阅读说明：本技术 一种禽流感h9亚型疫苗生产中的灭活病毒的方法 (Method for inactivating virus in production of avian influenza H9 subtype vaccine ) 是由 张文炎 刘之文 詹烜子 刘锦容 高艳 张云丽 王土活 于 2020-06-30 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种禽流感H9亚型疫苗生产中的灭活病毒的方法,通过对病毒灭活工艺的优化,可以显著提高疫苗制剂的安全性,减少应激反应,提高免疫效果。(The invention provides a method for inactivating virus in the production of avian influenza H9 subtype vaccine, which can obviously improve the safety of vaccine preparation, reduce stress reaction and improve immune effect by optimizing the virus inactivation process.)

一种禽流感H9亚型疫苗生产中的灭活病毒的方法

技术领域

本发明属于动物疫苗领域，具体是涉及一种禽流感H9亚型疫苗生产中的灭活病毒的方法。

背景技术

根据致病性不同， 禽流感可分为低致病性禽流感和高致病性禽流感。现高病性禽流感以H7N9亚型为代表，低致病性禽流感以H9N2亚型为代表。H9N2 亚型禽流感是我国禽类中传播速度快、流行范围广的禽流感；各种日龄的鸡都易感，临床严重程度有较大的差异，但造成经济损失都很大，产蛋鸡产蛋下降10%-60%或绝产，肉鸡和育雏或育成鸡死淘率在10%~80%不等；与大肠杆菌、禽传染性支气管炎、鸡传染性喉气管炎、新城疫、各种免疫抑制病原体协同感染， 尤其容易与大肠杆菌继发感染。

国内外的禽流感防治实践表明，疫苗免疫是防止禽流感爆发、避免造成巨大损失的主要措施。目前应用于禽流感的常规疫苗主要是全病毒灭活苗，全病毒灭活苗具有很多优点，其便于储备，当确定禽流感暴发的病毒亚型后，便可马上将储备的疫苗用于紧急预防接种。同时全病毒灭活苗还可制备成针对几种不同亚型病毒的多价疫苗，且亚型抗原之间不产生免疫干扰。全病毒灭活疫苗能够诱导机体产生有效的免疫应答反应，并在以往发生禽流感的过程中，可控制疫情的进一步蔓延与扩散，减少经济损失。

病毒灭活疫苗的生产工艺一般分为病毒的扩增、灭活、纯化和/或裂解。国内的禽流感灭活疫苗的生产工艺中，灭活过程都是使用甲醛溶液作为灭活剂，其灭活能达到很好的效果，但是甲醛灭活不仅灭活了病毒也破坏了病原体的免疫原性，并且甲醛灭活时间比较长，易受温度、pH值、浓度、是否存在有机物、病原体的种类和含氮量等因素影响，残留的游离甲醛，若随疫苗注入机体后，会产生应激性反应。所以需要寻找更加安全可靠的灭活剂进行病毒的灭活。本发明通过选择适合的灭活剂，对灭活条件进行优化，确定最佳的灭活工艺参数。

发明内容

本发明提供一种禽流感H9亚型疫苗生产中的灭活病毒的方法，采用本发明病毒灭活处理，可以显著提高疫苗制剂的安全性，减少应激反应，提高免疫效果。

本发明提供如下技术方案：

一种禽流感H9亚型疫苗生产中的灭活病毒的方法，包括以下步骤：

（1）病毒的接种和培养：选择制备疫苗用LMH细胞进行传代培养，待LMH细胞密度达1.0×10⁶-1.5×10⁶个/mL时接种禽流感病毒H9亚型，并加入细胞维持液进行繁殖培养；

（2）病毒收集、浓缩和纯化：将步骤（1）中细胞培养液进行冻融3次，于4℃、6000-8000rpm条件离心10-20min后，收集禽流感病毒H9亚型上清液，将上述上清液超滤浓缩，得禽流感病毒H9亚型病毒毒液；

（3）病毒灭活：在负压生产区，根据病毒液的量分别加入终浓度为0.025%-0.1％的BPL（β-丙内酯），至于2-8℃恒温摇床中，分别灭活16-48ｈ后，终止反应，获得含有灭活H9亚型禽流感病毒的溶液。

（4）疫苗制备：将白油、吐温、硬脂酸铝混合制备油相，将步骤3中灭活后的禽流感病毒的溶液与油相按照体积比1:2混合乳化，制备得到禽流感H9亚型疫苗。

本发明所述的一种禽流感H9亚型疫苗生产中的灭活病毒的方法中，优选的，步骤（2）中离心速率7000rpm，离心时间15min。

本发明所述的一种禽流感H9亚型疫苗生产中的灭活病毒的方法中，优选的，步骤（3）中灭活温度2-4℃，灭活时间24-48h。更优选的，灭活温度4℃，灭活时间24h。

本发明所述的一种禽流感H9亚型疫苗生产中的灭活病毒的方法中，终止反应的方法包括：加BPL用量5％亚硫酸钠终止反应；或者并在37℃条件下水解2小时使丙内酯发生水解进而终止反应。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

（1）BPL灭活疫苗诱导鸡产生抗体的能力要优于传统的甲醛灭活疫苗。（2）通过对灭活工艺条件的优化，筛选出最佳灭活工艺条件，灭活BPL浓度0.05％的BPL，灭活温度4℃，灭活时间24-48h。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

实施例1：灭活工艺条件优化

试验材料：H9N2亚型禽流感病毒

灭活方法：（1）病毒的接种和培养：选择制备疫苗用LMH细胞进行传代培养，待LMH细胞密度达1.0×10⁶-1.5×10⁶个/mL时接种禽流感病毒H9亚型，并加入细胞维持液进行繁殖培养；（2）病毒收集、浓缩和纯化：将步骤（1）中细胞培养液进行冻融3次，于4℃、7000rpm条件离心15min后，收集禽流感病毒H9亚型上清液，将上述上清液分别超滤浓缩，得禽流感病毒H9亚型病毒毒液；（3）病毒灭活：在负压生产区，根据病毒液的量分别加入终浓度为0.005%、0.015%、0.025%、0.05%、0.1％的BPL，至于4℃恒温摇床中，分别灭活2、4、8、16、24、48ｈ后，并在37℃条件下水解2小时使丙内酯发生水解，以便获得含有灭活H9亚型禽流感病毒的溶液。

测试方法：灭活后样品按照生产规程灭活检验要求接SPF鸡胚，孵育后72ｈ检测血凝价，并盲传一代，检测血凝价。

测试结果： 由表1可知，BPL的浓度和灭活时间会对禽流感病毒的灭活效果会产生影响；低浓度（0.005%、0.015%）时，灭活48h，不会对病毒的活性产生影响。 当BPL浓度≥0.025%，灭活24h，病毒能够完全灭活。特别是当BPL浓度≥0.05%时，灭活16h，病毒能够完全灭活。

表1 ：不同浓度BPL灭活禽流感病毒结果

注：血凝检测结果为0，判定为“－”，病毒已完全灭活；血凝检测结果不为0，判定为“＋”，病毒未完全灭活。

不同灭活温度对灭活效果影响。

灭活方法：灭活方法同表1，调整灭活时间为24h，并改变灭活温度，具体调整如表2所示。

测试结果：由表2可知，灭活温度会对BPL灭活禽流感病毒结果产生影响；当BPL浓度为0.025%时，灭活温度优选2-4h；当BPL浓度为0.05%时，灭活温度优选2-6h。

表2：不同温度对BPL灭活禽流感病毒结果

注：血凝检测结果为0，判定为“－”，病毒已完全灭活；血凝检测结果不为0，判定为“＋”，病毒未完全灭活。

实施例2：疫苗制备

疫苗制备：将白油94份、吐温6份、硬脂酸铝1.5份混合制备油相，将禽流感病毒的溶液与油相按照体积比1:2混合乳化，制备得到禽流感H9亚型疫苗。

表3：不同灭活工艺制备得到的疫苗

实施例4：BPL灭活疫苗安全性检验

测试方法：60羽SPF鸡随机分为6组，每组10羽，其中1-5组用５批BPL灭活疫苗安全性评价，每羽鸡胸部肌肉注射2.5mL。6组空白对照组，不接种。

安全性试验结果：观察免疫14d后，各处理组鸡均健康，剖检观察疫苗吸收良好，未出现异常。

实施例5： BPL灭活疫苗效力试验

测试方法：360羽SPF鸡随机分为6组，每组60羽，1-4组分别用表3灭活疫苗1-4免疫接种，5组用甲醛灭活对照组疫苗的免疫接种，6组作为空白对照组，比较BPL灭活疫苗的免疫效果。每羽鸡胸部肌肉注射0.5mL，免疫后14ｄ、21ｄ逐羽采血分离血清，进行抗体检测。

测试结果：由表4可知，由BPL灭活的禽流感病毒制成灭活疫苗对免疫动物安全，并且能保持良好的免疫原性，21ｄ的免疫效价为8 log₂左右，同比的甲醛灭活疫苗免疫效价只有７log₂左右，说明BPL灭活疫苗诱导鸡产生抗体的能力要优于甲醛灭活疫苗。此外，通过对比疫苗1-4免疫效果发现，疫苗2的免疫效果最佳，可见灭活的工艺体检会对疫苗的免疫效果产生显著影响；具体的机理有待进一步研究。

表4 免疫效果测试

凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。所有配方中百分比均为重量百分比。本发明组合物各制剂的加工工艺均为现有技术，根据不同情况可以有所变化。