灭活及保存呼吸道合胞病毒的方法
阅读说明：本技术 灭活及保存呼吸道合胞病毒的方法 (Method for inactivating and preserving respiratory syncytial virus ) 是由 郑子峥 张伟 张璐婧 孙永鹏 陈莉 夏宁邵 于 2018-07-06 设计创作，主要内容包括：本申请涉及病毒学与免疫学领域。具体而言,本申请涉及一种灭活分离的呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus,RSV)且稳定所述RSV中的pre-F蛋白的方法。此外,本申请还涉及一种保存RSV病毒且稳定所述RSV中的pre-F蛋白的方法。本申请还涉及,含有灭活的RSV病毒的疫苗,所述灭活的RSV病毒通过本发明的方法制备和/或保存,以及所述疫苗用于预防或治疗RSV感染或与RSV感染相关的疾病的用途。(The present application relates to the fields of virology and immunology. In particular, the present application relates to a method of inactivating an isolated Respiratory Syncytial Virus (RSV) and stabilizing the pre-F protein in said RSV. In addition, the present application relates to a method for preserving RSV virus and stabilizing the pre-F protein in said RSV. The present application also relates to vaccines comprising inactivated RSV virus, which inactivated RSV virus is produced and/or preserved by the methods of the invention, and the use of the vaccines for preventing or treating RSV infection or a disease associated with RSV infection.)
技术领域
本申请涉及病毒学与免疫学领域。具体而言，本申请涉及一种灭活分离的呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)且稳定所述RSV中的pre-F蛋白的方法。此外，本申请还涉及一种保存 RSV病毒且稳定所述RSV中的pre-F蛋白的方法。本申请还涉及，含有灭活的RSV病毒的疫苗，所述灭活的RSV病毒通过本发明的方法制备和/或保存，以及所述疫苗用于预防或治疗RSV感染或与RSV 感染相关的疾病的用途。
背景技术
自从20世纪50年代被发现以来，人类呼吸道合胞病毒(RSV) 一直是婴幼儿下呼吸道感染最主要的病原。在美国，RSV是引起1岁以下婴儿住院的首要原因(D.K.Shay,R.C.Holman.et al.,JAMA,282 (1999)1440-1446)，并且是5岁以下儿童临床约诊的主要原因之一(C.B. Hall,G.A.Weinberg,et al.,N Engl J Med,360(2009)588-598)。全球范围内每年有超过3000万例下呼吸道感染由RSV引起，其中超过300 万的人需住院治疗。RSV是小于5岁的儿童最常见的住院原因(H.Nair, W.A.Brooks,et al.,Lancet,378(2011)1917-1930)。早产儿、支气管及肺发育不良者、先天性心脏病及免疫缺陷的婴幼儿RSV感染率高达50-70％(A.C.Cooper,N.C.Banasiak,P.J.Allen,Pediatr Nurs,29 (2003)452-456)。每年有16-60万儿童死亡病例与RSV有关(T.S. Howard,L.H.Hoffman,et al.J Pediatr,137(2000)227-232；S.Leader, K.Kohlhase.J Pediatr,143(2003)S127-132)。婴幼儿感染RSV所导致的住院治疗时间可达2.5个月，由此引发的相关医疗费用在美国每年可高达3.6-5.7亿美元(E.A.Simoes.Lancet,354(1999)847-852)。老年人也是RSV易感人群，每年由RSV感染导致死亡的老年人数大于 12000位，约为同一人群中流感死亡率的1/3(A.R.Falsey,P.A. Hennessey,et al.N Engl J Med,352(2005)1749-1759；W.W. Thompson,D.K.Shay,E.Weintraub,et al.JAMA,289(2003) 179-186)。在我国，由于缺乏本国研发的RSV诊断试剂，RSV检测由于过高的成本而得不到推广，这导致了RSV在我国的流行情况及危害性至今不完全清楚。然而，针对我国部分地区的研究表明，RSV感染也是中国儿童下呼吸道感染的重要诱因(徐关仁,孙颂文,徐旭卿等. 疾病控制杂志,4(2000)37-39；谢健屏,谢健屏,何翠娟等.中华儿科杂志,35(1997)402-403；朱汝南,邓洁,王芳等.21(2003)25-28)。
在19世纪60年代，已在婴儿和儿童上评估了FI-RSV(***灭活全病毒疫苗，肌注，铝佐剂辅佐)的保护效率。然而结果显示，该疫苗在随后的RSV天然感染中缺乏保护性，并且甚至导致疾病严重程度增强。疫苗导致疾病严重程度增强这一现象严重阻滞了RSV疫苗的发展。迄今为止，还没有能够提供有效保护的抗RSV疫苗。目前，只有一株识别RSV融合蛋白的中和抗体(Palivizumab，商品名： Synagis)能在新生儿身上产生被动免疫效果，降低新生儿发病率。 Syangis的应用表明，结合RSV-F蛋白的中和性单抗可以用于临床保护，并且F蛋白上存在有效的中和活性位点。F蛋白位于病毒表面，并且对于病毒入胞和合胞体的形成是必须的。因此，F蛋白是开发抗 RSV疫苗以及筛选预防与保护性抗体的重要靶标蛋白。
RSV是副粘病毒科肺炎病毒属的单股负链非节段性RNA病毒，其基因组有15222个核苷酸，编码10种主要蛋白；其中，F蛋白(Fusion protein,F protein)是N-糖基化的I型跨膜糖蛋白，其全长为574个氨基酸，并且其作为主要跨膜蛋白，是RSV感染过程中的重要表面分子。F蛋白触发的膜融合的机制及过程尚不清楚。McLellan等(J.S. McLellan,M.Chen,J.S.Chang,et al.J Virol,84(2010)12236-12244) 已利用哺乳动物表达系统，获得了稳定的post-F蛋白结构。对于pre-F 蛋白，由于其结构不稳定，且存在多种中间体，因此，通过制备晶体来研究pre-F蛋白的结构相当困难。McLellan等(同上)利用结构已知的HPIV3pre-F蛋白，对RSV pre-F蛋白的结构进行了模拟和预测，并提出，RSV F蛋白可能存在pre-F构象。此外，McLellan等(同上) 还提出，F蛋白与靶细胞结合后，其构象从处于高能量、亚稳定状态的融合前F蛋白构象(pre-fusion F，pre-F)转变为高度稳定的融合后F 蛋白构象(post-fusion F，post-F)，从而导致病毒膜与细胞膜的融合。亚稳定的pre-F构象和稳定的post-F构象的自由能差异很大，这导致膜融合的过程是不可逆的。
另外，还已对pre-F和post-F蛋白构象上的中和表位进行了鉴定。结果显示，pre-F和post-F蛋白共享了约50％的蛋白表面，并且，具有高中和活性的表位(强中和表位)例如
这些研究结果表明，与post-F蛋白相比，pre-F蛋白具有更多、更强的中和表位，从而具有更高的用作疫苗的潜力。然而，由于pre-F 蛋白处于亚稳定状态，极易转变为稳定的post-F蛋白，因此，将pre-F 蛋白开发为有效的疫苗仍存在着极大的困难和挑战。本领域需要开发，稳定和维持灭活分离的RSV病毒中的pre-F蛋白的方法，以提高灭活 RSV病毒用作疫苗的效力。
发明内容
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“RSV融合蛋白”或“F蛋白”是指，呼吸道合胞病毒(RSV)的融合蛋白(Fusion protein，F protein)，其是本领域技术人员公知的，并且其示例性氨基酸序列可参见，例如NCBI GENBANK数据库登录号：P03420。在本文中，“RSV融合蛋白”、“融合蛋白”、“F蛋白”可互换使用。
如本文中所使用的，当提及F蛋白的氨基酸序列时，其使用SEQ ID NO：1所示的序列来进行描述。例如，表述“F蛋白的第196-209 位氨基酸残基”是指，SEQ ID NO：1所示的多肽的第196-209位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，在F蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于，置换，缺失和/ 或添加，例如不同基因型或基因亚型的F蛋白)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“F蛋白”应包括所有此类序列，包括例如SEQ ID NO：1所示的序列以及其天然或人工的变体。并且，当描述F蛋白的序列片段时，其不仅包括SEQ ID NO：1的序列片段，还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。例如，表述“F蛋白的第196-209位氨基酸残基”包括，SEQ ID NO：1的第196-209位氨基酸残基，以及其变体(天然或人工)中的相应片段。根据本发明，表述“相应序列片段”或“相应片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。
之前的研究显示，F蛋白至少存在1种确定的构象，post-F。 McLellan等结合副流感病毒(parainfluenza virus，PIV)的F蛋白研究结果推测，RSV的F蛋白可能还存在pre-F构象(McLellan等(2010), J Vriol，84:12236-12244)。在通常情况下，pre-F构象是不稳定的，其将自发转变为稳定的post-F构象。因此，从细胞中表达和纯化的F 蛋白主要以post-F构象存在；并且，在灭活的RSV病毒中，F蛋白也主要以post-F构象存在。
如本文中所使用的，术语“pre-F蛋白”是指，以pre-F构象存在的F蛋白。如本文中所使用的，术语“post-F蛋白”是指，以post-F 构象存在的F蛋白。关于pre-F蛋白、post-F蛋白以及它们的构象的更详细描述可参见，McLellan等(2010),J Vriol，84:12236-12244；McLellan等(2013)，Science，340:1113-1117；McLellan等(2015),Curr Opin Virol,11:70-75；中国专利申请201480013927.7，和PCT国际申请PCT/CN2014/073505(其全文通过引用并入本文，用于所有目的)。在本文中，“pre-F”与“pre-Fusion”可互换使用；“post-F”与“post-Fusion”可互换使用。
如本文中所使用的，表述“稳定pre-F蛋白”是指，至少部分地抑制、减少或延迟pre-F蛋白向post-F蛋白的转化。此外，该表述也指，尽可能维持F蛋白的pre-F构象，避免其转化为post-F构象。
作为病毒最主要的表面结构蛋白之一，F蛋白的表面存在大量的中和抗体识别表位。目前已知的RSV F蛋白的中和抗体主要针对以下抗原表位(J.S.McLellan,Y.Yang,etal.J Virol,85(2011)7788-7796；和，M.Magro,D.Andreu,et al.J Virol,84(2010)7970-7982)：
SiteⅡ表位：针对SiteⅡ表位的抗体包括已上市的预防性单抗 Synagis以及它的等效衍生物motavizumab和47F；它们主要识别F 蛋白的aa 255-275。McLellan等(J.S.McLellan,M.Chen,J.S.Chang, et al.J Virol,84(2010)12236-12244)通过解析motavizumab单抗与F 蛋白肽段aa 254-277的复合物的晶体结构证实，这个区域形成“螺旋-转角-螺旋”二级结构。晶体结构显示，motavizumab单抗结合在“螺旋-转角-螺旋”结构的一端，并且使得氢键和离子键作用于268位的 Asn与272位的Lys。进一步的研究结果显示，位于这两个点的突变可引起抗体逃逸。motavizumab结合的SiteⅡ表位的结构在post-F构象中保留得非常完整，抗体结合位点暴露充分。motavizumab与post-F 蛋白的结构揭示了Synagis和motavizumab单抗具有中和活性的机制。而RSV pre-F蛋白的模拟结构显示，该表位处于pre-F蛋白构象的内部，不能在pre-F蛋白的表面上暴露出来。Graham等证实，Synagis和motavizumab单抗只能够抑制RSV与细胞的融合，却不能抑制RSV的吸附(J.S.McLellan,Y.Yang,et al.J Virol,85(2011) 7788-7796；J.S.McLellan,M.Chen,A.Kim,et al.Nat Struct Mol Biol, 17(2010)248-250)。
Site I表位：识别Site I表位的抗体有131-2a，其识别F蛋白的半胱氨酸富集区。这类抗体最多阻断50％RSV病毒感染，表明该表位具有翻译后的多相性，或者这些抗体通过间接效应(例如病毒的聚沉) 起中和效果。此外，这些抗体部分地阻断病毒吸附靶细胞。Site I表位在pre-F蛋白的构象中靠近病毒的细胞膜，但是在post-F蛋白的构象中位于顶点。
SiteⅣ表位：SiteⅣ表位是19和101F等单抗抗体的靶点，其主要涉及F蛋白的aa422-438。该表位位于F蛋白中的构象相对保守的区域。McLellan等(J.S.McLellan,Y.Yang,et al.J Virol,85(2011) 7788-7796)已经解出了101F与F蛋白肽段(aa 422-438)的复合物的晶体结构。结果显示，SiteⅣ表位的核心区域为aa 427-437。
之前的研究结果(McLellan JS,Chen M,et al.Science 2013,340: 1113-1117)已显示，
如本文中所使用的，术语“表位”是指，抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。“表位”在本领域内也称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7， 8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸，其可以是“线性的”或“构象的”。参见，例如，EpitopeMapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。
如本文中使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M 或10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。
如本文中所使用的，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10- 9M 或10-10M或更小的解离平衡常数(KD)结合抗原，例如，如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定的。
如本文中所使用的，术语“中和表位”是指，能够诱发机体的针对病毒的中和活性的表位。此类表位不仅参与免疫系统(例如抗体) 对病毒蛋白的识别，而且通常可诱发机体的免疫系统产生具有中和活性的抗体(即，中和抗体)。如本文中所使用的，“中和抗体”是指，能够显著降低或完全抑制目标病毒的毒力(例如，感染细胞的能力)的抗体。通常而言，中和抗体能够识别并结合目标病毒上的中和表位，并且阻止目标病毒进入/感染受试者的细胞。在本文中，表位的中和活性是指，表位诱发机体产生针对病毒的中和活性的能力。表位的中和活性越高，则其诱发机体产生针对病毒的中和活性的能力越强。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，能够被RSV病毒感染并允许RSV病毒在其中进行增殖的细胞。此类宿主细胞可以为贴壁细胞或悬浮细胞，并且包括原代细胞和已建立的细胞系。此类宿主细胞的实例包括但不限于，哺乳动物(例如啮齿类动物和灵长类动物，例如鼠、猴和人)的呼吸道上皮细胞、肝细胞、肺细胞、肾细胞、宫颈细胞、卵巢细胞、骨细胞、乳腺细胞、横纹肌细胞、胃上皮细胞、皮肤表皮细胞、成纤维细胞和***细胞；例如Hep-2细胞、CNE1 细胞、CNE2细胞、BEL-7404细胞、BEL-7402细胞、QSG-7701细胞、PLC/PRF/5细胞、Huh7细胞、Huh7.5.1细胞、SSMC-7721细胞、 BNL-HCC细胞、Hep3B、SNU-739细胞、TIB75细胞、A549细胞、 H480细胞、H1299细胞、H441细胞、H368细胞、H1335细胞、H23 细胞、L929细胞、293FT细胞、293T细胞、293β5细胞、Vero细胞、 BHK-MKL细胞、RK-13细胞、HeLa细胞、TZM-bl细胞、SK-OV-3 细胞、U2-OS细胞、143B细胞、MCF-7细胞、MDA-MB-231细胞、 T-47D细胞、RD细胞、BGC-823细胞、AGS细胞、A431NS细胞、 MeWo细胞、LNCap细胞、RM1细胞和PC-3细胞。
如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有 6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序 (DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol. 48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0) 的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl Biosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residuetable)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP 程序中的Needleman和Wunsch(J MoI Biol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或 4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的必要特性的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem. 32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884 (1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多克隆抗体”和“多抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
如本文中所使用的，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，当其与抗原一起或预先递送入机体时，其可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物试验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂则在临床实验中使用较多。
如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如RSV感染或与RSV感染相关的疾病)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如RSV 感染或与RSV感染相关的疾病)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
如本文中所使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如灵长类动物，例如人。
如本文中所使用的，当术语“约”用于描述可测量的值(例如，物质的浓度、时间、温度等)时，意味着包含给定值的±10％、±5％、或±1％的范围。在某些示例性实施方案中，术语“约”是指给定值的正负10％，例如，约0.015％是指0.0135％-0.0165％的范围。
本发明人经过大量的实验研究，出人意料地发现：在固定/灭活RSV病毒时，通过使用特定的固定剂(例如甲醛，或多聚甲醛)，并使用特定的固定/灭活条件(例如特定的固定剂浓度)，能够获得特别有利的灭活RSV病毒，其与常规方法获得的灭活病毒相比，包含更高含量的pre-F蛋白(即，在本发明获得的灭活RSV病毒中，更多的F 蛋白以pre-F构象存在)。同时，在保存RSV病毒时，通过使用特定的保存条件(例如特定的储存液离子浓度)，能够维持和稳定RSV病毒中pre-F蛋白，甚至能够将pre-F蛋白的含量维持在接近于新鲜的活病毒的水平。这是特别有利的，因为此类灭活RSV病毒将展示更多的只存在于pre-F蛋白、而不存在于post-F蛋白中的强中和表位，从而能够诱发机体产生更强的针对RSV病毒的中和活性，因而特别适合用于开发抗RSV病毒的疫苗，用于预防或治疗RSV感染或与RSV感染相关的疾病(例如肺炎，如小儿肺炎)。
因此，在第一方面，本发明提供了一种灭活分离的呼吸道合胞病毒(RSV)且稳定所述RSV病毒中的pre-F蛋白的方法，其包括以下步骤：
(1)提供分离的活的RSV病毒；
(2)使用选自下列的固定剂对所述活的RSV病毒进行固定和灭活：甲醛溶液和多聚甲醛溶液；其中，甲醛的浓度按重量计为约 0.015％-约0.27％(w/w，下同)；多聚甲醛的浓度按重量计为约0.02％- 约0.3％(w/w，下同)；
(3)从步骤(2)的产物中去除所述固定剂，从而获得灭活的RSV病毒。
在本发明中，表述“分离的”是指该RSV病毒不包含于细胞(例如，宿主细胞)中或以其它方式在细胞(例如，宿主细胞)内提供。
在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，所述固定剂为甲醛溶液并且甲醛的浓度为约0.015％-约0.27％，例如约0.0156％-约0.2667％；例如，约0.0156％-约0.0234％，约0.0234％-约0.0244％，约0.0244％- 约0.0351％，约0.0351％-约0.0527％，约0.0527％-约0.079％，约 0.079％-约0.0977％，约0.0977％-约0.1185％，或约0.1185％-约0.1778％，或约0.1778％-约0.2667％。在某些优选的实施方案中，所述甲醛溶液为甲醛溶于无机溶剂的溶液。优选地，所述无机溶剂选自水、培养基和缓冲液。在某些示例性实施方案中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液(PBS)。
在某些优选的实施方案中，在约0℃-约40℃的温度(例如约0℃- 约4℃，约4℃-约10℃，约10℃-约15℃，约15℃-约20℃，约20℃- 约25℃，约25℃-约30℃，约30℃-约35℃，约35℃-约37℃，或约 37℃-约40℃；例如约4℃，约25℃或约37℃)下，使用甲醛溶液来对所述活的RSV病毒进行固定和灭活。
在某些优选的实施方案中，使用甲醛溶液来对所述活的RSV病毒进行固定和灭活，持续约6h-约36h(例如，约6h-约12h，约12h-约 24h，或约24h-约36h；例如，约6h，约12h，约24h，或约36h)。在某些优选的实施方案中，使用甲醛溶液来对所述活的RSV病毒进行固定和灭活，持续约12h。
在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，所述固定剂为多聚甲醛溶液，并且多聚甲醛的浓度为约0.02％-约0.3％，例如约0.026％-约 0.2963％；例如约0.026％-约0.039％，约0.039％-约0.0585％，约 0.0585％-约0.0625％，约0.0625％-约0.0878％，约0.0878％-约 0.1317％，约0.1317％-约0.1975％，约0.1975％-约0.25％，或约0.25％- 约0.2963％。在某些优选的实施方案中，所述多聚甲醛溶液为多聚甲醛溶于无机溶剂的溶液。优选地，所述无机溶剂选自水、培养基和缓冲液。在某些示例性实施方案中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液(PBS)。
在某些优选的实施方案中，在约10℃-约40℃的温度(例如约10℃ -约15℃，约15℃-约20℃，约20℃-约25℃，约25℃-约30℃，约30℃ -约35℃，约35℃-约37℃，或约37℃-约40℃；例如约10℃，约25℃，约37℃或约40℃)下，使用多聚甲醛溶液来对所述活的RSV病毒进行固定和灭活。
在某些优选的实施方案中，使用多聚甲醛溶液来对所述活的RSV 病毒进行固定和灭活，持续约6h-约36h(例如，约6h-约12h，约12h- 约24h，或约24h-约36h；例如，约6h，约12h，约24h，或约36h)。在某些优选的实施方案中，使用多聚甲醛溶液来对所述活的RSV病毒进行固定和灭活，持续约12h。
在某些优选的实施方案中，在约20℃-约30℃(例如，约20℃，约25℃或约30℃)的温度下，使用浓度为约0.015％-约0.25％(例如约0.0156％-约0.25％；例如，约0.0156％-约0.0625％，或约0.0625％- 约0.25％)的多聚甲醛溶液来对所述活的RSV病毒进行固定和灭活，持续约6h-约36h(例如，约6h-约12h，约12h-约24h，或约24h-约 36h；例如，约12h)。
在某些优选的实施方案中，在约35℃-约40℃(例如，约35℃，约37℃或约40℃)的温度下，使用浓度为约0.0156％-约0.0625％的多聚甲醛溶液来对所述活的RSV病毒进行固定和灭活，持续约6h-约 36h(例如，约6h-约12h，约12h-约24h，或约24h-约36h；例如，约12h)。
在某些优选的实施方案中，在步骤(1)中，通过下述步骤来提供分离的活的RSV病毒：(1a)用RSV病毒感染宿主细胞；(1b)在允许 RSV病毒增殖的条件下，培养步骤(1a)获得的经感染的宿主细胞；和 (1c)收集并裂解步骤(1b)获得的经培养的宿主细胞，并从其裂解物中回收RSV病毒。在本发明中，步骤(1c)的产物不含宿主细胞。
在某些优选的实施方案中，在步骤(1c)中，通过离心或过滤来回收 RSV病毒，并去除宿主细胞。
在某些优选的实施方案中，所述宿主细胞为贴壁细胞。在某些优选的实施方案中，所述宿主细胞为悬浮细胞。在某些优选的实施方案中，所述宿主细胞为原代细胞。在某些优选的实施方案中，所述宿主细胞为已建立的细胞系。在某些优选的实施方案中，所述宿主细胞选自哺乳动物(例如啮齿类动物和灵长类动物，例如鼠、猴和人)的呼吸道上皮细胞、肝细胞、肺细胞、肾细胞、宫颈细胞、卵巢细胞、骨细胞、乳腺细胞、横纹肌细胞、胃上皮细胞、皮肤表皮细胞、成纤维细胞和***细胞；例如Hep-2细胞、CNE1细胞、CNE2细胞、 BEL-7404细胞、BEL-7402细胞、QSG-7701细胞、PLC/PRF/5细胞、 Huh7细胞、Huh7.5.1细胞、SSMC-7721细胞、BNL-HCC细胞、Hep3B、 SNU-739细胞、TIB75细胞、A549细胞、H480细胞、H1299细胞、 H441细胞、H368细胞、H1335细胞、H23细胞、L929细胞、293FT 细胞、293T细胞、293β5细胞、Vero细胞、BHK-MKL细胞、RK-13 细胞、HeLa细胞、TZM-bl细胞、SK-OV-3细胞、U2-OS细胞、143B 细胞、MCF-7细胞、MDA-MB-231细胞、T-47D细胞、RD细胞、 BGC-823细胞、AGS细胞、A431NS细胞、MeWo细胞、LNCap细胞、RM1细胞和PC-3细胞。在某些优选的实施方案中，在步骤(1c) 中，通过用刮刀刮取或者通过用胰酶消化或者通过过滤或离心来收集所述经培养的宿主细胞。在某些优选的实施方案中，在步骤(1c)中，通过超声法裂解所述经培养的宿主细胞。
在某些优选的实施方案中，在步骤(3)中，通过透析、过滤或离心来去除所述固定剂。在某些优选的实施方案中，在步骤(3)中，通过将步骤(2)的产物透析到不含固定剂的溶液中来去除所述固定剂。
在某些优选的实施方案中，在步骤(3)中，使用盐溶液对步骤(2) 的产物进行透析，以去除所述固定剂。在某些优选的实施方案中，所述盐溶液的离子浓度为约100-约1000mM(例如约150-约1000mM，例如约100-约150mM，约150-约200mM，约200-约250mM，约250- 约300mM，约300-约350mM，约350-约400mM，约400-约450mM，约450-约500mM，约500-约550mM，约550-约600mM，约600-约 650mM，约650-约700mM，约700-约750mM，约750-约800mM，约800-约850mM，约850-约900mM，约900-约950mM，约950-约 1000mM，例如约150mM，约330mM，约550mM，约880mM)。
在某些优选的实施方案中，在步骤(3)中，使用离子浓度为约300- 约1000mM(例如约300-约900mM，约300-约350mM，约350-约 400mM，约400-约450mM，约450-约500mM，约500-约550mM，约550-约600mM，约600-约650mM，约650-约700mM，约700-约 750mM，约750-约800mM，约800-约850mM，或约850-约900mM；例如约330mM，约550mM或约880mM)的盐溶液对步骤(2)的产物进行透析。
在某些示例性实施方案中，所述盐溶液包含钠盐(例如，氯化钠、磷酸氢二钠或其组合)和/或钾盐(例如，氯化钾、磷酸二氢钾或其组合)。在某些示例性实施方案中，所述盐溶液为磷酸盐缓冲液(PBS)。在某些示例性实施方案中，所述盐溶液为钠盐溶液(例如，氯化钠、磷酸氢二钠或其组合)。
在某些优选的实施方案中，通过本发明的方法获得的灭活的RSV 病毒，与新鲜收获的活病毒中的pre-F蛋白相比，该灭活的RSV病毒中的pre-F蛋白可保留至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，或100％。在某些优选的实施方案中，通过本发明的方法获得的灭活的RSV病毒，与新鲜收获的活病毒中的pre-F 蛋白相比，该灭活的RSV病毒中的pre-F蛋白可保留至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，或100％，并且可维持上述比例至少24h，例如至少48h，或至少72h。
在某些优选的实施方案中，所述灭活的RSV病毒中的pre-F蛋白能够维持其构象至少24h，例如至少48h，或至少72h。
在第二方面，本发明提供了一种保存RSV病毒且稳定所述RSV 病毒中的pre-F蛋白的方法，其包括将RSV病毒放置于储存液中的步骤，其中所述储存液是离子浓度为约150-约1000mM(例如，约200- 约1000mM，或约300-约1000mM；例如，约150-约200mM，约200- 约250mM，约250-约300mM，约300-约350mM，约350-约400mM，约400-约450mM，约450-约500mM，约500-约550mM，约550-约 600mM，约600-约650mM，约650-约700mM，约700-约750mM，约750-约800mM，约800-约850mM，约850-约900mM，约900-约 950mM，约950-约1000mM，例如约150mM，约330mM，约550mM，或约880mM)的盐溶液。
在某些优选的实施方案中，所述储存液是离子浓度为约300-约 1000mM(例如约300-约900mM，约300-约350mM，约350-约400mM，约400-约450mM，约450-约500mM，约500-约550mM，约550-约 600mM，约600-约650mM，约650-约700mM，约700-约750mM，约750-约800mM，约800-约850mM，或约850-约900mM；例如约 330mM，约550mM或约880mM)的盐溶液。
在某些优选的实施方案中，所述储存液是包含钠盐(例如，氯化钠、磷酸氢二钠或其组合)和/或钾盐(例如，氯化钾、磷酸二氢钾或其组合)的盐溶液。在某些示例性实施方案中，所述储存液为磷酸盐缓冲液(PBS)，或者，所述储存液为钠盐溶液(例如，氯化钠、磷酸氢二钠或其组合)。
在某些优选的实施方案中，通过透析、过滤或离心将所述灭活的 RSV病毒放置于储存液中。
在某些优选的实施方案中，使用盐溶液对所述RSV病毒进行透析，从而将所述RSV病毒放置于储存液中；其中，所述盐溶液的离子浓度为约150-约1000mM(例如，约200-约1000mM，或约300-约 1000mM；例如，约150-约200mM，约200-约250mM，约250-约 300mM，约300-约350mM，约350-约400mM，约400-约450mM，约450-约500mM，约500-约550mM，约550-约600mM，约600-约 650mM，约650-约700mM，约700-约750mM，约750-约800mM，约800-约850mM，约850-约900mM，约900-约950mM，约950-约1000mM，例如约150mM，约330mM，约550mM，或约880mM)。
在某些优选的实施方案中，所述盐溶液的离子浓度为约300-约 1000mM(例如约300-约900mM，约300-约350mM，约350-约400mM，约400-约450mM，约450-约500mM，约500-约550mM，约550-约 600mM，约600-约650mM，约650-约700mM，约700-约750mM，约750-约800mM，约800-约850mM，或约850-约900mM；例如约 330mM，约550mM或约880mM)。
在某些优选的实施方案中，所述盐溶液包含钠盐(例如，氯化钠、磷酸氢二钠或其组合)和/或钾盐(例如，氯化钾、磷酸二氢钾或其组合)；例如，所述盐溶液为磷酸盐缓冲液(PBS)，或者，所述盐溶液为钠盐溶液(例如，氯化钠、磷酸氢二钠或其组合)。
在某些优选的实施方案中，使用盐溶液对所述RSV病毒进行透析，持续约6h-约24h(例如，约12h-约24h，约12h-约20h，或约 16h-约20h；例如，约18h)。
在某些优选的实施方案中，所述RSV病毒是活病毒。在此类实施方案中，所述方法用于保存活的RSV病毒且稳定所述活的RSV病毒中的pre-F蛋白。在某些优选的实施方案中，所述RSV病毒是从宿主细胞新鲜收获的活病毒。
在某些优选的实施方案中，所述RSV病毒是经灭活的病毒。在此类实施方案中，所述方法用于保存灭活的RSV病毒且稳定所述灭活的 RSV病毒中的pre-F蛋白。在本发明中，灭活病毒以破坏其感染受试者(例如哺乳动物，例如人)细胞的能力的方法是本领域技术人员熟知的，包括化学方式和物理方式。用于灭活病毒的合适方式包括但不限于使用有效量的选自下列的一项或多项进行处理：固定剂(例如醇类(如甲醇)、醛类(如甲醛、戊二醛)、β丙内酯、苯酚等)、热量、辐射(例如电磁辐射、X-射线辐射、γ辐射、紫外线辐射等)、补骨脂、亚甲基蓝、臭氧等。
在某些优选的实施方案中，通过下述步骤来提供所述灭活的RSV 病毒：
(i)提供分离的活的RSV病毒；
(ii)使用固定剂对所述活的RSV病毒进行固定和灭活；
(iii)从步骤(ii)的产物中去除所述固定剂，从而获得灭活的RSV 病毒。
在某些优选的实施方案中，在步骤(ii)中，所述固定剂选自甲醛溶液、多聚甲醛溶液、戊二醛溶液及β丙内酯溶液。在某些优选的实施方案中，所述固定剂为甲醛溶液或多聚甲醛溶液。
在某些优选的实施方案中，通过如第一方面所述的灭活RSV病毒的方法，来提供灭活的RSV病毒。
在某些优选的实施方案中，所述方法包括以下步骤：
(1)提供分离的活的RSV病毒；
(2)使用固定剂对所述活的RSV病毒进行固定和灭活；
(3)使用盐溶液对步骤(2)的产物进行透析，从而获得包含灭活的 RSV病毒的储存液；
其中，在步骤(3)中，所述盐溶液的离子浓度为约150-约1000mM (例如，约200-约1000mM，或约300-约1000mM；例如，约150-约 200mM，约200-约250mM，约250-约300mM，约300-约350mM，约350-约400mM，约400-约450mM，约450-约500mM，约500-约 550mM，约550-约600mM，约600-约650mM，约650-约700mM，约700-约750mM，约750-约800mM，约800-约850mM，约850-约 900mM，约900-约950mM，约950-约1000mM，例如约150mM，约 330mM，约550mM，或约880mM)。
在某些优选的实施方案中，所述盐溶液的离子浓度为约300-约 1000mM(例如约300-约900mM，约300-约350mM，约350-约400mM，约400-约450mM，约450-约500mM，约500-约550mM，约550-约 600mM，约600-约650mM，约650-约700mM，约700-约750mM，约750-约800mM，约800-约850mM，或约850-约900mM；例如约 330mM，约550mM或约880mM)。
在某些优选的实施方案中，所述储存液是包含钠盐(例如，氯化钠、磷酸氢二钠或其组合)和/或钾盐(例如，氯化钾、磷酸二氢钾或其组合)的盐溶液；例如，所述储存液为磷酸盐缓冲液(PBS)，或者，所述储存液为钠盐溶液(例如，氯化钠、磷酸氢二钠或其组合)。
在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，所述固定剂为甲醛溶液。
在某些优选的实施方案中，甲醛的浓度按重量计不大于约0.27％，例如不大于约0.2667％。在某些优选的实施方案中，在约0℃-约40℃的温度(例如约0℃-约4℃，约4℃-约10℃，约10℃-约15℃，约15℃ -约20℃，约20℃-约25℃，约25℃-约30℃，约30℃-约35℃，约35℃ -约37℃，或约37℃-约40℃；例如约4℃，约25℃或约37℃)下，使用甲醛溶液来对所述活的RSV病毒进行固定和灭活。在某些优选的实施方案中，使用甲醛溶液来对所述活的RSV病毒进行固定和灭活，持续约6h-约36h(例如，约6h-约12h，约12h-约24h，或约24h-约36h；例如，约6h，约12h，约24h，或约36h)。
在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，所述固定剂为多聚甲醛溶液。
在某些优选的实施方案中，多聚甲醛的浓度按重量计不大于约 0.3％，例如不大于约0.2963％。在某些优选的实施方案中，在约10℃ -约40℃的温度(例如约10℃-约15℃，约15℃-约20℃，约20℃-约 25℃，约25℃-约30℃，约30℃-约35℃，约35℃-约37℃，或约37℃ -约40℃；例如约10℃，约25℃，约37℃或约40℃)下，使用多聚甲醛溶液来对所述活的RSV病毒进行固定和灭活。在某些优选的实施方案中，使用多聚甲醛溶液来对所述活的RSV病毒进行固定和灭活，持续约6h-约36h(例如，约6h-约12h，约12h-约24h，或约24h-约 36h；例如，约6h，约12h，约24h，或约36h)。
在某些优选的实施方案中，所述方法还包括将包含RSV病毒的储存液在约0℃-约40℃(例如约0℃-约4℃，约4℃-约10℃，约10℃- 约15℃，约15℃-约20℃，约20℃-约25℃，约25℃-约30℃，约30℃-约35℃，约35℃-约37℃，或约37℃-约40℃；例如约4℃，约25℃或约37℃)的温度下保存的步骤。
在某些优选的实施方案中，通过本发明的方法保存的灭活的RSV 病毒，与新鲜收获的活病毒中的pre-F蛋白相比，该灭活的RSV病毒中的pre-F蛋白可保留至少60％(例如至少65％、至少70％、至少 75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，或100％)。在某些优选的实施方案中，通过本发明的方法保存的灭活的RSV病毒，与新鲜收获的活病毒中的pre-F蛋白相比，该灭活的RSV病毒中的pre-F蛋白可保留至少60％(例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，或100％)，并且可维持上述比例至少24h，例如至少48h，或至少72h。
在另一个方面，本发明提供了一种灭活的RSV病毒，其通过如第一方面所述的方法制备，和/或经如第二方面所述的方法保存。
在另一个方面，本发明提供了一种疫苗，其包含根据本发明的灭活的RSV病毒，以及任选地，药学上可接受的载体和/或赋形剂(例如佐剂)。
在某些优选的实施方案中，所述灭活的RSV病毒通过如第一方面所述的方法制备；或者，所述灭活的RSV病毒经如第二方面所述的方法保存；或者，所述灭活的RSV病毒通过如第一方面所述的方法制备，并且经如第二方面所述的方法保存。
本发明的疫苗可用于预防、治疗或抑制受试者的RSV感染或与 RSV感染相关的疾病(例如肺炎，如小儿肺炎)。
本发明的疫苗可以单独使用，也可以与其他药学活性剂(例如干扰素类药物，如干扰素或聚乙二醇干扰素)联合使用。
在另一个方面，本发明提供了一种制备疫苗的方法，其包括，将根据本发明的灭活的RSV病毒与药学上可接受的载体和/或赋形剂(例如佐剂)混合。
在某些优选的实施方案中，所述灭活的RSV病毒通过如第一方面所述的方法制备；或者，所述灭活的RSV病毒经如第二方面所述的方法保存；或者，所述灭活的RSV病毒通过如第一方面所述的方法制备，并且经如第二方面所述的方法保存。
在另一个方面，本发明提供了一种用于预防、治疗或抑制受试者的RSV感染或与RSV感染相关的疾病(例如肺炎，如小儿肺炎)的方法，其包括，给有此需要的受试者施用有效量的根据本发明的灭活的RSV病毒，或根据本发明的疫苗。
在某些优选的实施方案中，所述灭活的RSV病毒通过如第一方面所述的方法制备；或者，所述灭活的RSV病毒经如第二方面所述的方法保存；或者，所述灭活的RSV病毒通过如第一方面所述的方法制备，并且经如第二方面所述的方法保存。
在另一个方面，提供了本发明的灭活的RSV病毒在制备疫苗中的用途，所述疫苗用于预防、治疗或抑制受试者的RSV感染或与RSV 感染相关的疾病(例如肺炎，如小儿肺炎)。
在某些优选的实施方案中，所述灭活的RSV病毒通过如第一方面所述的方法制备；或者，所述灭活的RSV病毒经如第二方面所述的方法保存；或者，所述灭活的RSV病毒通过如第一方面所述的方法制备，并且经如第二方面所述的方法保存。
在另一个方面，提供了本发明的灭活的RSV病毒或疫苗，其用于预防、治疗或抑制受试者的RSV感染或与RSV感染相关的疾病(例如肺炎，如小儿肺炎)。
发明的有益效果
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：
(1)本发明的灭活RSV病毒的方法能够用于制备包含pre-F蛋白的灭活RSV病毒，并维持和稳定pre-F蛋白的构象。
(2)本发明的保存RSV病毒的方法能够维持和稳定pre-F蛋白的构象，甚至能够将pre-F蛋白的含量维持在接近于新鲜的活病毒的水平，亦能够用于制备包含pre-F蛋白的灭活RSV病毒。
(3)本发明的灭活RSV病毒，与常规灭活或保存方法获得的灭活病毒相比，包含更高含量的pre-F蛋白，能够在机体内诱导更为有效的免疫应答，因而特别适用于开发抗RSV病毒的疫苗，用于预防或治疗RSV感染或与RSV感染相关的疾病(例如肺炎，如小儿肺炎)。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1显示了pre-F和post-F蛋白上的中和表位的分布。结果显示， pre-F和post-F蛋白共享了约50％的蛋白表面，并且，具有高中和活性的表位(强中和表位)例如
图2显示了用9F7抗体、5C4抗体或8C2抗体孵育的样品的凝胶成像图，其中，所述样品从左至右分别为：采用浓度为6.25％、 1.5625％、0.3906％、0.0977％、0.0244％、0.0061％的甲醛溶液作为固定剂获得的灭活病毒、以及未加入固定剂进行固定/灭活的病毒。
图3显示了用指定浓度的β-丙内酯处理指定时间的样品中，病毒表面pre-F蛋白保留的相对比例(图3A，用5C4抗体孵育)以及总F 蛋白(pre-F构象和/或post-F构象)保留的相对比例(图3B，用8C2 抗体孵育)。
图4显示了用指定浓度的戊二醛处理指定时间的样品中，病毒表面pre-F蛋白保留的相对比例(图4A，用5C4抗体孵育)以及总F 蛋白(pre-F构象和/或post-F构象)保留的相对比例(图4B，用8C2 抗体孵育)。
图5显示了用指定浓度的甲醛处理指定时间的样品中，病毒表面 pre-F蛋白保留的相对比例(图5A、5C、5E、5G，用5C4抗体孵育) 以及总F蛋白(pre-F构象和/或post-F构象)保留的相对比例(图5B、 5D、5F、5H，用8C2抗体孵育)。
图6显示了用指定浓度的甲醛处理12h且放置指定时间后的样品中，病毒表面pre-F蛋白保留的相对比例(图6A，用5C4抗体孵育) 以及总F蛋白(pre-F构象和/或post-F构象)保留的相对比例(图6B，用8C2抗体孵育)。
图7显示了用指定浓度的多聚甲醛处理12h且放置指定时间后的样品中，病毒表面pre-F蛋白保留的相对比例(图7A，用5C4抗体孵育)以及总F蛋白(pre-F构象和/或post-F构象)保留的相对比例(图 7B，用8C2抗体孵育)。
图8显示了用指定浓度的甲醛处理12h且放置指定时间后的样品中，病毒表面pre-F蛋白保留的相对比例(图8A，用5C4抗体孵育) 以及总F蛋白(pre-F构象和/或post-F构象)保留的相对比例(图8B，用8C2抗体孵育)。
图9显示了用指定浓度的多聚甲醛处理12h且放置指定时间后的样品中，病毒表面pre-F蛋白保留的相对比例(图9A，用5C4抗体孵育)以及总F蛋白(pre-F构象和/或post-F构象)保留的相对比例(图 9B，用8C2抗体孵育)。
图10显示了在4℃、25℃或37℃下用指定浓度的多聚甲醛处理 12h且放置指定时间后的样品中，病毒表面pre-F蛋白保留的相对比例(图10A-10C，用5C4抗体孵育)以及总F蛋白(pre-F构象和/ 或post-F构象)保留的相对比例(图10D-10F，用8C2抗体孵育)。
图11显示了在PBS溶液中保存的经甲醛处理的样品和未经固定剂处理的样品中，病毒表面的pre-F蛋白保留的相对比例随时间的变化情况。
图12显示了经灭活/固定后的病毒分别在150mM，330mM， 550mM，880mM盐溶液中透析后，随着放置时间的延长，病毒表面 pre-F蛋白保留的相对比例(图12A-12D，用5C4抗体孵育)以及总 F蛋白(pre-F构象和/或post-F构象)保留的相对比例(图12E-12H，用8C2抗体孵育)。
图13显示了以优选浓度的甲醛溶液以及非优选浓度的甲醛溶液灭活的病毒作为免疫原免疫小鼠后，小鼠体内的RSV特异性中和抗体水平的检测结果。
序列描述
本申请涉及的序列的信息如下：
SEQ ID NO:1(F蛋白的氨基酸序列)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPPTNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEINLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGMDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPV TLSKDQLSGINNIAFSN
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2 版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons,Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
实施例1.RSV病毒的灭活
1.材料和仪器：
Hep-2细胞( CCL-23TM)，Vero细胞(ATCC)：获自ATCC。
hRSV(pSynkRSV A2D46F)：人呼吸道合胞病毒标准株，获自美国国立卫生院NIH。
5C4抗体：实验室自制。5C4抗体特异性识别并结合pre-F蛋白，而不识别或结合post-F蛋白。5C4抗体识别pre-F蛋白上的Siteφ表位，并且其为强中和抗体，中和活性显著高于Palivizumab。有关5C4 抗体的详细信息可参见，中国专利申请201480013927.7和PCT国际申请PCT/CN2014/073505。
8C2抗体：实验室自制。8C2抗体与pre-F蛋白和post-F蛋白均能够发生特异性结合。8C2抗体识别pre-F蛋白和post-F蛋白上的Site II表位，并且其为中和抗体，中和活性与Palivizumab基本上相当。
9F7抗体：实验室自制。9F7抗体为特异性识别戊型肝炎病毒的抗体，与pre-F蛋白或post-F蛋白均不能够发生特异性反应。有关9F7 抗体的详细信息可参见，例如，Min Zhaoet al.J Biol Chem,2015,290: 19910-19922)。
GaM-FITC：FITC标记的山羊抗小鼠抗体，获自Sigma公司。
Bio-Dot SF blotting装置，获自Bio-Rad公司。
ChemiDoc MP全波长凝胶成像系统，获自Bio-Rad公司。
大型台式高速冷冻离心机(型号：Sorvall ST16R),获自Thermo 公司。
2.病毒的准备
将Hep-2细胞(
培养后，用细胞刮刀收集细胞，于冰上冷却，然后用超生破碎仪进行破碎/裂解，以释放病毒。离心细胞裂解物，并收集上清液，随后将含有病毒的上清液分装到冻存管中，快速冻存于-80℃冰箱，保存备用。
3.病毒的固定和灭活
在各个EP管中分别用1×PBS配置指定类型和浓度(2×)的固定液。在37℃化冻病毒，将病毒液与各固定液按体积比1：1混合均匀，并在指定温度下灭活/固定指定时间。所使用的固定液如下：
甲醛(CH2O，CP，西陇化工，货号：50-00-0)；
多聚甲醛(HO(CH2O)nH，n＝10-100，SIGMA-ALDRICH，货号： 16005)；
甲醇(CH3OH,Methanol,AR西陇化工，目录号：1030003AR500)；
戊二醛(Glutaraldehyde solution,Fluka,目录号：49629)；
β-丙内酯(Propiolactone research grade,SERVA,目录号：
57-57-8)。
固定后，在150mM及以上的盐溶液中(例如330mM、550mM、 880mM)在4℃或25℃或37℃透析18h，以除去残余的固定液。透析完毕，取出样品，置于1.5ml EP管中,在25℃下放置24h或48h或72h。
4.灭活病毒表面pre-F和post-F蛋白的检测
从上述EP管中取出灭活病毒液100μl，用Bio-Dot SF blotting装置上样至硝酸盐纤维素膜上。在室温下，用5％脱脂奶封闭1h。
在室温下，用一级抗体(稀释于1×PBS中)孵育硝酸纤维素膜 1h，20ml每张膜。一级抗体包括：特异性结合pre-F蛋白的5C4抗体 (2ng/μl)；结合pre-F蛋白和post-F蛋白的8C2抗体(0.3ng/μl)；以及，不结合pre-F蛋白和post-F蛋白的9F7抗体(0.3ng/μl)。孵育后，在 25℃用1×PBS洗3次，10min/次。随后，避光，在室温下，用二级抗体GaM-FITC(Sigma，货号：F5387-2mL；1:3000稀释于1×PBS中) 孵育上述硝酸纤维素膜1h。孵育后，在25℃用1×PBS洗3次，10min/ 次。随后，用Bio-Rad公司的ChemiDoc MP全波长凝胶成像系统检测用进行检测拍照，记录实验数据。
5.数据处理
将上述硝酸纤维素膜检测拍照数据用Image Lab软件进行数据分析。具体操作如下：对于每一种固定液处理样品而言，分别用三种一级检测抗体进行孵育后(分别为5C4、8C2、9F7)，会产生三个不同的条带，进而产生三个不同的FITC信号强度值，即记为I-5C4、I-8C2、 I-9F7，其中I-9F7作为阴性对照组。其中，I-5C4减去I-9F7得到的差值，代表在该种固定条件处理下病毒表面pre-F的相对量；I-8C2 减去I-9F7得到的差值，代表在该种固定条件处理下病毒表面总F蛋白相对量。
每组实验中会带一管未处理的新鲜病毒样本作为对照组，直接上样到硝酸纤维素膜上，后续检测与固定样本相同，见步骤4。每个实验组样本定量的pre-F的相对量除以对照组的pre-F相对量的比值作为pre-F蛋白固定相对比例。每个实验组样本定量的总F蛋白相对量除以对照组的总F蛋白相对量的比值作为是F总蛋白固定相对比例。
图2显示了用9F7抗体、5C4抗体或8C2抗体孵育的样品的凝胶成像图，其中，所述样品从左至右分别为：采用浓度为6.25％、 1.5625％、0.3906％、0.0977％、0.0244％、0.0061％的甲醛溶液作为固定剂获得的灭活病毒、以及未加入固定剂进行固定/灭活的病毒。
6.实验结果
6.1固定剂及其浓度的选择
我们首先初步评估了本领域常用固定剂对RSV病毒表面pre-F的稳固效果。对于这些固定剂而言，我们采用了药典或参考文献中推荐的用于固定的条件(即，温度)。
简言之，将β-丙内酯用1×PBS配制为2×指定的浓度(1.6％、0.4％、 0.025％、0.00625％、0.001563％或0.000391％)，并于25℃静置30min。随后，在25℃下，将配制的β-丙内酯溶液与RSV病毒按体积比1：1 均匀混合，进行指定的时间(1h、5h、12h或24h)。0％的浓度(即，不固定组)表示，RSV病毒样品与PBS按体积比1：1均匀混合，并孵育指定的时间(下同)。随后，如上文所述，通过透析到1×PBS中去除固定剂，并将经固定的样品用于Dot blot检测。图3显示了用指定浓度的β-丙内酯处理指定时间的样品中，病毒表面pre-F蛋白保留的相对比例(图3A，用5C4抗体孵育)以及总F蛋白(pre-F构象和 /或post-F构象)保留的相对比例(图3B，用8C2抗体孵育)。结果显示，指定浓度的β-丙内酯处理样品1h、5h、12h或24h后，相对于不固定组(0％)没有稳定地维持病毒表面的pre-F蛋白。这一结果表明，β-丙内酯没有明显的优选浓度可以稳定或维持病毒表面的pre-F 蛋白的构象，不适合用于灭活RSV病毒。
将戊二醛用1×PBS配制为2×指定的浓度(0.15625％、0.039063％、 0.009766％、0.002441％、0.00061％、0.000153％、0.000038％、或 0.00001％)，并于25℃静置30min。随后，在25℃下，将配制的戊二醛溶液与RSV病毒按体积比1：1均匀混合，进行指定的时间(0.25h、 0.5h、1h、5h或12h)。随后，如上文所述，通过透析到1×PBS中去除固定剂，并将经固定的样品用于Dot blot检测。图4显示了用指定浓度的戊二醛处理指定时间的样品中，病毒表面pre-F蛋白保留的相对比例(图4A，用5C4抗体孵育)以及总F蛋白(pre-F构象和/或post-F构象)保留的相对比例(图4B，用8C2抗体孵育)。结果显示，用指定浓度的戊二醛处理样品0.25h、0.5h、1h、5h或12h后，相对于不固定组(0％)没有稳定地维持病毒表面的pre-F蛋白。这一结果表明，戊二醛没有优选浓度可以稳定或维持病毒表面的pre-F蛋白的构象，不适合用于灭活RSV病毒。
将甲醛用1×PBS配制为2×指定的浓度(6.25％、1.5625％、 0.3906％、0.0977％、0.0244％、0.0061％、0％)，并于25℃静置30min。随后，在25℃下，将配制的甲醛溶液与RSV病毒按体积比1：1均匀混合，分别进行6h(图5A-B)、12h(图5C-D)、24h(图5E-F)、 36h(图5G-H)。随后如上文所述，通过透析到1×PBS中去除固定剂，最后将灭活的病毒在25℃放置指定的时间(0h、24h、48h、72h)，并在每个时间点取样用于Dot blot检测。图5显示了用指定浓度的甲醛处理指定时间的样品中，病毒表面pre-F蛋白保留的相对比例(图 5A、5C、5E、5G，用5C4抗体孵育)以及总F蛋白(pre-F构象和/ 或post-F构象)保留的相对比例(图5B、5D、5F、5H，用8C2抗体孵育)。结果显示，用指定浓度的甲醛处理样品6h(图5A-B)、12h (图5C-D)、24h(图5E-F)、36h(图5G-H)后，在相同的甲醛浓度范围内(如6.25％-1.5625％、1.5625％-0.3906％、 0.3906％-0.0977％、0.0977％-0.0244％、0.0244％-0.0061％)，处理 12h时pre-F阳性值更多，并且随着放置时间的延长，处理12h的样品仍可以稳定维持在某一水平。
进一步，初步考察了甲醛浓度对固定作用的影响，将甲醛用1×PBS 配制为2×指定的浓度(6.25％、1.5625％、0.3906％、0.0977％、0.0244％、 0.0061％、0.0015％或0.0004％)，并于25℃静置30min。随后，在 25℃下，将配制的甲醛溶液与RSV病毒按体积比1：1均匀混合，在 25℃灭活12h，随后，如上文所述，通过透析到1×PBS中去除固定剂，最后将灭活的病毒在25℃放置指定的时间(0h、24h、48h、72h)，并在每个时间点取样用于Dotblot检测。图6显示了用指定浓度的甲醛处理指定时间的样品中，病毒表面pre-F蛋白保留的相对比例(图6A，用5C4抗体孵育)以及总F蛋白(pre-F构象和/或post-F构象) 保留的相对比例(图6B，用8C2抗体孵育)。结果显示，在用浓度为0.0244％-0.0977％的甲醛处理样品12h后，随着放置时间的延长(0 h、24h、48h、72h)病毒表面仍可以稳定保留显著量的pre-F蛋白 (即，稳定和维持了病毒表面的pre-F蛋白的构象)。这一结果表明，在进行长达12h的固定和灭活的情况下，浓度在0.0244％-0.0977％范围内的甲醛能够稳定和维持pre-F蛋白的构象，从而特别适合用于灭活RSV病毒。
将多聚甲醛用1×PBS配制为指定的浓度(4％、1％、0.25％、 0.0625％、0.0156％、0.0039％或0.001％)，并于25℃静置30min。随后，在25℃下，将配制的多聚甲醛溶液与RSV病毒按体积比1：1 均匀混合，在25℃灭活12h，随后，如上文所述，通过透析到1×PBS 中去除固定剂，最后将灭活的病毒在25℃放置指定的时间(0h、24h、 48h、72h)，并在每个时间点取样用于Dot blot检测。图7显示了用指定浓度的多聚甲醛处理指定时间的样品中，病毒表面pre-F蛋白保留的相对比例(图7A，用5C4抗体孵育)以及总F蛋白(pre-F构象和/或post-F构象)保留的相对比例(图7B，用8C2抗体孵育)。结果显示，在用浓度为0.0156％-0.25％的多聚甲醛处理样品12h后，随着放置时间的延长(0h、24h、48h、72h)病毒表面仍可以稳定保留显著量的pre-F蛋白(即，稳定和维持了病毒表面的pre-F蛋白的构象)。这一结果表明，在进行长达12小时的固定和灭活的情况下，浓度在0.0156％-0.25％范围内的多聚甲醛能够稳定和维持pre-F蛋白的构象，从而特别适合用于灭活RSV病毒。
此外，图3-7的结果还显示，不同的固定剂对pre-F蛋白的影响各不相同。特别地，图3-4的结果显示，与低浓度的β-丙内酯或戊二醛的处理相比，高浓度的β-丙内酯或戊二醛的处理导致样品与5C4抗体的反应性更快速地下降(即，pre-F蛋白的变构更快速地进行)。这些结果表明，β-丙内酯与戊二醛对pre-F蛋白的变构起促进作用。β- 丙内酯与戊二醛不利于RSV F蛋白pre-fusion构象的维持和稳定。
相比之下，图6-7的实验结果则显示，甲醛及多聚甲醛对F蛋白的pre-F构象的影响与其浓度有关；它们各自具有适于稳定pre-F蛋白的浓度范围。特别地，当用浓度为0.0244％-0.0977％的甲醛进行固定时，固定时间可长达12小时，且固定后的样品中仍然保留显著量的 pre-F蛋白。当用浓度为0.0156％-0.25％的多聚甲醛进行固定时，固定时间可长达12小时，且固定后的样品中仍然保留显著量的pre-F蛋白。
此外，图6-7的实验结果还显示，当甲醛或多聚甲醛以低于上述浓度范围的浓度使用时，样品与5C4抗体的反应性(pre-F蛋白)与不固定组相比没有明显变化，也即没有稳定地维持病毒表面的pre-F 蛋白。当甲醛浓度达到0.3906％及以上，或多聚甲醛浓度达到1％及以上时，样品与5C4抗体和8C2抗体的反应性(pre-F蛋白和post-F 蛋白)均显著降低，这表明F蛋白(pre-F和post-F)的表位易于被高浓度的固定剂彻底破坏。
F蛋白的pre-F构象已被证实是能够诱导抗RSV保护性抗体应答的优选构象。并且，之前的研究已显示，pre-F蛋白诱导的中和抗体滴度比post-F蛋白高1-2个LOG。如上文分析的，通过本发明方法获得的灭活RSV病毒保留了显著量的pre-F蛋白，因此，特别适合用作抗病毒疫苗，用于预防或治疗RSV感染或与RSV感染相关的疾病。
6.2甲醛及多聚甲醛的浓度的选择
我们进一步研究了甲醛及多聚甲醛的最佳使用浓度范围。简言之，将甲醛用1×PBS配制为2×指定的浓度(2.015％、1.35％、0.9％、0.6％、 0.4％、0.2667％、0.1778％、0.1185％、0.079％、0.0527％、0.0351％、 0.0234％、0.0156％、0.0104％、0.0069％、0.0046％、或0.0031％)，并于25℃静置30min。随后，在25℃下，将配制的甲醛溶液与RSV 病毒按体积比1：1均匀混合，进行指定的时间(12h)。随后，如上文所述，通过透析到1×PBS中去除固定剂，将灭活后的病毒在25℃下放置指定的时间(0h、24h、48h、72h)后取样用于Dotblot检测。图8显示了用指定浓度的甲醛处理指定时间的样品中，病毒表面 pre-F蛋白保留的相对比例(图8A，用5C4抗体孵育)以及总F蛋白 (pre-F构象和/或post-F构象)保留的相对比例(图8B，用8C2抗体孵育)。
结果显示，用浓度为0.0156％-0.2667％的甲醛处理样品后，病毒表面仍可以稳定保留显著量的pre-F蛋白(即，稳定和维持了病毒表面的pre-F蛋白的构象)。这一结果表明，在进行长达12小时的固定和灭活的情况下，浓度在0.0156％-0.2667％范围内的甲醛能够稳定和维持pre-F蛋白的构象，从而特别适合用于灭活RSV病毒。
此外，将多聚甲醛用1×PBS配制2×为指定的浓度(1％、0.6667％、 0.4444％、0.2963％、0.1975％、0.1317％、0.0878％、0.0585％、0.039％、 0.026％、0.0173％、0.0116％或0％)，并于25℃静置30min。随后，在25℃下，将配制的多聚甲醛溶液与RSV病毒按体积比1：1均匀混合，进行指定的时间(12h)。随后，如上文所述，通过透析到1×PBS 中去除固定剂，将灭活后的病毒在25℃下放置指定的时间(0h、24h、 48h、72h)后取样用于Dotblot检测。图9显示了用指定浓度的多聚甲醛处理指定时间的样品中，病毒表面pre-F蛋白保留的相对比例 (图9A，用5C4抗体孵育)以及总F蛋白(pre-F构象和/或post-F 构象)保留的相对比例(图9B，用8C2抗体孵育)。
结果显示，用浓度为0.0260％-0.2963％的多聚甲醛处理样品后，病毒表面仍可以稳定保留显著量的pre-F蛋白(即，稳定和维持了病毒表面pre-F蛋白的构象)。这一结果表明，在进行长12小时的固定和灭活的情况下，浓度在0.0260％-0.2963％范围内的多聚甲醛能够稳定和维持pre-F蛋白的构象，从而特别适合用于灭活RSV病毒。
6.3温度的选择
我们进一步研究了温度对固定剂的固定作用的影响。一般而言，甲醛溶液是相对稳定的固定剂，其固定作用基本上不受温度变化的影响。我们的实验结果也已显示，优选浓度范围内的甲醛溶液在0-40℃的温度下，均能够用于固定和灭活RSV病毒，并稳定和维持灭活病毒中的pre-F蛋白。
多聚甲醛在低温条件(0-10℃)下是相对稳定的，但在较高的温度下可发生降解，形成甲醛。因此，通常在低温条件下(例如4℃) 使用多聚甲醛。但由于RSV病毒对温度很敏感，其表面的pre-F蛋白在低温条件下极易变构成为Post-F蛋白，故为了研究不同温度下多聚甲醛对于灭活RSV病毒的影响，我们进一步进行了以下实验。
简言之，将多聚甲醛用1×PBS配制为2×指定的浓度(4％、1％、 0.25％、0.0625％、0.0156％、0.0039％或0.001％)，并于指定的温度下(4℃、25℃或37℃)静置30min。随后，在所述指定的温度下，将配制的多聚甲醛溶液与RSV病毒按体积比1：1均匀混合，进行指定的时间(例如12h)。随后，如上文所述，通过透析到1×PBS中去除固定剂，将灭活后的病毒在25℃下放置指定的时间(0h、24h、48 h、72h)后取样用于Dot blot检测。
实验结果如图10所示。图10显示了在4℃(A、D)、25℃(B、 E)或37℃(C、F)下用指定浓度的多聚甲醛处理指定时间的样品中，病毒表面pre-F蛋白保留的相对比例(图10A-10C，用5C4抗体孵育) 以及总F蛋白(pre-F构象和/或post-F构象)保留的相对比例(图 10D-10F，用8C2抗体孵育)。
结果显示，在4℃下用浓度为0.001％－4％的多聚甲醛处理样品后，样品中病毒表面的pre-F蛋白几乎完全检测不到(即，没有稳定和维持样品中病毒表面pre-F蛋白的构象，甚至加速或促进了pre-F 蛋白的变构)。在25℃下用浓度为0.0156％-0.25％的多聚甲醛处理样品后，病毒表面仍可以稳定保留显著量的pre-F蛋白(即，稳定和维持了病毒表面的pre-F蛋白的构象)。在37℃下用浓度为 0.0156％-0.0625％的多聚甲醛处理样品后，样品中仍然包含显著量的 pre-F蛋白阳性的细胞(即，稳定和维持了样品中的pre-F蛋白的构象)。
这些结果表明，多聚甲醛能够在不同温度下发挥其作用(即，灭活RSV病毒，且稳定和维持病毒中的pre-F蛋白)，但是其优选浓度范围需要根据实际使用的温度进行适当的调整。然而，最优选地，在常温条件(10℃-37℃)下使用多聚甲醛来固定和灭活RSV病毒，并稳定和维持pre-F蛋白。
6.4经固定的样品中病毒表面pre-F蛋白的稳定性检测
我们进一步研究了经固定的样品中病毒表面pre-F蛋白的稳定性。简言之，将甲醛用1×PBS配制为2×指定浓度(如25％、6.25％、 1.5625％、0.3906％、0.0977％、0.0244％、0.0061％、0.0015％或 0.0004％)，并于25℃静置30min。随后，在25℃下，将配制的甲醛溶液与RSV病毒按体积比1：1均匀混合，进行12h。随后，通过透析到PBS盐溶液中去除固定剂，并将经固定的样品保存于PBS盐溶液中。另外，还将未经固定剂处理的样品保存于生理盐水缓冲液中，用作对照。随后，在室温放置指定的时间(0h、24h、48h或72h)后，并将经固定的样品用于Dot blot检测。
实验结果如图11所示。图11显示了在PBS盐溶液中保存的经甲醛处理的样品和未经固定剂处理的样品中，病毒表面的pre-F蛋白保留的相对比例随时间的变化情况(用5C4抗体孵育)。
结果显示，在保存长达72h后，经甲醛处理的样品中病毒表面仍然保留显著量的pre-F蛋白(即，样品中病毒表面的pre-F蛋白保持稳定，未发生变构)。相比之下，在保存24h后，未经固定剂处理的样品中病毒表面的pre-F蛋白保留量随放置时间的延长而降低。这些结果表明，本发明的固定和灭活RSV病毒的方法能够有效稳定RSV 病毒表面的pre-F蛋白，避免其转化为post-F蛋白。
实施例2.RSV病毒的保存
在本实施例中，我们进一步研究了透析盐溶液(即储存液)对固定后病毒表面pre-F蛋白的影响。一般而言，我们通过透析、过滤或离心来去除固定后样品(即，包含灭活病毒和固定剂的溶液)中的固定剂。在实施例1中，我们采用了将固定后样品放置在不同浓度的透析盐溶液中置换出固定剂的方法，从而将灭活病毒保存于相应的储存液中。在本实施例中，进一步将固定后样品在不同盐溶液中进行透析，监测在不同盐溶液中，经灭活/固定过的病毒蛋白随时间的稳定情况。从而选出较为合适的储存盐溶液环境，使病毒表面的pre-F蛋白更加稳定。
用氯化钠(Nacl,Sodium chloride),(AR)(西陇化工，10011012AR) 和十二水磷酸氢二钠(国药集团，325)按照摩尔浓度比10：1配置不同浓度的盐溶液，分别有330mM，550mM，880mM，同时有一组溶液为PBS溶液，经计算得PBS溶液的摩尔浓度大约为150mM左右。
将获得的经灭活/固定后的样品放置在透析袋中，随后放置在不同盐溶液中进行透析，透析条件为：25℃，300转/min，样品与透析液的体积比为1：500，透析时间为18h，换液时间点分别为3h,6h,12h。
将透析后的样品取出，放进体积合适的EP管中，经过在25℃放置一定的时间(例如0h,24h,48h,72h)后检测病毒表面F蛋白，从而监测病毒表面pre-F蛋白以及总F蛋白在不同盐溶液中随时间的变化。
实验结果如图12所示。图12显示了经灭活/固定后的病毒分别在 150mM(A、B)，330mM(C、D)，550mM(E、F)，880mM(G、 H)盐溶液中透析后，随着放置时间的延长，病毒表面pre-F蛋白保留的相对比例(图12A、12C、12E、12G，用5C4抗体孵育)以及总 F蛋白(pre-F构象和/或post-F构象)保留的相对比例(图12B、12D、 12F、12H，用8C2抗体孵育)。
结果显示，在150mM盐溶液中透析后，经优选固定液浓度固定过的病毒，其表面保留有较多的pre-F蛋白，并且随着放置时间的延长，其病毒表面的pre-F蛋白仍保持在较高水平，并可维持72h以上。但在低于或者高于优选固定液浓度范围条件下固定过的病毒，其表面的pre-F蛋白大量丢失，并且随着在盐溶液中放置时间的延长，病毒表面的pre-F蛋白进一步丢失。在330mM，550mM，880mM盐溶液中透析后，经等于或高于低于优选固定液浓度固定过的病毒，其表面保留有大量的pre-F蛋白，并随着盐溶液浓度的升高而升高，逐级趋近于90％-100％，这种高水平的蛋白量可稳定维持72h以上。
上述结果表明，在将固定/灭活的病毒经透析除去固定液的过程中，透析液(即固定/灭活后病毒的储存液)的盐离子浓度对于稳定或维持病毒表面pre-F蛋白构象是重要的。当使用较低离子浓度的盐溶液(例如盐离子浓度小于150mM)作为储存液时，在透析或储存过程中，病毒表面pre-F蛋白会随着透析或放置时间的延长快速变构为 post-F蛋白。当使用较高离子浓度的盐溶液(例如盐离子浓度不低于 150mM)作为储存液时，随着透析或放置时间的延长，对于优选固定 /灭活条件(例如，实施例1中所述的甲醛或多聚甲醛及其优选浓度) 下灭活的病毒，在盐溶液中储存可以很好的维持已固定的pre-F蛋白；对于非优选固定/灭活条件(例如，低于实施例1中所述的优选浓度，和/或非优选固定剂)下灭活的病毒甚至未经固定的病毒，在高盐溶液透析或者放置过程中将未能固定的pre-F蛋白保持在pre-F构象，使之不易发生变构。因此，较高离子浓度(例如不低于150mM)的溶液可以很好地稳固pre-F蛋白构象，从而特别适用于保存RSV病毒。
实施例3.免疫保护性的检测
在本实施例中，我们研究了经甲醛固定液处理之后的RSV病毒的免疫保护性。简言之，将甲醛用2×PBS分别配制为0.01％和0.0527％的浓度，并于25℃静置30min。随后，在25℃下，将配制的各甲醛溶液与病毒按体积比1：1缓慢混合均匀，进行12h。随后，如上文所述，通过透析去除固定剂(25℃透析18h)，透析液为550mM的盐溶液，随后将透析好的样品通过离心来去除一部分可溶性杂蛋白，用一定体积的无血清培养基将沉淀重悬后与AL佐剂按体积比1:1混匀，用于 SPF级Balb/C小鼠进行肌肉免疫(n＝6-10)。0.0527％甲醛灭活的小组有三个免疫剂量，分别是2.52×105(L),2×107(M)以及1×108(H) 个病毒粒子/只小鼠，0.01％甲醛灭活的小组免疫剂量为2.52×105个病毒粒子/只小鼠，免疫周期为每15天一次，共进行2次。每针免疫结束后15天，通过眼球采血采集小鼠血液，检测血清的中和抗体的水平。
通过如下方案来检测血清的中和抗体的水平。在96孔板 (SIGMA-ALDRICH)中将小鼠血清用培养基稀释，每个血清除第一孔 10倍稀释(90μl培养基+10μl血清)，其余均4倍稀释(75μl培养基 +25μl稀释血清)，共稀释9梯度。取稀释后的血清75μl与75μL滴度为2×106PFU的RSV-A mkate病毒(该病毒在感染细胞后可在细胞中表达荧光蛋白mkate，最终可通过mkate荧光强度判定感染强度)。将稀释好的血清和病毒混匀后于37℃孵育1小时。1小时后取血清和病毒的混合液100μl加入到预先铺好Hep-2细胞(ATCC)(5×104个细胞每孔)的96孔细胞板中。之后细胞板于37℃培养24小时后，用 PARADIGM多功能读板仪(BECKMANCOULTER)读取荧光值。每个血清获得一组不同稀释浓度下的病毒感染细胞后的荧光读值，将荧光读值及血清稀释度输入Graph Prism软件中，通过曲线拟合计算出每个血清的中和IC50。在实验中会同时带入一组8C2单抗的中和检测对照。最终通过IC50数据，将每份血清换算成相对8C2的IC50 滴度，以1mg/mL的8C2抗体为1个中和单位，输出每份血清的相对8C2中和单位。
实验结果如图13所示。图13显示了，用优选浓度的甲醛溶液(即 0.0527％)，以及非优选浓度的甲醛溶液(即0.01％)灭活的病毒制备成免疫原后免疫小鼠，检测小鼠体内的RSV特异性中和抗体的水平。
图13中纵坐标代表小鼠血清中和抗体在免疫第二针后的IC50 值。结果显示，经不同浓度的甲醛溶液灭活的病毒，相同免疫剂量下会激发出不同的RSV中和抗体水平，相比较0.01％和0.0527％浓度灭活的病毒，优选条件下(0.0527％甲醛)灭活病毒作为免疫原可激发出更高的中和抗体水平，并且具有统计学差异。并且随着免疫剂量的增加，所激发出的中和抗体水平也随之升高。这些结果表明，通过本发明方法获得的灭活RSV病毒保留了显著量的pre-F蛋白，进而诱导高滴度中和抗体，因此，特别适合用作抗病毒疫苗，用于预防或治疗RSV感染或与RSV感染相关的疾病。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
SEQUENCE LISTING
<110> 厦门大学
<120> 灭活及保存呼吸道合胞病毒的方法
<130> IDC170135
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 574
<212> PRT
<213> respiratory syncytial virus
<400> 1
Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr
1 5 10 15
Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe
20 25 30
Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu
35 40 45
Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile
50 55 60
Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys
65 70 75 80
Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu
85 90 95
Met Gln Ser Thr Pro Pro Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro
100 105 110
Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr
115 120 125
Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val
130 135 140
Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu
145 150 155 160
Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys
165 170 175
Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val
180 185 190
Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn
195 200 205
Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln
210 215 220
Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn
225 230 235 240
Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu
245 250 255
Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys
260 265 270
Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile
275 280 285
Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro
290 295 300
Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro
305 310 315 320
Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg
325 330 335
Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe
340 345 350
Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp
355 360 365
Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Ile Asn Leu Cys Asn Val
370 375 380
Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr
385 390 395 400
Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys
405 410 415
Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile
420 425 430
Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Met Asp
435 440 445
Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly
450 455 460
Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro
465 470 475 480
Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn
485 490 495
Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu
500 505 510
Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr
515 520 525
Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val
530 535 540
Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser
545 550 555 560
Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn
565 570
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