阅读说明：本技术 亲水性化合物在单层脂质体中的高效包封 (Efficient encapsulation of hydrophilic compounds in unilamellar liposomes ) 是由 玛格达莱娜·普尔齐比洛 马雷克·朗纳 托马什·博罗维克 于 2018-03-23 设计创作，主要内容包括：本发明涉及亲水性物质在单层脂质体的亲水性空间中的高效包封。通过使用选自丙二醇或甘油的多元醇来溶解形成脂质体的脂质双层的疏水性化合物实现了高效包封。本发明提供了单层脂质体(UL)以及通过低温挤出制备单层脂质体的方法。本发明还涉及这些UL在制备药物、化妆品、食品添加剂或消毒剂中的用途。(The present invention relates to the efficient encapsulation of hydrophilic substances in the hydrophilic space of unilamellar liposomes. Efficient encapsulation is achieved by using a polyol selected from propylene glycol or glycerol to solubilize the hydrophobic compounds forming the lipid bilayer of the liposome. The present invention provides Unilamellar Liposomes (UL) and methods for preparing unilamellar liposomes by low temperature extrusion. The invention also relates to the use of these UL in the preparation of a medicament, cosmetic, food additive or disinfectant.)

亲水性化合物在单层脂质体中的高效包封

技术领域

本发明涉及制药技术领域，尤其涉及亲水性物质的高效脂质体包封。更具体地，本发明涉及具有一个脂质双层包围亲水性空间的单层脂质体(UL)，其中所述亲水性空间包含至少一种亲水性化合物，并且涉及包含这种单层脂质体的液体组合物。本发明还涉及将亲水性化合物包封在单层脂质体(UL)中的方法，并且涉及这些UL在制备药物、化妆品、食品添加剂或消毒剂中的用途。

背景技术

脂质体是具有由脂质双层构成的膜的小囊泡，类似于细胞膜，该脂质双层包围亲水性空间。特征是膜分子的两亲特性，其具有亲水头和疏水尾。在脂质体的膜内，两亲分子以这样的方式排列使得亲水部分与脂质体内部和外部的含水环境接触，而疏水部分位于双层内。膜分子通过非共价相互作用相互连接。脂质体具有一个或多于一个脂质双层，大小可以为25nm至100μm。囊泡的形状和大小尤其取决于周围水相的性质、其膜的确切化学组成及其制备方法。

脂质体通常用于药物制剂和化妆品制剂中，例如，用于增加两亲化合物和疏水性化合物的溶解度，从而提高其生物利用度(参见例如Kshirsagar,N.A.,Pandya,S.K.,Kirodian,B.G.,和Sanath,S.(2005)Liposomal drug delivery system from laboratoryto clinic.,J.Postgrad.Med.51,S5-S15；或Kalhapure,R.S.,Suleman,N.,Mocktar,C.,Seedat,N.,和Govender,T.(2015)Nanoengineered Drug Delivery Systems forEnhancing Antibiotic Therapy,J Pharm Sci-Us 104,872-905)。使用脂质体作为药物递送系统有助于将所述药物靶向性和选择性地运输至人类机体的相关部位。由于可以施用较低剂量，因而减少了脂质体配制的药物的副作用，并提高了效率和治疗广度。

基本上，由于脂质体的特殊理化特性，脂质体制剂适用于大多数化合物。在脂质体水分散体中，无论脂质体拓扑结构或大小如何，都仅在脂质双层中发现具有高分配系数的物质，然而具有低分配系数的物质可以分散或稀释在水性分散介质中或包封在脂质体的亲水性空间内。

然而，由于缺乏将亲水性物质高效包封在脂质体内的通用方法，目前，脂质体包封的亲水性化合物的实际治疗用途微不足道。被动包封涉及通过与含有待包封的亲水性化合物的水溶液一起振摇使干脂质膜水合来制备脂质体，产生的包封效率非常低，通常不超过百分之几。另外，通过这种方法获得的脂质体是多层囊泡(MLV)，其大小和拓扑结构变化很大(参见例如WO01/13887、EP1 565 164)。可以通过使水合脂质分散体经历均质化过程(参见，例如EP 0 776 194 A1、PL396706 A1、PL399298 A1、PL388134 A1和PL399592 A1)或超声处理(参见，例如PL389430 A1；或Watwe,R.M.,和Bellare,J.R.(1995)Manufacture ofLiposomes-a Review,Curr Sci India 68,715-724)来改进被动包封方法，以产生更小、更均匀大小的悬浮液。然而，这些技术通常导致低黏度的悬浮液，该悬浮液缺乏脂质结构对水分散介质的结构化，进而导致较差的包封效率。通常，添加至脂质膜的全部亲水性药物中仅约5％至15％被包封在囊泡中。此外，在均质化或超声处理期间施加的高能量导致脂质体悬浮液由于氧化而不稳定，并增加了敏感活性物质(如蛋白质或超分子聚合体)功能性降解的风险。

用于亲水性化合物脂质体包封的另一组技术使用具有不同极性的物质的混合物。然而，这些技术不适用于大多数蛋白质或其他复杂分子结构的包封，因为在这些技术中使用的非极性溶剂不可逆地改变了此类分子的结构。此外，这些技术的包封效率也不令人满意。例如，EP 0 514 435 B1公开了一种制备脂质体凝胶组合物的方法，其中通过振摇含有14重量％至20重量％的一元醇的水溶液来溶解磷脂(15重量％至30重量％)，并且通过均质化使所得脂质体负载亲水性化合物。不能期望该方法会导致水相与脂质囊膜的结构化，这使包封效率低，而一元醇具有变性和刺激性的性质。DE 4003 783 A1描述了一种通过在浓度为15重量％至20重量％的一元醇(乙醇或2-丙醇)存在下剧烈混合浓度最高30重量％的植物来源的磷脂来制备脂质体分散体的方法。同样在这种情况下，得到的含脂质体的水性分散体没有结构化，并且包封效率预期较低。该方法的另一个缺点是通过混合形成的脂质体大小不均一。

也可以通过使用卤代烃作为溶剂(WO 96/40061 A1)或将溶解在氯氟烃溶剂(“氟利昂”)中的脂质在高温下注入水溶液中(US4752425)来改变水溶液的极性，使得能够形成脂质体。然而，这些方法都不能使亲水性物质的包封效率大于50％。此外，必须使用高温用于溶剂蒸发，这阻止了使用所述方法来包封蛋白质和超分子复合物。

将亲水性物质包封在脂质体中的其他替代技术涉及将活性物质的亲水性、高静电电荷颗粒与两亲抗衡离子络合。因此，形成了两亲性复合物，然后用脂质覆盖。该方法需要操控具有不同极性的混合物，这在技术上是困难的。此外，它只能应用于高电荷分子，即核酸(例如，参见Oh,Y.K.,和Park,T.G.(2009)siRNA delivery systems for cancertreatment,Adv Drug Deliv Rev 61,850-862)，并且不适用于包封在疏水性液体存在下变性的蛋白质。

为了显著提高亲水性嘌呤核苷的包封效率并获得高脂质体内药物浓度，WO 95/15762公开了制备脂质体制剂的方法，该方法包括形成含有阿糖腺苷(或衍生物)的多层脂质体，并对脂质体进行冻干，控制再水合和任选地在压力下挤出。然而，挤出后，最大的包封效率仅达到45％。

因此，本发明的一个目的是提供包含亲水性化合物的脂质体，以及制备这种脂质体的方法，该脂质体和方法大大克服了现有技术的上述问题。

更具体地，本发明的一个目的是提供脂质体，该脂质体稳定地包封大量亲水性化合物，而无论其进一步的物理化学特性(例如大小或电荷)如何，例如包括在疏水性液体存在下变性的离子、蛋白质、肽、碳水化合物、天然聚合物和合成聚合物、核酸以及核酸衍生物。

本发明的又一个目的是提供一种以最高100％的包封效率将这种亲水性化合物包封到脂质体的亲水性空间中的方法。这些目的出人意料地通过本发明实现。

发明内容

在第一方面，本发明提供了一种单层脂质体(UL)，其具有一个包围亲水性空间的脂质双层，其中所述UL包含：(i)形成脂质双层的至少一种疏水性化合物，和(ii)丙二醇或甘油，其中亲水性空间包含至少一种溶解在亲水性溶剂中的亲水性化合物，其中亲水性化合物在亲水性溶剂中的浓度为20℃、101kPa下亲水性化合物在亲水性溶剂中的饱和浓度的至少80％。

在根据第一方面的UL的一个实施方案中，形成脂质双层的至少一种疏水性化合物与丙二醇或甘油的重量比为2∶1至1∶1。

在根据第一方面的UL的另一个实施方案中，形成脂质双层的至少一种疏水性化合物与至少一种亲水性化合物的重量比为100:1至1:3、50:1至1:2或25:1至1:1。

在本发明的第一方面的另一个实施方案中，相对于UL的重量，UL以以下量包含所述至少一种疏水性化合物：15％至40％、16％至39％、17％至38％、18％至37％、19％至35％、20％至30％、21％至25％或22％至24％，优选为20％至40％。

在根据第一方面的UL的另一个实施方案中，至少一种亲水性化合物选自：(i)分子量为100Da至1500Da、200Da至1400Da、300Da至1200Da或500Da至1000Da的低分子量亲水性物质；和(ii)分子量为1500Da至300kDa、2kDa至280kDa、5kDa至250kDa、10kDa至200kDa或50kDa至200kDa的亲水性大分子。

在根据第一方面的UL的另一个实施方案中，至少一种亲水性化合物选自离子、蛋白质、肽、碳水化合物、天然聚合物和合成聚合物、核酸、核酸衍生物及其组合。

在根据第一方面的UL的另一个实施方案中，亲水性化合物在亲水性溶剂中的饱和浓度为每1000ml亲水性溶剂1g至500g，优选每1000ml亲水性溶剂10g至200g。

在根据第一方面的UL的另一个实施方案中，亲水性溶剂选自水、缓冲水溶液、盐水溶液、单糖或二糖水溶液及其组合。

在第二方面，本发明提供了一种在UL中包封亲水性化合物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供包含至少一种疏水性化合物和选自丙二醇和甘油的多元醇的脂质溶液；(b)提供包含至少一种亲水性化合物的水相；(c)通过将(a)的脂质溶液与(b)的水相混合来制备水合的脂质溶液；和(d)在低于80℃的温度下挤出(c)的水合的脂质溶液，其中至少一种疏水性化合物形成UL的均质群，其中所述UL包含水相总体积的大于50％。

在根据第二方面的方法的一个实施方案中，将至少一种亲水性化合物以选自至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的被包封率包封在UL中。

在根据第二方面的方法的另一个实施方案中，在步骤(c)的水合的脂质溶液中包含的多元醇的浓度为水合的脂质溶液重量的5％至30％、10％至25％、15％至22％或18％至20％。

在根据第二方面的方法的另一个实施方案中，步骤(c)的水合的脂质溶液中至少一种疏水性化合物的总浓度为所述水合的脂质溶液重量的15％至40％、16％至39％、17％至38％、18％至37％、19％至35％、20％至30％、21％至25％或22％至24％，优选为所述水合的脂质溶液重量的20％至40％。

在根据第二方面的方法的另一个实施方案中，至少一种疏水性化合物选自磷脂、鞘脂或固醇，优选地选自磷脂酰胆碱，更优选地选自纯化的大豆磷脂酰胆碱。

在根据第二方面的方法的另一个实施方案中，步骤(b)包括调节水相的pH，优选将pH调节到5.0至7.5、6.0至7.4或7.0至7.2。

在另一个实施方案中，步骤(d)包括在小于60℃、小于40℃或小于30℃、优选在20℃的温度下挤出(c)的水合的脂质溶液。

在另一个实施方案中，根据第二方面的方法包括另一个步骤(e)，其中从步骤(d)得到的挤出的水合的脂质溶液中除去选自丙二醇和甘油的多元醇，优选地，其中所述多元醇通过超滤从所述挤出的水合的脂质溶液中除去。

在第三方面，本发明提供了通过根据本发明第二方面的方法制备的UL。

在第四方面，本发明提供了包含至少一个根据本发明的第一方面或第三方面的UL的液体组合物。

在所述第四方面的一个实施方案中，液体组合物具有以下性质中的至少一种：(i)pH为5.0至7.5、6.0至7.4或7.0至7.2；(ii)渗透压为30mOsm至400mOsm、40mOsm至300mOsm或50mOsm至200mOsm；(iii)亲水性化合物与疏水性化合物的总摩尔比为10^-5至1。在一个优选的实施方案中，所述液体组合物是含水组合物。

在本发明第四方面的另一个实施方案中，液体组合物还包含至少一种赋形剂，优选地，其中所述赋形剂选自：缓冲剂、渗透活性剂、防腐剂、抗氧化剂、调味剂、芳香剂及其组合；优选地，其中渗透剂选自一价盐或糖，更优选地选自氯化钠和蔗糖。

在第五方面，本发明涉及根据第一方面或第三方面的UL或根据第四方面的组合物，其用于治疗。

在第六方面，本发明涉及根据第一方面或第三方面的UL或根据第四方面的组合物作为药物、化妆品、食品添加剂或消毒剂的用途。

附图说明

图1：黏度随转子速度变化的图示。该图举例说明了实施例8中描述的流变仪测量的结果。所测试的脂质体样品包含不同的脂质浓度(10重量％、15重量％、20重量％、25重量％)，并通过使用不同的挤出参数获得。PC10％：在挤出之前样品中脂质的浓度为所述样品重量的10％；PC15％：在挤出之前样品中脂质的浓度为所述样品重量的15％；PC20％：在挤出之前样品中脂质的浓度为所述样品重量的20％；PC25％：在挤出之前样品中脂质的浓度为所述样品重量的25％；PC-MLV：未挤出的样品；PC-UL RT：在室温下挤出的样品，PC-ULT70：在70℃下挤出的样品。

图2：黏度值随脂质浓度变化的图示。该图举例说明了通过实施例8中所述的流变仪测量获得的结果。所测试的脂质体样品包含不同的脂质浓度(样品重量的10％、15％、20％、25％)，并通过使用不同的挤出参数获得。具体参见图1的描述。

图3A、图3B：脂质体大小分布和相关数据的图示。这些图总结了在实施例8中制备的样品中脂质体的大小分布，其通过动态光散射(DLS)确定，其中绘制了表示被测样品内颗粒的扩散的相关函数拟合。图3A显示了从单次挤出循环获得的样品中脂质体的大小分布，其脂质含量为10重量％。发现这些样品的多分散指数为至少0.2(PDI＞0.2)。图3B显示了从单次挤出循环获得的样品中脂质体的大小分布，其脂质含量为30重量％。发现这些样品的多分散指数小于0.2(PDI＜0.2)。

图4：在室温下脂质体大小随脂质浓度和挤出循环次数变化的图示。该图举例说明了在实施例8中通过在室温下进行挤出而制备的样品中脂质体大小随获得PDI＜0.2的样品所需的脂质浓度和挤出循环次数的变化。对于20重量％至40重量％的脂质含量，在第一挤出循环中便获得了脂质体大小分布高度均匀的样品。

图5：UL包封的荧光标记的葡聚糖(FITC标记)和木瓜蛋白酶的样品发射光谱的图示。该图举例说明了通过超滤和分馏实施例9中所述的样品而获得的渗透物和截留物的发射光谱。DextranFITC MW 5000PC 16％渗透物：来自包含UL包封的5kDa的FITC标记的葡聚糖且总磷脂酰胆碱(PC)浓度为样品重量的16％的样品的渗透物发射光谱；DextranFITC MW5000PC16％截留物：来自包含UL包封的5kDa的FITC标记的葡聚糖且总PC浓度为样品重量的16％的样品的截留物发射光谱；Papain MW 23000PC 16％渗透物：来自包含UL包封的23kDa的木瓜蛋白酶且总PC浓度为样品重量的16％的样品的渗透物发射光谱；Papain MW23000PC 16％截留物：来自包含UL包封的23kDa的木瓜蛋白酶且总PC浓度为样品重量的16％的样品的截留物发射光谱。

图6：荧光标记的葡聚糖(FITC标记)和木瓜蛋白酶的包封效率的图示。该图举例说明了通过实施例9中描述的方法，包封分子量为5kDa的荧光标记的葡聚糖和分子量为23kDa的木瓜蛋白酶的效率随所得到的UL悬浮液中脂质浓度的变化。

图7A、图7B：根据本发明的包含包封在UL亲水性空间内的亲水性大分子的样品的成像。由透射电子显微术获得图像。图7A显示了UL包封的未分级肝素。结构的流体动力学直径：150nm。图7B显示了具有12kDa分子量的氯E6的共价结合分子的UL包封的PVP聚合物。结构的流体动力学直径：130nm。

发明描述

在下面详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于本文描述的特定方法学、方案和试剂，因为它们可以变化。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求来限制。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语的含义与本领域普通技术人员通常理解的含义相同。

在本说明书的全文中引用了一些文件。无论是上文还是下文，本文引用的每个文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明书等)均通过引用整体并入本文。本文中的任何内容均不得解释为承认本发明由于在先发明而无权早于此类公开。

在下文中，将描述本发明的要素。这些要素与特定实施方案一起列出，但是，应该理解，它们可以以任何方式和任何数量组合以创建其他实施方案。各种描述的实施例和优选实施方案不应被解释为将本发明限制为仅明确描述的实施方案。该描述应被理解为支持并涵盖将明确描述的实施方案与任何数量的所公开和/或优选的要素相结合的实施方案。此外，除非上下文另外指出，否则应认为本申请的描述中公开了本申请中所有所描述要素的任何排列和组合。

在本说明书和随后的权利要求中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”应理解为隐含了包含陈述的整数或步骤或一组整数或步骤，但不排除任何其他整数或步骤或一组整数或步骤。如本说明书和所附权利要求中所使用的，除非内容另有明确规定，单数形式“一个”包括复数的指示物。

具体实施方式

在以下段落中，更详细地定义了本发明的不同方面。如此定义的每个方面可以与任何其他方面结合，除非有明确的相反指示。特别地，指示为优选或有利的任何特征可以与指示为优选或有利的任何其他特征组合。

在通向本发明的工作中，出人意料地发现，大量的亲水性化合物可以被稳定地包封在本发明的单层脂质体内。特别地，本发明人出乎意料地发现，在单层脂质体(UL)包含丙二醇或甘油的情况下，可以将溶解于亲水性溶剂中的亲水性化合物以在20℃和101kPa下所述亲水性化合物在所述亲水性溶剂中的饱和浓度的至少80％的浓度包封在所述UL的亲水性空间内。

根据所述脂质体的施用途径，将如此大量的亲水性化合物成功地包封在单层脂质体中提供了几个优点。当通过静脉内或肌内途径肠胃外给药时，脂质体可以在延长的时间段内提供包封的亲水性化合物的“贮库”控制释放，并通过限制血液中游离亲水性化合物的浓度来降低亲水性化合物的副作用。脂质体可以以治疗上有利的方式改变亲水性化合物的组织分布和吸收，并且通过减少化合物的频繁施用来提高治疗的便利性。

因此，在第一方面，本发明提供了一种单层脂质体(UL)，其具有一个包围亲水性空间的脂质双层，其中UL包含：(i)形成脂质双层的至少一种疏水性化合物，和(ii)丙二醇或甘油，其中亲水性空间包含至少一种溶解在亲水性溶剂中的亲水性化合物，其中亲水性化合物在亲水性溶剂中的浓度为20℃和101kPa下亲水性化合物在亲水性溶剂中的饱和浓度的至少80％。

单层脂质体(UL)

如本文所使用的，术语“单层脂质体”或“UL”指由单个脂质双层构成的囊泡，其包围亲水性空间。所述囊泡可以是任何形状，包括椭圆形囊泡、盘状囊泡、梨形囊泡、杯形囊泡、出芽囊泡和球形囊泡。优选地，本发明的单层脂质体基本上是球形的。

本发明的UL可以是直径最大为100nm的小单层囊泡(SUV)，或者直径最大为100μm至1μm的大单层囊泡(LUV)。优选地，本发明的UL的直径为50nm至250nm、100nm至200nm或130nm至150nm。如本文所使用的，术语“直径”指流体力学直径，其应理解为以与被测量的颗粒的扩散方式相同的方式扩散的假想硬球的尺寸。确定本文公开的UL的流体动力学直径的合适方法例如动态光散射(DLS)，其是本领域技术人员已知的。

本发明的UL可以用于治疗中，或用于药物、化妆品、食品添加剂或消毒剂的制备中。

脂质双层

如本文所使用的，术语“脂质双层”指由两个脂质层组成的封闭结构，其通过疏水性化合物的组装而形成。

疏水性化合物

如本文所使用的，术语“疏水性化合物”指包含极性区域和非极性区域的两亲性脂质化合物。优选地，所述疏水性化合物选自磷脂、鞘脂和固醇。更优选地，所述疏水性化合物是磷脂酰胆碱，甚至更优选纯化的大豆磷脂酰胆碱。

在本文描述的UL中，疏水性化合物的非极性链朝向彼此相对的脂质双层的内部，并因此在两个极性区域之间限定了非极性区域。由此形成的两个脂质层之间的亲脂性内部隔室作为向内和向外的亲水性物质的渗透屏障。疏水性化合物的极性基团朝向周围介质以及朝向脂质双层形成的封闭结构的内部空间。

优选地，在根据本发明的UL中，形成脂质双层的至少一种疏水性化合物与UL中包含的丙二醇或甘油的重量比为2∶1至1∶1。确定所述重量比的合适方法是本领域技术人员公知的，例如用于化合物分离的超速离心、用于疏水性化合物浓度测定的HPLC-ELSD、以及用于丙二醇和甘油含量测定的气相色谱法(GC)(例如，参见Elmoslemany RM,Abdallah OY,El-Khordagui LK,Khalafallah NM.Propylene Glycol Liposomes as a TopicalDelivery System for Miconazole Nitrate:Comparison with ConventionalLiposomes.AAPS PharmSciTech.2012；13(2):723-731.doi:10.1208/s12249-012-9783-6)。

还优选地，本发明的UL包含至少一种疏水性化合物，其含量为UL重量的15％至40％、16％至39％、17％至38％、18％至37％、19％至35％、20％至30％、21％至25％或22％至24％，更优选为UL重量的20％至40％。

还优选地，形成脂质双层的至少一种疏水性化合物与本文所述UL的亲水性空间中包含的至少一种亲水性化合物的重量比为100:1至1:3、50:1至1:2或25:1至1:1。UL中的所述重量比可以通过本领域技术人员已知的任何方法来确定，例如通过疏水性化合物提取，然后通过HPCL-ELSD检测疏水性化合物的浓度。根据亲水性化合物的理化性质选择合适的分析方法进行亲水性化合物的检测属于从业者的普通技能。

在一个实施方案中，本发明的UL不含带电荷的脂质。

亲水性空间

如本文所使用的，术语“亲水性空间”指由脂质双层形成的封闭结构的极性内表面所界定的空间。根据本发明的UL的亲水性空间包含亲水性溶剂和至少一种溶解在所述亲水性溶剂中的亲水性化合物。

亲水性溶剂

如本文所使用的，术语“亲水性溶剂”指与辛醇不混溶的任何溶剂。优选地，所述术语指在20℃下具有75.0至80.1的相对介电常数值的任何溶剂。在本文描述的方法中，亲水性溶剂可以选自水、缓冲水溶液、盐水溶液、单糖或二糖水溶液及其组合。

优选地，在本发明的UL的亲水性空间中包含至少90重量％、至少95重量％或至少99重量％的亲水性溶剂。最优选地，在本发明的UL的亲水性空间中包含100重量％的亲水性溶剂。

亲水性化合物

如本文所使用的，术语“亲水性化合物”指具有负log P值(P＝分配系数辛醇-水)的任何化合物。可以通过本领域已知的任何方法确定分配系数(例如，参见J.Sangster:Octanol-Water Partition Coefficients:Fundamentals and Physical Chemistry,Wiley Series in Solution Chemistry的第2卷,John Wiley&Sons,Chichester,1997)。优选地，亲水性化合物选自离子、蛋白质、肽、碳水化合物、天然聚合物和合成聚合物、核酸、核酸衍生物及其组合。

还优选地，至少一种亲水性化合物选自：(i)分子量为100Da至1500Da、200Da至1400Da、300Da至1200Da或500Da至1000Da的低分子量亲水性物质；和(ii)分子量为1500Da至300kDa、2kDa至280kDa、5kDa至250kDa、10kDa至200kDa或50kDa至200kDa的亲水性大分子。

本发明的UL中包含的亲水性溶剂中的亲水性化合物的浓度为在20℃和101kPa下亲水性化合物在亲水性溶剂中的饱和浓度的至少80％。

如本文所使用的，术语“饱和浓度”指在20℃和101kPa下亲水性化合物在亲水性溶剂中的浓度，在该浓度下，亲水性溶剂不能溶解更多的亲水性化合物，并且额外量的所述亲水性化合物将作为分离相出现，即为沉淀物。确定亲水性化合物的饱和浓度的合适方法是本领域技术人员公知的，例如，根据用于测试化学品的水溶性的OECD指南的烧瓶法或柱洗脱法(参照用于测试化学品的OECD指南，第1节，测试编号105–水溶性)。

优选地，亲水性化合物在亲水性溶剂中的饱和浓度为每1000ml亲水性溶剂1g至500g，更优选为每1000ml亲水性溶剂10g至200g。

进一步优选地，本文描述的UL中包含的亲水性化合物与疏水性化合物的总摩尔比大于1∶100000。

本发明的方法

本发明人还开发了一种将亲水性化合物高效包封在单层脂质体内的方法。出乎意料地发现，通过使用选自丙二醇和甘油的多元醇作为形成脂质双层的疏水性化合物的溶剂，可以将包含亲水性化合物的水相总体积的50％以上稳定地包封在UL中。

因此，在第二方面，本发明涉及一种在UL中包封亲水性化合物的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含至少一种疏水性化合物和选自丙二醇和甘油的多元醇的脂质溶液；提供包含至少一种亲水性化合物的水相；通过将(a)的脂质溶液与(b)的水相混合来制备水合的脂质溶液；和在低于80℃的温度下挤出(c)的水合的脂质溶液，其中至少一种疏水性化合物形成UL的均质群，其中所述UL包含水相总体积的大于50％。

优选地，所述UL包含水相总体积的大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于98％或大于99％。

包封效率

本发明的上述方法通过在室温下低能量挤出的简单方法，有利于制备具有明确定义的大小分布的稳定的含有UL的悬浮液，同时分别提供了被包封的亲水性化合物的高结构稳定性和高度包封。

至少一种亲水性化合物可以通过本文所述的方法包封在UL中，包封效率选自至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％。

在本发明的上下文中，术语“包封效率”指以百分比[％]表示的“a”值，该值根据下式确定：

a＝(C_tot-C_out)/C_tot

其中，“C_out”指样品中残留在UL的亲水空间外的水相那部分中的亲水性化合物的浓度，“C_tot”指样品中的亲水性化合物的总浓度。“C_out”和“C_tot”通过光谱法确定。

由于包含至少一种亲水性化合物的水相的包封体积与残留在UL外部的所述水相的体积的比率高，因此通过本发明的方法实现了亲水性化合物的有效包封。这意味着在本文描述的方法的步骤(b)中提供的水相总体积的至少一半存在于通过本文描述的方法获得的脂质体内。

因此，由本发明的方法获得的组合物包含均质的UL，其中所述UL包含水相总体积的大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于98％或大于99％。

在本发明方法的步骤(b)中，可以通过将所述至少一种亲水性化合物溶解在亲水性溶剂中来制备包含至少一种亲水性化合物的水相。优选地，步骤(b)中提供的水相中的亲水性化合物的浓度为在20℃和101kPa下亲水性化合物在亲水性溶剂中的饱和浓度的至少80％。亲水性化合物在亲水性溶剂中的饱和浓度可以为每1000ml亲水性溶剂1g至500g，优选为每1000ml亲水性溶剂10g至200g。

本发明方法的步骤(b)还可以包括调节水相的pH，优选将pH调节到5.0至7.5、6.0至7.4或7.0至7.2。优选地，所述pH调节在20℃的温度下进行。用于测量和调节液体溶液的pH的合适方法是本领域技术人员已知的。

在本文所述的方法中，步骤(c)的水合的脂质溶液中包含的多元醇的浓度优选为水合的脂质溶液重量的5％至30％、10％至25％、15％至22％或18％至20％。

疏水性化合物浓度

本发明人还发现，如果在本发明方法的步骤(c)中制备的水合的脂质溶液中包含高浓度的至少一种疏水性化合物，则获得UL悬浮液，其被所述UL的脂质双层紧密地包封。因此，步骤(c)的水合的脂质溶液中至少一种疏水性化合物的总浓度可以为所述水合的脂质溶液重量的15％至40％、16％至39％、17％至38％、18％至37％、19％至35％、20％至30％、21％至25％或22％至24％。

特别优选地，步骤(c)的水合的脂质溶液中至少一种疏水性化合物的总浓度为所述水合的脂质溶液重量的20％至40％、20％至30％或30％至40％。本发明人发现，这样浓缩的UL悬浮液的单个挤出循环进一步将本文描述的方法的包封效率提高至最高99％，并且实现了UL悬浮液不低于4000cPs(6RPM，室温)的高黏度，而无需使用其他胶凝剂或增稠剂。优选地，UL悬浮液的黏度达到至少5000cPs、至少7000cPs或至少10000cPs(6RPM，室温)。

至少一种疏水性化合物可以选自磷脂、鞘脂或固醇。优选地，至少一种疏水性化合物可以选自磷脂酰胆碱，更优选地选自纯化的大豆磷脂酰胆碱。在一个实施方案中，步骤(c)的水合的脂质溶液不含带电荷的脂质。

挤出

步骤(d)中(c)的水合的脂质溶液的挤出可以在低于80℃、低于60℃或低于40℃的温度下进行。

出人意料地发现，本发明的方法在室温下的单个挤出循环后已经以超过95％的效率实现了本文所述的UL中亲水性大分子的包封。

因此，优选本文所述方法的步骤(d)包括在低于30℃的温度下、更优选在室温(20℃)下挤出(c)的水合的脂质溶液。进一步优选地，本发明的方法包括单个挤出循环。最优选地，本文所述方法的步骤(d)包括在单个挤出循环中在室温(20℃)下挤出(c)的水合的脂质溶液。

如本文所使用的，术语“挤出循环”指(c)的水合的脂质溶液通过孔径为100nm的聚碳酸酯过滤器一次。

进一步的方法步骤

本文描述的方法的挤出步骤(d)之后可以是进一步的步骤(f)，其是从由挤出步骤(d)得到的含UL的悬浮液中除去甘油或丙二醇。优选地，所述多元醇的去除是通过超滤完成的。在一个特别优选的实施方案中，将由挤出步骤(d)得到的含UL的悬浮液应用于超滤系统(例如，用于实验室规模的MicroKros MWCO 70kD，或用于较大制剂的可商购获得的盒)，然后用等渗水相洗涤。在超滤步骤之后，脂质体悬浮液中残留的多元醇的量与样品和所施加的水相的体积分数成比例。优选地，所述含量小于含UL的悬浮液重量的1％、小于0.8％、小于0.5％、小于0.4％、小于0.3％、小于0.2％或小于0.1％。

本发明的方法可以包括进一步稀释由步骤(d)或(e)得到的含UL的悬浮液的步骤，优选地通过添加盐溶液，更优选地无菌盐溶液来稀释。

或者，所述进一步的方法步骤可包括冻干或喷雾干燥由步骤(d)或(e)得到的含UL的悬浮液，以提供含固体脂质体的组合物，例如脂质体粉末。

赋形剂

本发明的方法还可以包括添加至少一种赋形剂，该赋形剂可以选自：缓冲剂、渗透活性剂、防腐剂、抗氧化剂、调味剂、芳香剂及其组合。优选地，所述渗透剂选自单价盐或糖，更优选地选自氯化钠和蔗糖。还优选地，本发明的方法包括以使得最终产物获得30mOsm至400mOsm的渗透压的量添加渗透剂。

本发明的组合物

在第三方面，本发明提供了包含根据本发明所述的至少一种UL的组合物。在第四方面，本发明提供了通过本文描述的方法制备的组合物。

在本发明的上下文中，术语“组合物”分别指根据第三方面的组合物和根据第四方面的组合物，包括液体组合物、半固体组合物和固体组合物。本发明的组合物可以是液体组合物，优选是含水液体组合物，例如含水稀释液或悬浮液，或者是半固体组合物，例如软膏或凝胶。

本发明的组合物也可以是固体组合物，优选粉末组合物，例如喷雾干燥或冻干的粉末组合物。

本文所述的组合物可以选自药物组合物、化妆品组合物、食品组合物、食品添加剂组合物或消毒剂组合物。在本发明的组合物是药物组合物的情况下，优选亲水性化合物是药物活性剂或药物化合物。

本文所述的组合物还可以包含至少一种赋形剂。优选地，所述赋形剂选自缓冲剂、渗透活性剂、防腐剂、抗氧化剂、调味剂、芳香剂及其组合；优选地，其中所述渗透剂选自一价盐或糖，更优选地选自氯化钠和蔗糖。

优选地，本发明的组合物具有以下性质中的至少一种：(i)pH为5.0至7.5、6.0至7.4或7.0至7.2；(ii)渗透压为30mOsm至400mOsm、40mOsm至300mOsm或50mOsm至200mOsm；和/或(iii)亲水性化合物与疏水性化合物的总摩尔比为10^-5至1。

还优选的是，本文描述的组合物具有至少4000cPs(6RPM，室温)、至少5000cPs(6RPM，室温)、至少7000cPs(6RPM，室温)或至少10000cPs(6RPM，室温)的黏度。

本发明的UL和组合物的用途

本文所述的单层脂质体(UL)或组合物可以分别用作药物、化妆品、食品添加剂或消毒剂，或分别用于制备药物、化妆品、食品添加剂或消毒剂。在一个实施方案中，本发明的UL或组合物用于治疗。

本文所述的组合物可以不经进一步修饰而以软膏形式用作皮肤病学产品或美容产品。

本文所述的组合物也可以稀释形式使用。如果包封在UL中的亲水性物质旨在作为药物产品供全身使用，则本发明的组合物优选用等渗溶液稀释，所述等渗溶液不改变包封在UL中的亲水性化合物的量。这样稀释的UL悬浮液可以用于在治疗应用中施用肽、完整的蛋白质、聚合物、糖或核酸。迄今为止，这些化合物在药物上的使用受到限制，因为它们可以立即从生理液中除去。这在口服施用中尤其重要，在口服施用过程中，蛋白质、聚合物、糖或核酸在消化过程中被水解。

因此，总而言之，本发明克服了生物药物的开发和治疗应用中的主要障碍。

通过以下实施例描述本发明，实施例应被解释为仅是示例性的，而并不限制本发明的范围。

实施例1

将1000mg磷脂90G(Lipoid AG)溶解在750mg丙二醇(Chempur)中，同时搅拌(4h，室温)，直到获得均匀的脂质黄色溶液，然后与3250mg水相混合，该水相含有5mg荧光标记的葡聚糖(MW 5kDa)，其用磷酸盐缓冲液(0.01M，pH 7.2)缓冲。在一个循环中将所得混合物通过孔径为100nm的聚碳酸酯过滤器挤出。

结果，获得了脂质体悬浮液，其脂质浓度为所述悬浮液重量的20％，其中96％的标记的葡聚糖被包封在单层脂质体(UL)内。

实施例2

将1500mg磷脂90G(Lipoid AG)溶解在1000mg丙二醇(Chempur)中，搅拌(4h，室温)，直到获得均匀的脂质黄色溶液，然后与2500mg水相混合，该水相含有5mg荧光标记的葡聚糖(MW 5kDa)，其用磷酸盐缓冲液(0.01M，pH 7.2)缓冲。在一个循环中将所得混合物通过孔径为100nm的聚碳酸酯过滤器挤出。

结果，获得了脂质体悬浮液，其脂质浓度为所述悬浮液重量的30％，其中96％的标记的葡聚糖被包封在单层脂质体(UL)内。

实施例3

将2000mg磷脂90G(Lipoid AG)溶解在1000mg丙二醇(Chempur)中，搅拌(4h，室温)，直到获得均匀的脂质黄色溶液，然后与2000mg水相混合，该水相含有5mg磷酸标记的葡聚糖(MW 5kDa)，其用磷酸盐缓冲液(0.01M，pH 7.2)缓冲。在一个循环中将所得混合物通过孔径为100nm的聚碳酸酯过滤器挤出。

结果，获得了脂质体悬浮液，其脂质浓度为所述悬浮液重量的40％，其中99％的标记的葡聚糖被包封在单层脂质体(UL)内。

实施例4

将1500mg磷脂90G(Lipoid AG)溶解在1000mg丙二醇(Chempur)中，搅拌(4h，室温)，直到获得均匀的脂质黄色溶液，然后与2500mg水相混合，该水相含有50mg木瓜蛋白酶(MW 23kDa)，其用磷酸盐缓冲液(0.01M，pH7.2)缓冲。在一个循环中将所得混合物通过孔径为100nm的聚碳酸酯过滤器挤出。

结果，获得了脂质体悬浮液，其脂质浓度为所述悬浮液重量的30％，其中99％的木瓜蛋白酶被包封在单层脂质体(UL)内。

实施例5

制备了用于癌症治疗的添加剂或膳食补充剂的高浓度维生素C产物，该产品具有以下成分：

通过将210mg磷脂90G(Lipoid AG)溶解在180mg丙二醇(Chempur)中并搅拌该混合物(4h，室温，60RPM)直至获得均匀的脂质黄色溶液来制备产物。将所述溶液与590mg水相混合(12h，室温，200RPM)，所述水相包含用磷酸缓冲液(0.01M，pH7.2)缓冲的210mg维生素C。在一个循环中将所得混合物通过孔径为100nm的聚碳酸酯过滤器挤出。依次添加EDTA、天然香料和甜味剂并搅拌(0.5h，室温，60RPM)以获得最终产物。

实施例6

制备了用于治疗贫血的添加剂或膳食补充剂的高浓度铁制剂，该制剂具有以下成分：

项目	名称	量[mg]
			1.	纯化的大豆磷脂酰胆碱	220.0
2.	丙二醇	180.0
			3.	二磷酸铁(III)	20.0
4.	维生素E	10.0
			5.	磷酸缓冲液	560.0
6.	天然香料	5.0
			7.	甜味剂	5.0
	总计：	1000.0

通过将220mg磷脂90G(Lipoid AG)溶解在180mg丙二醇(Chempur)中并搅拌该混合物(4h，室温，60RPM)直至获得均匀的脂质黄色溶液来制备产物。将所述溶液与580mg水相混合(12h，室温，200RPM)，所述水相包含用磷酸缓冲液(0.01M，pH7.2)缓冲的20mg二磷酸铁(III)。在一个循环中将所得混合物通过孔径为100nm的聚碳酸酯过滤器挤出。依次添加作为抗氧化剂的维生素E、天然香料和甜味剂并搅拌(0.5h，室温，60RPM)以获得最终产物。

实施例7

制备了用于基因治疗的药物，其具有以下成分：

通过将240mg磷脂酰胆碱、10mg N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,NJ,N-三甲基甲基硫酸铵(DOTAP)和20mg 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)溶解在200mg丙二醇(Chempur)中并搅拌(4h，室温，60RPM)直至获得均匀的脂质黄色溶液来制备产物。将所述溶液与530mg水相混合(12h，室温，200RPM)，所述水相含有20mg脱氧核糖核酸(DNA)，其用磷酸盐缓冲盐水1x(PBS)缓冲。在一个循环中将所得混合物通过孔径为100nm的聚碳酸酯过滤器挤出。将所得产物冻干或在盐水中稀释以直接施用。

实施例8

为了优化单层脂质体(UL)的制备工艺，使用表1所示的配方和工艺参数制备了几种含脂质体的样品，并确定了这些样品中的黏度和大小分布。

表1：测试脂质体样品的配方和工艺参数汇总

在包含单层脂质体(UL)的样品的制备过程的第一步中，通过搅拌磷脂酰胆碱和丙二醇的混合物并在室温下孵育所述混合物数小时直至磷脂酰胆碱完全溶解来制备脂质溶液。向所得澄清的黄色脂质溶液中加入一定量的蒸馏水，以使最终样品重量为10g。剧烈混合样品直至获得均匀的白色磷脂悬浮液。

将获得的多层脂质体(MLV)的悬浮液等分成三批。将一批进行黏度测试(未校准的批)。通过孔径为100nm的聚碳酸酯过滤器进行挤出来校准另外两批。分别在室温(RT)或70℃下进行挤出工艺，直到获得样品中所得单层脂质体(UL)的均匀的大小分布。

通过使用配备有锥板测量系统的Bruker流变仪来确定所获得的包含脂质体的样品的黏度。将少量样品(0.1g至0.2g)放入恒温的测量室中，并通过测量黏度相对于锥体旋转速度的变化进行表征。测量在室温(20℃)下进行。这些黏度测量的结果如图1和图2所示。

此外，在用蒸馏水以1:100的比例稀释样品后，使用Malvern ZetaSizer Nano ZS仪器通过动态光散射(DLS)测定所得样品中脂质体的大小分布。大小确定的结果如图3A、图3B和图4所示。

结果

作为优化单层脂质体(UL)制备过程的结果，发现在室温下低压挤出后已经形成UL。此外，发现挤出样品中脂质的量优选为至少20重量％。还发现，将所述脂质浓度设置为大于或等于20重量％有利于通过样品单次通过聚碳酸酯过滤器来获得脂质体的单分散群体(PDI<0.2)，这与包含较少量脂质的样品相反。

实施例9

为了证明本发明的亲水性大分子包封方法的高效性，根据实施例1至实施例4通过将脂质的丙二醇溶液分别与荧光标记的亲水性聚合物(5kDa的FITC标记的葡聚糖)或蛋白质(木瓜蛋白酶，分子量为23kDa)的水溶液混合，并将得到的悬浮液通过孔径为100nm的聚碳酸酯过滤器挤出来制备样品。所得UL悬浮液中的脂质浓度为所述悬浮液重量的20％至40％。

用蒸馏水以1:100的比例稀释样品后，使用实施例8中所述的DLS技术验证UL的大小。

通过光谱法确定UL包封的荧光标记的聚合物或蛋白质的浓度。因此，样品通过Biomax-50过滤盒(Merck Millipore)进行超滤，截留范围为140kDa至300kDa，以确定两个隔室即脂质体外部(渗透物部分)和脂质体内部(保留物部分)中亲水性化合物的浓度。用Thermo Scientific Nicolet Evolution 100UV-VIS分光荧光计测量稳态荧光发射光谱。木瓜蛋白酶和荧光标记的葡聚糖(FITC-葡聚糖)的激发波长分别设置为280nm和490nm。

包封效率根据上文提供的公式确定。简而言之，根据下式确定以百分比[％]表示的包封率“a”：

a＝(C_tot-C_out)/C_tot

其中，“C_out”是确定样品中残留在UL的亲水空间之外的水相部分中的亲水性化合物的浓度，“C_tot”是确定样品中的亲水性化合物的总浓度。

结果

在所有样品中，在单个挤出循环后获得的UL均质群的平均大小约为100nm，PDI<0.2，其中将近100％的葡聚糖或木瓜蛋白酶分别包封在UL中。图5显示了分别包含木瓜蛋白酶和荧光标记的葡聚糖的样品的滤液(渗透物)和包封在UL中的样品的含水部分(截留物)的发射光谱。

具体地，显示出本发明的方法实现了以超过95％的效率将这些亲水性大分子包封在所述UL中。在图6中显示根据样品中脂质浓度计算的包封效率。

实施例10

为了确认本文介绍的包封亲水性大分子的方法学的高效性以及所获得结构的完整性，使用透射电子显微镜对分别含有未分级肝素和PVP的共价键合的氯E6分子的本发明UL制剂进行成像(见图7)。所得图像证实了在本发明描述的UL中亲水性大分子的包封有效性以及本文描述的包封方法的高效性。

实施例11

为了进一步证明本发明的亲水性大分子包封方法的高效性，将1000mg磷脂90G(Lipoid AG)溶于1000mg甘油(PCC，波兰)中，同时搅拌(4h，室温)，直到获得均匀的脂质黄色溶液，然后与2000mg在0.1M NaCl中含10mg白蛋白(分子量超过66kDa)的水溶液混合。如以上实施例9中所述的来确定包封效率。

结果，获得了UL悬浮液，其脂质浓度为所述悬浮液重量的25％，其中83％的白蛋白被包封在单层脂质体(UL)内。

实施例12

为了进一步证明本发明的亲水性大分子包封方法的高效性，将25g磷脂90G(Lipoid AG)溶于25g甘油(PCC，波兰)中，同时搅拌(4h，室温)，直到获得均匀的脂质黄色溶液，然后与50g在0.1M NaCl中含有0.5重量％肝素的水相混合。在一个循环中将所得混合物通过孔径为100nm的聚碳酸酯过滤器挤出。为了评估包封效率，将所得的UL悬浮液通过Biomax-50过滤盒(Merck Millipore)进行超滤，截留范围为140kDa至300kDa，以确定两个隔室即脂质体外部(渗透物部分)和脂质体内部(保留物部分)中亲水性化合物的浓度。使用配备有ELSD检测器和SEC柱的HPLC测定检测器和UL包封的肝素的浓度。

结果，获得了脂质体悬浮液，其脂质浓度为所述悬浮液重量的25％，其中56％的肝素被包封在单层脂质体(UL)内。

实施例13

为了进一步证明本发明的亲水性大分子包封方法的高效性，将30g磷脂90G(Lipoid AG)溶于20g甘油(PCC，波兰)中，同时搅拌(4h，室温)，直到获得均匀的脂质黄色溶液，然后与50g在0.1M NaCl中的含有0.5重量％肝素的水相混合。在一个循环中将所得混合物通过孔径为100nm的聚碳酸酯过滤器挤出。为了评估包封效率，将所得的UL悬浮液通过Biomax-50过滤盒(Merck Millipore)进行超滤，截留范围为140kDa至300kDa，以确定两个隔室即脂质体外部(渗透物部分)和脂质体内部(保留物部分)中亲水性化合物的浓度。使用配备有ELSD检测器和SEC柱的HPLC测定检测器和UL包封的肝素的浓度。

结果，获得了脂质体悬浮液，其脂质浓度为所述悬浮液重量的30％，其中80％的肝素分别被包封在单层脂质体(UL)内。