针对ZIKV和DENV，尤其是DENV血清型1(DENV1)、DENV血清型2(DENV2)、DENV血清型3(DENV3)和DENV血清型4(DENV4)，优选地针对DENV血清型1(DENV1)。

可以从Genbank数据库中以登录号NC_001477.1、NC_001474.2、NC_001475.2和NC_002640.1访问四种登革热病毒血清型的参考基因组的完整核苷酸序列。

在本发明的特定实施方案中，所述DENV来自以下毒株：GenBank KDH0026A(DENV1)、GenBank R0712259(DENV2)、GenBank KDH0010A(DENV3)和GenBank CRBIP10.4VIMFH4(DENV4)。

在本发明的特定实施方案中，多表位引发具有HLA限制的抗原应答，例如HLA-A*0201、HLA-A*2402、HLA-B*0702、HLA-B*3501和HLA-B*4002，优选地HLA-A*0201、HLA-A*2402、HLA-B*0702和HLA-B*3501。

在本发明的特定实施方案中，(i)ZIKV的NS1和NS3蛋白的至少T细胞表位，或(ii)ZIKV的NS1和NS5蛋白的至少T细胞表位，或(iii)ZIKV的NS3和NS5蛋白的至少T细胞表位，或(iv)ZIKV的NS1、NS3和NS5蛋白的至少T细胞表位，或(v)ZIKV的C、NS1、NS3、NS4B和NS5蛋白的至少T细胞表位(全长或天然ZIKV蛋白除外)组装在独特的多肽(优选在融合多肽)中。优选地，以上定义的T细胞表位组装在融合多肽中。

所述T细胞表位可以相互直接或间接融合。

根据本发明的特定实施方案，一个T细胞表位与另一T细胞表位“直接”融合，即，T细胞表位的3′端直接连接到第二T-表位的5′端(依此类推)，对应于由来自至少两种不同的ZIKV蛋白(特别是ZIKV C蛋白和选自NS1、NS3、NS4B和NS5的ZIKVNS蛋白)中的连续T细胞表位组成的嵌合多表位，特别是源自ZIKV的共有序列。根据一个替代实施方案，至少两个T细胞表位，特别是至少三个T细胞表位的融合是“间接的”，并因此涉及其他的，尤其是(一个或多个)非NS氨基酸残基区段，尤其是包含不形成人T细胞表位的1至15个氨基酸残基的存在。

本发明的嵌合多表位包含一个或多个抗原区域或由一个或多个抗原区域组成，尤其是在2至15个抗原区域之间，优选在10至15个抗原区域之间，更优选地11、12、13或14个抗原区域。

如本文所定义，术语“抗原区域”是指包含一个或多个ZIKV T细胞表位的区域，即一组ZIKV T细胞表位的区域。所述ZIKV T细胞表位的氨基酸序列可以与其他ZIKV T细胞表位的氨基酸序列相差一个或多个氨基酸残基，和/或可以具有重叠序列，并因此共享一些氨基酸。在确定的抗原区域中，所述ZIKV T细胞表位具有相同的ZIKV蛋白，特别是具有ZIKV的C、NS1、NS3、NS4B和NS5蛋白，优选具有ZIKV的NS1、NS3和NS5蛋白。本发明的嵌合多表位可以包含相同ZIKV蛋白的一个或多个不同抗原区域。

在本发明的特定实施方案中，必须检查位于两个连续抗原区域之间的接合(junction)两侧上的相邻氨基酸序列没有形成新的表位，特别是新的强人T细胞表位。结果，根据免疫表位数据库(IEDB)分析资源(http：//tools.immuneepeepitope.org/mhci/)，所述氨基酸序列由不超过15个氨基酸残基组成，并且基于它们对HLA-A*01：01、HLA-A*02：01、HLA-A*03：01、HLA-A*11：01、HLA-A*24：02、HLA-B*07：02、HLA-B*35：01和HLA-B*40：03等位基因的低结合预测来选择。例如，在两个ZIKV蛋白片段之间，特别是在选自ZIKV的C、NS1、NS3、NS4B和NS5蛋白的两个ZIKV蛋白片段之间，或在两个抗原区域之间的融合中，围绕所述融合接合的区域包含由不超过15个氨基酸残基组成且不形成强表位的肽序列。因此，接合肽可包含第一ZIKV蛋白的14个氨基酸残基和第二ZIKV蛋白的1个氨基酸残基，或第一ZIKV蛋白的13个氨基酸残基和第二ZIKV蛋白的2个氨基酸残基，或第一ZIKV蛋白的12个氨基酸残基和第二ZIKV蛋白的3个氨基酸残基，或第一ZIKV蛋白的11个氨基酸残基和第二ZIKV蛋白的4个氨基酸残基，或第一ZIKV蛋白的10个氨基酸残基和第二ZIKV蛋白的5个氨基酸残基，或第一ZIKV蛋白的9个氨基酸残基和第二ZIKV蛋白的6个氨基酸残基，或第一ZIKV蛋白的8个氨基酸残基和第二ZIKV蛋白的7个氨基酸残基，或第一ZIKV蛋白的7个氨基酸残基和第二ZIKV蛋白的8个氨基酸残基，或第一ZIKV蛋白的6个氨基酸残基和第二ZIKV蛋白的9个氨基酸残基，或第一ZIKV蛋白的5个氨基酸残基和第二ZIKV蛋白的10个氨基酸残基，或第一ZIKV蛋白的4个氨基酸残基和第二ZIKV蛋白的11个氨基酸残基，或第一ZIKV蛋白的3个氨基酸残基和第二ZIKV蛋白的12个氨基酸残基，或第一ZIKV蛋白的2个氨基酸残基和第二ZIKV蛋白的13个氨基酸残基，或第一ZIKV蛋白的1个氨基酸残基和第二ZIKV蛋白的14个氨基酸残基。所述第一和第二ZIKV蛋白可以是不同或相同的。

在本发明的特定实施方案中，嵌合多表位具有少于1500个氨基酸残基，尤其是少于1000个氨基酸残基。

可用于本发明的嵌合多表位的实例具有由962个氨基酸残基组成的SEQ ID NO：99的氨基酸序列。所述嵌合多表位由11个抗原区域组成，其中第一抗原区域位于氨基酸残基1到93(SEQ ID NO：102)，第二抗原区域位于氨基酸残基94到206(SEQ ID NO：104)，第三抗原区域位于氨基酸残基207到270(SEQ ID NO：106)，第四抗原区域位于氨基酸残基271到286(SEQ ID NO：108)，第五抗原区域位于氨基酸残基287到331(SEQ ID NO：110)，第六抗原区域位于氨基酸残基332到473(SEQ ID NO：112)，第七抗原区域位于氨基酸残基474到547(SEQ ID NO：114)，第八抗原区域位于氨基酸残基548到766(SEQ ID NO：116)，第九抗原区域位于氨基酸残基767到821(SEQ ID NO：118)，第十抗原区域位于氨基酸残基822到839(SEQ ID NO：120)，第十一抗原区域位于氨基酸残基840到962(SEQ ID NO：122)。

编码所述嵌合多表位的多核苷酸的天然和优化序列分别如SEQ ID NO：100和101所限定。

编码所述嵌合多表位的多核苷酸的另一核苷酸序列如SEQ ID NO：124所限定。

所述嵌合多表位的第一抗原区域包含ZIKV的C蛋白的T细胞表位。编码所述第一抗原区域的多核苷酸的天然序列如SEQ ID NO：103所限定。

所述嵌合多表位的第二抗原区域包含ZIKV的NS1蛋白的T细胞表位。编码所述第二抗原区域的多核苷酸的天然序列如SEQ ID NO：105所限定。

所述嵌合多表位的第三抗原区域包含ZIKV的NS1蛋白的T细胞表位。编码所述第三抗原区域的多核苷酸的天然序列如SEQ ID NO：107所限定。

所述嵌合多表位的第四抗原区域包含ZIKV的NS1蛋白的T细胞表位。编码所述第四抗原区域的多核苷酸的天然序列如SEQ ID NO：109所限定。

所述嵌合多表位的第五抗原区域包含ZIKV的NS3蛋白的T细胞表位。编码所述第五抗原区域的多核苷酸的天然序列如SEQ ID NO：111所限定。

所述嵌合多表位的第六抗原区域包含ZIKV的NS3蛋白的T细胞表位。编码所述第六抗原区域的多核苷酸的天然序列如SEQ ID NO：113所限定。

所述嵌合多表位的第七抗原区域包含ZIKV的NS4B蛋白的T细胞表位。编码所述第七抗原区域的多核苷酸的天然序列如SEQ ID NO：115所限定。

所述嵌合多表位的第八抗原区域包含ZIKV的NS5蛋白的T细胞表位。编码所述第八抗原区域的多核苷酸的天然序列如SEQ ID NO：117所限定。

所述嵌合多表位的第九抗原区域包含ZIKV的NS5蛋白的T细胞表位。编码所述第九抗原区域的多核苷酸的天然序列如SEQ ID NO：119所限定。

所述嵌合多表位的第十抗原区域包含ZIKV的NS5蛋白的T细胞表位。编码所述第十抗原区域的多核苷酸的天然序列如SEQ ID NO：121所限定。

所述嵌合多表位的第十一抗原区域包含ZIKV的NS5蛋白的T细胞表位。编码所述第十抗原区域的多核苷酸的天然序列如SEQ ID NO：123所限定。

本发明还涉及本发明的嵌合多表位与包含其他ZIKV抗原的不同的免疫原性多肽的缔合。所述多肽的缔合可以作为编码所述嵌合多表位和与如本文所公开的载体不同的免疫原性多肽中的每个的多核苷酸表达的结果而实现。或者，所述缔合可以由包含所述嵌合多表位和不同的免疫原性多肽的氨基酸构建体产生。

本发明的嵌合多表位可以化学合成，或在细胞系统中表达编码嵌合多表位的核酸分子后在体外(无细胞系统)或体内产生。

为了检查本发明的嵌合多表位在体外细胞系统中的正确表达，所述嵌合多表位可以在其3′端包含标签序列。

在本发明中，ZIKV蛋白，尤其是ZIKV的C、NS1、NS3、NS4B或NS5蛋白，优选ZIKV的NS1、NS3或NS5蛋白，特别是使用针对ZIKV的共有序列而设计的抗原。尤其地，所述抗原是使用从2013年及以后流传观察到的寨卡病毒的共有氨基酸序列而设计的。

在本发明的特定实施方案中，所述ZIKV来自非洲谱系，尤其是来自非洲毒株ArD158084(GenBank：KF383119)或非洲毒株ArD128000(GenBank：KF383117)或非洲分离株ARB13565(GenBank：KF268948)，或来自亚洲谱系，尤其是来自亚洲毒株FLR(GenBank：KX087102)或亚洲分离株SSABR1(GenBank：KU707826)或亚洲分离株Z1106031(GenBank：KU312314)或亚洲分离株Bahia07(GenBank：KU940228)或亚洲毒株FVM00318/VEN/Maracay/2016(GenBank：KY693680)或亚洲分离株FLR(GenBank：KU820897)。

在本发明的另一特定实施方案中，所述ZIKV对应于ZIK病毒的各种谱系，其包括自2013年以来在太平洋和美洲流传的毒株。

在本发明的优选实施方案中，ZIKV的C、NS1、NS3、NS4B或NS5蛋白具有氨基酸序列，该氨基酸序列是代表各种ZIKV毒株的选择的C、NS1、NS3、NS4B或NS5序列的共有氨基酸序列，所述ZIKV毒株包括来自亚洲谱系，特别是来自ZIKV毒株(GenBank：KX087102，KU707826，KU312314，KU940228，KY693680，KU820897）。

本发明还涉及编码根据本发明的嵌合多表位的分离的或纯化的多核苷酸。

本发明还涉及在核酸构建体中编码根据本发明的嵌合多表位的分离的或纯化的多核苷酸，所述核酸构建体还包含编码其他ZIKV抗原的多核苷酸。

如本文所限定的那样，术语“分离的或纯化的”是指已经由人从其天然状态改变的分子，即，如果分子存在于自然界中，则它们已经被改变和/或从其初始环境中取出。例如，天然存在并发现于天然表达多核苷酸的活生物体的生物环境中的多核苷酸在本文中不是“分离的”。然而，当从其天然环境中分离出和/或通过克隆、扩增和/或化学合成获得时，相同的多核苷酸在本发明中被认为是“分离的”。此外，通过转化、基因操纵或任何其他重组方法引入生物体的多核苷酸是“分离的”，即使其存在于所述生物体中。

如本文所定义，术语“编码”定义了当将所述分子置于包含用于转录的启动子的表达控制序列下时，核酸分子被转录的能力以及在适当情况下被翻译成产物表达到选定的细胞或细胞系中的能力。因此，根据本发明的“多核苷酸编码”要么受限于具有翻译成氨基酸序列的序列的核酸，要么在指定时还包括表达控制序列。

本发明还涉及适于递送根据本发明的嵌合多表位的载体，尤其是非复制型载体，其中所述载体是携带多表位的重组分子，或者是表达多表位的病毒载体，或表达多表位的哺乳动物表达载体，例如pcDNA3载体、pcDNA5载体、pcDNA6载体、pCI载体和pCMV载体。

本发明还涉及包含根据本发明的多核苷酸的载体。

如本文所定义，术语“载体”是指设计用于转导/转染一种或多种细胞类型的多核苷酸构建体。载体可以是例如设计用于分离、繁殖和复制***的多核苷酸(称为***物)的“克隆载体”，设计用于表达多核苷酸分子特别是用于在宿主细胞中表达***物的“表达载体”，或设计导致产生重组病毒颗粒或病毒样颗粒的“病毒载体”，或包含多于一种类型的载体的属性的“穿梭载体”。

公众可获得许多适用于转导或转染细胞，特别是稳定转染细胞和细菌的载体(例如质粒，病毒)，以及用于构建此类细胞系的方法。将理解，本发明涵盖包含本发明的任何多核苷酸的任何类型的载体。

在本发明的特定实施方案中，本发明涉及一种表达载体，其可以是包含作为(一个或多个)多核苷酸***物的一个或多个本文定义的核酸分子的质粒。在一个特定的实施方案中，质粒包含如本文所定义的编码本发明的嵌合多表位的作为***物的多核苷酸，并且任选地包含编码其他ZIKV抗原的多核苷酸。

对于本领域的技术人员熟知可以在本发明中使用的载体包含麻疹病毒载体，特别是减毒的活麻疹病毒载体(例如，如在Combredet，C.et al.，2003，JVirol，77(21)：11546-11554，欧洲专利申请EP17305676.3和国际申请WO2004/000876，WO2004/001051，WO2014/049094，WO2015/197565公开的)，慢病毒载体(例如，如国际申请WO2005/111221，WO2007/052165，WO2008/078198，WO2009/019612和WO2016/091836中所公开)或mRNA(例如，Moderna的mRNA Therapeutics^TM平台；如国际申请WO2012135805、WO2013039861和WO2015/085318或2015年6月2日在线公布的Youn H.and Chung JK的Expert Opinion.Expert Opin BiolTher.2015Sep 2；15(9)：1337-1348doi：10.1517/14712598.2015.1057563所公开的)。

本发明还涉及用根据本发明的多核苷酸或根据本发明的载体转化的宿主细胞。

可以用编码本发明的嵌合多表位的多核苷酸和任选地用编码其他ZIKV抗原的多核苷酸遗传转化宿主细胞。因此可以用本发明的载体遗传转化特定的宿主细胞。

可以通过本领域技术人员熟知的方法用基因组载体转染本发明的宿主细胞，即通过化学转染(磷酸钙，脂质转染胺(lipofectamine))、基于脂质的技术(脂质体)、电穿孔、光穿孔、病毒载体的使用......

在本发明的特定实施方案中，用本发明的多核苷酸转化或转导细胞，其方式是通过与同源细胞序列重组或通过***细胞基因组使多核苷酸整合到细胞基因组中。转染、感染或转导可以在体外发生，即在活生物体外的人工环境中。

如本文所用，术语“转染的”、“转化的”或“感染的”是指包含本发明的载体的细胞(瞬时表达)，而术语“遗传转化的”是指细胞基因组已被本发明的多核苷酸的确定地修饰的细胞(永久表达)。

所述瞬时或稳定转化的细胞可以是任何原核(细菌)或真核(酵母、昆虫或动物，包括哺乳动物，特别是人)细胞。在一个实施方案中，细胞是非人类细胞。在一个特定的实施方案中，本发明的细胞是分离的人细胞，“分离的”是指其自然环境之外。

在本发明的特定实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如禽类细胞、尤其是CEF(小鸡胚成纤维细胞)细胞，哺乳动物细胞、尤其是HEK-293(人胚肾)细胞，其细胞系293以ATCC登录号CRL-1573保藏(如国际申请WO2008/078198中所公开)，或酵母细胞。

本发明还涉及一种免疫原性组合物，其包含选自以下的至少一种组分：

(i)根据本发明的嵌合多表位，

(ii)根据本发明的多核苷酸，

(iii)根据本发明的载体，和

(iv)根据本发明的宿主细胞。

在本发明的特定实施方案中，免疫原性组合物还包含佐剂和/或药学上可接受的媒介物(vehicle)。

在本发明的另一特定实施方案中，免疫原性组合物还包含编码其他ZIKV抗原的多核苷酸。

在本发明的特定实施方案中，免疫原性组合物不包含佐剂和/或药学上可接受的媒介物。

如本文所定义，药学上可接受的媒介物包括能够在组合物中配制多表位、多核苷酸、根据本发明的载体的任何物质。媒介物是生理学上可接受的任何物质或物质的组合，即适于在与宿主特别是人接触的组合物中使用，因此是无毒的。这种媒介物的实例是磷酸盐缓冲盐溶液、蒸馏水、乳剂如油/水乳剂和各种类型的润湿剂无菌溶液等。

如本文所定义，佐剂包括例如脂质体、油相、例如弗氏(Freund)型佐剂，通常以具有水相的乳剂形式使用或可包含水不溶性无机盐，例如氢氧化铝、硫酸锌、胶体氢氧化铁、磷酸钙或氯化钙。

在本发明的另一特定实施方案中，将免疫原性组合物配制成用于通过肠胃外途径例如皮下注射(s.c.)、皮内注射(i.d.)、肌内注射(i.m.)、腹膜内注射(i.p.)或静脉内(i.v.)注射施用。

在本发明的另一特定实施方案中，免疫原性组合物以一种或多种施用剂量，尤其是以初免-加强施用方案来施用。

待施用的量(剂量)取决于待治疗的对象，包括患者的状况、个体免疫系统的状态、施用途径和宿主的大小。对于病毒载体或100微克质粒DNA，合适的剂量范围为10³TCID50至10⁷TCID50，并且可以根据情况由本领域技术人员进行修改。

本发明还涉及一种疫苗组合物，其包含选自以下的至少一种组分：

(i)根据本发明的嵌合多表位，

(ii)根据本发明的多核苷酸，

(iii)根据本发明的载体，以及

(iv)根据本发明的宿主细胞。

在本发明的优选的实施方案中，免疫原性或疫苗组合物用于预防人对象的ZIKV感染或(ii)用于预防人对象的ZIKV和登革热病毒(DENV)感染。

本发明还涉及在表达人HLA I类等位基因：HLA-A*02：01或HLA-A*24：02或HLA-B*07：02或HLA-B*35：01的小鼠中体内诱导针对ZIKV多表位的表位的免疫应答。按照初免加强给药方案进行小鼠免疫，其中第一次皮内注射编码ZIKV多表位的质粒DNA(2次同时在下背部皮下注射50毫克质粒DNA，然后使用预定程序进行体内电穿孔)，然后在3周后加强免疫(使用相同的预定程序，在下背部2次皮下注射50毫克质粒DNA，并进行电穿孔)。使用AgilePulse仪器(BTX，Harvard apparatus)的电穿孔设置由3个电压组组成：包括第一组450V、脉冲长度为50微秒、脉冲间隔为0.2微秒和1个脉冲，第二组450V、脉冲长度为50微秒、脉冲间隔为50微秒和1个脉冲，以及第三组110V、脉冲长度为10毫秒、脉冲间隔为20毫秒和8个脉冲。根据ELISPOT测定，在加强免疫后十天，采集免疫小鼠的脾脏，并测试脾细胞响应于用衍生自ZIKV多表位的特定肽体外刺激而分泌干扰素γ的能力。

通过以下实施例，本发明的其他特征和优点将变得明显，并且还将在附图中进行说明。

具体实施方式

图1.ZIKV特异性应答强度和应答供体的频率。对于(A)所有供体、(B)ZIKV供体或(C)DENV/ZIKV供体，显示了跨越ZIKV蛋白质组的每个重叠肽的累积IFN-γ应答(以点形成细胞(SFC)每百万细胞)。热图指示对每种蛋白质中的每种肽的阳性IFN-γ应答的供体数(C，衣壳；M，膜；E，包膜，NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。每个图下方的数字代表每种蛋白质在总响应中所占的百分比。

图2.曾有DENV感染的ZIKV供体显示出更广泛的T细胞应答，其强度更高。ZIKV和DENV/ZIKV供体的(A)反应广度和(B)反应强度。每个点代表一个供体(空心圆：ZIKV供体；实心圆：DENV/ZIKV供体)，长条代表每组供体的中值。使用非参数两尾曼-惠特尼检验计算P值。ZIKV(C)和DENV/ZIKV(D)供体中每个供体对单个肽的应答频率。每个点代表一个肽。条形代表每个供体的中值应答。

图3.在ZIKV和DENV/ZIKV供体中与DENV的应答强度和序列相同性的比较。每个点代表不同供体针对一种肽的累积应答。百分比代表ZIKV序列与4种DENV血清型之间的平均相同性值。(A)在ZIKV供体中诱导应答的肽。(B)在DENV/ZIKV供体中诱导应答的肽。

图4.18AAHK3C_pVAX-ZIKV_polyEpitop_pVAX1质粒的示意图。发明人使用ThermoFisher Scientific商业化的pVAX1质粒。将编码SEQ ID NO：124中定义的ZIKV的嵌合多表位的多核苷酸***所述质粒中。

图5.通过皮内注射和体内电穿孔用编码ZIKV的嵌合多表位的质粒DNA对HLA-A*2402转基因小鼠进行免疫(在第0天初免使用2x50μgDNA，在第21天使用2x50μgDNA加强)。ZIKV的所述嵌合多表位具有SEQ ID NO：99的氨基酸序列。编码所述嵌合多表位的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：124所定义。加强后第14天，通过腹膜内注射2mg抗IFNAR抗体(MAR1-5A3)暂时消除免疫小鼠的IFNα应答，并在用抗IFNAR抗体治疗后24小时进行病毒接种。对于病毒接种，小鼠接受腹膜内注射ZIKV的French Guyana毒株FG15，每只小鼠使用10³pfu，病毒接种后第1、2、3和6天通过qRT-PCR定量病毒血症。将四只小鼠用作对照小鼠(用空载体电穿孔)，并用pZIKV构建体疫苗接种5只小鼠(用编码ZIKV的嵌合多表位的质粒DNA电穿孔)。使用AgilePulse仪器(BTX，Harvard apparatus)的电穿孔设置由3个电压组组成：包括第一组450V、脉冲长度为50微秒、脉冲间隔为0.2微秒和1个脉冲，第二组450V、脉冲长度为50微秒、脉冲间隔为50微秒和1个脉冲，以及第三组110V、脉冲长度为10毫秒、脉冲间隔为20毫秒和8个脉冲。

实施例

伦理声明

人体血液样本以匿名方式从Fundacion Hematologica Colombia(Bogota D.C.，Colombia)的健康成年供体获得。本研究中描述的所有方案均已获得EL BosqueUniversity(Colombia)的机构审查委员会(IRB)的批准。

人体血液样本

供体是包括男女，年龄在20至60岁之间。在2016年10月至2016年12月的三个月时间内从Bogota D.C附近的ZIKV流行地区(主要来自Villavicencio，Meta)获得了总共82个样本。PBMC通过密度梯度离心纯化(Lymphoprep^TM；Stemcell technologies)并重悬于含有10％二甲基亚砜的FBS(Gibco)中，并冷冻保存在液氮中。由于细胞活力差，必须从研究中排除所获得的82个血液样本中的11个。

病毒和细胞系

使用DENV1 KDH0026A(由Dr L.Lambrecht，lnstitut Pasteur，Paris提供)，DENV2R0712259(由Dr.A.Failloux，lnstitut Pasteur，Paris提供)，DENV3 KDH0010A(由Dr.L.Lambrecht，lnstitut Pasteur，Paris提供)，DENV4CRBIP 10.4VIMFH4(来自lnstitutPasteur Collection)和ZIKV KU312312(由Dr.Dominique Rousset，lnstitutPasteur.Cayenne提供)进行体外测定。使用Leibovitz’s L-15培养基中培养的白纹伊蚊(Aedes Albopictus)蚊子细胞系C6/36生长所有病毒，该培养基补充有10％胎牛血清含0.1mM非必需氨基酸和1X磷酸胰蛋白培养液。Dr M.Flamand和Dr B.Jacquelin(lnstitutPasteur，Paris)分别友情提供了Vero-E6细胞和DC-SIGN-表达U937。

HLA分型

通过标准技术(QIAmp；Qiagen)从研究对象的PBMC中分离出的基因组DNA用于HLA分型。根据制造商的方案使用HLA I类(等位基因A、B和C)和HLA II类(等位基因DRB1)的基于Luminex的高分辨率分型(Sequence-Specific Oligonucleotides(SSO)typing；Immucor，Lifecodes)。

血清学

如前所述(Aubry M，et al.2017，Emerging infectious diseases23(4)：669-672)，使用重组的基于抗原(EDIII抗原)的间接ELISA测定ZIKV血清阳性。简而言之，将96孔板(Nunc，Life Technologies，Rochester，NY)在4℃用50ng的PBS中的抗原包被过夜。洗涤后，在37℃加入200μl含3％脱脂牛奶和0.1％Tween-20的PBS持续1小时。将封闭溶液替换为在含1.5％BSA和0.1％Tween-20的PBS中以1：500稀释的100μl血浆，然后将平板在37℃孵育60分钟。洗涤3次后，用辣根过氧化物酶缀合的山羊抗人IgG免疫球蛋白(ROCKLAND)检测结合的抗体。在37℃孵育1小时并洗涤3次后，添加100μl含TMB(KPL，Eurobio)的底物溶液。孵育15分钟后，使用自动酶标仪(Tecan infinite 200pro)在650nm处测定光密度(OD)。每个血浆样品一式两份进行测试。由在ZIKV爆发之前收集的具有阳性DENV IgG血清学的个体获得的血浆样品用作阴性对照。由阴性对照计算出的截断值为0.196。通过间接ELISA测定IgG的DENV血清阳性(Panbio；Alere)，并按照制造商的说明通过捕获ELISA测定IgM(Tecnosuma)。为了进一步表征血清阳性的供体，并确认ELISA的特异性，如先前所述进行了基于流式细胞术的中和测定(Andreatta M，et al.2015，Immunogenetics 67(11-12)：641-650；Nielsen M&Andreatta M 2016，Genome Med 8(1)：33)。简而言之，将血浆样品的10倍系列稀释液与病毒稀释液在37℃孵育1小时，所述病毒稀释液诱导7-15％的感染。然后在37℃将病毒抗体混合物加入U937-DC-SIGN细胞以中和DENV1-4感染，或加入Vero细胞以中和ZIKV感染，持续2小时，然后将细胞用新鲜培养基洗涤2次并然后温育24小时。然后将细胞用4％多聚甲醛固定，用与Alexa-488缀合的4G2抗体染色，并通过流式细胞仪测量感染细胞的百分比。抗体的中和效价表示为血浆的倒数稀释度，在该稀释度50％的病毒被抑制。来自ZIKV暴发之前收集的供体的血浆样本或来自试剂盒提供的阴性样本的血浆样本以检测抗DENV抗体没有显示出分别针对ZIKV或DENV感染的任何中和活性。进行ELISA和中和测定后，从本研究选择的71个血浆样品中，进一步选择了来自ZIKV血清阳性个体的总共9个样品和来自DENV/ZIKV血清阳性个体的11个样品进行ELISPOT分析。表1列出了这项研究中包括的二十个献血者的完整清单。

病毒序列

来自Colombia的ZIKV的相同氨基酸序列(GenBank KX087102和KU820897)用作重叠的15聚体肽组的参考。

来自Colombia的总共50个编码DENV序列的全长蛋白质(血清型1∶14个序列；血清型2∶16个序列；血清型3：13个序列；血清型4∶7序列)获自GenBank，并用于成对序列相同性比较。

肽

所有肽均由Mimotopes(Victoria，Australia)合成。通过ELISPOT测定测试了总共853个11个氨基酸重叠的15聚体肽和197个8个氨基酸重叠的9聚体肽。为了鉴定T细胞表位，将15-聚体肽合并为12个肽的库，并在第二次ELISPOT测定中测试阳性库中的单个肽。鉴定出阳性的15-聚体肽后，并根据其HLA I类或II类HLA限制性潜力(在至少两个供体之间预测或共享)，分别合成和测试9-聚体肽。

离体IFN-γ ELISPOT测定

用具有12种肽(2μg/ml，终浓度)或单个肽(1μg/ml，终浓度)库的含有10％人AB血清的0.2ml完全RPMI在包被有抗IFN-γ mAb(克隆1-D1K，Mabtech，Sweden)的96孔平底板(MSIPS 4510，Millipore，Bedford，MA)中孵育PBMC(2x10⁵)20小时。在37℃孵育20小时后，将孔用PBS/0.05％Tween 20洗涤，然后与生物素化的抗IFN-γ mAb(克隆7-B6-1，Mabtech)孵育1小时30分钟。使用链霉亲和素碱性磷酸酶(Mabtech)和BCIP/NBT底物(Promega，France)对斑点进行显影，并使用自动ELISPOT读数器(Immunospot，Cellular TechnologyLimited，Germany)对斑点进行计数。相对于1x10⁶PBMC，以斑点形成细胞(SFC)表达IFN-γ产生细胞的数量。通过减去未刺激的对照孔中检测到的斑点数来计算值。如果值等于或大于20个斑点，且比未刺激的对照孔的平均值高至少三倍，则认为该值是正值。作为阳性对照，用CEF肽库(Mabtech)刺激细胞。

免疫原性和HLA限制预测

分别使用NetMHCpan3.0和NetMHCIIpan3.1服务器分析肽与MHC I类和II类等位基因的结合可能性评估(Andreatta M，et al.2015，Immunogenetics 67(11-12)：641-650；Nielsen M&Andreatta M 2016，Genome Med 8(1)：33)。

统计学

使用Prism软件7.0版(GraphPad Software)分析所有数据。使用非参数两尾曼恩惠特尼检验确定统计学显著性以比较两个独立组。认为在P＜0.05处差异显著。

结果

ZIKV蛋白质组免疫显性区域的鉴定

为了研究在ZIKV感染后诱导的T细胞免疫，发明人在γ干扰素(IFN-γ)特异性酶联免疫吸附点(ELISPOT)测定中检查了生活在ZIKV流行区的献血者的应答。通过ELISA对所有研究参与者的血液样本进行了ZIKV IgG和DENV IgM和IgG的存在的测试，以及通过基于流式细胞术的中和测定测试针对ZIKV和4种DENV血清型的病毒特异性抗体的存在，来自ZIKV血清阳性个体的PBMC进行HLA分型。表1列出了这项研究中所包括的献血者的细节。针对跨整个ZIKV蛋白质组的15-聚体肽库(重叠11个氨基酸)的T细胞反应性，筛选了来自20个ZIKV血清阳性供体的PBMC。分析应答强度(斑点形成细胞(SFC)每10⁶个细胞)和应答供体的频率，发现非结构(NS)蛋白NS1、NS3和NS5是最活跃和最常被识别的蛋白，占总应答的69％(图1A)。令人惊讶的是，在ZIKV供体中，这些NS1、NS3和NS5分别代表总应答的15％、19％和35％，而据报道，NS3、NS4B和NS5蛋白分别占DENV特异性T细胞应答的31％、15％和22％(Simmons CP，et al.2005，J.Virol.79(9)：5665-5675；Duangchinda T，et al.2010，ProcNatl Acad Sci USA107(39)：16922-16927；Rivino L，et al.2013，J.Virol.87(5)：2693-2706；WeiskopfD，et al.2013，Proc Natl Acad Sci U S A 110(22)：E2046-2053)。由于在DENV和ZIKV流行地区选择了这些供体，并且由于这些病毒共享总共43％的蛋白质序列相同性(对于非结构蛋白，高达68％)，因此发明人试图区分ZIKV特异性表位以及两种病毒共享的表位。在20名ZIKV血清阳性的献血者中，有11个个体同时具有抗DENV和抗ZIKV IgG抗体，而9个个体没有发现任何可检测的抗DENV抗体(表1)。因此，本发明人分别分析了仅具有ZIKV感染史的供体(ZIKV供体)和具有DENV和ZIKV感染史的供体(DENV/ZIKV供体)的T细胞应答。如图1B和1C所示，NS1、NS3和NS5蛋白分别占ZIKV供体应答的13％、31％和32％，而它们在DENV/ZIKV供体中分别占应答的15％、16％和36％。这些结果证实了NS1、NS3和NS5是ZIKV感染供体中T细胞的主要靶，而不管先前是否感染了DENV，并且与仅感染ZIKV的供体相比，揭示了先前感染DENV的供体中针对NS5的应答频率和强度增加。

在跨越整个ZIKV蛋白质组的853个肽中，有410个肽引起了显著的T细胞应答，其中一些被多个供体识别。对于大多数抗原肽，应答供体的HLAI类和II类等位基因与预测结合该表位的等位基因相吻合(Andreatta M，et al.2015，Immunogenetics 67(11-12)：641-650；Nielsen M&Andreatta M 2016，Genome Med 8(1)：33)。在ZIKV和DENV/ZIKV供体中诱导强烈应答的表位中，几个15-聚体肽包含预计会与至少一个由应答供体表达的等位基因强烈结合的短序列(表2)。例如，NS2B_117-131肽(具有如在SEQ ID NO：25中所限定的氨基酸序列)包含10聚体序列(具有如在SEQ ID NO：26中所限定的氨基酸序列)，其被预测与应答供体55表达的HLA-A*0301和-A*1101分子强烈结合。在其他情况下，多个反应供体表达至少一个共同的等位基因，具有与刺激肽结合的强大潜力。这对于在包含预测与HLA-B*5101和HLA-A*0201等位基因结合的9聚体(具有如在SEQ ID NO：9中所限定的氨基酸序列)和10聚体(具有如在SEQ ID NO：8中所限定的氨基酸序列)的包膜中的E_455-469肽(具有如在SEQ IDNO：7中所限定的氨基酸序列)成立，这两个等位基因均由应答供体1和77表达。这也适用于NS5_13-27肽(具有如在SEQ ID NO：46中所限定的氨基酸序列)，该NS5_13-27肽在共享HLA-B*3501等位基因的供体55和69中诱导了强烈应答，预计该等位基因以高亲和力与9聚体肽MSALEFYSY(具有如在SEQ ID NO：47中所限定的氨基酸序列)结合。有趣的是，该表位还显示出在携带HLA-A*0101分子的转基因小鼠中诱导显著应答，该HLA-A*0101分子由供体69表达(Wen J，et al.2017，Nat Microbiol 2：17036)。类似地，在表达HLA-B*4002和-B*4403等位基因的供体28、53和66中观察到针对NS5_546-560肽(具有如在SEQ ID NO：67中所限定的氨基酸序列)的强T细胞应答，并在共享预测的HLA-A*2402等位基因的供体33和59中观察到针对NS5_605-619肽(具有如在SEQ ID NO：72中所限定的氨基酸序列)的强T细胞应答。最后，发明人还鉴定了NS4B和NS5蛋白中的几个9聚体免疫显性表位，包括NS4B_112-126肽(具有如在SEQ IDNO：41中所限定的氨基酸序列)、NS5_293-307肽(具有如在SEQ ID NO：49和50中所限定的氨基酸序列)、NS5_297-311肽(具有如在SEQ ID NO：53-55中所限定的氨基酸序列)和NS5_345-359肽(具有如在SEQ ID NO：58中所限定的氨基酸序列)中，其在共享一个或多个等位基因的供体中诱导大量T细胞应答，这些等位基因具有与这些肽结合的强大潜力。

值得注意的是，在NS3和NS5蛋白中，已经有几种表位被描述为免疫显性表位，无论是在人感染DENV或接种疫苗后还是在小鼠ZIKV感染后预测或通过实验验证(Wen J，etal.2017，Nat Microbiol 2：17036；Dar H，et al.2016，Asian Pac J Trop Med 9(9)：844-850；Weiskopf D，et al.2015，J.Virol.89(1)：120-128；Dikhit MR，et al.2016，Infection，genetics and evolution：journal of molecular epidemiology andevolutionary genetics in infectious diseases 45：187-197)。实际上，在DENV/ZIKV供体中鉴定的9聚体肽中，NS5_293-307(具有如在SEQ ID NO：49和50中所限定的氨基酸序列)、NS5_297-311(具有如在SEQ ID NO：53-55中所限定的氨基酸序列)和NS5_345-359(具有如在SEQ IDNO：58中所限定的氨基酸序列)在用DENV1、DENV2感染或用DENV减毒活疫苗(DLAV)疫苗接种后的HLA-B*3501个体的PBMC中已经被检测到，分别在来自ZIKV的NS5_297-311肽(具有如在SEQID NO：53-55中所限定的氨基酸序列)和NS5_345-359肽(具有如在SEQ ID NO：58中所限定的氨基酸序列)中的302和350位残基上具有赖氨酸到精氨酸和苯丙氨酸到酪氨酸的氨基酸取代(Rivino L，et al.2013，J.Virol.87(5)：2693-2706；WeiskopfD，et al.2015，J.Virol.89(1)：120-128；Imrie A，et al.2007，J.Virol.81(18)：10081-10091)(表2)。从DENV/ZIKV供体获得的这些结果因此证实了这些NS5肽包含受HLA-B*3501分子限制的嵌套表位。然而，含有APRTVVAAEM表位(具有如在SEQ ID NO：29中所限定的氨基酸序列)的15聚体NS3_219-233肽(具有如在SEQ ID NO：28中所限定的氨基酸序列)在既不表达HLA-B*0702也不表达B*3501的2个DENV/ZIKV供体中诱导了实质性应答，尽管这些等位基因在疫苗接种DLAV的应答供体或在ZIKV感染后ifnar-/-HLA-B*0702转基因小鼠中表达(Wen J，et al.2017，Nat.Microbiol.2∶17036；WeiskopfD，et al.2015，J.Virol.89(1)：120-128)。这表明NS3_219-233肽(具有如在SEQ ID NO：28中所限定的氨基酸序列)除HLA-B*0702或B*3501外，还包含与其他HLA等位基因结合的另一表位或混杂表位。

先前感染DENV的供体中的应答更广，强度更高。

考虑到针对NS1的ZIKV特异性抗体应答以及DENV与ZIKV之间针对E和NS1蛋白的CD4 T细胞交叉反应水平低(Stettler K，et al.2016，Science 353(6301)：823-826)，发明人在免疫显性表位中比较了来自ZIKV供体的PBMC和来自DENV/ZIKV供体的PBMC中的T细胞应答。首先，比较ZIKV和DENV/ZIKV供体中应答T细胞的频率，表明DENV/ZIKV供体中的应答强度相对于ZIKV供体更高(图1B和1C)。在这两组中，每个供体的刺激肽数量以及每个供体的平均应答均有所不同，在先前有DENV感染的供体中，应答显著更广，应答强度更高(图2A，左图和右图)。为了确定该差异是否仅涉及在每个供体中引起更强应答的少量肽，或者是否涉及大多数肽，发明人绘制了两个不同的供体组中每个供体针对不同肽的应答频率。如图2B所示，在ZIKV供体中，9个个体中有2个显示中位应答高于100SFC/百万个细胞，而11个DENV/ZIKV供体中，有6个表现出了这种强应答，这也与更多数量的肽有关。该结果表明，与初次供体相比，在先前感染了DENV的供体中，针对ZIKV肽的T细胞活化频率更高，应答强度更高。这有力地证明了交叉反应性T细胞的存在，这些T细胞在DENV最初感染期间被引发，然后在随后的ZIKV感染期间扩增，如最近在连续感染DENV和ZIKV后的小鼠中所示(Wen J，etal.2017，Nat Microbiol 2.17036)。

DENV/ZIKV交叉反应性T细胞主要靶向NS5蛋白

为了更具体地鉴定ZIKV特异性肽和DENV/ZIKV交叉反应性肽，发明人比较了两种类型的供体识别的最具免疫显性的表位的序列。如图2A和表3所示，NS1和NS3蛋白包含高比例的肽，所述肽在ZIKV和DENV/ZIKV供体中均引起强烈应答，而E蛋白和更高程度的NS5蛋白则包含大多数仅在DENV/ZIKV供体中诱导强烈应答的肽。这表明NS1和NS3蛋白包含更多的ZIKV特异性表位，而NS5蛋白包含更多的DENV和ZIKV共享的并被交叉反应性T细胞识别的表位。令人惊讶的是，大多数仅由DENV/ZIKV供体识别的肽与四种DENV血清型具有高度的相同性。例如，在NS1蛋白中，诱导ZIKV供体应答的5个表位中有2个的序列显示出与4种DENV血清型有高于60％的相同性，而诱导DENV/ZIKV供体的强烈应答的NS5蛋白的11个表位中有8个显示与四种DENV血清型具有高于66.7％的序列相同性(表3)。为了确定增加应答的强度是否与和DENV具有更高序列相同性的肽的识别相关，发明人绘制了每种肽相对于DENV和ZIKV序列之间的相同性百分比的累积应答。在ZIKV供体中，只有四个与DENV具有约60％相同性的ZIKV肽可以引发高于300SFC每百万细胞的应答，而21个与DENV至少具有70％相同性的ZIKV肽在DENV/ZIKV供体中诱导了这种强烈应答(图3)；在这些供体中诱导最强T细胞应答的四种肽与DENV共享最高的序列相同性。总之，这些数据强烈支持了DENV和ZIKV感染后诱导的交叉反应性T细胞的活化，其识别了DENV与ZIKV之间的共同表位，并主导了针对ZIKV的T细胞应答。

在这项研究中，使用来自感染ZIKV的人献血者的PBMC，发明人鉴定了许多T细胞表位，该T细胞表位对ZIKV特异或在DENV与ZIKV之间共享。虽然DENV特异性T细胞应答主要针对NS3、NS4B和NS5，但是针对ZIKV的应答主要靶向NS1、NS3和NS5蛋白中的表位。在先前被DENV感染的供体中观察到针对来自NS5蛋白的肽的更强和更广的IFN-γ应答，导致发明人推测该区包含更多被交叉反应性T细胞识别的肽，而NS1蛋白优先被ZIKV特异性T细胞靶向。与NS1蛋白相比，这些数据与NS5蛋白中ZIKV和DENV序列中观察到的更高百分比相同性相一致。除其序列相同性外，在亚洲ZIKV谱系中观察到的高NS 1分泌性((LiuY，et al.2017，Nature 545(7655)：482-486)也可以解释与在DENV感染的供体中观察到的NS1特异性T细胞的频率相比，在感染ZIKV的供体中所诱导的NS1特异性T细胞的频率更高(Weiskopf D，etal.2013，Proc Natl Acad Sci US A 110(22)：E2046-2053)。

对于几个表位，该15聚体肽或9聚体肽与最近在表达人HLA分子的转基因小鼠中鉴定的表位匹配，从而证实了对该肽的I类等位基因限制。对于在表达HLA-B*0702等位基因的供体中诱导了应答的15聚体肽VARVSPFGGLKRLPA(具有如在SEQ ID NO：92中所限定的氨基酸序列)就是这种情况(数据未显示)，其包含显示在感染ZIKV的HLA-B*0702转基因小鼠中引发显著应答的C25-35肽SPFGGLKRLPA(具有如在SEQ ID NO：93中所限定的氨基酸序列)(Wen J，et al.2017，Nat Microbiol 2：17036)。在分别表达HLA-B*0702和HLA-A*0101等位基因的人供体中(数据未显示和表2)和在表达这些等位基因的转基因小鼠中(Wen J，etal.2017，Nat Microbiol2：17036)用诱导强烈应答的NS3肽(FPDSNSPIM，具有如在SEQ IDNO：94中所限定的氨基酸序列)、NS4B肽(RGSYLAGASLIYTVT，具有如在SEQ ID NO：95中所限定的氨基酸序列)和NS5肽(NQMSALEFYSY，具有如在SEQ ID NO：96中所限定的氨基酸序列)建立相同的相关性。在其他情况下，还可以在应答供体中鉴定出在HLA-B*0702和HLA-A*0101转基因小鼠中鉴定出的表位，尽管它们不表达这些等位基因，例如NS3_219-233肽(具有如在SEQ ID NO：28中所限定的氨基酸序列)(表2)和NS1_19-33肽(具有如在SEQ ID NO：78中所限定的氨基酸序列)或NS5_13-27肽(具有如在SEQ ID NO：46中所限定的氨基酸序列)(表3)，其在不表达两个等位基因HLA-B*0702或HLA-A*0101的供体中引起应答。对于这些供体，一种可能性可能是，转基因小鼠中鉴定出的表位对于不同于转基因小鼠表达的等位基因的人HLA等位基因具有更高的亲和力，或者15聚体肽包含与不同等位基因结合的另一表位。使用9聚体表位的结合研究和使用TAP缺陷型细胞的HLA I类稳定化测定应区分这些可能性。

发明人还报道了在DENV感染和ZIKV感染后鉴定与DENV共享共同序列并且优先被交叉反应性T细胞靶向的几种肽。在这些肽中，NS5_293-307肽(具有如在SEQ ID NO：48中所限定的氨基酸序列)和NS5_297-311肽(具有如在SEQ ID NO：52中所限定的氨基酸序列)包含氨基酸序列HPYRTWAYH(具有如在SEQ ID NO：49中限定的氨基酸序列)，其与先前在感染了DENV1的太平洋岛民中鉴定的表位共享七个氨基酸(Imrie A，et al.2007，J.Virol.81(18)：10081-10091)。类似地，NS5_325-339肽(具有如在SEQ ID NO：86中所限定的氨基酸序列)包含氨基酸序列KPWDVVTGV(具有如在SEQ ID NO：97中所限定的氨基酸序列)，其与在这些被DENV1感染的个体中鉴定的表位KPWDVIPMV(具有如在SEQ ID NO：98所限定的氨基酸序列)具有66.7％的相同性(Imrie A，et al.2007J.Virol.81(18)：10081-10091)。最后，在DENV/ZIKV供体(表3)中诱导最强应答的NS5_345-359肽(具有如在SEQ ID NO：58中所限定的氨基酸序列)、NS5_465-479肽(具有如在SEQ ID NO：88中所限定的氨基酸序列)和NS5_481-495肽(具有如在SEQ ID NO：89中所限定氨基酸序列)还包含先前在DENV感染的个体中鉴定出的9聚体表位(WeiskopfD，et al.2015，J.Virol.89(1)：120-128)。总而言之，这些数据揭示了DENV/ZIKV交叉反应性T细胞的活化，该细胞主导了连续的DENV和ZIKV感染后的应答。值得注意的是，尽管这些交叉反应性肽与DENV表现出高度的序列相同性，并可以在DENV感染后刺激T细胞应答，但这些肽在初次感染ZIKV后并没有诱导应答，这表明这些肽在DENV的环境下但不是ZIKV感染的环境下是免疫显性的。可以预期该结果，因为表位的免疫显性或其相对丰度取决于该蛋白表达的其他表位。这也与先前的观察一致，该观察表明表位的产生与蛋白质序列中表达的侧翼残基的可切割性相关(Zhang SC，et al.2012，J.Immunol.188(12)：5924-5934)。重要的是，对于这些交叉反应性表位，在ZIKV感染的供体中不存在T细胞应答，不仅是由于该人群中不存在呈递的HLA等位基因，因为在应答DENV/ZIKV供体中表达的大多数等位基因在ZIKV供体中也有表达(表1)。这是发明人针对NS5_13-27表位(具有如在SEQ IDNO：46中所限定的氨基酸序列)、NS5_293-307表位(具有如在SEQ ID NO：48中所限定的氨基酸序列)、NS5_345-359表位(具有如在SEQ ID NO：57中所限定的氨基酸序列)和NS5_546-560表位(具有如在SEQ ID NO：67中所限定的氨基酸序列)所观察到的，预测是分别与由ZIKV供体经常表达的HLA-B*3501和HLA-B*4002等位基因的强结合者(表2和图3)。总而言之，这些结果表明，在最初的ZIKV感染的情况下，对ZIKV特异性表位有优先识别，而在感染异源DENV/ZIKV后，存在针对交叉反应性表位的更频繁、更强T细胞应答。有趣的是，在DENV/ZIKV供体中观察到的针对这些NS5表位的强T细胞应答主要依赖于表达HLA-B*3501等位基因的供体，该等位基因是与针对DENV的高强度应答相关的等位基因，并且对DENV感染和疾病有更强的保护(Weiskopf D，et al.2013，ProcNatl Acad Sci U S A 110(22)：E2046-2053)。由于所有血液样品均得自无症状ZIKV感染史的供体，因此本发明人无法将在HLA-B*3501供体中获得的ZIKV特异性T细胞应答的强度与对疾病的保护联系起来。需要对更多的对原发性ZIKV感染后具有较高疾病易感性的对象进行研究，以确定就DENV而言，对于ZIKV感染中的T细胞是否具有HLA相关的保护作用。同样，如最近在小鼠中所建议的那样，比较曾患有或未曾经历过先前DENV感染的供体的疾病严重程度，以确定感染DENV后诱导的交叉反应性T细胞是否可以针对ZIKV感染和疾病介导更好的防护也很重要(W Wen J，et al.2017，Nat Microbiol 2∶17036；Elong Ngono A，et al.2017，Cell host&microbe 21(1)：35-46)。由于CD4+和CD8+T细胞均显示出对DENV感染的保护作用，因此需要对MHC II类限制性反应进行全面分析，以确定CD4在ZIKV感染和疾病保护中的作用。最后，在无症状或有症状的供体中对ZIKV特异性T细胞进行进一步的表型分析，将有助于确定针对ZIKV感染和疾病的自然免疫和疫苗接种中的保护相关性。对于DENV特异性T细胞而言，确定是否对ZIKV特异性肽的强应答在特定的HLA等位基因中是否更频繁并且与多功能相关是特别重要的(Weiskopf D，et al.2013，Proc Natl Acad Sci U S A 110(22)：E2046-2053)。

总之，尽管许多研究集中在针对ZIKV的抗体应答上，更具体地说是ZIKV和DENV之间共享的B细胞表位的鉴定，但关于T细胞在控制ZIKV感染中的作用知之甚少。使用来自最近有ZIKV感染史、血清阳性或非DENV的献血者的PBMC，发明人通过干扰素(IFN)-γ酶联免疫斑点(ELISPOT)测定筛选完整的蛋白质组，建立了ZIKV T细胞表位分布的第一个作图。发明人表明，非结构蛋白NS1、NS3和NS5包含诱导强T细胞应答的大部分免疫显性肽。发明人还表明，NS5蛋白包含两种病毒共享的许多表位，并且其在DENV和ZIKV感染后诱导最高的应答。令人惊讶的是，具有DENV感染史的供体显示出对以前鉴定为DENV CD8+T细胞表位的肽的实质性应答。在这些供体中观察到的最强的T细胞应答对应于与四种DENV血清型具有高度氨基酸相同性的序列，表明交叉反应性T细胞被活化。这些结果对未来的ZIKV疫苗和DENV疫苗具有至关重要的意义，并为研究ZIKV特异性和DENV/ZIKV共享的T细胞表位在诱导针对这些病毒的长期免疫中的作用提供了新的机会。

小鼠中的多ZIKV DNA疫苗接种

使用编码嵌合多表位的质粒并电穿孔，以2x50μg DNA，间隔3周进行DNA免疫，并在病毒加强免疫后15天进行攻击(腹膜内注射ZIKV，10³pfu/小鼠)。

用质粒和电穿孔(EP)进行DNA疫苗接种如下进行：

对于疫苗接种，将通过背部皮内接种两次注射25μl的DNA，每次2mg/ml，然后立即使用AgilePulse仪器(BTX Harvard Apparatus)进行电穿孔。

电穿孔程序将包括3个电压组：

第1组：450V，脉冲长度50微秒，脉冲间隔0.2微秒，Nb脉冲：1；第2组：450V，脉冲长度50微秒，脉冲间隔50微秒，Nb脉冲：1；第3组：110V，脉冲长度10毫秒，脉冲间隔20毫秒，Nb脉冲：8。

在用ZIKV攻击前的第-1天，进行2mg抗IFNAR抗体(MAR1-5A3)的腹膜内注射，以暂时阻断I型IFN应答。

在攻击后第1天至第6天，通过qRT-PCR对血浆样品中的病毒血症进行定量。

非人类灵长类动物(印度恒河猴)中的DNA疫苗接种

DNA疫苗接种将在第0和4周时进行2次肌内注射，其中注射1mg编码ZIKV嵌合多表位的质粒，然后如前所述，在4周后通过皮下接种10⁴pfuZIKV进行攻击(Dowd，K.A.，etal.Science 2016，354，237-240)。

在第0天(初免接种前)，初免接种后第7天，然后在第35天(加强免疫后一周)和第60天(用ZIKV攻击之前)收集PBMC，以通过ELISpot分析针对覆盖整个嵌合多表位序列的重叠肽的T细胞应答(IFN-γ和TNF-α)。通过细胞内染色分析单核细胞CD14、DC、T细胞、B细胞和NK细胞的数量和表型，以及T细胞(CD8 T细胞)的细胞因子谱。

还在第0天(免疫接种之前)、第14天、第28天(加强免疫之前)和第56天(免疫攻击之前)收集血样，以通过聚焦减少中和滴定(FRNT)测定中和抗体滴度。

从第56天(攻击前)到第66天，每天通过qRT-PCR测试血浆样品，用于定量病毒血症。

用表达细胞因子的质粒作为遗传佐剂以去除电穿孔的使用DNA疫苗接种的替代方案

最近的研究表明，将表达T细胞表位的质粒与表达IL-12或GM-CSF或IL-12和GM-CSF的组合的质粒共同施用改善T细胞应答，从而充分去除了电穿孔(EP)的需要(Boyer，J.D.，et al.J Med Primatol 2005，34，262-270；Suschak，J.J.，et al.The Journal ofinfectious diseases 2018；Suschak，J.J.，et al.Antiviral research 2018，159，113-121)。

因此，本发明人将评估与多ZIKV DNA免疫组合的IL-12和GM-CSFDNA免疫对恒河猴中针对ZIKV肽的T细胞应答的强度和针对ZIKV感染的免疫保护的作用。

序列表

<110> 巴斯德研究院

埃尔博斯克大学

<120> 包含非结构蛋白的寨卡病毒嵌合多表位及其在免疫原性组合物中的用途

<130> B12633A/AD/DP

<140> PCT/EP2018/xxxxx

<141> 2018-11-08

<150> EP17306553.3

<151> 2017-11-09

<160> 124

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 15-mer epitope in the C protein of ZIKV (C-13-27)

<400> 1

Ile Val Asn Met Leu Lys Arg Gly Val Ala Arg Val Ser Pro Phe

1 5 10 15

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<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 9-mer epitope in the C protein of ZIKV (C-13-27)

<400> 2

Leu Lys Arg Gly Val Ala Arg Val Ser

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 9-mer predicted epitope in the C protein of ZIKV (C-13-27)

<400> 3

Met Leu Lys Arg Gly Val Ala Arg Val

1 5

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 15-mer epitope in the C protein of ZIKV (C-85-99)

<400> 4

Lys Lys Asp Leu Ala Ala Met Leu Arg Ile Ile Asn Ala Arg Lys

1 5 10 15

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<212> PRT

<213> Artificial sequence

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<223> 9-mer first epitope in the C protein of ZIKV (C-85-99)

<400> 5

Ala Ala Met Leu Arg Ile Ile Asn Ala

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 9-mer second epitope in the C protein of ZIKV (C-85-99)

<400> 6

Lys Asp Leu Ala Ala Met Leu Arg Ile

1 5

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<400> 7

Gly Met Ser Trp Phe Ser Gln Ile Leu Ile Gly Thr Leu Leu Met

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<210> 8

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial sequence

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<400> 8

Gly Met Ser Trp Phe Ser Gln Ile Leu Ile

1 5 10

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence

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<223> 9-mer predicted epitope in the E protein of ZIKV (E-455-469)

<400> 9

Met Ser Trp Phe Ser Gln Ile Leu Ile

1 5

<210> 10

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<212> PRT

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<223> 15-mer epitope in the NS1 protein of ZIKV (NS1-63-77)

<400> 10

Met Glu Asn Ile Met Trp Arg Ser Val Glu Gly Glu Leu Asn Ala

1 5 10 15

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<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 9-mer first epitope in the NS1 protein of ZIKV (NS1-63-77)

<400> 11

Ile Met Trp Arg Ser Val Glu Gly Glu

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence

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<223> 9-mer second epitope in the NS1 protein of ZIKV (NS1-63-77)

<400> 12

Trp Arg Ser Val Glu Gly Glu Leu Asn

1 5

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<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial sequence

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<223> 10-mer predicted epitope in the NS1 protein of ZIKV (NS1-63-77)

<400> 13

Ile Met Trp Arg Ser Val Glu Gly Glu Leu

1 5 10

<210> 14

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 15-mer epitope in the NS1 protein of ZIKV (NS1-83-97)

<400> 14

Gly Val Gln Leu Thr Val Val Val Gly Ser Val Lys Asn Pro Met

1 5 10 15

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence

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<223> 9-mer epitope in the NS1 protein of ZIKV (NS1-83-97)

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Val Gln Leu Thr Val Val Val Gly Ser

1 5

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<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 10-mer predicted epitope in the NS1 protein of ZIKV (NS1-83-97)

<400> 16

Val Gln Leu Thr Val Val Val Gly Ser Val

1 5 10

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<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

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<223> 15-mer epitope in the NS1 protein of ZIKV (NS1-163-177)

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Phe His Thr Ser Val Trp Leu Lys Val Arg Glu Asp Tyr Ser Leu

1 5 10 15

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<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 9-mer first epitope in the NS1 protein of ZIKV (NS1-163-177)

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Val Trp Leu Lys Val Arg Glu Asp Tyr

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 9-mer second epitope in the NS1 protein of ZIKV (NS1-163-177)

<400> 19

Trp Leu Lys Val Arg Glu Asp Tyr Ser

1 5

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<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 12-mer predicted epitope in the NS1 protein of ZIKV (NS1-163-177)

<400> 20

His Thr Ser Val Trp Leu Lys Val Arg Glu Asp Tyr

1 5 10

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 9-mer first predicted epitope in the NS1 protein of ZIKV

(NS1-163-177)

<400> 21

His Thr Ser Val Trp Leu Lys Val Arg

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 9-mer second predicted epitope in the NS1 protein of ZIKV

(NS1-163-177)

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Phe His Thr Ser Val Trp Leu Lys Val

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<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

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<223> 15-mer epitope in the NS1 protein of ZIKV (NS1-275-289)

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<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 9-mer epitope in the NS1 protein of ZIKV (NS1-275-289)

<400> 24

Cys Pro Gly Thr Lys Val His Val Glu

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<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

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<223> 15-mer epitope in the NS2B protein of ZIKV (NS2B-117-131)

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Ala Ala Gly Ala Trp Tyr Val Tyr Val Lys Thr Gly Lys Arg Ser

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<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 10-mer predicted epitope in the NS2B protein of ZIKV

(NS2B-117-131)

<400> 26

Ala Ala Gly Ala Trp Tyr Val Tyr Val Lys

1 5 10

<210> 27

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 9-mer predicted epitope in the NS2B protein of ZIKV

(NS2B-117-131)

<400> 27

Tyr Val Tyr Val Lys Thr Gly Lys Arg

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<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

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Thr Val Ile Leu Ala Pro Thr Arg Val Val Ala Ala Glu Met Glu

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<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 10-mer epitope in the NS3 protein of ZIKV (NS3-219-233)

<400> 29

Ala Pro Thr Arg Val Val Ala Ala Glu Met

1 5 10

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<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 10-mer predicted epitope in the NS3 protein of ZIKV (NS3-219-233)

<400> 30

Ile Leu Ala Pro Thr Arg Val Val Ala Ala

1 5 10

<210> 31

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 15-mer epitope in the NS3 protein of ZIKV (NS3-271-285)

<400> 31

Leu Gln Pro Ile Arg Val Pro Asn Tyr Asn Leu Tyr Ile Met Asp

1 5 10 15

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<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 9-mer predicted epitope in the NS3 protein of ZIKV (NS3-271-285)

<400> 32

Val Pro Asn Tyr Asn Leu Tyr Ile Met

1 5

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<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 15-mer epitope in the NS3 protein of ZIKV (NS3-311-325)

<400> 33

Ala Ala Ile Phe Met Thr Ala Thr Pro Pro Gly Thr Arg Asp Ala

1 5 10 15

<210> 34

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 9-mer first epitope in the NS3 protein of ZIKV (NS3-311-325)

<400> 34

Phe Met Thr Ala Thr Pro Pro Gly Thr

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 9-mer second epitope in the NS3 protein of ZIKV (NS3-311-325)

<400> 35

Ile Phe Met Thr Ala Thr Pro Pro Gly

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<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 15-mer epitope in the NS4A protein of ZIKV (NS4A-86-100)

<400> 36

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<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 10-mer predicted epitope in the NS4A protein of ZIKV

(NS4A-86-100)

<400> 37

Ser Ala Trp Leu Met Trp Leu Ser Glu Ile

1 5 10

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<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 9-mer first predicted epitope in the NS4A protein of ZIKV

(NS4A-86-100)

<400> 38

Val Thr Leu Gly Ala Ser Ala Trp Leu

1 5

<210> 39

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 9-mer second predicted epitope in the NS4A protein of ZIKV

(NS4A-86-100)

<400> 39

Leu Gly Ala Ser Ala Trp Leu Met Trp

1 5

<210> 40

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 15-mer epitope in the NS4B protein of ZIKV (NS4B-112-126)

<400> 40

Ala Ile Ile Leu Leu Val Ala His Tyr Met Tyr Leu Ile Pro Gly

1 5 10 15

<210> 41

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 9-mer epitope in the NS4B protein of ZIKV (NS4B-112-126)

<400> 41

Ala Ile Ile Leu Leu Val Ala His Tyr

1 5

<210> 42

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 10-mer epitope in the NS4B protein of ZIKV (NS4B-112-126)

<400> 42

Leu Leu Val Ala His Tyr Met Tyr Leu Ile

1 5 10

<210> 43

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 8-mer epitope in the NS4B protein of ZIKV (NS4B-112-126)

<400> 43

Leu Val Ala His Tyr Met Tyr Leu

1 5

<210> 44

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 9-mer first predicted epitope in the NS4B protein of ZIKV

(NS4B-112-126)

<400> 44

Leu Leu Val Ala His Tyr Met Tyr Leu

1 5

<210> 45

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 9-mer second predicted epitope in the NS4B protein of ZIKV

(NS4B-112-126)

<400> 45

Leu Val Ala His Tyr Met Tyr Leu Ile

1 5

<210> 46

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 15-mer epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-13-27)

<400> 46

Lys Ala Arg Leu Asn Gln Met Ser Ala Leu Glu Phe Tyr Ser Tyr

1 5 10 15

<210> 47

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 9-mer predicted epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-13-27)

<400> 47

Met Ser Ala Leu Glu Phe Tyr Ser Tyr

1 5

<210> 48

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 15-mer epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-293-307)

<400> 48

Trp Phe Phe Asp Glu Asn His Pro Tyr Arg Thr Trp Ala Tyr His

1 5 10 15

<210> 49

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 9-mer first epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-293-307)

<400> 49

His Pro Tyr Arg Thr Trp Ala Tyr His

1 5

<210> 50

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 9-mer second epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-293-307)

<400> 50

Phe Phe Asp Glu Asn His Pro Tyr Arg

1 5

<210> 51

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 8-mer predicted epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-293-307)

<400> 51

Phe Phe Asp Glu Asn His Pro Tyr

1 5

<210> 52

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 15-mer epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-297-311)

<400> 52

Glu Asn His Pro Tyr Arg Thr Trp Ala Tyr His Gly Ser Tyr Glu

1 5 10 15

<210> 53

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 9-mer first epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-297-311)

<400> 53

Asn His Pro Tyr Arg Thr Trp Ala Tyr

1 5

<210> 54

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 9-mer second epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-297-311)

<400> 54

Tyr Arg Thr Trp Ala Tyr His Gly Ser

1 5

<210> 55

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 9-mer third epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-297-311)

<400> 55

Arg Thr Trp Ala Tyr His Gly Ser Tyr

1 5

<210> 56

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 10-mer predicted epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-297-311)

<400> 56

Tyr Arg Thr Trp Ala Tyr His Gly Ser Tyr

1 5 10

<210> 57

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 15-mer epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-345-359)

<400> 57

Thr Asp Thr Thr Pro Tyr Gly Gln Gln Arg Val Phe Lys Glu Lys

1 5 10 15

<210> 58

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 9-mer epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-345-359)

<400> 58

Thr Pro Tyr Gly Gln Gln Arg Val Phe

1 5

<210> 59

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 15-mer epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-425-439)

<400> 59

Glu Ala Val Asn Asp Pro Arg Phe Trp Ala Leu Val Asp Lys Glu

1 5 10 15

<210> 60

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 9-mer epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-425-439)

<400> 60

Glu Ala Val Asn Asp Pro Arg Phe Trp

1 5

<210> 61

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 13-mer predicted epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-425-439)

<400> 61

Ala Val Asn Asp Pro Arg Phe Trp Ala Leu Val Asp Lys

1 5 10

<210> 62

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 15-mer epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-461-475)

<400> 62

Lys Lys Gln Gly Glu Phe Gly Lys Ala Lys Gly Ser Arg Ala Ile

1 5 10 15

<210> 63

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 12-mer predicted epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-461-475)

<400> 63

Gly Glu Phe Gly Lys Ala Lys Gly Ser Arg Ala Ile

1 5 10

<210> 64

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 15-mer epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-473-487)

<400> 64

Arg Ala Ile Trp Tyr Met Trp Leu Gly Ala Arg Phe Leu Glu Phe

1 5 10 15

<210> 65

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 9-mer predicted epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-473-487)

<400> 65

Tyr Met Trp Leu Gly Ala Arg Phe Leu

1 5

<210> 66

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 10-mer predicted epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-473-487)

<400> 66

Ala Ile Trp Tyr Met Trp Leu Gly Ala Arg

1 5 10

<210> 67

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 15-mer epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-546-560)

<400> 67

Arg Phe Asp Leu Glu Asn Glu Ala Leu Ile Thr Asn Gln Met Glu

1 5 10 15

<210> 68

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 9-mer predicted epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-546-560)

<400> 68

Asn Glu Ala Leu Ile Thr Asn Gln Met

1 5

<210> 69

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 15-mer epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-565-579)

<400> 69

Leu Ala Leu Ala Ile Ile Lys Tyr Thr Tyr Gln Asn Lys Val Val

1 5 10 15

<210> 70

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 10-mer predicted epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-565-579)

<400> 70

Leu Ala Leu Ala Ile Ile Lys Tyr Thr Tyr

1 5 10

<210> 71

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 9-mer predicted epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-565-579)

<400> 71

Ala Leu Ala Ile Ile Lys Tyr Thr Tyr

1 5

<210> 72

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 15-mer epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-605-619)

<400> 72

Gln Val Val Thr Tyr Ala Leu Asn Thr Phe Thr Asn Leu Val Val

1 5 10 15

<210> 73

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 9-mer epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-605-619)

<400> 73

Tyr Ala Leu Asn Thr Phe Thr Asn Leu

1 5

<210> 74

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 10-mer predicted epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-605-619)

<400> 74

Thr Tyr Ala Leu Asn Thr Phe Thr Asn Leu

1 5 10

<210> 75

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 15-mer epitope in the C protein of ZIKV (C-49-63)

<400> 75

Ala Ile Leu Ala Phe Leu Arg Phe Thr Ala Ile Lys Pro Ser Leu

1 5 10 15

<210> 76

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 15-mer epitope in the E protein of ZIKV (E-67-81)

<400> 76

Asp Met Ala Ser Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala Tyr

1 5 10 15

<210> 77

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 15-mer epitope in the E protein of ZIKV (E-87-101)

<400> 77

Asp Thr Gln Tyr Val Cys Lys Arg Thr Leu Val Asp Arg Gly Trp

1 5 10 15

<210> 78

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 15-mer epitope in the NS1 protein of ZIKV (NS1-19-33)

<400> 78

Val Phe Val Tyr Asn Asp Val Glu Ala Trp Arg Asp Arg Tyr Lys

1 5 10 15

<210> 79

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 15-mer epitope in the NS1 protein of ZIKV (NS1-55-69)

<400> 79

Cys Gly Ile Ser Ser Val Ser Arg Met Glu Asn Ile Met Trp Arg

1 5 10 15

<210> 80

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 15-mer epitope in the NS1 protein of ZIKV (NS1-91-105)

<400> 80

Gly Ser Val Lys Asn Pro Met Trp Arg Gly Pro Gln Arg Leu Pro

1 5 10 15

<210> 81

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 15-mer epitope in the NS1 protein of ZIKV (NS1-107-121)

<400> 81

Pro Val Asn Glu Leu Pro His Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys Ser

1 5 10 15

<210> 82

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 15-mer epitope in the NS1 protein of ZIKV (NS1-147-161)

<400> 82

His Arg Ala Trp Asn Ser Phe Leu Val Glu Asp His Gly Phe Gly

1 5 10 15

<210> 83

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 15-mer epitope in the NS1 protein of ZIKV (NS1-195-209)

<400> 83

His Ser Asp Leu Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Glu Lys Asn Asp Thr

1 5 10 15

<210> 84

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 15-mer epitope in the NS3 protein of ZIKV (NS3-131-145)

<400> 84

Pro Ala Gly Thr Ser Gly Ser Pro Ile Leu Asp Lys Cys Gly Arg

1 5 10 15

<210> 85

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 15-mer epitope in the NS3 protein of ZIKV (NS3-143-157)

<400> 85

Cys Gly Arg Val Ile Gly Leu Tyr Gly Asn Gly Val Val Ile Lys

1 5 10 15

<210> 86

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 15-mer epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-325-339)

<400> 86

Val Val Arg Leu Leu Ser Lys Pro Trp Asp Val Val Thr Gly Val

1 5 10 15

<210> 87

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 15-mer epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-373-387)

<400> 87

Gln Val Met Ser Met Val Ser Ser Trp Leu Trp Lys Glu Leu Gly

1 5 10 15

<210> 88

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 15-mer epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-465-479)

<400> 88

Glu Phe Gly Lys Ala Lys Gly Ser Arg Ala Ile Trp Tyr Met Trp

1 5 10 15

<210> 89

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 15-mer epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-481-495)

<400> 89

Gly Ala Arg Phe Leu Glu Phe Glu Ala Leu Gly Phe Leu Asn Glu

1 5 10 15

<210> 90

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 15-mer epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-573-586)

<400> 90

Thr Tyr Gln Asn Lys Val Val Lys Val Leu Arg Pro Ala Glu Lys

1 5 10 15

<210> 91

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 15-mer epitope in the NS5 protein of ZIKV (NS5-849-863)

<400> 91

Cys Gly Ser Leu Ile Gly His Arg Pro Arg Thr Thr Trp Ala Glu

1 5 10 15

<210> 92

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 15-mer epitope in the C protein of ZIKV (C-21-35)

<400> 92

Val Ala Arg Val Ser Pro Phe Gly Gly Leu Lys Arg Leu Pro Ala

1 5 10 15

<210> 93

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 11-mer epitope in the C protein of ZIKV (C-25-35)

<400> 93

Ser Pro Phe Gly Gly Leu Lys Arg Leu Pro Ala

1 5 10

<210> 94

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 9-mer epitope in the NS3 protein of ZIKV

<400> 94

Phe Pro Asp Ser Asn Ser Pro Ile Met

1 5

<210> 95

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 15-mer epitope in the NS4B protein of ZIKV

<400> 95

Arg Gly Ser Tyr Leu Ala Gly Ala Ser Leu Ile Tyr Thr Val Thr

1 5 10 15

<210> 96

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 11-mer epitope in the NS5 protein

<400> 96

Asn Gln Met Ser Ala Leu Glu Phe Tyr Ser Tyr

1 5 10

<210> 97

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 9-mer epitope contained in the NS5 protein (NS5-331-339)

<400> 97

Lys Pro Trp Asp Val Val Thr Gly Val

1 5

<210> 98

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 9-mer epitope in the NS5 protein

<400> 98

Lys Pro Trp Asp Val Ile Pro Met Val

1 5

<210> 99

<211> 962

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Amino acid sequence of a chimeric polyepitope of ZIKV

<400> 99

Gly Gly Phe Arg Ile Val Asn Met Leu Lys Arg Gly Val Ala Arg Val

1 5 10 15

Ser Pro Phe Gly Gly Leu Lys Arg Leu Pro Ala Gly Leu Leu Leu Gly

20 25 30

His Gly Pro Ile Arg Met Val Leu Ala Ile Leu Ala Phe Leu Arg Phe

35 40 45

Thr Ala Ile Lys Pro Ser Leu Gly Leu Ile Asn Arg Trp Gly Ser Val

50 55 60

Gly Lys Lys Glu Ala Met Glu Ile Ile Lys Lys Phe Lys Lys Asp Leu

65 70 75 80

Ala Ala Met Leu Arg Ile Ile Asn Ala Arg Lys Glu Lys Val Phe Val

85 90 95

Tyr Asn Asp Val Glu Ala Trp Arg Asp Arg Tyr Lys Tyr His Pro Asp

100 105 110

Ser Pro Arg Arg Leu Ala Ala Ala Val Lys Gln Ala Trp Glu Asp Gly

115 120 125

Ile Cys Gly Ile Ser Ser Val Ser Arg Met Glu Asn Ile Met Trp Arg

130 135 140

Ser Val Glu Gly Glu Leu Asn Ala Ile Leu Glu Glu Asn Gly Val Gln

145 150 155 160

Leu Thr Val Val Val Gly Ser Val Lys Asn Pro Met Trp Arg Gly Pro

165 170 175

Gln Arg Leu Pro Val Pro Val Asn Glu Leu Pro His Gly Trp Lys Ala

180 185 190

Trp Gly Lys Ser Tyr Phe Val Arg Ala Ala Lys Thr Asn Asn His Arg

195 200 205

Ala Trp Asn Ser Phe Leu Val Glu Asp His Gly Phe Gly Val Phe His

210 215 220

Thr Ser Val Trp Leu Lys Val Arg Glu Asp Tyr Ser Leu Glu Cys Asp

225 230 235 240

Pro Ala Val Ile Gly Thr Ala Val Lys Gly Lys Glu Ala Val His Ser

245 250 255

Asp Leu Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Glu Lys Asn Asp Thr Trp Ile Arg

260 265 270

Phe Glu Glu Cys Pro Gly Thr Lys Val His Val Glu Glu Thr Ile Phe

275 280 285

Lys Thr Lys Asp Gly Asp Ile Gly Ala Val Ala Leu Asp Tyr Pro Ala

290 295 300

Gly Thr Ser Gly Ser Pro Ile Leu Asp Lys Cys Gly Arg Val Ile Gly

305 310 315 320

Leu Tyr Gly Asn Gly Val Val Ile Lys Asn Gly Lys Thr Arg Arg Val

325 330 335

Leu Pro Glu Ile Val Arg Glu Ala Ile Lys Thr Arg Leu Arg Thr Val

340 345 350

Ile Leu Ala Pro Thr Arg Val Val Ala Ala Glu Met Glu Glu Ala Leu

355 360 365

Arg Gly Leu Pro Val Arg Tyr Met Thr Thr Ala Val Asn Val Thr His

370 375 380

Ser Gly Thr Glu Ile Val Asp Leu Met Cys His Ala Thr Phe Thr Ser

385 390 395 400

Arg Leu Leu Gln Pro Ile Arg Val Pro Asn Tyr Asn Leu Tyr Ile Met

405 410 415

Asp Glu Ala His Phe Thr Asp Pro Ser Ser Ile Ala Ala Arg Gly Tyr

420 425 430

Ile Ser Thr Arg Val Glu Met Gly Glu Ala Ala Ala Ile Phe Met Thr

435 440 445

Ala Thr Pro Pro Gly Thr Arg Asp Ala Phe Pro Asp Ser Asn Ser Pro

450 455 460

Ile Met Asp Thr Glu Val Glu Val Pro Gln Ala Gly Val Leu Phe Gly

465 470 475 480

Met Gly Lys Gly Met Pro Phe Tyr Ala Trp Asp Phe Gly Val Pro Leu

485 490 495

Leu Met Ile Gly Cys Tyr Ser Gln Leu Thr Pro Leu Thr Leu Ile Val

500 505 510

Ala Ile Ile Leu Leu Val Ala His Tyr Met Tyr Leu Ile Pro Gly Leu

515 520 525

Gln Ala Ala Ala Ala Arg Ala Ala Gln Lys Arg Thr Ala Ala Gly Ile

530 535 540

Met Lys Asn Ile Ile Gly Asn Arg Ile Glu Arg Ile Arg Ser Glu His

545 550 555 560

Ala Glu Thr Trp Phe Phe Asp Glu Asn His Pro Tyr Arg Thr Trp Ala

565 570 575

Tyr His Gly Ser Tyr Glu Ala Pro Thr Gln Gly Ser Ala Ser Ser Leu

580 585 590

Ile Asn Gly Val Val Arg Leu Leu Ser Lys Pro Trp Asp Val Val Thr

595 600 605

Gly Val Thr Gly Ile Ala Met Thr Asp Thr Thr Pro Tyr Gly Gln Gln

610 615 620

Arg Val Phe Lys Glu Lys Val Asp Thr Arg Val Pro Asp Pro Gln Glu

625 630 635 640

Gly Thr Arg Gln Val Met Ser Met Val Ser Ser Trp Leu Trp Lys Glu

645 650 655

Leu Gly Lys His Lys Arg Pro Arg Val Cys Thr Lys Glu Glu Phe Ile

660 665 670

Asn Lys Val Arg Ser Asn Ala Ala Leu Gly Ala Ile Phe Glu Glu Glu

675 680 685

Lys Glu Trp Lys Thr Ala Val Glu Ala Val Asn Asp Pro Arg Phe Trp

690 695 700

Ala Leu Val Asp Lys Glu Arg Glu His His Leu Arg Gly Glu Cys Gln

705 710 715 720

Ser Cys Val Tyr Asn Met Met Gly Lys Arg Glu Lys Lys Gln Gly Glu

725 730 735

Phe Gly Lys Ala Lys Gly Ser Arg Ala Ile Trp Tyr Met Trp Leu Gly

740 745 750

Ala Arg Phe Leu Glu Phe Glu Ala Leu Gly Phe Leu Asn Glu Arg Phe

755 760 765

Asp Leu Glu Asn Glu Ala Leu Ile Thr Asn Gln Met Glu Lys Gly His

770 775 780

Arg Ala Leu Ala Leu Ala Ile Ile Lys Tyr Thr Tyr Gln Asn Lys Val

785 790 795 800

Val Lys Val Leu Arg Pro Ala Glu Lys Gly Lys Thr Val Met Asp Ile

805 810 815

Ile Ser Arg Gln Asp Met Glu Ala Glu Glu Val Leu Glu Met Gln Asp

820 825 830

Leu Trp Leu Leu Arg Arg Ser Lys Pro Ser Thr Gly Trp Asp Asn Trp

835 840 845

Glu Glu Val Pro Phe Cys Ser His His Phe Asn Lys Leu His Leu Lys

850 855 860

Asp Gly Arg Ser Ile Val Val Pro Cys Arg His Gln Asp Glu Leu Ile

865 870 875 880

Gly Arg Ala Arg Val Ser Pro Gly Ala Gly Trp Ser Ile Arg Glu Thr

885 890 895

Ala Cys Leu Ala Lys Ser Tyr Ala Gln Met Trp Gln Leu Leu Tyr Phe

900 905 910

His Arg Arg Asp Leu Arg Leu Met Ala Asn Ala Ile Cys Ser Ser Val

915 920 925

Pro Val Asp Trp Val Pro Thr Gly Arg Thr Thr Trp Ser Ile His Gly

930 935 940

Lys Gly Glu Trp Met Thr Thr Glu Asp Met Leu Val Val Trp Asn Arg

945 950 955 960

Val Trp

<210> 100

<211> 2886

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Native nucleotide sequence of the polynucleotide encoding a

chimeric polyepitope of ZIKV

<400> 100

ggaggattcc ggattgtcaa tatgctaaaa cgcggagtag cccgtgtgag cccctttggg 60

ggcttgaaga ggctgccagc cggacttctg ctgggtcatg ggcccatcag gatggtcttg 120

gcgattctag cctttttgag attcacggca atcaagccat cactgggtct catcaataga 180

tggggttcag tggggaaaaa agaggctatg gaaataataa agaagttcaa gaaagatctg 240

gctgccatgc tgagaataat caatgctagg aaggagaagg tgttcgtcta taacgacgtt 300

gaagcctgga gggacaggta caagtaccat cctgactccc cccgtagatt ggcagcagca 360

gtcaagcaag cctgggaaga tggtatctgc gggatctcct ctgtttcaag aatggaaaac 420

atcatgtgga gatcagtaga aggggagctc aacgcaatcc tggaagagaa tggagttcaa 480

ctgacggtcg ttgtgggatc tgtaaaaaac cccatgtgga gaggtccaca gagattgccc 540

gtgcctgtga acgagctgcc ccacggctgg aaggcttggg ggaaatcgta cttcgtcaga 600

gcagcaaaga caaataacca tagagcatgg aacagctttc ttgtggagga tcatgggttc 660

ggggtatttc acactagtgt ctggctcaag gttagagaag attattcatt agagtgtgat 720

ccagccgtta ttggaacagc tgttaaggga aaggaggctg tacacagtga tctaggctac 780

tggattgaga gtgagaagaa tgacacatgg attcggtttg aggaatgccc aggcactaag 840

gtccacgtgg aggaaacaat atttaagaca aaggatgggg acattggagc ggttgcgctg 900

gattacccag caggaacttc aggatctcca atcctagaca agtgtgggag agtgatagga 960

ctttatggca atggggtcgt gatcaaaaat gggaaaacca ggagagttct tcctgaaata 1020

gtccgtgaag ccataaaaac aagactccgt actgtgatct tagctccaac cagggttgtc 1080

gctgctgaaa tggaggaagc ccttagaggg cttccagtgc gttatatgac aacagcagtc 1140

aatgtcaccc actctggaac agaaatcgtc gacttaatgt gccatgccac cttcacttca 1200

cgtctactac agccaatcag agtccccaac tataatctgt atattatgga tgaggcccac 1260

ttcacagatc cctcaagtat agcagcaaga ggatacattt caacaagggt tgagatgggc 1320

gaggcggctg ccatcttcat gaccgccacg ccaccaggaa cccgtgacgc atttccggac 1380

tccaactcac caattatgga caccgaagtg gaagtcccac aagctggagt gttgtttggt 1440

atgggcaaag ggatgccatt ctacgcatgg gactttggag tcccgctgct aatgataggt 1500

tgctactcac aattaacacc cctgacccta atagtggcca tcattttgct cgtggcgcac 1560

tacatgtact tgatcccagg gctgcaggca gcagctgcgc gtgctgccca gaagagaacg 1620

gcagctggca tcatgaagaa catcattggt aaccgcattg aaaggatccg cagtgagcac 1680

gcggaaacgt ggttctttga cgagaaccac ccatatagga catgggctta ccatggaagc 1740

tatgaggccc ccacacaagg gtcagcgtcc tctctaataa acggggttgt caggctcctg 1800

tcaaaaccct gggatgtggt gactggagtc acaggaatag ccatgaccga caccacaccg 1860

tatggtcagc aaagagtttt caaggaaaaa gtggacacta gggtgccaga cccccaagaa 1920

ggcactcgtc aggttatgag catggtctct tcctggttgt ggaaagagct aggcaaacac 1980

aaacggccac gagtctgtac caaagaagag ttcatcaaca aggttcgtag caatgcagca 2040

ttaggggcaa tatttgaaga ggaaaaagag tggaagactg cagtggaagc tgtgaacgat 2100

ccaaggttct gggctctagt ggacaaggaa agagagcacc acctgagagg agagtgccag 2160

agttgtgtgt acaacatgat gggaaaaaga gaaaagaaac aaggggaatt tggaaaggcc 2220

aagggcagcc gcgccatctg gtatatgtgg ctaggggcta gatttctaga gttcgaagcc 2280

cttggattct tgaacgagag gtttgatctg gagaatgaag ctctaatcac caaccaaatg 2340

gagaaagggc acagggcctt ggcattggcc ataatcaagt acacatacca aaacaaagtg 2400

gtaaaggtcc ttagaccagc tgaaaaaggg aaaacagtta tggacattat ttcgagacaa 2460

gacatggagg ctgaggaagt tctagagatg caagacttgt ggctgctgcg gaggtcaaaa 2520

ccctcaactg gatgggacaa ctgggaagaa gttccgtttt gctcccacca cttcaacaag 2580

ctccatctca aggacgggag gtccattgtg gttccctgcc gccaccaaga tgaactgatt 2640

ggccgggccc gcgtctctcc aggggcggga tggagcatcc gggagactgc ttgcctagca 2700

aaatcatatg cgcaaatgtg gcagctcctt tatttccaca gaagggacct ccgactgatg 2760

gccaatgcca tttgttcatc tgtgccagtt gactgggttc caactgggag aactacctgg 2820

tcaatccatg gaaagggaga atggatgacc actgaagaca tgcttgtggt gtggaacaga 2880

gtgtgg 2886

<210> 101

<211> 2886

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Optimised nucleotide sequence of the polynucleotide encoding a

chimeric polyepitope of ZIKV

<400> 101

ggcggcttca gaatcgtgaa catgctgaag cgcggcgtgg ccagagtgtc tccatttggc 60

ggactgaaga gactgcctgc cggactgctt ctcggacacg gccctattag aatggtgctg 120

gccatcctgg cctttctgcg gttcacagcc atcaagccta gcctgggcct gatcaacaga 180

tggggcagcg tgggcaagaa agaagccatg gaaatcatca agaagttcaa gaaagacctg 240

gccgccatgc tgcggatcat caacgcccgg aaagaaaagg tgttcgtgta caacgacgtg 300

gaagcctggc gggacagata caagtatcac cctgacagcc ccagacggct ggccgctgct 360

gtgaaacaag cttgggagga tggcatctgc ggcatcagca gcgtgtcccg gatggaaaac 420

atcatgtggc ggagcgtgga aggcgagctg aacgccattc tggaagagaa cggcgtgcag 480

ctgacagtgg ttgtgggctc cgtgaagaac cctatgtggc ggggacctca gagactcccc 540

gtgcctgtta atgagctgcc tcacggatgg aaggcctggg gcaagagcta ttttgtgcgg 600

gctgccaaga ccaacaacca cagagcctgg aacagcttcc tggtggaaga tcacggcttc 660

ggcgtgttcc acacaagcgt gtggctgaaa gtgcgcgagg actacagcct ggaatgcgac 720

cctgccgtga ttggcacagc cgtgaaggga aaagaagccg tgcacagcga tctcggctac 780

tggatcgaga gcgagaagaa cgacacctgg atcagattcg aggaatgccc cggcaccaag 840

gtgcacgtgg aagagacaat cttcaagacc aaggacggcg acatcggcgc cgtggctctt 900

gattatcctg ccggcacatc tggcagcccc atcctggata agtgcggcag agtgatcggc 960

ctgtacggca atggcgtcgt gatcaagaac ggcaagacca gaagagtgct gcccgagatt 1020

gtgcgggaag ccattaagac ccggctgcgg acagtgattc tggcccctac aagagtggtg 1080

gccgccgaga tggaagaagc cctgagagga ctgcctgtgc ggtacatgac aaccgccgtg 1140

aatgtgaccc acagcggcac cgaaatcgtg gacctgatgt gccacgccac cttcacctct 1200

agactgctgc agcccatcag agtgcccaac tacaacctgt acatcatgga cgaggcccac 1260

ttcacagacc ccagctctat tgccgccaga ggctacatca gcaccagagt ggaaatgggc 1320

gaagccgccg ctatcttcat gaccgctaca ccacctggca ccagggacgc ctttccagac 1380

agcaacagcc ctatcatgga caccgaggtg gaagtgcctc aggccggcgt tctgtttggc 1440

atgggaaagg gcatgccatt ctacgcctgg gatttcggcg tgcccctgct gatgatcggc 1500

tgttactctc agctgacccc tctgacactg atcgtggcca tcattctgct ggtggcccac 1560

tacatgtatc tgatccctgg actgcaggcc gctgccgcta gagctgctca gaaaagaaca 1620

gccgccggaa tcatgaagaa catcatcggc aaccggatcg agcggatcag aagcgagcac 1680

gccgagacat ggttcttcga cgagaatcac ccctaccgga cctgggccta ccacggctct 1740

tatgaagctc ctacacaggg cagcgccagc agcctgatta acggcgttgt cagactgctg 1800

agcaagccct gggatgtcgt gacaggcgtg accggaatcg ccatgaccga cacaacacct 1860

tacggccagc agcgggtgtt caaagaaaaa gtggacacca gggtgcccga tcctcaagag 1920

ggcaccagac aagtgatgag catggtgtcc agctggctgt ggaaagagct gggcaagcac 1980

aagaggccca gagtgtgcac caaagaggaa ttcatcaaca aagtgcggag caacgccgct 2040

ctgggcgcca tctttgagga agagaaagaa tggaaaaccg ccgtcgaggc cgtgaacgac 2100

cctagatttt gggccctcgt ggacaaagag agagagcacc acctgagagg cgagtgccag 2160

agctgcgtgt acaatatgat gggcaaacgc gagaaaaagc agggcgagtt cggcaaggcc 2220

aagggcagta gagccatctg gtacatgtgg ctgggagcca gattcctgga attcgaggcc 2280

ctgggcttcc tgaacgagag attcgacctg gaaaatgagg ccctgatcac caaccagatg 2340

gaaaagggac acagagccct ggctctggcc attatcaagt acacctacca gaacaaggtg 2400

gtcaaggtgc tgcggcctgc cgagaagggc aagacagtga tggacatcat ctcccggcag 2460

gacatggaag ccgaagaggt gctggaaatg caggacctgt ggctgctgag aagaagcaag 2520

ccaagcaccg gctgggacaa ctgggaagaa gtgcccttct gcagccacca cttcaacaag 2580

ctgcacctga aggacggccg gtccatcgtg gtgccttgta gacaccagga cgagctgatc 2640

ggcagagcta gagtttctcc tggcgccgga tggtccatca gagagacagc ctgtctggcc 2700

aagagctacg cccagatgtg gcagctgctg tacttccaca gacgggacct gagactgatg 2760

gccaacgcca tctgtagcag cgtgccagtg gattgggtgc caaccggcag aaccacctgg 2820

tccattcatg gcaaaggcga gtggatgacc accgaggaca tgctggtcgt gtggaataga 2880

gtgtgg 2886

<210> 102

<211> 93

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Amino acid sequence of a fragment of the C protein in the

chimeric polyepitope of ZIKV

<400> 102

Gly Gly Phe Arg Ile Val Asn Met Leu Lys Arg Gly Val Ala Arg Val

1 5 10 15

Ser Pro Phe Gly Gly Leu Lys Arg Leu Pro Ala Gly Leu Leu Leu Gly

20 25 30

His Gly Pro Ile Arg Met Val Leu Ala Ile Leu Ala Phe Leu Arg Phe

35 40 45

Thr Ala Ile Lys Pro Ser Leu Gly Leu Ile Asn Arg Trp Gly Ser Val

50 55 60

Gly Lys Lys Glu Ala Met Glu Ile Ile Lys Lys Phe Lys Lys Asp Leu

65 70 75 80

Ala Ala Met Leu Arg Ile Ile Asn Ala Arg Lys Glu Lys

85 90

<210> 103

<211> 279

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Native nucleotide sequence of the polynucleotide encoding a

fragment of the C protein in the chimeric polyepitope of ZIKV

<400> 103

ggaggattcc ggattgtcaa tatgctaaaa cgcggagtag cccgtgtgag cccctttggg 60

ggcttgaaga ggctgccagc cggacttctg ctgggtcatg ggcccatcag gatggtcttg 120

gcgattctag cctttttgag attcacggca atcaagccat cactgggtct catcaataga 180

tggggttcag tggggaaaaa agaggctatg gaaataataa agaagttcaa gaaagatctg 240

gctgccatgc tgagaataat caatgctagg aaggagaag 279

<210> 104

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Amino acid sequence of a fragment of the NS1 protein in the

chimeric polyepitope of ZIKV

<400> 104

Val Phe Val Tyr Asn Asp Val Glu Ala Trp Arg Asp Arg Tyr Lys Tyr

1 5 10 15

His Pro Asp Ser Pro Arg Arg Leu Ala Ala Ala Val Lys Gln Ala Trp

20 25 30

Glu Asp Gly Ile Cys Gly Ile Ser Ser Val Ser Arg Met Glu Asn Ile

35 40 45

Met Trp Arg Ser Val Glu Gly Glu Leu Asn Ala Ile Leu Glu Glu Asn

50 55 60

Gly Val Gln Leu Thr Val Val Val Gly Ser Val Lys Asn Pro Met Trp

65 70 75 80

Arg Gly Pro Gln Arg Leu Pro Val Pro Val Asn Glu Leu Pro His Gly

85 90 95

Trp Lys Ala Trp Gly Lys Ser Tyr Phe Val Arg Ala Ala Lys Thr Asn

100 105 110

Asn

<210> 105

<211> 339

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Native nucleotide sequence of the polynucleotide encoding a

fragment of the NS1 protein in the chimeric polyepitope of ZIKV

<400> 105

gtgttcgtct ataacgacgt tgaagcctgg agggacaggt acaagtacca tcctgactcc 60

ccccgtagat tggcagcagc agtcaagcaa gcctgggaag atggtatctg cgggatctcc 120

tctgtttcaa gaatggaaaa catcatgtgg agatcagtag aaggggagct caacgcaatc 180

ctggaagaga atggagttca actgacggtc gttgtgggat ctgtaaaaaa ccccatgtgg 240

agaggtccac agagattgcc cgtgcctgtg aacgagctgc cccacggctg gaaggcttgg 300

gggaaatcgt acttcgtcag agcagcaaag acaaataac 339

<210> 106

<211> 64

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Amino acid sequence of a second fragment of the NS1 protein in

the chimeric polyepitope of ZIKV

<400> 106

His Arg Ala Trp Asn Ser Phe Leu Val Glu Asp His Gly Phe Gly Val

1 5 10 15

Phe His Thr Ser Val Trp Leu Lys Val Arg Glu Asp Tyr Ser Leu Glu

20 25 30

Cys Asp Pro Ala Val Ile Gly Thr Ala Val Lys Gly Lys Glu Ala Val

35 40 45

His Ser Asp Leu Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Glu Lys Asn Asp Thr Trp

50 55 60

<210> 107

<211> 192

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Native nucleotide sequence of the polynucleotide encoding a

second fragment of the NS1 protein in the chimeric polyepitope of

ZIKV

<400> 107

catagagcat ggaacagctt tcttgtggag gatcatgggt tcggggtatt tcacactagt 60

gtctggctca aggttagaga agattattca ttagagtgtg atccagccgt tattggaaca 120

gctgttaagg gaaaggaggc tgtacacagt gatctaggct actggattga gagtgagaag 180

aatgacacat gg 192

<210> 108

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Amino acid sequence of a third fragment of the NS1 protein in the

chimeric polyepitope of ZIKV

<400> 108

Ile Arg Phe Glu Glu Cys Pro Gly Thr Lys Val His Val Glu Glu Thr

1 5 10 15

<210> 109

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Native nucleotide sequence of the polynucleotide encoding a third

fragment of the NS1 protein in the chimeric polyepitope of ZIKV

<400> 109

attcggtttg aggaatgccc aggcactaag gtccacgtgg aggaaaca 48

<210> 110

<211> 45

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Amino acid sequence of a fragment of the NS3 protein in the

chimeric polyepitope of ZIKV

<400> 110

Ile Phe Lys Thr Lys Asp Gly Asp Ile Gly Ala Val Ala Leu Asp Tyr

1 5 10 15

Pro Ala Gly Thr Ser Gly Ser Pro Ile Leu Asp Lys Cys Gly Arg Val

20 25 30

Ile Gly Leu Tyr Gly Asn Gly Val Val Ile Lys Asn Gly

35 40 45

<210> 111

<211> 135

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Native nucleotide sequence of the polynucleotide encoding a

fragment of the NS3 protein in the chimeric polyepitope of ZIKV

<400> 111

atatttaaga caaaggatgg ggacattgga gcggttgcgc tggattaccc agcaggaact 60

tcaggatctc caatcctaga caagtgtggg agagtgatag gactttatgg caatggggtc 120

gtgatcaaaa atggg 135

<210> 112

<211> 142

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Amino acid sequence of a second fragment of the NS3 protein in

the chimeric polyepitope of ZIKV

<400> 112

Lys Thr Arg Arg Val Leu Pro Glu Ile Val Arg Glu Ala Ile Lys Thr

1 5 10 15

Arg Leu Arg Thr Val Ile Leu Ala Pro Thr Arg Val Val Ala Ala Glu

20 25 30

Met Glu Glu Ala Leu Arg Gly Leu Pro Val Arg Tyr Met Thr Thr Ala

35 40 45

Val Asn Val Thr His Ser Gly Thr Glu Ile Val Asp Leu Met Cys His

50 55 60

Ala Thr Phe Thr Ser Arg Leu Leu Gln Pro Ile Arg Val Pro Asn Tyr

65 70 75 80

Asn Leu Tyr Ile Met Asp Glu Ala His Phe Thr Asp Pro Ser Ser Ile

85 90 95

Ala Ala Arg Gly Tyr Ile Ser Thr Arg Val Glu Met Gly Glu Ala Ala

100 105 110

Ala Ile Phe Met Thr Ala Thr Pro Pro Gly Thr Arg Asp Ala Phe Pro

115 120 125

Asp Ser Asn Ser Pro Ile Met Asp Thr Glu Val Glu Val Pro

130 135 140

<210> 113

<211> 426

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Native nucleotide sequence of the polynucleotide encoding a

second fragment of the NS3 protein in the chimeric polyepitope of

ZIKV

<400> 113

aaaaccagga gagttcttcc tgaaatagtc cgtgaagcca taaaaacaag actccgtact 60

gtgatcttag ctccaaccag ggttgtcgct gctgaaatgg aggaagccct tagagggctt 120

ccagtgcgtt atatgacaac agcagtcaat gtcacccact ctggaacaga aatcgtcgac 180

ttaatgtgcc atgccacctt cacttcacgt ctactacagc caatcagagt ccccaactat 240

aatctgtata ttatggatga ggcccacttc acagatccct caagtatagc agcaagagga 300

tacatttcaa caagggttga gatgggcgag gcggctgcca tcttcatgac cgccacgcca 360

ccaggaaccc gtgacgcatt tccggactcc aactcaccaa ttatggacac cgaagtggaa 420

gtccca 426

<210> 114

<211> 74

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Amino acid sequence of a fragment of the NS4B protein in the

chimeric polyepitope of ZIKV

<400> 114

Gln Ala Gly Val Leu Phe Gly Met Gly Lys Gly Met Pro Phe Tyr Ala

1 5 10 15

Trp Asp Phe Gly Val Pro Leu Leu Met Ile Gly Cys Tyr Ser Gln Leu

20 25 30

Thr Pro Leu Thr Leu Ile Val Ala Ile Ile Leu Leu Val Ala His Tyr

35 40 45

Met Tyr Leu Ile Pro Gly Leu Gln Ala Ala Ala Ala Arg Ala Ala Gln

50 55 60

Lys Arg Thr Ala Ala Gly Ile Met Lys Asn

65 70

<210> 115

<211> 222

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Native nucleotide sequence of the polynucleotide encoding a

fragment of the NS4B protein in the chimeric polyepitope of ZIKV

<400> 115

caagctggag tgttgtttgg tatgggcaaa gggatgccat tctacgcatg ggactttgga 60

gtcccgctgc taatgatagg ttgctactca caattaacac ccctgaccct aatagtggcc 120

atcattttgc tcgtggcgca ctacatgtac ttgatcccag ggctgcaggc agcagctgcg 180

cgtgctgccc agaagagaac ggcagctggc atcatgaaga ac 222

<210> 116

<211> 219

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Amino acid sequence of a fragment of the NS5 protein in the

chimeric polyepitope of ZIKV

<400> 116

Ile Ile Gly Asn Arg Ile Glu Arg Ile Arg Ser Glu His Ala Glu Thr

1 5 10 15

Trp Phe Phe Asp Glu Asn His Pro Tyr Arg Thr Trp Ala Tyr His Gly

20 25 30

Ser Tyr Glu Ala Pro Thr Gln Gly Ser Ala Ser Ser Leu Ile Asn Gly

35 40 45

Val Val Arg Leu Leu Ser Lys Pro Trp Asp Val Val Thr Gly Val Thr

50 55 60

Gly Ile Ala Met Thr Asp Thr Thr Pro Tyr Gly Gln Gln Arg Val Phe

65 70 75 80

Lys Glu Lys Val Asp Thr Arg Val Pro Asp Pro Gln Glu Gly Thr Arg

85 90 95

Gln Val Met Ser Met Val Ser Ser Trp Leu Trp Lys Glu Leu Gly Lys

100 105 110

His Lys Arg Pro Arg Val Cys Thr Lys Glu Glu Phe Ile Asn Lys Val

115 120 125

Arg Ser Asn Ala Ala Leu Gly Ala Ile Phe Glu Glu Glu Lys Glu Trp

130 135 140

Lys Thr Ala Val Glu Ala Val Asn Asp Pro Arg Phe Trp Ala Leu Val

145 150 155 160

Asp Lys Glu Arg Glu His His Leu Arg Gly Glu Cys Gln Ser Cys Val

165 170 175

Tyr Asn Met Met Gly Lys Arg Glu Lys Lys Gln Gly Glu Phe Gly Lys

180 185 190

Ala Lys Gly Ser Arg Ala Ile Trp Tyr Met Trp Leu Gly Ala Arg Phe

195 200 205

Leu Glu Phe Glu Ala Leu Gly Phe Leu Asn Glu

210 215

<210> 117

<211> 657

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Native nucleotide sequence of the polynucleotide encoding a

fragment of the NS5 protein in the chimeric polyepitope of ZIKV

<400> 117

atcattggta accgcattga aaggatccgc agtgagcacg cggaaacgtg gttctttgac 60

gagaaccacc catataggac atgggcttac catggaagct atgaggcccc cacacaaggg 120

tcagcgtcct ctctaataaa cggggttgtc aggctcctgt caaaaccctg ggatgtggtg 180

actggagtca caggaatagc catgaccgac accacaccgt atggtcagca aagagttttc 240

aaggaaaaag tggacactag ggtgccagac ccccaagaag gcactcgtca ggttatgagc 300

atggtctctt cctggttgtg gaaagagcta ggcaaacaca aacggccacg agtctgtacc 360

aaagaagagt tcatcaacaa ggttcgtagc aatgcagcat taggggcaat atttgaagag 420

gaaaaagagt ggaagactgc agtggaagct gtgaacgatc caaggttctg ggctctagtg 480

gacaaggaaa gagagcacca cctgagagga gagtgccaga gttgtgtgta caacatgatg 540

ggaaaaagag aaaagaaaca aggggaattt ggaaaggcca agggcagccg cgccatctgg 600

tatatgtggc taggggctag atttctagag ttcgaagccc ttggattctt gaacgag 657

<210> 118

<211> 55

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Amino acid sequence of a second fragment of the NS5 protein in

the chimeric polyepitope of ZIKV

<400> 118

Arg Phe Asp Leu Glu Asn Glu Ala Leu Ile Thr Asn Gln Met Glu Lys

1 5 10 15

Gly His Arg Ala Leu Ala Leu Ala Ile Ile Lys Tyr Thr Tyr Gln Asn

20 25 30

Lys Val Val Lys Val Leu Arg Pro Ala Glu Lys Gly Lys Thr Val Met

35 40 45

Asp Ile Ile Ser Arg Gln Asp

50 55

<210> 119

<211> 165

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Native nucleotide sequence of the polynucleotide encoding a

second fragment of the NS5 protein in the chimeric polyepitope of

ZIKV

<400> 119

aggtttgatc tggagaatga agctctaatc accaaccaaa tggagaaagg gcacagggcc 60

ttggcattgg ccataatcaa gtacacatac caaaacaaag tggtaaaggt ccttagacca 120

gctgaaaaag ggaaaacagt tatggacatt atttcgagac aagac 165

<210> 120

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Amino acid sequence of a third fragment of the NS5 protein in the

chimeric polyepitope of ZIKV

<400> 120

Met Glu Ala Glu Glu Val Leu Glu Met Gln Asp Leu Trp Leu Leu Arg

1 5 10 15

Arg Ser

<210> 121

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Native nucleotide sequence of the polynucleotide encoding a third

fragment of the NS5 protein in the chimeric polyepitope of ZIKV

<400> 121

atggaggctg aggaagttct agagatgcaa gacttgtggc tgctgcggag gtca 54

<210> 122

<211> 123

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Amino acid sequence of a fourth fragment of the NS5 protein in

the chimeric polyepitope of ZIKV

<400> 122

Lys Pro Ser Thr Gly Trp Asp Asn Trp Glu Glu Val Pro Phe Cys Ser

1 5 10 15

His His Phe Asn Lys Leu His Leu Lys Asp Gly Arg Ser Ile Val Val

20 25 30

Pro Cys Arg His Gln Asp Glu Leu Ile Gly Arg Ala Arg Val Ser Pro

35 40 45

Gly Ala Gly Trp Ser Ile Arg Glu Thr Ala Cys Leu Ala Lys Ser Tyr

50 55 60

Ala Gln Met Trp Gln Leu Leu Tyr Phe His Arg Arg Asp Leu Arg Leu

65 70 75 80

Met Ala Asn Ala Ile Cys Ser Ser Val Pro Val Asp Trp Val Pro Thr

85 90 95

Gly Arg Thr Thr Trp Ser Ile His Gly Lys Gly Glu Trp Met Thr Thr

100 105 110

Glu Asp Met Leu Val Val Trp Asn Arg Val Trp

115 120

<210> 123

<211> 369

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Native nucleotide sequence of the polynucleotide encoding a

fourth fragment of the NS5 protein in the chimeric polyepitope of

ZIKV

<400> 123

aaaccctcaa ctggatggga caactgggaa gaagttccgt tttgctccca ccacttcaac 60

aagctccatc tcaaggacgg gaggtccatt gtggttccct gccgccacca agatgaactg 120

attggccggg cccgcgtctc tccaggggcg ggatggagca tccgggagac tgcttgccta 180

gcaaaatcat atgcgcaaat gtggcagctc ctttatttcc acagaaggga cctccgactg 240

atggccaatg ccatttgttc atctgtgcca gttgactggg ttccaactgg gagaactacc 300

tggtcaatcc atggaaaggg agaatggatg accactgaag acatgcttgt ggtgtggaac 360

agagtgtgg 369

<210> 124

<211> 2886

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Nucleotide sequence of the polynucleotide encoding a chimeric

epitope of ZIKV

<400> 124

ggcggcttcc ggatcgtgaa tatgctgaag agaggcgtgg ccagagtcag cccttttggc 60

ggactgaaaa gactgcctgc cggactgctt ctcggccacg gacctattag aatggtgctg 120

gccatcctgg cctttctgcg gtttacagcc atcaagccta gcctgggcct gatcaataga 180

tggggcagcg tgggcaagaa agaagccatg gaaatcatca agaagttcaa gaaagacctg 240

gccgccatgc tgcggatcat caacgcccgg aaagaaaagg tgttcgtgta caacgacgtc 300

gaggcctggc gggacagata caagtatcac cctgacagcc ctagaaggct ggccgctgct 360

gtgaaacagg cctgggagga tggcatctgt ggcatcagca gcgtgtcccg gatggaaaac 420

atcatgtggc ggagcgtgga aggcgagctg aacgccattc tggaagaaaa cggcgtgcag 480

ctgacagtgg tcgtgggctc cgtgaagaat cctatgtggc gaggacctca gagactgccc 540

gtgcctgtga atgaactgcc tcatggatgg aaggcctggg gcaagagcta ttttgtgcgg 600

gctgccaaga ccaacaacca cagagcctgg aacagcttcc tggtggaaga tcacggcttc 660

ggcgtgttcc acaccagcgt gtggctgaaa gtgcgcgagg attacagcct ggaatgcgat 720

cctgccgtga tcggaacagc cgtgaaggga aaagaagccg tgcacagcga tctcggctac 780

tggatcgaga gcgagaagaa cgacacctgg atcagattcg aggaatgccc cggcaccaag 840

gtgcacgtgg aagagacaat cttcaagacc aaggacggcg acatcggcgc cgtggctctt 900

gattatcctg ccggaacaag cggcagcccc atcctggata agtgtggcag agtgatcggc 960

ctgtacggca acggcgttgt gatcaagaac ggcaagacca gaagagtgct gcccgagatc 1020

gtgcgggaag ccattaagac ccggctgaga acagtgattc tggcccctac aagagtggtg 1080

gccgccgaaa tggaagaagc cctgagaggc ctgcctgtgc ggtacatgac aaccgccgtg 1140

aatgtgacac acagcggcac agagatcgtg gacctgatgt gtcacgccac cttcacctct 1200

agactgctgc agcccatcag agtgcccaac tacaacctgt acatcatgga cgaggcccac 1260

ttcacagacc ccagctctat tgccgccaga ggctacatca gcaccagagt ggaaatgggc 1320

gaagccgccg ctatcttcat gacagccaca cctccaggca ccagggacgc ctttccagac 1380

agcaacagcc ctatcatgga caccgaggtg gaagtgcctc aggctggcgt tctgtttggc 1440

atgggcaagg gcatgccttt ctacgcctgg gattttggcg tgcccctgct gatgatcggc 1500

tgctactctc agctgacccc tctgacactg atcgtggcca ttattctgct ggtggcccac 1560

tacatgtatc tgatccctgg actgcaggcc gctgcagcca gagctgctca aaaaagaaca 1620

gccgccggaa tcatgaagaa catcatcggc aaccggatcg agcggatcag aagcgagcac 1680

gccgagacat ggttcttcga cgagaatcac ccctaccgga catgggccta ccacggatct 1740

tatgaagccc ctacacaggg cagcgccagc agccttatca atggcgttgt gcggctgctg 1800

agcaagccct gggatgttgt tacaggcgtg accggaatcg ccatgaccga tacaacaccc 1860

tacggccagc agcgggtgtt caaagaaaaa gtggacacca gggtgcccga tcctcaagag 1920

ggcacaagac aagtgatgag catggtgtcc agctggctgt ggaaagagct gggcaagcac 1980

aagaggccca gagtgtgcac caaagaggaa ttcatcaaca aagtgcggag caacgccgct 2040

ctgggcgcca tctttgagga agagaaagaa tggaaaactg ccgttgaggc cgtgaacgac 2100

cctagatttt gggccctcgt ggacaaagag agagagcacc atctgagagg cgagtgccag 2160

tcctgcgtgt acaatatgat gggcaaacgc gagaaaaagc agggcgagtt cggcaaggcc 2220

aagggaagca gagccatctg gtatatgtgg ctgggagcca gattcctgga attcgaggcc 2280

ctgggcttcc tgaacgagag attcgacctg gaaaatgagg ccctgatcac caaccagatg 2340

gaaaagggac acagagccct ggctctggcc atcatcaagt acacctacca gaacaaggtg 2400

gtcaaggtgc tgaggccagc cgagaagggc aagactgtga tggacatcat cagccggcag 2460

gacatggaag ccgaagaggt gctggaaatg caggatctgt ggctgctgcg gagaagcaag 2520

ccttccacag gctgggacaa ctgggaagaa gtgcccttct gcagccacca cttcaacaag 2580

ctgcacctga aggacggcag atccatcgtg gtgccttgca gacaccagga cgaactgatc 2640

ggcagagcta gagtttctcc tggcgccgga tggtccatca gagaaacagc ctgtctggcc 2700

aagagctacg cccagatgtg gcagctgctg tacttccaca gacgggacct gagactgatg 2760

gccaatgcca tctgtagcag cgtgccagtg gattgggtgc caaccggcag aaccacatgg 2820

tctatccacg gcaaaggcga gtggatgacc accgaggata tgctggtcgt gtggaataga 2880

gtttgg 2886