阅读说明：本技术 一种野生毛柄钉灰包菌株的专用培养基及培养方法 (Special culture medium and culture method for wild petiole nail ash wrapped strain ) 是由 罗影 贾培松 努尔孜亚·亚力买买提 贾文婕 魏鹏 郝敬喆 宋博 高海峰 丁丽丽 关 于 2020-06-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种野生毛柄钉灰包的专用培养基及其培养方法。通过菌株分离、基础培养基、母种培养基和培养条件的筛选试验,得到野生毛柄钉灰包菌株培养的专用培养基及其培养方法。本发明所述的培养基按照质量体积比计包括：胰蛋白胨5-15、酵母粉4-6、NaCl 8-12、木屑粉20-30、燕麦粉20-30、琼脂粉15-30和蒸馏水800-1500。利用该培养基培养的毛柄钉灰包菌丝体生长速度可达0.52-0.64mm/d,菌丝长势强,本发明提供的技术方案解决了现有技术未见报道有关野生毛柄钉灰包菌株适合的专用培养基的技术问题,本发明提供的专用培养基及野生毛柄钉灰包菌株的培养方法,能够满足开展生物学研究的要求,为其人工驯化栽培方面具有现实的实用价值和应用推广价值。(The invention discloses a special culture medium for wild petiole nail ash bags and a culture method thereof. The special culture medium for culturing the wild petiole glochidion strain and the culture method thereof are obtained through strain separation, a basic culture medium, a mother culture medium and a screening test of culture conditions. The culture medium comprises the following components in percentage by mass and volume: 5-15 parts of tryptone, 4-6 parts of yeast powder, 8-12 parts of NaCl, 20-30 parts of sawdust powder, 20-30 parts of oat powder, 15-30 parts of agar powder and 800-1500 parts of distilled water. The growth speed of the ash-coated mycelium of the petiole nails cultured by using the culture medium can reach 0.52-0.64mm/d, the growth vigor of the mycelium is strong, the technical scheme provided by the invention solves the technical problem that the prior art does not report the suitable special culture medium for the wild petiole nail ash-coated strain, and the special culture medium and the culture method for the wild petiole nail ash-coated strain provided by the invention can meet the requirement of developing biological research and have practical value and application and popularization value in the aspect of artificial domestication and cultivation of the strain.)

一种野生毛柄钉灰包菌株的专用培养基及培养方法

技术领域

本发明涉及野生食用菌菌株的培养技术领域，具体涉及一种野生毛柄钉灰包菌株的专用培养基及培养方法。

背景技术

食用菌普遍富含蛋白质、多糖和维生素，而脂肪含量低，通常具有提高人体免疫力、改善人体机能、治疗心血管疾病的生理功效，被誉为21世纪的健康食品。随着人民生活水平的提高，人们对新型食用菌品种的需求逐渐增大，因此，新的野生食用菌品种开发成为形势发展的需要。

钉灰包属(Battarrea.)建立于1801年，以内包被在与菌柄的连接处环裂以及孢体具有独特的弹丝区别于其它真菌，全世界记载有3种。钉灰包属的成员均具有大型的担子果，且外形特征变化较大，部分鉴别特征有时难于获得，导致种的概念的混乱，以致于一度认为毛柄钉灰包是鬼笔状钉灰包的一种形态。刘虹和范黎等认为钉灰包属(Battarrea)的毛柄钉灰包(B.stevenii)和鬼笔状钉灰包(B.phalloides)是两个独立的种。

毛柄钉灰包(B.stevenii)担子果大型，最初埋生于地下，球形，可食用，包被与柄的帽状顶端相连，成熟后地上生，包被在与柄的连接处环裂。当前并未有毛柄钉灰包驯化栽培的报道，现有技术研究表明，野生毛柄钉灰包菌株在普通马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上基本不生长，现有技术也未见报道有关野生毛柄钉灰包菌株的适合的专用培养基，难以满足开展生物学研究的要求，也不便于作为菌种进行人工驯化栽培研究，因此，亟待开发野生毛柄钉灰包菌株的分离培养方法。

发明内容

针对现有技术中未见报道有关野生毛柄钉灰包菌株适合的培养基，以及野生毛柄钉灰包菌株在普通马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上基本不生长，难以满足开展生物学研究的要求，也不便于作为菌种进行人工驯化栽培研究的技术现状，本发明旨在提供一种野生毛柄钉灰包的专用培养基及野生毛柄钉灰包菌株的培养方法。通过菌株分离、基础培养基、母种培养基和培养条件的筛选试验，得到野生毛柄钉灰包菌株适合的专用培养基，利用该培养基培养的野生毛柄钉灰包菌丝体生长速度较快，菌丝长势强，能够满足开展生物学研究的要求，也便于开展毛柄钉灰包菌种的人工驯化栽培研究，为其人工驯化栽培奠定了技术基础。

为了达到以上技术目的，本发明采用的技术方案包括为：

本发明具体提供的一种野生毛柄钉灰包的专用培养基，按照质量体积比计，所述专用培养基包括：胰蛋白胨5-15，酵母粉4-6，NaCl8-12，木屑粉20-30，燕麦粉20-30，琼脂粉15-30，蒸馏水800-1500。

优选的，一种野生毛柄钉灰包的专用培养基，按照质量体积比计，所述专用培养基包括：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl10，木屑粉25，燕麦粉25，琼脂粉20，蒸馏水1000。

本发明中，所述燕麦粉使用前需晒干粉碎，过20目筛。

本发明中，所述的木屑粉使用前需晒干粉碎，过20目筛。

同时，本发明提供一种野生毛柄钉灰包的培养方法，采用上述提供的专用培养基，具体野生毛柄钉灰包的培养方法包括如下步骤：

(1)培养基的制备：按照配方称取各试剂，在去离子水中加入胰蛋白胨、酵母粉和NaCl，搅拌直至各溶质溶解，摩尔浓度为1.0mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.0，然后加入木屑粉、燕麦粉和琼脂粉，最后用去离子水定容至1000mL，将已制备好的培养基趁热分装于试管内，每支10ml，用硅胶塞塞紧试管口，按每10支为一捆，用防潮纸包紧有硅胶塞的一端，放入高压灭菌锅内灭菌，压力1.0-1.5kg/cm²，温度115-121℃，时间15-30min，取出试管摆斜面，冷却凝固后为母种培养基。

(2)在野生毛柄钉灰包分布区采集其幼嫩子实体，用报纸或透气袋包裹子实体，带回实验室进行菌种分离，用刷子将子实体表面杂质清理干净，用75％酒精仔细擦拭子实体表面进行消毒，在无菌条件下，将子实体纵向掰开，用灼烧杀菌的镊子或手术刀在掰开的新鲜子实体截面上取黄豆粒大小的组织，接种至步骤(1)中所得专用母种培养基斜面上。

(3)将接种好的菌种放置于22-28℃生化培养箱暗培养，待菌丝体长好后备用；取生长快，无杂菌污染的菌丝块再次移入另一斜面培养基表面，22-28℃培养，菌丝长满斜面且无杂菌，即为野生毛柄钉灰包母种，制备获得野生毛柄钉灰包的培养方法。

本发明通过以上技术方案，最终形成野生毛柄钉灰包的专用培养基及其培养方法，具有以下技术效果：

(1)本发明提供一种野生毛柄钉灰包的专用培养基及野生毛柄钉灰包菌株的培养方法，野生毛柄钉灰包菌以LB为基础培养基时，菌丝体的生长速度为0.23mm/d，长势最佳，在常用的PDA培养基上基本不吃料，进而以LB为基础培养基，设置不同的母种培养基配方，野生毛柄钉灰包菌菌丝体的生长速度为0.23-0.63mm/d，其中在本发明提供的培养基及培养条件下菌丝体的生长速度达0.52-0.64mm/d，且菌丝长势强。

(2)本发明提供的一种野生毛柄钉灰包的专用培养基及野生毛柄钉灰包菌株的培养方法，克服了现有技术未见报道有关野生毛柄钉灰包菌株适合的专用培养基的技术问题，采用本发明专用培养基及野生毛柄钉灰包菌株的培养方法，能够满足开展生物学研究的要求，便于开展毛柄钉灰包菇菌种的人工驯化栽培研究，为其人工驯化栽培方面具有现实的实用价值和应用推广价值。

附图说明

无

具体实施方式

下面举实施例说明本发明，但是本发明并不限于下述的实施例。

本发明中野生毛柄钉灰包的分离培养中选用的木屑、燕麦、胰蛋白胨、琼脂粉、酵母粉、蒸馏水等均可通过公共渠道购买，工艺中所采用的设备和仪器均为本领域常见的设备。

实施例1：野生毛柄钉灰包菌株的专用培养基

野生毛柄钉灰包的专用培养基按照质量体积比计，所述专用培养基包括：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，木屑粉25g/L，燕麦粉25g/L，琼脂粉20g/L和蒸馏水1000g/L。

实施例2：野生毛柄钉灰包菌株的专用培养基

野生毛柄钉灰包的专用培养基按照质量体积比计，所述专用培养基包括：胰蛋白胨5g/L，酵母粉6g/L，NaCl12g/L，木屑粉20g/L，燕麦粉30g/L，琼脂粉15g/L和蒸馏水1000g/L。

实施例3：野生毛柄钉灰包菌株的专用培养基

野生毛柄钉灰包的专用培养基按照质量体积比计，所述专用培养基包括：胰蛋白胨15g/L，酵母粉4g/L，NaCl8g/L，木屑粉25g/L，燕麦粉20g/L，琼脂粉20g/L和蒸馏水800g/L。

实施例4：野生毛柄钉灰包菌株的专用培养基

野生毛柄钉灰包的专用培养基按照质量体积比计，所述专用培养基包括：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，木屑粉30g/L，燕麦粉25g/L，琼脂粉30g/L和蒸馏水1200g/L。

实施例5：野生毛柄钉灰包菌株的专用培养基

野生毛柄钉灰包的专用培养基按照质量体积比计，所述专用培养基包括：胰蛋白胨12g/L，酵母粉6g/L，NaCl10g/L，木屑粉30g/L，燕麦粉25g/L，琼脂粉25g/L和蒸馏水1500g/L。

实施例6：野生毛柄钉灰包菌株的培养方法

在实施上述实施例1提供的野生毛柄钉灰包的专用培养基为基础，具体的野生毛柄钉灰包菌株的培养方法包括以下步骤：

(1)培养基的制备：在去离子水中加入胰蛋白胨、酵母粉和NaCl，搅拌直至各溶质溶解，摩尔浓度为1.0mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.0，然后加入木屑粉、燕麦粉和琼脂粉，最后用去离子水定容至1000mL，将已制备好的培养基趁热分装于试管内，每支10ml，用硅胶塞塞紧试管口，按每10支为一捆，用防潮纸包紧有硅胶塞的一端，放入高压灭菌锅内灭菌，压力1.2kg/cm²，温度118℃，时间20min，取出试管摆斜面，凝固后为母种培养基。

(2)在野生毛柄钉灰包分布区采集其幼嫩子实体，用报纸或透气袋包裹子实体，带回实验室进行菌种分离，用刷子将子实体表面杂质清理干净，用75％酒精仔细擦拭子实体表面进行消毒，在无菌条件下，将子实体纵向掰开，用灼烧杀菌的镊子或手术刀在掰开的新鲜子实体截面上取黄豆粒大小的组织，接种至步骤(1)所得专用母种培养基斜面上。

(3)将接种好的菌种放置于25℃恒温培养箱暗培养，待菌丝体长好后备用；取生长快，无杂菌污染的菌丝块再次移入另一斜面培养基表面，25℃培养，菌丝长满斜面且无杂菌，即为野生毛柄钉灰包母种，制备获得野生毛柄钉灰包的培养方法。

实施例7：野生毛柄钉灰包菌株的培养方法工艺参数的优化

在实施上述实施例1提供的野生毛柄钉灰包的专用培养基为基础，具体的野生毛柄钉灰包菌株的培养方法包括以下步骤：

(1)培养基的制备：在去离子水中加入胰蛋白胨、酵母粉和NaCl，搅拌直至各溶质溶解，摩尔浓度为1.0mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.0，然后加入木屑粉、燕麦粉和琼脂粉，最后用去离子水定容至1000mL，将已制备好的培养基趁热分装于试管内，每支10ml，用硅胶塞塞紧试管口，按每10支为一捆，用报纸或牛皮纸包紧有硅胶塞的一端，放入高压灭菌锅内灭菌，压力1.0kg/cm²，温度121℃，时间30min，取出试管摆斜面，凝固后为母种培养基。

(2)在野生毛柄钉灰包分布区采集其幼嫩子实体，用报纸或透气袋包裹子实体，带回实验室进行菌种分离，用刷子将子实体表面杂质清理干净，用75％酒精仔细擦拭子实体表面进行消毒，在无菌条件下，将子实体纵向掰开，用灼烧杀菌的镊子或手术刀在掰开的新鲜子实体截面上取黄豆粒大小的组织，接种至步骤(1)所得专用母种培养基斜面上。

(3)将接种好的菌种放置于22℃恒温培养箱暗培养，待菌丝体长好后备用；取生长快，无杂菌污染的菌丝块再次移入另一斜面培养基表面，28℃培养，菌丝长满斜面且无杂菌，即为野生毛柄钉灰包母种，制备获得野生毛柄钉灰包的培养方法。

实施例8：野生毛柄钉灰包菌株的培养方法工艺参数的优化

在实施上述实施例1提供的野生毛柄钉灰包的专用培养基为基础，具体的野生毛柄钉灰包菌株的培养方法包括以下步骤：

(1)培养基的制备：在去离子水中加入胰蛋白胨、酵母粉和NaCl，搅拌直至各溶质溶解用，摩尔浓度为1.0mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.0，然后加入木屑粉、燕麦粉和琼脂粉，最后用去离子水定容至1000mL，将已制备好的培养基趁热分装于试管内，每支10ml，用硅胶塞塞紧试管口，按每10支为一捆，用防潮纸包紧有硅胶塞的一端，放入高压灭菌锅内灭菌，压力1.5kg/cm²，温度115℃，时间15min，取出试管摆斜面，凝固后为母种培养基。

(2)在野生毛柄钉灰包分布区采集其幼嫩子实体，，用报纸或透气袋包裹子实体，带回实验室进行菌种分离，用刷子将子实体表面杂质清理干净，用75％酒精仔细擦拭子实体表面进行消毒，在无菌条件下，将子实体掰开，用灼烧杀菌的镊子或手术刀在掰开的新鲜子实体截面上取黄豆粒大小的组织，接种至步骤(1)所得专用母种培养基斜面上。

(3)将接种好的菌种放置于28℃恒温培养箱暗培养，待菌丝体长好后备用；取生长快，无杂菌污染的菌丝块再次移入另一斜面培养基表面，22℃培养，菌丝长满斜面且无杂菌，即为野生毛柄钉灰包母种，制备获得野生毛柄钉灰包的培养方法。

实施例9：野生毛柄钉灰包菌株的培养方法工艺参数的优化

在实施上述实施例1提供的野生毛柄钉灰包的专用培养基为基础，具体的野生毛柄钉灰包菌株的培养方法包括以下步骤：

(1)培养基的制备：在去离子水中加入胰蛋白胨、酵母粉和NaCl，搅拌直至各溶质溶解用，摩尔浓度为1.0mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.0，然后加入木屑粉、燕麦粉和琼脂粉，最后用去离子水定容至1000mL，将已制备好的培养基趁热分装于试管内，每支10ml，用硅胶塞塞紧试管口，按每10支为一捆，用报纸或牛皮纸包紧有硅胶塞的一端，放入高压灭菌锅内灭菌，压力1.3kg/cm²，温度116℃，时间25min，取出试管摆斜面，凝固后为母种培养基。

(2)在野生毛柄钉灰包分布区采集其幼嫩子实体，，用报纸或透气袋包裹子实体，带回实验室进行菌种分离，用刷子将子实体表面杂质清理干净，用75％酒精仔细擦拭子实体表面进行消毒，在无菌条件下，将子实体纵向掰开，用灼烧杀菌的镊子或手术刀在掰开的新鲜子实体截面上取黄豆粒大小的组织，接种至步骤(1)所得专用母种培养基斜面上。

(3)将接种好的菌种放置于26℃恒温培养箱暗培养，待菌丝体长好后备用；取生长快，无杂菌污染的菌丝块再次移入另一斜面培养基表面，25℃培养，菌丝长满斜面且无杂菌，即为野生毛柄钉灰包母种，制备获得野生毛柄钉灰包的培养方法。

实施例10：野生毛柄钉灰包菌的培养基优化筛选

本实施例在实施例1至实施例5提供的培养基配方和实施例6培养方法的基础上进行，通过对本发明基础培养基、母种培养基和培养条件的筛选，最终确定本发明专用培养基，并与常用的培养基培养进行了对比，具体如下：

基础培养基筛选

采用平板试验法对基础培养基进行筛选，每个平皿中央定量接种直径5mm的野生毛柄钉灰包菌菌丝块，25℃恒温黑暗培养，测定不同外源因子对野生毛柄钉灰包菌丝生长的影响，主要以菌丝生长速度为指标，同时观察菌落的形态特征、菌丝长势、菌落色泽等，所有试验均采用90mm的培养皿，培养基用量20mL/皿，具体培养基配方基菌丝生长情况见附表1-2。

表1：毛柄钉灰包基础培养基配方

表2：不同基础培养基对毛柄钉灰包菌生长的影响

序号	培养基名称	菌丝生长速度(mm/d)	菌丝长势
				1	PDA	不吃料	-
2	PDA+VB<sub>1</sub>	不吃料	-
				3	综合PDA	不吃料	-
4	综合PDA+VB<sub>1</sub>	不吃料	-
				5	LB	0.23±0.02a	++
6	LB+VB<sub>1</sub>	0.16±0.04b	++
				7	YPD	0.14±0.05b	++
8	YPD+VB<sub>1</sub>	0.16±0.00b	++

注：1.生长速度后面的小写字母代表显著性差异(P＝0.05)；2.菌丝长势：“+”弱，“++”一般，“+++”强；

由表2试验结果可知，采用平板实验法，选择实验室常用的4种培养基，PDA、综合PDA、LB和YPD，及分别加20mg/LV_B1的培养基。结果显示：毛柄钉灰包的菌丝在LB上生长最好，YPD次之，在PDA和综合PDA上基本不吃料，且加入V_B1对毛柄钉灰包菌丝影响不显著，基础培养基以LB培养基最佳，野生毛柄钉灰包菌再LB培养基上菌丝的生长速度为0.23±0.02mm/d，菌丝长势较好。

母种培养基筛选

以LB为基础培养基，在本发明实施例1-9的基础上，设置新型培养基配方见附表3，通过野生毛柄钉灰包的菌丝体培养实验，对比分析了野生毛柄钉灰包的菌丝体在各培养基上及不同培养条件下的生长速度和菌丝长势情况，结果见附表4。

表3：毛柄钉灰包母种培养基配方

表4：不同母种培养基培养毛柄钉灰包菌对其菌丝生长情况的影响

注：1.生长速度后面的小写字母代表显著性差异(P＝0.05)；2.菌丝长势：“+”弱，“++”一般，“+++”强；

由附表4数据可知，以LB培养基为基础培养基，毛柄钉灰包在母种培养基上培养均能生长，生长速度为0.23～0.64mm/d，其中在LB+木屑粉+燕麦粉培养基上生长速度最佳，菌丝生长速度为0.63±0.02mm/d，显著高于其他处理；在菌丝长势方面，野生毛柄钉灰包菌丝体在LB+燕麦粉、LB+小麦粉/草原土、LB+高粱粉/燕麦粉培养基上的长势均较强，在其他培养基上长势均较弱或一般。同时本实施例在LB+木屑粉+燕麦粉培养基的基础上，对培养基配方及培养条件进行优化，从附表4的数据可知，在本发明提供的培养基配方范围内，菌丝体的生长速度可达0.52-0.64mm/d，比其他以LB为基础配方的培养基的生长速度更高，从菌丝长势上看，实施例1、实施例3及实施例6的长势较强，这表明，本发明以LB+木屑粉+燕麦粉作为培养基野生毛柄钉灰包菌株的专用培养基，满足开展生物学研究的要求，也便于开展毛柄钉灰包菇菌种的人工驯化栽培研究。

综上数据可知，以LB为基础培养基，设置不同的母种培养基配方，野生毛柄钉灰包菌菌丝体均可以生长，生长速度为0.23-0.63mm/d，其中在本发明提供的培养基及培养方法中野生毛柄钉灰包菌菌丝体的生长速度达0.52-0.64mm/d，且菌丝长势强。由此可见，本发明提供的一种野生毛柄钉灰包的专用培养基及野生毛柄钉灰包菌株的培养方法，克服了现有技术未见报道有关野生毛柄钉灰包菌株的适合的专用培养基的技术问题，采用本发明提供的专用培养基及野生毛柄钉灰包菌株的培养方法，能够满足开展生物学研究的要求，便于开展毛柄钉灰包菇菌种的人工驯化栽培研究，为其人工驯化栽培方面具有现实的实用价值和应用推广价值。

上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。