阅读说明：本技术 一种制备卵黄免疫球蛋白的方法 (Method for preparing yolk immunoglobulin ) 是由 顾璐萍 王旭婷 杨严俊 苏宇杰 常翠华 李俊华 于 2020-06-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种制备卵黄免疫球蛋白的方法,属于食品技术领域。所述方法是先采用超声结合冷冻对蛋黄进行预处理,再结合絮凝剂和超滤浓缩进行纯化得到卵黄免疫球蛋白。本发明先对蛋黄进行超声处理,破坏卵黄球体结构,再对其进行冷冻处理,使得脂蛋白和油脂形成凝胶,这有利于水溶性部分与非水溶性部分实现快速分离,进一步采用低倍数的水进行稀释,使得免疫球蛋白溶解在水溶液中,再进行后续的纯化工序,该工艺具有处理量小、耗时短、杂质少、絮凝剂用量少、产物得率和纯度较高等优点,最终免疫球蛋白的得率为1.0％～4.0％,纯度为30％～70％；同时,大幅度降低后续纯化工序的负荷,提高膜的使用效率,适合工业化大规模生产。(The invention discloses a method for preparing yolk immunoglobulin, belonging to the technical field of food. The method comprises the steps of firstly adopting ultrasound and freezing to pretreat egg yolk, and then combining flocculating agent and ultrafiltration concentration to purify to obtain egg yolk immunoglobulin. The invention firstly carries out ultrasonic treatment on the yolk to destroy the yolk sphere structure, and then carries out freezing treatment on the yolk to lead lipoprotein and grease to form gel, which is beneficial to realizing rapid separation of a water-soluble part and a non-water-soluble part, and further adopts low-multiple water to dilute so as to lead the immunoglobulin to be dissolved in a water solution, and then carries out subsequent purification procedures, the process has the advantages of small treatment amount, short time consumption, less impurities, less flocculant consumption, higher product yield and purity and the like, and finally the yield of the immunoglobulin is 1.0-4.0 percent, and the purity is 30-70 percent; meanwhile, the load of the subsequent purification process is greatly reduced, the use efficiency of the membrane is improved, and the method is suitable for industrial large-scale production.)

一种制备卵黄免疫球蛋白的方法

技术领域

本发明涉及一种制备卵黄免疫球蛋白的方法，属于食品技术领域。

背景技术

卵黄免疫球蛋白(IgY)是指鸡群经被动免疫产生具有特异性活性的抗体蛋白。IgY具有纯度高、特异性强、安全性高、热稳定性强且不激活补体等特性，在食品、医药及日用化工等领域具有广阔的应用前景。

卵黄的组成包括50％水、30％脂肪和20％蛋白质，大多数蛋白质与脂肪结合以脂蛋白的形式存在，而免疫球蛋白是卵黄中的一种水溶性蛋白，因此，提取卵黄免疫球蛋白技术难点是去除卵黄中的非水溶性成分。目前卵黄免疫球蛋白的提取方法主要有无机物沉淀法、有机物沉淀法、有机物聚合法和水稀释法等。其中无机物沉淀法即盐析法，是提取蛋白质非常经典的一种方法，但由于卵黄中蛋白质种类较多，该方法制备的产品纯度较低；有机物沉淀法和有机物聚合法提纯效果较好，但存在有机物残留等问题；水稀释法经济、操作简单，适合规模化工业化生产，但存在水稀释比例要求高、工序耗时长、工艺处理量大、粗提取物中杂质较多，导致后续纯化工序负荷重、产品提取率低、纯度不高等问题。

发明内容

针对上述问题，本发明先对蛋黄进行超声处理，破坏卵黄球体结构，再对其进行冷冻处理，使得脂蛋白和油脂形成凝胶，这有利于水溶性部分与非水溶性部分实现快速分离，进一步采用低倍数的水进行稀释，使得免疫球蛋白溶解在水溶液中，再进行后续的纯化工序，该工艺具有处理量小、耗时短、杂质少、絮凝剂用量少、产物得率和纯度较高等优点，同时，大幅度降低后续纯化工序的负荷，提高膜的使用效率，适合工业化大规模生产。

本发明的第一个目的是提供一种提取卵黄免疫球蛋白的预处理方法，所述方法是采用超声结合冷冻对蛋黄进行预处理。

本发明的第二个目的是提供一种制备卵黄免疫球蛋白的方法，所述方法是先采用超声结合冷冻对蛋黄进行预处理，再结合絮凝剂和超滤浓缩进行纯化得到卵黄免疫球蛋白。

在本发明一种实施方式中，所述超声预处理条件为：超声功率为40～600W，超声时间为2～30min。

在本发明一种实施方式中，所述冷冻预处理是将蛋黄放置于-20～-15℃下冷冻12～24h，取出后在0～8℃下解冻12～24h。

在本发明一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：

(1)原料处理：将新鲜鸡蛋清洗消毒、分离蛋清和蛋黄，将蛋黄搅拌均匀；

(2)超声处理：将蛋黄置于超声仪中，进行超声处理；

(3)冻融蛋黄：将(1)中所得蛋黄冷冻，然后解冻；

(4)除脂：将(2)中所得蛋黄凝胶加水、使用食品酸度调节剂调节pH、搅拌、静置沉淀后，离心得免疫球蛋白提取液；

(5)絮凝纯化：步骤(3)中免疫球蛋白上清液中加入絮凝剂，离心或板框过滤得高纯度免疫球蛋白提取液；

(6)超滤浓缩纯化：将步骤(4)中免疫球蛋白提取液进行低温超滤膜分离纯化，得浓缩提取液；

(7)微滤除菌：将步骤(5)中得到的浓缩液进行低温微滤膜除菌；

(8)冷冻干燥：将步骤(6)中得到的微滤透过液进行冷冻干燥得产品卵黄免疫球蛋白。

在本发明一种实施方式中，步骤(1)中所述鸡蛋为普通鸡蛋或经免疫后的蛋鸡所产的新鲜鸡蛋，抗原为常见的人体致病菌或病毒培养提纯达到一定数量级，经灭活作抗原，加上抗原佐剂，对15～20周龄健康蛋鸡进行3～6次免疫注射；

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中具体条件为超声功率为40～600W，超声时间为2～30min。此步骤的作用是使蛋黄球体结构被破坏，促进免疫球蛋白被释放，有利于提高免疫球蛋白得率。

在本发明一种实施方式中，步骤(3)中具体条件为将步骤(3)中所得蛋黄在-18±2℃下冷冻12～24h，取出后在0～8℃环境下解冻12～24h。此关键步骤的作用是使蛋黄中绝大多数脂溶性蛋白在低温过程中发生结构变化，形成不可逆凝胶，易与水溶性免疫球蛋白分离，从而减小后续提取、絮凝、膜分离等工序的操作难度和工作强度，减小能耗，提高效率。相较于其他粗提方法，此工序具有操作简单、能耗低，耗时短、效率高、产品得率高纯度好等优势。

在本发明一种实施方式中，步骤(4)中将步骤(3)得到的蛋黄凝胶加入去离子水中，调节pH、搅拌、静置沉淀，离心得免疫球蛋白提取液，具体技术条件为蛋黄：去离子水为1:4～1:9(w/w)，使用食品酸度调节剂调节pH至4.0～7.0，食品酸度调节剂可选用醋酸、乳酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸钠、柠檬酸钠、柠檬酸钾等，搅拌转速600～1000rpm，搅拌时间10～30min，离心机3000～8000rpm分离3～15min，沉淀1～5h。此步骤的作用是分离免疫球蛋白和其他非水溶性物质，可得到较纯的免疫球蛋白提取液。此步骤相较于之前的水稀释法，其优势在于大幅度减少了用水量，所需水的要求仅为去离子水而不是超纯水，减少生产成本，同时缩短了搅拌沉淀的时间，此外，所得上清澄清透明，绝大部分非水溶性物质已经除去，减小了后续絮凝、超滤的工作负担。

在本发明的一种实施方式中，步骤(5)将步骤(4)中所得的免疫球蛋白提取液进一步加入絮凝剂，絮凝剂为海藻酸钠、黄原胶、壳聚糖、果胶、卡拉胶、魔芋胶、瓜尔豆胶、羧甲基纤维素钠等一种或者两种以上天然多糖的水溶液，浓度为0.8～1.5％，添加量为上清液体积的0～0.8％，然后进行离心或板框过滤得到免疫球蛋白澄清提取液。此步骤的作用在于纯化免疫球蛋白提取液，去除杂蛋白，减轻后续超滤膜和微滤膜的工作压力，延长膜的使用周期。本步骤的优势在于使用无害的天然多糖，环保健康，且用量少，视前一步骤所得提取液澄清程度酌情添加，甚至可以不添加。

在本发明的一种实施方式中，步骤(6)将步骤(5)中所得免疫球蛋白提取液进行低温超滤膜分离，得到免疫球蛋白浓缩截留液。具体技术条件为温度4～10℃，截留分子量为20000～150000。此步骤的作用是浓缩纯化免疫球蛋白提取液，并进一步去除小分子杂蛋白。

在本发明的一种实施方式中，步骤(7)将步骤(6)中所得免疫球蛋白浓缩截留液进行冷除菌，得到微滤透过液。本步骤的具体技术条件为微滤膜孔径0.22μm，主产品的微生物指标为总菌数≤3000CFU。本步骤的优点在于除菌效果好，且不损害产品的生物活性。

在本发明的一种实施方式中，步骤(8)将步骤(7)中所得微滤透过液在-30～-50℃下进行冷冻干燥，得到高纯度的免疫球蛋白粉末产品，得率为1.0％～4.0％，纯度为30％～70％，得到的产品可应用于制备药品、食品、保健品、日用品等；原料分离所得蛋清用于制作蛋白粉，步骤(4)离心后所得蛋黄沉淀用于制备蛋黄粉、卵磷脂等产品。

本发明的第三个目的是提供一种应用上述方法制备得到的卵黄免疫球蛋白。

本发明的第四个目的是提供一种上述卵黄免疫球蛋白在食品、医药和日用化工方面的应用。

本发明的有益效果：

本发明的优势是产物纯度高，产物杂质少，纯度可达70％；提取过程耗时短，经超声—冷冻预处理，搅拌时间仅为10～30min，即可进行后续操作；絮凝剂添加量为0～0.8％，用量少；除脂过程减少了水的添加量，从而减少了后续板框、超滤等浓缩过程的处理量，提高了过滤膜的循环使用效率。本发明既提高了免疫球蛋白的提取效率和提取纯度，又降低了生产的成本，是一种可行的工业化大规模生产方法。

附图说明

图1为本发明的超声辅助卵黄免疫球蛋白生产方法流程图。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。

1.蛋白质得率的测定

使用Bradford法测定上清液蛋白浓度，可得上清中蛋白质含量，然后除以所用蛋黄质量计算得到蛋白质量得率。

计算公式为：

2.免疫球蛋白纯度的测定

使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法(Native-PAGE)，在不加入SDS疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到若干蛋白质条带，根据条带含量扫描得到免疫球蛋白条带所占的比例，即为免疫球蛋白的纯度。

3.实施例中提到的鸡蛋为普通鸡蛋或经免疫后的蛋鸡所产的新鲜鸡蛋，蛋鸡免疫是以常见的人体致病菌或病毒，经灭活作抗原，再加上抗原佐剂，对15～20周龄健康蛋鸡进行3～6次免疫注射。

实施例1

(1)分离蛋黄：将新鲜鸡蛋清洗、消毒、破壳、分蛋，取蛋黄搅拌均匀；

(2)超声处理：超声功率40W，超声时间20min；

(3)冻融蛋黄：将(2)中所得蛋黄液置于-18℃下冷冻24h，然后取出置于0℃下解冻24h，得蛋黄凝胶；

(4)除脂：将(2)中所得蛋黄凝胶以1:7(w/w)的比例加入去离子水中，用搅拌桨以200rpm的转速搅拌10min，用食品酸度调节剂调节溶液pH至5.0，然后0℃下静置沉淀3h，最后5000rpm离心8min取上清；

(5)絮凝纯化：在(3)中所得澄清上清液加入0.8％海藻酸钠水溶液，添加量为上清液体积的0.4％，然后进行板框过滤得到上清液；

(6)超滤浓缩纯化：将(4)中所得上清液用超滤膜浓缩纯化，超滤膜截留分子量为50KDa，得浓缩截留液；

(7)微滤除菌：将步骤(5)中得到的浓缩截留液进行低温微滤膜除菌，微滤膜孔径为0.22μm；

(8)冷冻干燥：将步骤(6)中得到的微滤透过液在-40℃下进行冷冻干燥得产品卵黄免疫球蛋白粉末，得率为2.24％，纯度为38.6％。

实施例2

(1)分离蛋黄：将新鲜鸡蛋清洗、消毒、破壳、分蛋，取蛋黄搅拌均匀；

(2)超声处理：超声功率600W，超声时间10min；

(3)冻融蛋黄：将(1)中所得蛋黄液置于-18℃下冷冻20h，然后取出置于4℃下解冻18h，得蛋黄凝胶；

(4)除脂：将(2)中所得蛋黄凝胶以1:9(w/w)的比例加入去离子水中，用搅拌桨以900rpm的转速搅拌10min，用食品酸度调节剂调节溶液pH至5.6，然后0℃下静置沉淀5h，最后8000rpm离心5min取上清；

(5)絮凝纯化：在(3)中所得澄清上清液加入1.0％海藻酸钠水溶液，添加量为上清液体积的0.5％，然后进行板框过滤得到上清液；

(6)超滤浓缩纯化：将(4)中所得上清液用超滤膜浓缩纯化，超滤膜截留分子量为30KDa，得浓缩截留液；

(7)微滤除菌：将步骤(5)中得到的浓缩截留液进行低温微滤膜除菌，微滤膜孔径为0.22μm；

(8)冷冻干燥：将步骤(6)中得到的微滤透过液在-45℃下进行冷冻干燥得产品卵黄免疫球蛋白粉末，得率为3.86％，纯度为65.8％。

实施例3

(1)分离蛋黄：将新鲜鸡蛋清洗、消毒、破壳、分蛋，取蛋黄搅拌均匀；

(2)超声处理：超声功率150W，超声时间15min；

(3)冻融蛋黄：将(1)中所得蛋黄液置于-18℃下冷冻22h，然后取出置于6℃下解冻15h，得蛋黄凝胶；

(4)除脂：将(2)中所得蛋黄凝胶以1:6(w/w)的比例加入去离子水中，用搅拌桨以600rpm的转速搅拌10min，用食品酸度调节剂调节溶液pH至5.0，然后4℃下静置沉淀5h，最后6000rpm离心5min取上清；

(5)絮凝纯化：在(3)中所得澄清上清液加入1.5％海藻酸钠水溶液，添加量为上清液体积的0.4％，然后进行板框过滤得到上清液；

(6)超滤浓缩纯化：将(4)中所得上清液用超滤膜浓缩纯化，超滤膜截留分子量为40KDa，得浓缩截留液；

(7)微滤除菌：将步骤(5)中得到的浓缩截留液进行低温微滤膜除菌，微滤膜孔径为0.22μm；

(8)冷冻干燥：将步骤(6)中得到的微滤透过液在-50℃下进行冷冻干燥得产品卵黄免疫球蛋白粉末，得率为2.88％，纯度为43.4％。

对比例1

省略实施例2中的超声步骤(2)，即单独采用冷冻预处理，其他参数条件和实验步骤与实施例2一致。制备得到的卵黄免疫球蛋白粉末的得率为1.64％，纯度为26.3％。

对比例2

省略实施例2中的冷冻步骤(3)，即单独采用超声预处理，其他参数条件和实验步骤与实施例2一致。制备得到的卵黄免疫球蛋白粉末的得率为0.98％，纯度为15.5％。

对比例3

省略实施例2中的超声步骤(2)和冷冻步骤(3)，其他参数条件和实验步骤与实施例2一致。制备得到的卵黄免疫球蛋白粉末的得率为0.75％，纯度为12.7％。

表1不同工艺条件生产免疫球蛋白的得率和纯度

由表1数据可以看出，在保证其他条件相同的情况下，单独采用冷冻预处理制备得到的卵黄免疫球蛋白(对比例1)的得率为1.64％，较对比例3提高了0.89％，纯度为26.3％，较对比例3提高了13.6％；单独采用超声预处理制备得到的卵黄免疫球蛋白(对比例2)的得率为0.98％，较对比例3仅提高了0.23％，纯度为15.5％，较对比例3仅提高了2.8％；而采用超声结合冷冻预处理得到的卵黄免疫球蛋白(实施例2)的得率为3.86％，较对比例3提高了3.11％，较单独冷冻预处理和单独超声预处理的效果之和(1.12％)更优越；纯度为65.8％，较对比例3提高了53.1％；较单独冷冻预处理和单独超声预处理的效果之和(16.4％)更优越。这说明冷冻和超声预处理在提高卵黄免疫球蛋白的得率和纯度方面相互支持，具有一定的协同作用。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。