包含b组腺病毒的调配物
阅读说明：本技术 包含b组腺病毒的调配物 (Formulations comprising group B adenoviruses ) 是由 S·阿尔维斯 M·基尔蒂卡 于 2019-01-31 设计创作，主要内容包括：本公开提供了一种适合于B组腺病毒的液体调配物,所述液体调配物包括：a)B组腺病毒,如有复制能力的B组腺病毒；b)15％v/v到25％v/v甘油,例如16％v/v、17％v/v、18％v/v、19％v/v、20％v/v、21％v/v甘油；以及c)0.1％v/v到1.5％v/v乙醇,例如0.2-1％,如1％v/v乙醇；以及d)缓冲液,以及e)任选地氨基酸,其中所述调配物的pH处于8.0到9.6的范围内,并且本公开提供了所述液体调配物在治疗中,特别是在癌症治疗中的用途。(The present disclosure provides a liquid formulation suitable for a group B adenovirus, the liquid formulation comprising: a) group B adenoviruses, e.g., replication competent group B adenoviruses; b) 15% v/v to 25% v/v glycerol, such as 16% v/v, 17% v/v, 18% v/v, 19% v/v, 20% v/v, 21% v/v glycerol; and c) 0.1% v/v to 1.5% v/v ethanol, for example 0.2-1%, such as 1% v/v ethanol; and d) a buffer, and e) optionally an amino acid, wherein the pH of the formulation is in the range of 8.0 to 9.6, and the present disclosure provides the use of the liquid formulation in therapy, in particular in the treatment of cancer.)
本公开涉及一种B组腺病毒的调配物(如艾纳德诺(EnAd))，一种制备所述调配物的方法以及所述调配物在治疗，具体地治疗癌症中的用途。
背景技术
目前，药物领域处于实现病毒作为人类用途治疗剂的潜力的边缘。迄今为止，源自ONXY-15(ONYX制药公司(ONYX Pharmaceuticals)，并且由上海三维生物技术有限公司(Shanghai Sunway Biotech)获得)的病毒在有限数量的国家中被批准用于头颈癌，并且
许多病毒疗法基于腺病毒，如B组腺病毒，例如EnAd。EnAd(先前称为ColoAd1)是当前在临床试验中用于治疗上皮癌的嵌合溶瘤腺病毒(WO2005/118825)。这些基于腺病毒的治疗剂需要以适合于支持登记之后的临床试验和需求两者的量并且在遵守良好制造实践(GMP)的条件下进行制造。
用于长期储存的腺病毒调配物是本领域已知的，参见例如US7,888,096和US7,351,415。此类调配物已经用于悬浮C组腺病毒(如Ad5)，具体地被工程化为表达人p53的复制缺陷型Ad5病毒。
B组腺病毒与C组腺病毒具有不同的性质，例如B组病毒通过CD46感染细胞，而C组病毒通过CAR受体(柯萨基病毒(cocksackievirus)和腺病毒受体)感染细胞。当通过高效液相色谱分析时，B组病毒与C组病毒具有不同的保留时间。参见例如图7，其示出了Ad5和Ad11类型病毒(如EnAd)的相对保留时间。
本发明的诸位发明人已经发现，当使用现有技术调配物来悬浮B组腺病毒(如EnAd)时，腺病毒仅可以在病毒浓度和功效两者均发生显著降解之前在4℃下保持非常短的时间段。这种类型的降解被称为化学降解，因为所述降解源于调配物中发生的化学过程。
物理稳定性也是非常重要的，例如物理不稳定性可能本身通过聚集表现出来，这可能导致免疫原性增加。
因此，需要针对B组腺病毒的长期储存特别定制改进的调配物，例如适合于在4℃下储存的调配物。这允许调配物在4℃下保持较长的时间段，其中对腺病毒的功效和活力具有最小的有害影响。这进而使得调配物的储存和运输(例如，从制造设施到诊所)变得相当容易且更便宜。
令人惊讶地，本发明的诸位发明人已经确定，虽然许多成分对于B组病毒调配物的稳定是重要的，但是少量的乙醇似乎对于使降解最小化和保持感染性是必要的。
本公开提供了各成分的组合，所述成分一起用于稳定B组病毒(如EnAd)，具体地在4℃下。
发明内容
本公开提供了适合于储存B组腺病毒(例如，对至少一个转基因进行编码的B组病毒)的调配物，并且将所述调配物概括在以下段落中：
1.一种适合于B组腺病毒的液体调配物，所述液体调配物包括：
a)B组腺病毒，如有复制能力的B组腺病毒；
b)15％v/v到25％v/v甘油，(例如，17％v/v到20％v/v)，如16％v/v、17％v/v、18％v/v、19％v/v、20％v/v、21％v/v甘油；以及
c)0.1％v/v到1.6％v/v乙醇，例如0.1-1.5％，如1％v/v乙醇或可替代地1.4％v/v或1.5％v/v；
d)缓冲液，
其中所述调配物的pH处于8.0到9.6的范围内，例如8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4或9.5，如8.5到9.5，具体地8.5到9.0，更具体地pH8.5、8.6、8.7、8.8或8.9。
2.根据段落1所述的调配物，其中所述pH是8.0。
3.根据段落1所述的调配物，其中所述pH是8.1。
4.根据段落1所述的调配物，其中所述pH是8.2。
5.根据段落1所述的调配物，其中所述pH是8.3。
6.根据段落1所述的调配物，其中所述pH是8.4。
7.根据段落1所述的调配物，其中所述pH是8.5。
8.根据段落1所述的调配物，其中所述pH是8.6。
9.根据段落1所述的调配物，其中所述pH是8.7。
10.根据段落1所述的调配物，其中所述pH是8.8。
11.根据段落1所述的调配物，其中所述pH是8.9。
12.根据段落1所述的调配物，其中所述pH是9。
13.根据段落1到12中任一项所述的调配物，其中所述调配物用于例如在用注射用液体(如等渗溶液或注射用水)稀释之后通过静脉内施用进行施用。
14.根据段落13所述的调配物，其中所述调配物用于通过缓慢注射进行施用。
15.根据段落13所述的调配物，其中所述调配物用于通过输注进行施用。
16.根据段落1到15中任一项所述的调配物，其进一步包括表面活性剂，例如非离子型表面活性剂。
17.根据段落16所述的调配物，其进一步包括聚山梨醇酯，例如聚山梨醇酯20、40、60或80，如0.05-0.15％v/v聚山梨醇酯20、40、60或80。
18.根据段落17所述的调配物，其中所述调配物包括聚山梨醇酯80，例如0.05-0.15％v/v聚山梨醇酯80，如0.115％v/v聚山梨醇酯80。
19.根据段落1到18中任一项所述的调配物，其进一步包括甲硫氨酸，例如0.01-0.3mM，如0.01到0.25，具体地0.25mM甲硫氨酸。
20.根据段落1到18中任一项所述的调配物，其进一步包括甲硫氨酸，例如0.01-0.3mM，例如0.01到0.2，如0.15mM甲硫氨酸。
21.根据段落1到20中任一项所述的调配物，其进一步包括5mM到20mM，如15mM精氨酸。
22.根据段落1到20中任一项所述的调配物，其进一步包括精氨酸，例如5mM到15mM，如10mM精氨酸。
23.根据段落1到20中任一项所述的调配物，其中所述缓冲液选自葡甲胺、Gly-NaCl和TRIS。
24.根据段落23所述的调配物，其中所述调配物包括葡甲胺缓冲液。
25.根据段落1到24中任一项所述的调配物，其中所述调配物不包括HEPES缓冲液。
26.根据段落1到15中任一项所述的调配物，其中所述调配物包括：
a)15-20％v/v甘油；
b)1-1.5％v/v乙醇；
c)0.2-0.3mM甲硫氨酸；
d)10-20mM精氨酸；以及
e)缓冲液，如葡甲胺；以及
f)任选地0.1-0.2％v/v聚山梨醇酯80；
其中所述调配物的pH处于范围为8.0到9.5内的pH，例如8.0到9.0，如pH 8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0，具体地8.0。
27.根据段落26所述的调配物，其中所述调配物包括：
a)20％v/v甘油；
b)1.4-1.5％v/v乙醇；
c)0.25mM甲硫氨酸；
d)15mM精氨酸；以及
e)缓冲液，如葡甲胺；
其中所述调配物的pH处于范围为8.0到9.5内的pH，例如8.0到9.0，如pH 8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0，具体地8.0。
28.根据段落1到15中任一项所述的调配物，其中所述调配物包括：
a)20％v/v甘油；
b)1％v/v乙醇；
c)0.115％v/v聚山梨醇酯80；
d)0.15mM甲硫氨酸；
e)10mM精氨酸；以及
f)缓冲液，如葡甲胺；
其中所述调配物的pH处于范围为8.0到9.5内的pH，例如8.5到9.5，如pH 8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0，具体地9.0。
29.根据前述段落中任一项所述的调配物，其中所述B组腺病毒包括式(I)的序列：
5'ITR-B1-BA-B2-BX-BB-BY-B3-3'ITR
其中：
B1是键或包括：E1A、E1B或E1A-E1B；
BA包括-E2B-L1-L2-L3-E2A-L4；
B2是键或包括：E3；
BX是键或包括以下的DNA序列：限制位点，一个或多个转基因或两者；
BB包括L5；
BY是键或包括以下的DNA序列：限制位点，一个或多个转基因或两者；
B3是键或包括：E4；
其中BX或BY中的至少一个不是键。
30.根据段落29所述的调配物，其中BX包括转基因或转基因盒。
31.根据段落29或30所述的调配物，其中BY包括转基因或转基因盒。
32.根据段落29所述的调配物，其中BY包括转基因或转基因盒，并且BX是键。
33.根据段落29到32中任一项所述的调配物，其中所述一个或多个转基因或转基因盒受内源或外源启动子，如内源启动子的控制。
34.根据段落33所述的调配物，其中所述转基因盒受选自由以下组成的组的内源启动子的控制：E4和主要晚期启动子，具体地所述主要晚期启动子。
35.根据段落29到34中任一项所述的调配物，其中所述转基因盒进一步包括独立地选自以下的调节元件：
a)剪接受体序列(例如，短剪接受体序列CAGG，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)；
b)内部核糖体进入序列或高自切割效率2A肽；
c)Kozak序列；以及
d)其组合。
36.根据段落35所述的调配物，其中所述转基因盒包括位于蛋白质编码序列起始处的Kozak序列。
37.根据段落29到36中任一项所述的调配物，其中所述转基因盒编码高自切割效率2A肽，例如P2A肽、E2A肽、F2A肽和T2A肽。
38.根据段落37所述的调配物，其中所述转基因盒编码多种高自切割效率2A肽，如2种、3种或4种肽。
39.根据段落38所述的调配物，其中自切割肽是由不相同的DNA序列编码的。
40.根据段落29到39中任一项所述的调配物，其中所述转基因盒进一步包括多腺苷酸化序列。
41.根据段落29到40中任一项所述的调配物，其中所述转基因盒进一步包括对前导序列进行编码的序列。
42.根据段落29到41中任一项所述的调配物，其中所述转基因盒进一步包括位于DNA序列的3'端处和/或DNA序列的5'端处的限制位点。
43.根据段落29到42中任一项所述的调配物，其中至少一个转基因盒编码单顺反子mRNA。
44.根据段落29到43中任一项所述的调配物，其中至少一个转基因盒编码多顺反子mRNA。
45.根据段落29到44中任一项所述的调配物，其中所述转基因编码RNAi序列、多肽(如蛋白质或肽)。
46.根据段落45所述的调配物，其中所述多肽是抗体或其结合片段。
47.根据段落46所述的调配物，其中所述抗体或其结合片段对以下具有特异性：OX40、OX40配体、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40配体、CD70、CD137、GITR、4-1BB、ICOS、ICOS配体、CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、VISTA、B7-H3、B7-H4、HVEM、ILT-2、ILT-3、ILT-4、TIM-3、LAG-3、BTLA、LIGHT、CD160、CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2，例如CD40和CD40配体。
48.根据段落45到47中任一项所述的调配物，其中所述经过编码的多肽是独立地选自包括以下的组的细胞因子：IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-9、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-33、IL-35、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、IL-25、IL-1RA、IFNα、IFNβ、IFNγ、TNFα、TGFβ、淋巴毒素α(LTA)和GM-CSF，例如IL-12、IL-18、IL-22、IL-7、IL-15、IL-21、IFNγ、TNFα、TGFβ和淋巴毒素α(LTA)。
49.根据段落24到44中任一项所述的调配物，其中所述经过编码的多肽是独立地选自包括以下的组的趋化因子：IL-8、CCL5、CCL17、CCL20、CCL22、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL12、CCL2、CCL19、CCL21、CXCR2、CCR2、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR3、CXCR4、CXCR5和CRTH2，例如CCL5、CXCL9、CXCL12、CCL2、CCL19、CCL21、CXCR2、CCR2、CCR4和CXCR4或其受体(如选自以下的趋化因子：IL-8、CCL5、CCL17、CCL20、CCL22、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL12、CCL2、CCL19、CCL21或其受体，更具体地CCL5、CXCL9、CXCL12、CCL2、CCL19、CCL21或其受体)。
50.根据段落29到49中任一项所述的调配物，其中所述经过编码的多肽是报告基因，例如碘化钠同向转运体、细胞内金属蛋白、HSV1-tk、GFP、荧光素酶或***受体，例如碘化钠同向转运体。
51.根据段落50所述的调配物，其中所述报告基因是荧光蛋白。
52.根据段落1到51中任一项所述的调配物，其中所述腺病毒的E4orf4区是非功能性的，例如完全缺失、部分缺失或截短。
53.根据段落1到48中任一项所述的调配物，其中所述腺病毒的E2B区是嵌合的，例如其中所述E2B区包括源自第一腺病毒血清型的核酸序列和源自第二不同腺病毒血清型的核酸序列；其中所述第一血清型和所述第二血清型各自选自腺病毒亚组B、C、D、E或F。
54.根据段落1到53中任一项所述的调配物，其中所述腺病毒是嵌合EnAd。
55.根据段落1到54中任一项所述的调配物，其中所述腺病毒是Ad11。
56.根据段落1到55中任一项所述的调配物，其中所述B组腺病毒是有复制能力的。
57.根据段落1到56中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:14或其衍生物中，例如不带有His标签的病毒。
58.根据段落1到57中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:15或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
59.根据段落1到58中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:16或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
60.根据段落1到59中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:17或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
61.根据段落1到60中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:18或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
62.根据段落1到61中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:19或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
63.根据段落1到62中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:20或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
64.根据段落1到63中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:21或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
65.根据段落1到64中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:22或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
66.根据段落1到65中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:23或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
67.根据段落1到66中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:24或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
68.根据段落1到67中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:25或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
69.根据段落1到68中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:26或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
70.根据段落1到69中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:27或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
71.根据段落1到70中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:28或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
72.根据段落1到71中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:29或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
73.根据段落1到72中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:30或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
74.根据段落1到73中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:31或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
75.根据段落1到74中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:32或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
76.根据段落1到75中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:33或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
77.根据段落1到76中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:34或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
78.根据段落1到77中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:35或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
79.根据段落1到78中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:36或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
80.根据段落1到79中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:37或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
81.根据段落1到80中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:38或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
82.根据段落1到81中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:39或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
83.根据段落1到82中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:40或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
84.根据段落1到83中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:41或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
85.根据段落1到84中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:42或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
86.根据段落1到85中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:43或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
87.根据段落1到86中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:44或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
88.根据段落1到87中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:45或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
89.根据段落1到88中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:46或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
90.根据段落1到89中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:47或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
91.根据段落1到86中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:48或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
92.根据段落1到91中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:49或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
93.根据段落1到92中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:50或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
94.根据段落1到93中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:51或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
95.根据段落1到94中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:52或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
96.根据段落1到95中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:53或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
97.根据段落1到96中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:54或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
98.根据段落1到97中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:55或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
99.根据段落1到98中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:56或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
100.根据段落1到99中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:57或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
101.根据段落1到100中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:58或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
102.根据段落1到101中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:59或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
103.根据段落1到102中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:60或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
104.根据段落1到103中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:61或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
105.根据段落1到104中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:62或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
106.根据段落1到105中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:63或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
107.根据段落1到106中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:64或其衍生物中，例如不带有His标签的病毒。
108.根据段落1到107中任一项所述的调配物，其中所述病毒示出于SEQ ID NO:65或其衍生物中，例如带有或不带有His标签的病毒。
109.根据段落1到108中任一项所述的调配物，其用于治疗中。
110.根据段落109所述的调配物，其用于治疗癌症，例如结肠直肠癌、肝癌、***癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、甲状腺癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌或肺癌。
111.根据段落109或110所述的调配物，其用于例如在用注射用液体稀释之后静脉内施用。
112.根据段落109或110所述的调配物，其用于瘤内注射。
113.一种根据段落1到107中任一项所述的调配物在制造用于治疗癌症的药物中的用途，例如结肠直肠癌、肝癌、***癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、甲状腺癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌或肺癌。
114.一种治疗方法，所述方法包括向对其有需要的患者施用根据段落1到108中任一项所述的调配物。
115.根据段落114所述的治疗方法，其中待治疗的所述患者患有癌症，例如结肠直肠癌、肝癌、***癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、甲状腺癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌或肺癌。
116.根据段落114或115所述的方法，其中通过静脉内或瘤内注射施用所述调配物。
有利地，本发明的诸位发明人已经确定，如本文所描述的调配物允许B组腺病毒(如EnAd)成功地储存，例如在4℃下，持续长时间段，如6个月或更久，例如1年、1.5年和2年(具体地18到24个月，如18个、19个、20个、21个、22个、23个或24个月)，而没有功效的显著降解或降低。在本公开的调配物中还可以使聚集最小化。本公开的调配物也可以在如25℃等的温度下保持稳定持续适度的时间段。
病毒的长期储存可以例如处于如-60℃或更低等的温度下，更具体地处于-60℃到-80℃的范围内，具体地-60℃、-61℃、-62℃、-63℃、-64℃、-65℃、-66℃、-67℃、-68℃、-69℃、-70℃、-71℃、-72℃、-73℃、-74℃、-75℃、-76℃、-77℃、-78℃、-79℃和-80℃。
在一个实施例中，本公开的调配物的pH为8.5到9.5(如pH为8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4或9.5)，其显著高于生理pH，即pH 7.4。
在一个实施例中，调配物的pH为9.0。令人惊讶地，本发明的诸位发明人已经发现，高pH对调配物中的B组腺病毒(如EnAd)的稳定性具有显著影响。
甘油的浓度对于B组腺病毒(如EnAd)的稳定性也是重要的。
根据欧洲药品管理局(EU Medicines Agency)，虽然在小型化学实体和顺势救济疗法的口服和局部药物调配物中采用乙醇，但是乙醇的使用涉及某些安全问题。乙醇是一种中枢神经系统抑制剂。在成人中轻度到中度中毒可以包含欣快感、共济失调、镇静、攻击行为、恶心和呕吐。在较高剂量下，其可能引起呼吸抑制或衰竭以及心脏毒性，如房性心动过速、心房颤动、心律失常、AV阻滞、低血压、充血性心力衰竭和严重心肌抑制。在儿童中，乙醇中毒可能引起低血糖症、低体温症以及昏迷。急性暴露之后的其它毒性包含癫痫发作、张力减退、反射减退、胃肠道出血、急性肝炎、急性胰腺炎、横纹肌溶解症、低钾血症以及乳酸酸中毒。
乙醇代谢在个体之间并且随年龄而变化，例如一些个体缺乏酶醇脱氢酶，这降低其代谢醇的能力。在用于静脉内施用的调配物中，乙醇直接进入血流中，这使任何毒性作用最大化。另外，所施用体积可以很大，因此500ml到1L含有10％乙醇的调配物是50ml到100ml乙醇。
因此，虽然乙醇似乎对于稳定B组腺病毒调配物是重要的，但重要的是应最小化调配物中的乙醇的毒性。令人惊讶地，非常少量的乙醇(例如小于1.5％，如小于1％)足以提供稳定。在一个实施例中，采用不超过1.5％的乙醇，例如采用不超过1％的乙醇。这是有益的，因为其使乙醇的毒性最小化，同时提供稳定作用。另外，其使得调配物适合于大多数患者群体。
在一个实施例中，本公开的调配物包括非离子型表面活性剂，例如选自包括以下的组：西土马哥1000(也称为Briji 52、56或58)、十八十六醇(cetostearyl alcohol)、棕榈酸、甘油单月桂酸酯、油醇、泊洛沙姆、普朗尼克F127、聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20、40、60、80或85)、硬脂酸、脱水山梨糖醇三硬脂酸酯。在一个实施例中，采用亲水-亲油平衡值处于14.5到17范围内的非离子型表面活性剂。
在一个实施例中，调配物进一步包括聚山梨醇酯，例如聚山梨醇酯20、40、60或80，如0.05-0.15％聚山梨醇酯20、40、60、80或其两种或更多种的组合。在一个实施例中，调配物包括0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.10％、0.11％、0.12％、0.13％、0.14％或0.15％聚山梨醇酯20、40、60、80或其两种或更多种的组合。向调配物中添加聚山梨醇酯的优点在于聚山梨醇酯有助于在长期储存期间保持B组腺病毒功效，并且可以使聚集最小化。
在一个实施例中，调配物包括聚山梨醇酯80，例如0.05-0.15％聚山梨醇酯80，如0.09％到0.11％聚山梨醇酯80，如0.1％或0.115％聚山梨醇酯。在一个实施例中，调配物包括0.115％聚山梨醇酯。
有利地，非离子型表面活性剂，具体地聚山梨醇酯(如聚山梨醇酯80)减少或抑制调配物内的界面应力，例如减少病毒上的表面应力，这又可能引起病毒的破坏。
虽然不希望受理论束缚，但认为向调配物中添加某些氨基酸(例如，甲硫氨酸、精氨酸和其组合)可以减少病毒/病毒相互作用，并且由此有助于稳定B组腺病毒在调配物中的分布，例如通过提供空间保护。添加一种或多种氨基酸，例如甲硫氨酸、精氨酸和其组合也可以优化B组腺病毒的优先水合/排除。此参数被认为在稳定B组腺病毒中具有重大重要性。优先相互作用可以表示为优先结合共溶剂(如水)或其优先排除(优先水合)。
在一个实施例中，调配物进一步包括至少一种氨基酸，例如1种、2种或3种氨基酸。
在一个实施例中，所述至少一种氨基酸具有疏水侧链，例如所述至少一种氨基酸选自丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸和其组合。
在一个实施例中，调配物进一步包括甲硫氨酸，例如0.01-0.3mM(0.01-0.2mM)，例如0.01mM、0.02mM、0.03mM、0.04mM、0.05mM、0.06mM、0.07mM、0.08mM、0.09mM、0.10mM、0.12mM、0.13mM、0.14mM、0.15mM、0.16mM、0.17mM、0.18mM、0.19mM、0.20mM，如0.15mM甲硫氨酸。可替代地，甲硫氨酸可以以0.25mM存在于调配物中。
在一个实施例中，所述至少一种氨基酸具有碱性带电侧链，例如选自精氨酸、组氨酸、赖氨酸和其组合。
在一个实施例中，调配物进一步包括精氨酸，例如1mM到20mM(或1mM到15mM)，例如2mM到10mM的精氨酸，如2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、5mM、5.5mM、6mM、6.5mM、7mM、7.5mM、8mM、8.5mM、9mM、9.5mM或10mM的精氨酸。在一个实施例中，调配物中的精氨酸处于10mM到20mM的范围内，例如10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM或20mM，如14mM、15mM或16mM。有利地，向调配物中添加精氨酸进一步增强腺病毒的稳定性，特别是在储存的前12个月期间。
在一个实施例中，调配物进一步包括以下中的一种或多种：葡甲胺缓冲液、甘氨酸缓冲液、TRIS缓冲液。这些缓冲液当掺入到所公开的调配物中时都显示出产生良好的稳定性。
在一个实施例中，调配物包括例如在pH 8.0下的葡甲胺缓冲液。葡甲胺缓冲液适合用于pH范围为8.0到10.5，例如8.5到10.5。
在一个实施例中，缓冲液是TRIS。TRIS能够在pH 7到9的范围内进行缓冲。在一个实施例中，缓冲液不包括TRIS。
在一个实施例中，缓冲液是甘氨酸缓冲液，其能够在pH 8.6到10.6的范围内进行缓冲。
必须选择缓冲液以匹配pH，例如HEPES仅能够缓冲高达pH 8.2。与HEPES相比，本文公开的其它缓冲液可以提供B组腺病毒的改进的稳定性概况。因此，尽管HEPE通常用于B组腺病毒(如EnAd)的储存，但是在一个实施例中，调配物不包括HEPES缓冲液。
在一个实施例中，根据本公开的调配物中的病毒编码1个、2个、3个或4个转基因。
式(I)的定义
在一个实施例中，BX包括限制位点，例如1个、2个、3个或4个限制位点，如1个或2个。在一个实施例中，BX包括至少一个转基因，例如1个或2个转基因。在一个实施例中，BX包括至少一个转基因(例如，1个或2个转基因)和一个或多个限制位点(例如，2个或3个限制位点)，具体地其中所述限制位点夹着基因或包括基因的DNA序列以允许从基因组中特异性地切除和/或替代所述一个或多个基因。可替代地，限制位点可以夹着每个基因，例如当存在两个转基因时，需要三个不同的限制位点以确保可以选择性地切除和/或替代所述基因。在一个实施例中，一个或多个，例如所有转基因均呈转基因盒的形式。
在一个实施例中，BX不包括限制位点。在一个实施例中，BX是键。在一个实施例中，Bx包括一个或多个转基因或由其组成。
在一个实施例中，BY包括限制位点，例如1个、2个、3个或4个限制位点，如1个或2个。在一个实施例中，BY包括至少一个转基因，例如1个或2个转基因。在一个实施例中，BY包括至少一个转基因(例如，1个或2个转基因)和一个或多个限制位点(例如，2个或3个限制位点)，具体地其中所述限制位点夹着基因或包括基因的DNA序列以允许从基因组中特异性地切除和/或替代所述一个或多个基因。可替代地，限制位点可以夹着每个基因，例如当存在两个转基因时，需要三个不同的限制位点以确保可以选择性地切除和/或替代所述基因。
在一个实施例中，BY不包括限制位点。在一个实施例中，BY是键。在一个实施例中，BY包括一个或多个转基因或由其组成。
除了使转基因盒的大小最小化之外，在病毒中采用内源启动子在治疗背景下也可能是有利的，因为转基因仅在病毒复制时表达。这与组成型外源启动子形成对比，所述组成型外源启动子将不断地转录转基因，并且可能导致经过编码的实体(如经过编码的多肽)的不适当浓度或定位。
可替代地，采用外源启动子可能是有利的，因为所述外源启动子可以强烈地和组成性地表达经过编码的实体，这在某些情况下可能特别有用，例如在患者具有严重弥漫性癌症的情况下。因此，在一个实施例中，转基因的表达处于CMV启动子的控制下。
在一个实施例中，转基因盒进一步包括独立地选自以下的调节元件：剪接受体序列、内部核糖体进入序列或高自切割效率2A肽、Kozak序列和其组合。
在一个实施例中，所述转基因盒包括位于蛋白质编码序列起始处的Kozak序列。
在一个实施例中，所述转基因盒编码高自切割效率2A肽。
在一个实施例中，所述转基因盒进一步包括多腺苷酸化序列。
在一个实施例中，所述转基因盒进一步包括位于DNA序列的3'端处和/或DNA序列的5'端处的限制位点。
具体实施方式
本发明公开的调配物具有高于生理pH的碱性pH。可以使用本领域已知的常规技术将给定溶液缓冲到特定pH，例如包含缓冲到包括以下的酸/碱系统：Tris、赖氨酸、强酸(例如，HCl)或弱酸(例如，乙酸或马来酸)、强碱(例如，NaOH)或弱碱(例如，氨)。
如本文所使用的，缓冲液是指适合于悬浮或储存B组腺病毒而不负面影响例如所述B组腺病毒的结构完整性或其复制能力的缓冲液。现今使用的大多数生物缓冲液由NEGood和其研究团队开发(Good等人,1966,Good和Izawa,1972,Ferguson等人,1980；“Good缓冲液(Good buffer)”)，并且包含N-取代的牛磺酸或甘氨酸缓冲液。下文列出了一些通常使用的生物缓冲液。此列表不是详尽的，并且其它缓冲液也将是本领域的技术人员已知的。
在一个实施例中，所公开的调配物包括以下缓冲液中的一种或多种：2-氨基乙磺酸(AES)缓冲液、甲酸盐缓冲液(如甲酸铵缓冲液、乙酸铵缓冲液)、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙二醇(AMPD)缓冲液、N-(1,1,-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(AMPSO)缓冲液、二羟乙基甘氨酸缓冲液、双-三-丙烷、硼酸缓冲液、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)缓冲液、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)缓冲液、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(HEPPS)缓冲液、1-甲基哌啶缓冲液、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-(2-羟基丙磺酸)(HEPPSO)缓冲液、甘氨酰甘氨酸缓冲液、哌嗪-1,4-双(2-羟基丙磺酸)二水合物或哌嗪-N,N'-双(2-羟基丙磺酸)(POPSO)缓冲液、[三(羟甲基)甲基氨基]丙磺酸(TAPS)缓冲液、3-[N-三(羟甲基)-甲基氨基]-2-羟基丙磺酸(TAPSO)缓冲液、三乙醇胺缓冲液、2-[三(羟甲基)-甲基氨基]-乙磺酸(TES)缓冲液、三甲基甘氨酸缓冲液、葡甲胺缓冲液、甘氨酸缓冲液(如Gly-NaOH)、TRIS缓冲液。
在一个实施例中，所公开的调配物包括以下缓冲液中的一种或多种：葡甲胺缓冲液、Gly-NaCl缓冲液、TRIS缓冲液。
如本文所使用的长期是指至少6个月的时间段，如6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个或36个月。在一个实施例中，所公开的调配物允许B组腺病毒稳定地储存持续至少12个月，如12个月、18个月和24个月。除非指明，否则长期存储通常是指在4℃下的存储。
在一个实施例中，将调配物储存在温度范围为-1℃到-95℃下，例如-1℃到-80℃，如-1℃、-2℃、-3℃、-4℃，或-65℃、-66℃、-67℃、-68℃、-69℃、-70℃、-71℃、-72℃、-73℃、-74℃、-75℃、-77℃、-78℃、-79℃、-80℃、-81℃、-82℃、-83℃、-84℃、-85℃、-86℃、-87℃、-88℃、-89℃或-90℃，具体地-80℃。
在一个实施例中，提供了液体胃肠外调配物(包含重构的调配物)，例如对于根据本公开的输注或注射例如能够复制的溶瘤，其中所述调配物提供的剂量范围为每剂量体积1×1010到1×1014个病毒颗粒。
在一个实施例中，液体调配物作为浓缩物提供，其在向患者施用之前需要稀释。
在一个实施例中，调配物作为冻干的调配物提供，其用于与可注射液体(如注射用水、盐水或葡萄糖)一起重构。
在一个实施例中，调配物作为液体浓度提供，其用于用注射用液体(如注射用水、盐水、葡萄糖或类似物)稀释。
在一个实施例中，将调配物制造为液体(在任何时间都没有冻干)，具体地呈最终形式，即，适合于向患者施用。
肠胃外调配物意指设计为不通过胃肠道递送的调配物。典型的肠胃外递送途径包含注射、植入或输注。在一个实施例中，调配物以推注递送的形式提供。
在一个实施例中，肠胃外调配物呈注射的形式。注射包含静脉内、皮下、肿瘤内或肌内注射。如本文所采用的注射意指通过注射器将液体***体内。在一个实施例中，本公开的方法不涉及肿瘤内注射。
在一个实施例中，肠胃外调配物呈输注的形式。
如本文所采用的输注意指通过滴注、输注泵、注射器驱动器或等效装置施用流体。在一个实施例中，输注在时间段范围为1.5分钟到120分钟内施用，如约3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟、65分钟、70分钟、65分钟、80分钟、85分钟、90分钟、95分钟、100分钟、105分钟、110分钟或115分钟。
在一个实施例中，通过注射器驱动器施用小于100ml的一个剂量的调配物，例如30ml。
在一个实施例中，注射以缓慢注射的方式施用，例如在1.5分钟到30分钟的时间段内施用。如本文所采用的缓慢注射是用注射器的手动注射。
在一个实施例中，调配物用于静脉内(i.v.)施用。此途径对于溶瘤病毒的递送特别有效，因为其可以快速进入大多数器官和组织，并且对于转移的治疗特别有用，例如确定的转移，尤其是位于高度血管化区(如肝和肺)的转移。
治疗调配物通常在制造和储存条件下是无菌的且稳定的。组合物可以被调配为溶液、微乳液、脂质体或适合于向人施用的其它肠胃外调配物。
根据本公开的调配物可以被调配为预填充装置，如注射器或小瓶，特别是作为单个剂量。
调配物通常将包括药学上可接受的稀释剂或载剂，例如与病毒相容的无毒的等渗载剂，并且其中病毒在必需的一段时间内是稳定的。
载剂可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其合适的混合物的溶剂或分散介质。例如，通过使用分散剂或表面活性剂，如卵磷脂或如聚山梨醇酯80或40等非离子型表面活性剂，可以保持适当的流动性。在分散体中，可以通过表面活性剂的存在来辅助保持所需粒度。等渗剂的实例包含组合物中的糖、如甘露醇等多元醇、山梨糖醇或氯化钠。
在一个实施例中，所采用的肠胃外调配物可以包括糖(例如，右旋糖、甘露糖、蔗糖或类似物)、盐(如氯化钠、氯化镁或氯化钾)和其中两种或更多种的组合。
在一个实施例中，根据本公开的调配物不包括糖。出于本公开的目的，缓冲液的组分不被认为是糖。
在一个实施例中，本公开的调配物不包括盐，如氯化钠。出于本公开的目的，用于缓冲液中的试剂不被认为是盐。
在一个实施例中，本公开的调配物不包括二价阳离子，例如CaCl2和/或MgCl2。
调配物还可以包括防腐剂，如EDTA。在一个实施例中，本公开的调配物不含有EDTA。
在一个实施例中，根据本公开的调配物不包括氯丁醇。
在一个实施例中，本公开的调配物不包括明胶。
在一个实施例中，调配物不含有增加B组腺病毒的免疫原性的任何成分，即调配物不含有一种或多种佐剂。
在一个实施例中，调配物将包括根据本公开的纯化的溶瘤病毒，例如每剂量1×1010个到1×1014个病毒颗粒，如每剂量1×1010个到1×1012个病毒颗粒。在一个实施例中，调配物中的病毒的浓度处于2×108vp/ml到2×1014vp/ml，如2×1012vp/ml的范围内。
可在《雷明顿氏药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》(马克出版公司(Mack Publishing Company)，新泽西州(N.J.)1991)中获得药学上可接受的载剂的详尽讨论。
本公开还扩展到鼻内递送的液体溶液或悬浮液，例如采用如在WO2009/068877和US2004/0153033两者中公开的装置，所述文献通过引用并入本文。
除非上下文另有指明，否则所采用的B组腺病毒通常将指代命名为B组病毒的能够复制(包含有复制能力)的腺病毒或复制缺陷型病毒，例如Ad11，如包含其嵌合体的Ad11p，如EnAd。在一些情况下，其可以用于仅指有复制能力的病毒，并且这一点从上下文中将是清楚的。
如本文所采用的B亚组(B组或B型)是指至少具有来自B组腺病毒的纤维和六邻体的病毒，例如来自B组病毒的整个衣壳，如基本上来自B组病毒的整个基因组。B亚组病毒包含3、7、11、14、16、21、34、35、50和55。
在一个实施例中，本公开的病毒(如溶瘤病毒)具有Ad11六邻体，如A11p六邻体。在一个实施例中，本公开的病毒(如溶瘤病毒)具有B亚组纤维。在一个实施例中，本公开的病毒(如溶瘤病毒)具有Ad11纤维，如A11p纤维。在一个实施例中，本公开的病毒(如溶瘤病毒)具有来自同一血清型的纤维和六邻体蛋白，例如B亚组腺病毒，如Ad11，具体地Ad11p。
在一个实施例中，本公开的病毒(如溶瘤病毒)具有来自同一血清型的纤维、六邻体和五邻体蛋白，例如Ad11，具体地Ad11p，例如在后者的基因组序列的位置30811-31788、18254-21100和13682-15367处发现。
艾纳德诺(EnAd)是具有来自Ad11p的纤维、五邻体和六邻体的先前被称为ColoAd1(WO2005/118825)的嵌合溶瘤腺病毒，因此其是B组病毒。其具有嵌合E2B区，所述区包括来自Ad11p和Ad3的DNA。在EnAd中几乎整个E3区和E4区的一部分都缺失。
如本文所采用的E3是指对部分或整个腺病毒E3区(即，蛋白质/多肽)进行编码的DNA序列，其可以被突变使得由E3基因编码的蛋白质具有保守或非保守的氨基酸变化，使得其具有与野生型(对应的未突变蛋白质)相同的功能；与野生型蛋白质相比功能增加；功能降低，如与野生型蛋白质相比无功能或与野生型蛋白质或其组合相比具有新功能，视情况而定。E3区的一部分缺失(在E3区中部分缺失)的位置包含E3区的1％到99％缺失的位置，例如在基因的编码和/或非编码区中的如2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％缺失。
如本文所采用的E4是指对腺病毒E4区(即，多肽/蛋白质区)进行编码的DNA序列，其可以被突变使得由E4基因编码的蛋白质具有保守或非保守的氨基酸变化，并且具有与野生型(对应的非突变蛋白质)相同的功能；与野生型蛋白质相比功能增加；功能降低，如与野生型蛋白质相比无功能或与野生型蛋白质或其组合相比具有新功能，视情况而定。
E4区可以具有与病毒复制相关的一种或多种功能，并且因此修饰(如E4区的缺失)可能对病毒生命周期和复制产生影响，例如使得可能需要包装细胞用于复制。
在一个实施例中，E4具有缺失的E4ORF4区。
如本文所采用的“源自”是指例如其中DNA片段取自腺病毒或与最初在腺病毒中发现的序列相对应。这种语言不旨在限制如何获得序列，例如可以合成在根据本公开的病毒中采用的序列。
在一个实施例中，衍生物在其全长上与原始DNA序列具有100％序列同一性。
在一个实施例中，衍生物与原始DNA序列具有95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性。
在一个实施例中，衍生物在严格条件下与原始DNA序列杂交。
如本文所使用的，“严格”通常在约Tm(熔解温度)-50℃(比探针的Tm低5°)到约Tm以下20℃到25℃的范围内发生。如本领域的技术人员将理解的，可以使用严格杂交来鉴定或检测相同的多核苷酸序列或鉴定或检测类似或相关的多核苷酸序列。如本文所使用的，术语“严格条件”意指如果在序列之间存在至少95％，如至少97％同一性，则杂交通常将发生。
如本文所使用的，如本文所使用的“杂交”应包含“多核苷酸链通过碱基配对与互补链连接的任何过程”(Coombs,J.,《生物技术字典(Dictionary of Biotechnology)》,斯托克顿出版社(Stockton Press),纽约,纽约州,1994)。
溶瘤病毒是优先地感染癌细胞并加速细胞死亡的病毒，例如通过裂解癌细胞，或在癌细胞中选择性复制。优先地感染癌细胞的病毒是当与正常健康细胞相比时显示更高速率的感染癌细胞的病毒。
在癌细胞中选择性复制的病毒是需要在癌细胞中上调的基因或蛋白质来复制的病毒，如p53基因。
E2B区是B组腺病毒中的已知区并且表示约18％的病毒基因组。认为的是，其编码蛋白质IVa2、DNA聚合酶和末端蛋白质。在Ad11的Slobitski菌株(称为Ad11p)中，这些蛋白质分别编码在基因组序列中的位置5588-3964、8435-5067和10342-8438处，并且E2B区从10342-3950延伸。E2B区的确切位置可能在其它血清型中会变化，但功能在迄今为止检查的所有人类腺病毒基因组中是保守的，因为其全部均具有相同的一般组织。
如本文所采用的能够复制是指能够在体内复制的病毒，包含复制依赖于患病细胞中的上调基因的病毒(如p53)和有复制能力的病毒。
在一个实施例中，病毒是有复制能力的。如本文所采用的有复制能力的病毒是指能够在没有对必需病毒蛋白进行编码的互补细胞系(如由E1区编码的互补细胞系(也称为包装细胞系))的辅助下复制的病毒以及能够在没有辅助病毒的辅助下复制的病毒。
如本文所采用的病毒载体是复制缺陷型的。本公开的复制缺陷型病毒需要包装细胞系来复制。包装细胞系含有一个或多个基因以补充在病毒中有缺陷的基因。
在一个实施例中，本公开提供了一种制备药物调配物的方法，所述方法包括以下步骤：将B组腺病毒(如有复制能力的B组病毒)与15％v/v到25％v/v甘油、0.1％v/v到1.5％v/v乙醇、缓冲液(其中％v/v是最终调配物体积)混合，并且如果需要，将pH范围调节为8.0到9.5，例如8.0到9.5(或8.5到9.5)，如8.0到8.5(或8.5到9)。
在一个实施例中，所述方法进一步包括添加0.01mM到0.3mM，例如0.01mM到0.25mM(或0.01mM到2mM)，如0.25mM(或0.15mM)甲硫氨酸。
在一个实施例中，调配物包括与之一起提交的相关序列表中公开的病毒序列。
治疗
根据本公开的调配物的患者接受者可以是人或动物，例如家畜。在一个实施例中，患者是人，如成年人。
本公开的调配物适合于能够复制(包含有复制能力)的B组腺病毒和复制缺陷型B组腺病毒载体的调配物，其用于治疗和诊断应用，例如用于基因治疗应用、疫苗、癌症治疗等。
在进一步的方面，本公开扩展到如本文所描述的用于治疗，具体地用于治疗癌症的调配物。
在一个实施例中，所述治疗方法用于***。
如本文所采用的肿瘤(tumour)旨在指代由过度细胞***引起的异常组织块，其是不受控制的和渐进的，也称为肿瘤(neoplasm)。肿瘤可以是良性的(非癌性的)或恶性的。肿瘤涵盖所有形式的癌症和转移。在一个实施例中，所述肿瘤是癌性的。
在一个实施例中，所述肿瘤是实体瘤。实体瘤可以定位或转移。
在一个实施例中，所述肿瘤是上皮来源的。
在一个实施例中，所述肿瘤是恶性肿瘤，如结肠直肠癌、肝癌、***癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、甲状腺癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌或肺癌。
在一个实施例中，所述肿瘤是结肠直肠恶性肿瘤。
如本文所采用的，恶性肿瘤是指癌性细胞。
在一个实施例中，溶瘤腺病毒用于治疗或预防转移。
在一个实施例中，本文的调配物用于治疗耐药性癌症。
在一个实施例中，病毒与进一步的癌症治疗或疗法的施用组合施用。
在一个实施例中，提供了根据本公开的用于制造用于治疗癌症(例如，上述癌症)的药物的调配物。
在进一步的方面，提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括向对其有需要的患者(例如，人类患者)施用治疗有效量的根据本公开的调配物。
在一个实施例中，本文的调配物与另一种疗法组合施用。
如本文所采用的，“组合”旨在涵盖在癌症治疗或疗法之前、同时和/或之后施用本文的调配物的位置。然而，通常，用于组合疗法的治疗方案通常会重叠。
癌症疗法包含外科手术、放射疗法、靶向疗法和/或化学疗法。
如本文所采用的，癌症治疗是指用治疗化合物或生物制剂进行治疗，例如旨在治疗癌症的抗体和/或其维持疗法。
在一个实施例中，癌症治疗选自包含以下的任何其它抗癌疗法：化学治疗剂；靶向抗癌剂，如抗体药物缀合物；放射疗法、放射性同位素疗法或其任何组合。
在一个实施例中，本公开的调配物可以用作对于如外科手术(新辅助疗法)等疗法的预治疗，以缩小肿瘤、治疗转移和/或预防转移或进一步转移。可以在如外科手术(辅助疗法)等疗法之后使用调配物以治疗转移和/或预防转移或进一步转移。
在一个实施例中，本公开的调配物用于维持疗法。
在一个实施例中，根据本公开的调配物与癌症疗法组合施用，例如与癌症疗法同时施用。
如本文所采用的，同时地是与调配物同时或大致同时施用另外的癌症治疗。治疗可以包含在同一调配物内或以单独调配物的形式施用。
在一个实施例中，病毒与化学治疗剂的施用例如同时组合施用。
如本文所采用的，化学治疗剂旨在是指对恶性细胞和组织选择性破坏的特异性抗肿瘤化学药剂或药物。例如，烷化剂、抗代谢物、蒽环类药物、植物生物碱、拓扑异构酶抑制剂和其它抗肿瘤剂。特异性化学治疗剂的实例包含阿霉素(doxorubicin)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、紫杉醇(paclitaxel)、卡培他滨(capecitabine)、伊立替康(irinotecan)以及如顺铂(cisplatin)和奥沙利铂(oxaliplatin)等铂类(platins)。剂量可以由医师基于所治疗的癌症的性质来选择。
组合疗法和化学治疗剂
本公开的调配物可以与进一步的癌症疗法(例如，化学疗法)组合采用。
除非上下文另外指明，否则化学治疗剂和化学疗法或细胞毒性剂在本文中可互换采用。
本文所采用的化学疗法旨在是指对恶性细胞和组织“选择性”破坏的特异性抗肿瘤化学药剂或药物，例如烷化剂、抗代谢物(包含胸苷酸合酶抑制剂)、蒽环类药物、抗微管剂(包含植物生物碱)、拓扑异构酶抑制剂、parp抑制剂和其它抗肿瘤剂。在此上下文中，选择性地使用是不严格的，因为当然这些药剂中的许多均具有严重的副作用。
优选的剂量可以由医师基于所治疗的癌症的性质来选择。
可以在本公开的方法中采用的烷化剂的实例包含烷化剂氮芥、亚硝基脲、四嗪、氮丙啶、铂类和衍生物、以及非经典烷化剂。
含有铂的化学治疗剂(也称为铂类)，如顺铂、卡铂、奥沙利铂、沙铂、吡铂、奈达铂、三铂和脂铂(顺铂的脂质体形式)，具体地顺铂、卡铂和奥沙利铂。
根据确切的癌症，顺铂的剂量范围为约20到约270mg/m2。剂量通常处于约70到约100mg/m2的范围内。
氮芥包含二氯甲基二乙胺、环磷酰胺(cyclophosphamide)、美法仑、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、异环磷酰胺(ifosfamide)和白消安。亚硝基脲包含N-亚硝基-N-甲基脲(N-Nitroso-N-methylurea)(MNU)、卡莫司汀(carmustine)(BCNU)、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)和司莫司汀(semustine)(MeCCNU)、福莫司汀(fotemustine)和链脲霉素(streptozotocin)。四嗪包含达卡巴嗪(dacarbazine)、米托唑胺(mitozolomide)和替莫唑胺(temozolomide)。
氮丙啶包含噻替派(thiotepa)、自力霉素(mytomycin)和亚丝醌(diaziquone)(AZQ)。
可以在本公开的方法中采用的抗代谢物的实例包含抗叶酸剂(例如，氨甲蝶呤(methotrexate)和培美曲塞(pemetrexed))、嘌呤类似物(例如，硫嘌呤，如硫唑嘌呤、巯嘌呤、硫嘌呤、氟达拉滨(包含磷酸盐形式)、喷司他丁和克拉屈滨)、嘧啶类似物(例如，氟嘧啶，如5-氟尿嘧啶和其前药，如卡培他滨
可以在本公开的方法中采用的蒽环类药物的实例包含柔红霉素(daunorubicin)(道诺霉素(Daunomycin))、柔红霉素(脂质体)、阿霉素(doxorubicin)(亚德里亚霉素(Adriamycin))、阿霉素(脂质体)、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)、目前仅用于治疗膀胱癌的戊柔比星(valrubicin)和米托蒽醌(mitoxantrone)蒽环类类似物，具体地阿霉素。
可以在本公开的方法中采用的抗微管剂的实例包含长春花生物碱和紫杉烷。
长春花生物碱包含完全天然的化学药品，例如长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine)，以及还包含半合成长春花生物碱，例如长春瑞滨(vinorelbine)、长春地辛(vindesine)和长春氟宁(vinflunine)。
紫杉烷包含紫杉醇、多西他赛、白蛋白结合型紫杉醇、卡巴他赛(carbazitaxel)和其衍生物。本文所采用的紫杉烷的衍生物包含紫杉烷如紫杉醇(taxol)的再调配物，例如在胶束调配物中，衍生物还包含化学衍生物，其中合成化学物质用于修饰紫杉烷起始材料。
可以在本公开的方法中采用的拓扑异构酶抑制剂包含I型拓扑异构酶抑制剂、II型拓扑异构酶抑制剂和II型拓扑异构酶毒剂。I型抑制剂包含拓朴替康、伊立替康、吲哚替康(indotecan)和因帝米替康(indimitecan)。II型抑制剂包含染料木素和ICRF 193，其具有以下结构：
II型毒剂包含安吖啶(amsacrine)、依托泊苷(etoposide)、磷酸依托泊苷(etoposide phosphate)、替尼泊苷(teniposide)和阿霉素以及氟喹诺酮(fluoroquinolone)。
在一个实施例中，所采用的化学治疗剂的组合是，例如铂和5-FU或其前药，例如顺铂或奥沙利铂和卡培他滨或吉西他滨，如FOLFOX。
在一个实施例中，化学疗法包括化学治疗剂，具体地细胞毒性化学治疗剂的组合。
在一个实施例中，化学疗法组合包括铂，如顺铂和氟尿嘧啶或卡培他滨。
在一个实施例中，化学疗法组合包括卡培他滨和奥沙利铂(Xelox)。
在一个实施例中，化学疗法是亚叶酸和5-FU的组合，任选地与奥沙利铂组合。
在一个实施例中，化学疗法是亚叶酸、5-FU和伊立替康(FOLFIRI)的组合，任选地与奥沙利铂(FOLFIRINOX)组合。所述方案由以下组成：伊立替康(180mg/m2 IV，90分钟以上)与亚叶酸(400mg/m2[或2×250mg/m2]IV，120分钟以上)同时施用；随后是氟尿嘧啶(400-500mg/m2IV推注)，然后是氟尿嘧啶(2400-3000mg/m2静脉内输注，46小时以上)。此周期通常每两周重复一次。上文所示的剂量可能因周期而异。
在一个实施例中，化学疗法组合采用微管抑制剂，例如硫酸长春新碱、埃博霉素A、N-[2-[(4-羟苯基)氨基]-3-吡啶基]-4-甲氧基苯磺酰胺(ABT-751)，紫杉醇来源的化学治疗剂，例如紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇或多西他赛或其组合。
在一个实施例中，所述组合采用mTor抑制剂。mTor抑制剂的实例包含：依维莫司(everolimus)(RAD001)、WYE-354、KU-0063794、雷帕霉素(papamycin)(西罗莫司)、替西罗莫司(Temsirolimus)、地磷莫司(Deforolimus)(MK-8669)、AZD8055和BEZ235(NVP-BEZ235)。
在一个实施例中，所述组合采用MEK抑制剂。MEK抑制剂的实例包含：AS703026、CI-1040(PD184352)、AZD6244(司美替尼)、PD318088、PD0325901、AZD8330、PD98059、U0126-EtOH、BIX 02189或BIX 02188。
在一个实施例中，所述组合采用AKT抑制剂。AKT抑制剂的实例包含：MK-2206和AT7867。
在一个实施例中，所述组合采用极光激酶抑制剂。极光激酶抑制剂的实例包含：极光A抑制剂I、VX-680、AZD1152-HQPA(巴拉塞替(Barasertib))、SNS-314甲磺酸、PHA-680632、ZM-447439、CCT129202和橙皮苷(Hesperadin)。
在一个实施例中，所述组合采用例如如在WO2010/038086中所公开的p38抑制剂，如N-[4-({4-[3-(3-叔丁基-1-p-甲苯基-1H-吡唑-5-基)脲基]萘乙酰胺-1-基氧基}甲基)吡啶-2-基]-2-甲氧基乙酰胺基。
在一个实施例中，所述组合采用例如选自以下的pi3K抑制剂：达托尼西(dactolisib)、皮克立西(pictilisib)、LY294002、艾德拉尼(idelalsib)、布帕尼西(buparlisib)、奥托非尼(autophinib)、色雷利塞(serabelisib)、IP1-549、SF2534、GDC-0326、SAR405、TGR-1202、VPS34、GSK2269557、740Y-P、PI-103、NU7441、TGX-221、IC-87114、渥曼青霉素(wormannin)、XL147类似物、ZSTK474、阿培利司(alpelisib)、AS-605240、PIK-75、3-甲基腺嘌呤、A66、沃塔里昔布(voxtalisib)、PIK-93、AZD6482、PF-04691502、艾皮托里昔布(apitolisib)、GSK105965、达维利西(duvelisib)、TG100-115、AS-252424、BGT226、CUDU-907、PIK-294、AS-604850、GSK2636771、库潘尼西(copanlisib)、YM201636、CH5132799、CAY10505、PIK-293、TG100713、VS-5584、他塞利西(taselisib)、CZC24832、AMG319、GSK2292767、GDC-0084、HS-173、槲皮素(quercetin)、沃塔里昔布、GNE-317、LY3023414、VPS34-IN1、PIK-III、PI-3065、皮拉里昔布(pilaralisib)、AZD8835、PF-4989216和AZD8186。
在一个实施例中，所述组合采用Bcl-2抑制剂。Bcl-2抑制剂的实例包含：甲磺酸奥巴托克斯(obatoclax mesylate)、ABT-737、ABT-263(纳威托克斯(navitoclax)和TW-37。
在一个实施例中，化学疗法组合包括抗代谢物，如卡培他滨(希罗达(xeloda))、磷酸氟达拉滨、氟达拉滨(氟达拉(fludara))、地西他滨、雷替曲塞(拓优得)、盐酸吉西他滨和克拉屈滨。
在一个实施例中，所述组合包括更昔洛韦(ganciclovir)，其可以有助于控制免疫应答和/或肿瘤血管形成。
在一个实施例中，所述组合包括PARP抑制剂。
在一个实施例中，治疗剂是更昔洛韦，其可以有助于控制免疫应答和/或肿瘤血管形成。
在一个实施例中，本文方法中采用的一个或多个疗法是节拍法，即使用低剂量抗癌药物的连续或频繁治疗，通常伴随其它疗法的方法。
B亚组溶瘤腺病毒(具体地Ad11和源自其的如EnAd等腺病毒)可以与化学治疗剂特别协同，因为所述腺病毒似乎具有很大程度上独立于细胞凋亡的作用机制，从而通过主要的坏死性机制杀死癌细胞。此外，化学疗法期间发生的免疫抑制可以允许溶瘤病毒以更高效率发挥作用。
如本文所采用的，治疗剂量是指当在适合的治疗方案中采用时适合于实现预期治疗效果，例如改善疾病的症状或病状、具体地不会引发剂量限制性副作用的如溶瘤腺病毒等病毒的量。当病毒颗粒的数量可能足以导致以下情况时，剂量可以被视为治疗癌症或转移的治疗剂量：肿瘤或转移性生长减慢或停止、或发现肿瘤或转移的大小缩小和/或延长患者的寿命。合适的治疗剂量通常是治疗效果与可耐受毒性之间的平衡，例如考虑到治疗所获得的益处，副作用和毒性是可耐受的。
在一个实施例中，提供了在单一治疗周期中全身施用多个剂量的根据本公开的溶瘤腺病毒的肠胃外调配物，例如其中在每次施用中给予的总剂量是在每剂量1×1010到1×1014个病毒颗粒的范围内。
在一个实施例中，施用一个或多个剂量(例如，每个剂量)的病毒或包括所述病毒的组合物，使得病毒颗粒递送的速率处于每分钟2×1010个颗粒到每分钟2×1012个颗粒的范围内。
在一个实施例中，每周施用根据本公开的病毒或治疗构建体(包含由其构成的调配物)，例如在第1周剂量在第1天、第3天、第5天施用，随后每个后续一周施用一个剂量。
在一个实施例中，每两周或每三周施用根据本公开的病毒或治疗构建体(包含由其构成的调配物)，例如在第1周的第1天、第3天和第5天施用，并且在第2周或第3周也在其第1天、第3天和第5天施用。此给药方案可以重复多次，视情况而定。
在一个实施例中，每月施用根据本公开的调配物(包含包括所述调配物的调配物)，例如在治疗周期中或以维持疗法的形式施用。
在一个实施例中，通过重组技术制备本公开的病毒和构建体。技术人员将理解，有防护的腺病毒基因组可以通过其它技术手段制造，包含完全合成基因组或包括整个基因组的一部分的质粒。技术人员将理解，在合成基因组的情况下，***区可以不包括限制位点核苷酸，因为后者是使用克隆方法***基因之后的假象。
在一个实施例中，有防护的腺病毒基因组是以完全合成的方式制造的。
在本说明书的上下文中，“包括(comprising)”应解释为“包含(including)”。
包括某些特征/元件的本发明的实施例还旨在扩展到相关元件/特征的“由……组成(consisting)”或“基本上由……组成(consisting essentially)”的可替代实施例。
当在技术上适当时，可以组合本发明的实施例。
如专利和申请等技术参考文献通过引用并入本文。
本文具体地且明确地叙述的任何实施例可以单独或与一个或多个进一步的实施例组合形成免责声明的基础。
本文的标题用于将文件划分成各个章节并且不旨在用于解释本文所提供的本公开的含义。
本申请要求于2018年1月31日提交的GB1801614.7的优先权，并且所述文献通过引用并入本文。优先权申请可以用作对本说明书的校正的基础。
在以下实例中仅通过说明的方式进一步描述本发明。
附图说明
图1示出了跨不同pH值范围比较B组腺病毒在不同缓冲液中的稳定性的实验结果。(A)在2-8下储存持续20个月的腺病毒的稳定性；(B)在25℃下储存持续8周的B组腺病毒的稳定性。
图2显示了确定甘油对B组腺病毒稳定性的影响的实验结果。(A)曲线图示出了B组腺病毒在第0周、第7周和第17周跨范围为8％到20％的不同甘油浓度的范围的稳定性。(B)曲线图示出了在7周内甘油在多分散性中的作用。(C)曲线图示出了如通过HPLC测定测量的在含有0％、10％和20％甘油的调配物中的B组腺病毒的浓度的变化％。
图3示出了确定乙醇/精氨酸/甲硫氨酸/聚山梨醇酯有助于B组腺病毒的稳定性的实验结果。(A)曲线图示出了B组腺病毒针对不同缓冲液随时间推移的功效。(B)曲线图示出了B组腺病毒针对不同缓冲液随时间推移的浓度。(C)曲线图示出了包括甘油、HEPES缓冲液、乙醇、精氨酸、甲硫氨酸和聚山梨醇酯的对照调配物随时间推移的浓度。
图4示出了显示在4℃下长期储存期间乙醇、精氨酸和甲硫氨酸对腺病毒功效的影响的实验结果。(A)示出了B组腺病毒在具有20％甘油的5mM HEPES中的功效；(B)曲线图示出了当乙醇包含在调配物中时对相对功效的影响。(C)曲线图示出了当乙醇和甲硫氨酸包含在调配物中时对相对功效的影响。(D)曲线图示出了当乙醇、甲硫氨酸和精氨酸包含在调配物中时对相对功效的影响。(E)曲线图示出了在图4B-4D中测试的调配物的腺病毒随时间推移的浓度。
图5示出了评估聚山梨醇酯对腺病毒稳定性的影响的实验结果。(A)曲线图示出了当在调配物中包含0.115％聚山梨醇酯相对于当在调配物中包含0.15％聚山梨醇酯时腺病毒随时间推移的功效。(B)曲线图示出了当在调配物中包含0.115％聚山梨醇酯相对于当在调配物中包含0.15％聚山梨醇酯时腺病毒随时间推移的浓度。
图6示出了评估在25℃下在10周的时间范围内储存在不同调配物中的腺病毒的稳定性的实验结果。(A)在25℃下，在10周的时间范围内，储存在不同调配物中的腺病毒的功效。(B)在25℃下，在10周的时间范围内，储存在不同调配物中的腺病毒的浓度。
图7示出了通过阴离子交换色谱法分析的Ad5(C组病毒)和Ad11(B组病毒)的相对保留时间。
图8A示出了在4℃下储存的溶瘤相对功效分析(20％甘油、1.4％乙醇、15mM精氨酸、0.25mM甲硫氨酸)。
图8B示出了在4℃下储存的总病毒颗粒:感染性病毒颗粒(20％甘油、1.4％乙醇、15mM精氨酸、0.25mM甲硫氨酸)的比率。
图8C示出了溶瘤相对功效分析(20％甘油、1.4％乙醇、15mM精氨酸、0.25mM甲硫氨酸)。
图8D示出了通过AEX-HPLC的病毒浓度(20％甘油、1.4％乙醇、15mM精氨酸、0.25mM甲硫氨酸)。
图8E示出了总病毒颗粒:感染性病毒颗粒(20％甘油、1.4％乙醇、15mM精氨酸、0.25mM甲硫氨酸)的比率。
序列
SEQ ID NO:1剪接受体(SA)；SEQ ID NO:2分支剪接受体(BSA)；SEQ ID NO:3内部核糖体进入序列(IRES)；SEQ ID NO:4多腺苷酸化序列
SEQ ID NO:5BX DNA序列，其与EnAd基因组的bp 28166-28366相对应并且包含所述bp 28166-28366；SEQ ID NO:6BY DNA序列，其与EnAd基因组的bp 29345-29379相对应并且包含所述bp 29345-29379；SEQ ID NO:7前导序列；SEQ ID NO:8前导序列；SEQ ID NO:9P2A肽；SEQ ID NO:10F2A肽；SEQ ID NO:11E2A肽；SEQ ID NO:12 2A肽；SEQ ID NO:13EnAd基因组；SEQ ID NO:14NG-73病毒基因组序列；SEQ ID NO:15NG-74病毒基因组序列；SEQ IDNO:16NG-76病毒基因组序列；SEQ ID NO:17NG-77病毒基因组序列；SEQ ID NO:18NG-78病毒基因组序列；
SEQ ID NO:19NG-92病毒基因组序列；SEQ ID NO:20NG-95病毒基因组序列；SEQID NO:21NG-96病毒基因组序列；SEQ ID NO:22NG-97病毒基因组序列；SEQ ID NO:23NG-134病毒基因组序列；SEQ ID NO:24NG-135病毒基因组序列；SEQ ID NO:25NG-139病毒基因组序列，其由转基因盒组成，所述转基因盒编码***在BY区中的细胞因子TNFa；SEQ ID NO:26病毒基因组序列，其由转基因盒组成，所述转基因盒编码***在BY区中的抗VEGF全长抗体。转基因盒含有SSA、具有5'前导序列的ab重链序列、SSA和ab轻链序列；SEQ ID NO:27病毒基因组序列，其由转基因盒组成，所述转基因盒编码***在BY区中的抗VEGF全长抗体；SEQ ID NO:28NG-165病毒基因组序列，其由转基因盒组成，所述转基因盒编码***到BY区中的抗VEGF全长抗体；SEQ ID NO:29NG-167病毒基因组序列，其由转基因盒组成，所述转基因盒编码***在BY区中的具有C端His6标签的抗VEGF ScFv；SEQ ID NO:30NG-177病毒基因组序列，其由转基因盒组成，所述转基因盒编码***到BY区中的抗PD-L1全长抗体；SEQ IDNO:31NG-185病毒基因组序列，其由具有***到BX和BY区中的独特限制位点的EnAd基因组组成；SEQ ID NO:32NG-190病毒基因组序列，其由转基因盒组成，所述转基因盒编码***到BY区中的抗PD-L1全长抗体；SEQ ID NO:33NG-217病毒基因组序列，其由转基因盒组成，所述转基因盒编码***在BY区中的肿瘤相关抗原NY-ESO-1；SEQ ID NO:34NG-220病毒基因组序列，其由转基因盒组成，所述转基因盒编码***在BY区中的肿瘤相关抗原NY-ESO-1；SEQID NO:35NG-221病毒基因组序列，其由具有转基因盒的EnAd基因组组成，所述转基因盒编码***在BY区中的具有C端His6标签的抗PD-L1 ScFv；SEQ ID NO:36NG-242病毒基因组序列，其由转基因盒组成，所述转基因盒编码***到BY区中的抗CTLA-4全长抗体；SEQ ID NO:37NG-257病毒基因组序列，其包括具有转基因盒的EnAd基因组，所述转基因盒编码***到BX区中的抗VEGF ScFv；SEQ ID NO:38NG258病毒基因组序列，其由转基因盒组成，所述转基因盒编码***到BY区中的抗VEGF全长抗体；SEQ ID NO:39NG-272病毒基因组序列，其包括具有转基因盒的EnAd基因组，所述转基因盒编码***到BY区中的抗VEGF ScFv和抗PD-L1ScFv；SEQ ID NO:40NG-280病毒基因组序列，其由转基因盒组成，所述转基因盒编码***到BY区中的碘化钠同向转运体(NIS)；SEQ ID NO:41NG-281病毒基因组序列，其包括具有转基因盒和第二转基因盒的EnAd基因组，所述转基因盒编码***在Bx区中的抗VEGF ScFv，所述第二转基因盒编码***到BY区中的抗PD-L1 ScFv；SEQ ID NO:42NG-330病毒基因组序列，其包括具有转基因盒的EnAd基因组，所述转基因盒编码***在BY区中的T淋巴细胞活化抗原CD80。转基因盒含有5'SSA、人CD80 cDNA序列和3'poly(A)序列；SEQ ID NO:43NG-343病毒基因组序列，其包括具有转基因盒的EnAd基因组，所述转基因盒编码***在BY区中的IFNα和CD80。转基因盒含有5'SSA、IFNαcDNA序列、P2A肽、CD80 cDNA序列和3'poly(A)序列；SEQ ID NO:44NG-641基因组；SEQ ID NO:45NG-345病毒基因组序列，其包括具有转基因盒的EnAd基因组，所述转基因盒编码***在BY区中的Flt3配体、MIP1α和IFNα。转基因盒含有5'SSA、Flt3配体cDNA序列、P2A肽序列、MIP1αcDNA序列、T2A肽序列、IFNαcDNA序列和3'poly(A)序列；SEQ ID NO:46NG-346病毒基因组序列，其包括具有转基因盒的EnAd基因组，所述转基因盒编码***在BY区中的Flt3配体、MIP1α和CD80。转基因盒含有5'SSA、Flt3配体cDNA序列、P2A肽序列、MIP1αcDNA序列、T2A肽序列、CD80 cDNA序列和3'poly(A)序列；SEQ IDNO:47NG-347病毒基因组序列，其包括具有转基因盒的EnAd基因组，所述转基因盒编码***在BY区中的IFNα、MIP1α和CD80。转基因盒含有5'SSA、IFNαcDNA序列、P2A肽序列、MIP1αcDNA序列、T2A肽序列、CD80 cDNA序列和3'poly(A)序列；SEQ ID NO:48NG-348病毒基因组序列，其包括具有转基因盒的EnAd基因组，所述转基因盒编码***在BY区中的单链Fv抗人CD3e和T淋巴细胞活化抗原CD80的膜锚定嵌合形式。转基因盒含有5'SSA、膜锚定抗CD3εcDNA序列、P2A肽、人CD80 cDNA序列和3'poly(A)序列；SEQ ID NO:49NG-348A病毒基因组序列，其包括具有转基因盒的EnAd基因组，所述转基因盒编码***在BY区中的具有C端V5标签的单链Fv抗人CD3e和T淋巴细胞活化抗原CD80的膜锚定嵌合形式。转基因盒含有5'SSA、膜锚定抗CD3εcDNA序列、V5标签、P2A肽、人CD80 cDNA序列和3'poly(A)序列；SEQ ID NO:50NG-350A基因组序列；SEQ ID NO:51NG-420病毒基因组序列，其包括具有转基因盒的EnAd基因组，所述转基因盒编码***在BY区中的单链Fv抗人CD3e的膜锚定嵌合形式。转基因盒含有5'SSA、膜锚定抗CD3εcDNA序列和3'poly(A)序列；SEQ ID NO:52NG-420A病毒基因组序列，其包括具有转基因盒的EnAd基因组，所述转基因盒编码***在BY区中的单链Fv抗人CD3e和C端V5标签的膜锚定嵌合形式。转基因盒含有5'SSA、膜锚定抗CD3εcDNA序列、V5标签序列和3'poly(A)序列；SEQ ID NO:53NG-601(EnAd-CMV-EpCAMBiTE)；SEQ ID NO:54NG-602(EnAd-SA-EpCAMBiTE)；SEQ ID NO:55NG-605(EnAd-CMV-FAPBiTE)；SEQ ID NO:56NG-606(EnAd-SA-FAPBiTE)；SEQ ID NO:57NG-611基因组；SEQ ID NO:58NG-612基因组；SEQ ID NO:59NG-613基因组；SEQ ID NO:60NG-614基因组；SEQ ID NO:61NG-615基因组；SEQ ID NO:62NG-616基因组；SEQ ID NO:63NG-617基因组；SEQ ID NO:64NG-618基因组；SEQ ID NO:65NG-640基因组。
实例
实例1—测试pH对腺病毒调配物的稳定性的影响
进行实验以确定pH对B组腺病毒调配物的稳定性的影响。对不同的缓冲液进行测试：碳酸盐/碳酸氢盐、二乙醇胺(diethnolamine)、Gly-NaCl、HEPE、葡甲胺、硼酸钠和Tris缓冲液。产生具有一系列不同pH值的每种缓冲液：8.0、8.5、9.0、9.5和10.0。每种缓冲液还含有甘油、乙醇、精氨酸、甲硫氨酸和聚山梨醇酯。将EnAd悬浮在每种缓冲液中，并且将调配物储存在4℃下。以规则间隔从每种调配物中取样，并且通过使用HPLC测量样品中的病毒DNA的浓度来确定每种调配物中的腺病毒的稳定性。DNA浓度较低强烈表明病毒降解水平较高并因此稳定性较低。
实验结果示出于表1A和1B中。如从图1A可以看出，pH对腺病毒的稳定性具有显著影响。在pH 9.0下观察到峰稳定性，并且当pH下降到8.0或上升到10.0时，峰稳定性显著下降。在25℃下短期(长达8周)储存也观察到类似的效果(图1B)。重要的是，尽管在不同缓冲液之间存在稳定性的轻微变化，但pH的影响更加重要，并且偏离9.0pH最远的调配物具有最低的稳定性，而不管在调配物中使用哪种缓冲液。因此，结果表明8.5到9.5之间的pH提供了最好的稳定性。
实例2—测试甘油对腺病毒调配物的稳定性的影响
进行一系列实验以确定当甘油包含在调配物中时对B组腺病毒调配物的稳定性的影响。使用确定性筛选设计(DSD)以三种浓度组合筛选甘油：9％、14％和20％。使用SAS JMP统计软件来分析结果。基于DSD数据创建模型。每种调配物还含有10mM HEPES。将腺病毒悬浮于每种调配物中，并且将所述调配物在4℃下储存持续17周的时间段。通过使用HPLC测量样品中的病毒DNA浓度，在第0周、第7周和第17周评估调配物的稳定性。
结果示出于图2A中。如可以看到的，在甘油浓度与稳定性之间存在明显的相关性，其中具有较高甘油浓度的调配物具有较高稳定性。所述效果似乎在17-20％甘油浓度标记周围逐渐减少，这表明超过20％甘油不太可能对稳定性产生显著影响。因此，这些结果表明15-20％之间的甘油浓度将显著增强稳定性并且约19％到20％的浓度将可能产生最好的结果。
图2B和2C示出了另外的研究结果，其中在37℃下储存(图2B)和在25℃下储存之后对0％、10％和20％甘油调配物进行评估。图2B示出了与当添加10％或20％甘油时相比，当从调配物中排除甘油时，多分散性(其是在溶液中分子质量分布的量度—较高的多分散性与B组腺病毒的较高的降解相关)显著较高。图2C示出了B组腺病毒浓度随时间推移的变化％，并且清楚地示出了与当将10％或20％甘油添加到调配物中时相比，当不使用甘油时浓度水平更陡且更急剧的下降。因此，这些结果还证实了图2A中的发现，即将甘油包含在调配物中对稳定性具有显著影响。
实例3—测试添加乙醇/精氨酸/甲硫氨酸/聚山梨醇酯对B组腺病毒调配物的稳定性的影响
进行一系列实验以确定当从调配物中省略乙醇/精氨酸/甲硫氨酸/聚山梨醇酯时对B组腺病毒调配物的稳定性的影响。对一系列不同的缓冲液进行测试：HEPES 5mM、葡甲胺10mM、TRIS 10mM和Gly-NaCl 10mM。这些调配物均不含有任何乙醇、精氨酸、甲硫氨酸或聚山梨醇酯。将B组腺病毒悬浮于每种调配物中，并且将所述调配物在4℃下储存持续9个月的时间段。调配物的稳定性和功效分别通过HPLC和MTS(细胞活力测定，其评估腺病毒裂解细胞的能力)以3个月的间隔进行评估，即在第0个月、第3个月、第6个月和第9个月时。
图3A示出了B组腺病毒在9个月储存时间段内的功效。如可以看到的，B组腺病毒在这个时间范围内存在显著降解，其中大多数调配物在9个月标记前接近0U/vp功效。值得注意的例外是含有葡甲胺的调配物，但即使此调配物也没有从最初地起始水平1U/vp显著下降到约0.5U/vp，即在9个月之后调配物中的B组腺病毒的功效减半。此结果表明，葡甲胺缓冲液在保存B组腺病毒的功效方面是最好的，并且还突出显示了调配物中包含乙醇、精氨酸、甲硫氨酸和聚山梨醇酯的重要性。
图3B示出了在9个月时间段内B组腺病毒的浓度水平，并且再次示出了其中在9个月时间段内测试的所有调配物的浓度显著降低的趋势。为了比较，图3C示出了B组腺病毒在含有乙醇/精氨酸/甲硫氨酸/聚山梨醇酯的调配物中的浓度。请注意，即使在4℃下储存20个月之后，仍可观察到稳定的B组腺病毒浓度。基于图3B，至少关于浓度水平，似乎TRIS缓冲液表现最好。此实验还示出了这些组分对于调配物的整体稳定性是重要的。
实例4—测试乙醇、精氨酸和甲硫氨酸对腺病毒调配物的稳定性的单独影响
根据实例3的结果，进行了进一步实验，试图确定乙醇、精氨酸和甲硫氨酸中的每一种对在4℃下长期储存(24个月)期间B组腺病毒调配物的稳定性的相对影响。
MTS测定的结果示出于图4中。对三种不同的调配物进行测试，第一种调配物包含1％乙醇(图4A)，第二种调配物包含1％乙醇和0.15mM甲硫氨酸(图4C)并且第三种调配物包含1％乙醇、0.15mM甲硫氨酸和10mM精氨酸(图4B)。测试的所有调配物均含有5mM HEPES、17％甘油并且处于pH 8.0。
结果表明，与仅具有HEPES和甘油并且不含有任何这些组分的对照调配物相比，B组腺病毒的功效由所有3种组分保持。对照调配物的功效在3个月内下降到0.5U/vp，而图4A到4C表明当添加3种组分时，稳定性的时间段显著延长。具体地，结果表明乙醇的添加将调配物的稳定性延长约6个月，乙醇和甲硫氨酸的添加将稳定性提高约15个月，并且乙醇、甲硫氨酸和精氨酸的添加将稳定性提高约12个月。因此，这些结果表明乙醇、甲硫氨酸和精氨酸均有助于稳定性。
图4D示出了如通过HPLC确定的腺病毒浓度水平，并且表明病毒浓度在整个24个月的储存时间段内对于所有3种调配物保持大致恒定。考虑到乙醇存在于所有3种调配物中，这可能表明乙醇具有最大的影响。
实例5—测试聚山梨醇酯对B组腺病毒调配物的稳定性的影响
此实例描述了评估聚山梨醇酯在4℃下长期储存(20个月)期间对腺病毒调配物稳定性的重要性的实验结果。
对两种调配物进行测试，一种调配物具有0.115％聚山梨醇酯80，并且另一种调配物具有0.15％聚山梨醇酯80。这两种调配物还含有20％甘油、5mM HEPES、1.5％乙醇、10mM精氨酸、0.2mM甲硫氨酸并且处于pH 8.0。
实验结果示出于图5A和5B中。图5A示出了，对于含有0.15％聚山梨醇酯的调配物，在10个月标记周围，调配物的功效逐渐下降到约0.5U/vp，但然后在0.5U/vp处一直保持稳定到20个月点。因此，聚山梨醇酯似乎对保存调配物中的腺病毒功效做出显著贡献。对于含有0.115％聚山梨醇酯的调配物，功效的下降是类似的。这表明将聚山梨醇酯保持在约0.1％周围会导致调配物具有良好的稳定性。
图5B示出了如通过HPLC确定的腺病毒浓度水平，并且表明病毒浓度在整个20个月的储存时间段内对于两种调配物保持相当恒定。
实例6—测试不同缓冲液和其对B组腺病毒调配物的稳定性的影响
本实例描述了，用于比较在25℃下短期储存(11周)期间用于B组腺病毒调配物中的不同缓冲液的稳定性的实验结果。
对7种不同的调配物进行测试：pH 9.0的Gly-NaCl、pH 8.0的TRIS、pH 8.8的TRIS、pH 8.0的葡甲胺、pH 8.5的葡甲胺、pH 9.0的葡甲胺和pH 8.0的HEPES。所有调配物均含有20％甘油、1.4％乙醇、15mM精氨酸、0.15mM或0.25mM甲硫氨酸、0.15％聚山梨醇酯。
结果示出于图6A和6B中。图6A示出了随时间推移的功效比率(100ppc/RS)，而图6B示出了随时间推移所测量的调配物浓度(vp/ml)。基于这些曲线图，调配物的稳定性增加的大致顺序似乎是HEPE、TRIS、Gly-NaCl和葡甲胺(最好)。
实例7
进行实验以证实在加速条件下使用筛选方法鉴定的条件转化为4℃长期储存，具有更广泛的一组稳定性指示方法。在10mM处对一系列不同的缓冲液进行测试：pH 8.0的葡甲胺、pH 8.5的葡甲胺、pH 9.0的葡甲胺、pH 8.5的TRIS和Gly-NaCl。所有调配物均含有20％甘油、1.4％乙醇、15mM精氨酸、0.25mM甲硫氨酸。B组腺病毒调配物在4℃和-80℃两者下储存持续12个月的时间段。以规则的间隔通过AEX-HPLC(病毒浓度)、MTS(细胞活力测定，其评估腺病毒裂解细胞的能力)和感染性测定(评估腺病毒感染细胞并开始复制的能力)来评估在4℃下储存的调配物的稳定性和功效。在12个月后，使用相同的方法一起分析在-80℃和4℃下储存的样品。
在4℃下储存的腺病毒的周期性分析的结果示出于图8A和8B中。图8A中的MTS(相对溶瘤功效)示出了，储存在pH 8.0中的腺病毒比储存在pH 8.5和pH 9.0缓冲液中时更稳定持续更长时间。通过如图8B所示的替代性分析来证实这一点；在4℃下储存时存在的非感染性颗粒的比率随着pH升高而较早增加。在pH 8.0下，在赋形剂(甘油、甲硫氨酸、精氨酸和乙醇)存在下，腺病毒在储存期间最稳定。
图8C、8D和8E比较了已经在4℃下储存的腺病毒与在-80℃下储存持续相同时间段的腺病毒。在所有附图中，甘油对照在pH 7.8下缓冲，并且含有20％甘油并不含其它赋形剂。图8D证实了在任一温度下在任何测试的调配物中通过AEX-HPLC所检测的腺病毒的浓度均没有变化。图8C比较了在两种温度条件下储存的腺病毒的相对溶瘤功效(MTS)。当与-80℃相比，一种或多种赋形剂(乙醇、精氨酸或甲硫氨酸)的存在稳定了腺病毒在4℃下储存时的功效。在所有赋形剂存在的情况下，通过功效所测量的腺病毒稳定性在4℃下，在pH 8.0是最大的，其中稳定性随着pH增加而降低。比较储存时非感染性颗粒的形成速率的图8E中的结果证实了溶瘤功效(MTS)结果。
在4℃下储存病毒持续12个月证实一种或多种赋形剂(甲硫氨酸、精氨酸、乙醇和甘油)的存在改善了腺病毒的稳定性。结果还证实，当在4℃下储存时，pH的保持对于腺病毒稳定性是必需的。在此实验中，稳定性的最佳pH是8.0，并且稳定性随着pH的增加而降低。在实例1中，数据指示pH>8.0将更稳定，其中最佳值为8.5-9.0。然而，在pH 8.0下所测试的仅有的缓冲液条件是HEPES。因此可以得出结论，与实例1中使用的HEPES缓冲液相比，葡甲胺(一种基于糖的缓冲剂)在pH 8.0下对腺病毒具有更大的稳定作用。
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