一种颗粒酶b结合化合物及其前体化合物和用途
阅读说明：本技术 一种颗粒酶b结合化合物及其前体化合物和用途 (Granzyme B binding compound, precursor compound thereof and application ) 是由 宋少莉 许晓平 于 2021-04-30 设计创作，主要内容包括：本发明提供了通式(Ⅰ)～(Ⅳ)的化合物,其中通式(Ⅰ)-(Ⅱ)是通式(Ⅲ)-(Ⅳ)配合物的前体化合物,本发明通式(Ⅲ)的金属配合物可用于PET或SPECT成像方法测定免疫治疗疗效,为免疫治疗疗效评估提供新方法。本发明基于颗粒酶B抑制剂IEPD-CHO,设计合成了一种新的特异性靶向颗粒酶B的化合物及放射性金属配合物,能够定性和定量的反映免疫治疗直接生物标记物颗粒酶B的表达和活性,从而直接反映免疫疗效。(The invention provides compounds of general formulas (I) - (IV), wherein the general formulas (I) - (II) are precursor compounds of complexes of the general formulas (III) - (IV), and the metal complex of the general formula (III) can be used for determining the curative effect of immunotherapy by a PET or SPECT imaging method, thereby providing a new method for evaluating the curative effect of the immunotherapy. The invention designs and synthesizes a novel specific targeting granzyme B compound and a radioactive metal complex based on a granzyme B inhibitor IEPD-CHO, and can qualitatively and quantitatively reflect the expression and activity of an immunotherapy direct biomarker granzyme B so as to directly reflect the curative effect of immunity.)
技术领域
本发明涉及药物化学技术领域，具体涉及一种放射性同位素标记的颗粒酶B结合化合物及其前体化合物，以及所述化合物在核医学中用作制备免疫治疗效果评估的示踪剂和成像剂的用途。
背景技术
免疫治疗是恶性肿瘤治疗史上里程碑式的创新，相比于传统治疗手段，免疫治疗因其独特的疗效和多癌种适应性而具有不可比拟的发展优势[1]。尽管已经成功应用于多种肿瘤，免疫治疗仍面临诸多挑战。其中随着瘤种和免疫疗法的不同，患者的客观缓解率差别非常大。以派姆单抗(Pembrolizumab)为例，其在黑色素瘤、非小细胞肺癌、胃癌以及三阴性乳腺癌中分别只有30％，19％，20％和16％的病人获益。因此预测免疫疗法的获益人群是肿瘤免疫治疗一个亟须解决的问题。
预测患者是否获益可以通过治疗前相关生物标志物的检测或治疗后的早期疗效评估来达成。目前，治疗前肿瘤活检相关基因组和免疫标志物包括肿瘤突变负荷(TMB)、微卫星不稳定性(MSI-H)、错配修复基因和PD-L1表达水平等[4]。然而这些生物标志物的预测阈值常因瘤种和免疫疗法的不同而改变，尚无统一标准，而且在某些肿瘤中，这些生物标志物在响应者和非响应者之间有明显的重叠，未能很好解决免疫应答率低的问题。相比于治疗前筛选，在早期免疫治疗之后，对免疫系统激活后相关标志物的分析要比对治疗前样本分析更有价值，因为免疫激活后各类免疫标志物是肿瘤杀伤能力更为直接的信号。并且可以根据早期免疫反应及时调整免疫治疗方案，切实实现个体化治疗，从而有效提高免疫治疗的应答率。分子影像方法是目前早期评估疗效的最有效方法之一，临床最常用的FDGPET/CT显像已经证实了其在化疗、放疗等传统疗法中疗效评估的优势，然而近期的一系列研究则暴露了免疫治疗中FDG PET/CT评估免疫疗效的局限性。免疫治疗造成的炎性细胞浸润会导致肿瘤FDG的短暂升高，造成疾病假性进展，误导临床诊断[7,8]。因此，迫切需要一种反映免疫杀伤直接相关生物标记物的分子影像方法以有效评估免疫疗效，精准筛选免疫疗法获益人群。
免疫系统杀伤清除肿瘤细胞主要依靠细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)和天然杀伤(Nature Killer，NK)细胞，而CTLs和NK细胞最主要的杀伤肿瘤细胞途径是通过它们释放的颗粒酶进入到肿瘤细胞内激活Caspase相关酶，引起Caspase级联反应，最终导致细胞凋亡[9]。而在人体的多种颗粒酶中，颗粒酶B又起主导作用。因此，监测颗粒酶B的表达不仅可以确定CTLs和NK细胞的活性，还能进一步早期反映免疫治疗的效果。颗粒酶B是免疫治疗最直接相关的生物标志物。
发明内容
本发明满足了针对颗粒酶B的特异性地化合物，以及它们在核医学中作为颗粒酶B的显像剂、示踪剂和肿瘤治疗试剂。本发明提供了新颖的颗粒酶B特异性显像剂，旨在解决免疫治疗缺乏精确的评估方法问题。
为解决上述问题，本发明采用了以下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种如通式(Ⅰ)-(Ⅳ)任一项所示的化合物，
其中：
m是0-10的整数，
n是0-10的整数，
R1和R2各自独立地选自氢，卤素，直连或支链羧酸基，COOH，CHO，羟基，OC1-6烷基，SC1-6烷基，C1-6烷基，C1-6卤代烷基，环烷基，芳基，杂环芳基或各类天然、非天然氨基酸中的任意一种或几种；
进一步的，所述R1为醛基；更进一步的，所述R1为甲醛基；
或者进一步的，所述R1为单环杂芳基；更进一步的，R1为
进一步的，所述R2为氢或乙酸基；
R3，R5和R7各自独立地选自氢，C1-6烷基，C1-6卤代烷基中的任意一种或几种；进一步的，所述R3，R5和R7各自为氢；
R4和R6各自独立选自氢，卤素，直连或支链羧酸基，COOH，羟基，巯基，OC1-6烷基，SC1-6烷基，SC1-6烷基，C1-6烷基，C1-6卤代烷基或各类天然、非天然氨基酸中的任意一种或几种；
进一步的，所述R4为丙酸基或氢；
进一步的，所述R6为丁基或
R8和R9各自独立地选自天然氨基酸，非天然氨基酸，OC1-6烷基，SC1-6烷基，C1-6烷基，C1-6卤代烷基，环烷基，芳基，杂环芳基中的任意一种或几种；进一步的，所述R8和R9独自地选自甘氨酸或丙氨酸中的任意一种；
L为各类金属螯合剂或取代金属螯合剂；
M为各种放射性同位素，包括68Ga，64Cu，89Zr，90Y，99mTc，111In，177Lu，186Re，188Re，201Tl，203Pb，212Bi，213Bi，225Ac以及金属络合物Al18F；
本发明的第二方面提供了上述任一种化合物或配合物或其药用盐在制备用于在患者成像试剂中的应用；
本发明的第三方面提供了上述任一种化合物或配合物或其药用盐在制备用于诊断肿瘤免疫治疗疗效的试剂中的应用；
本发明的第四方面提供了上述任一种化合物或配合物或其药用盐在制备用于肿瘤治疗的试剂中的应用。
如果没有另行说明，在本发明中，术语“烷基”本身或作为另一分子的一部分，是指直链或支链或环状烃基、或它们的组合，其可以是完全饱和的、单或多不饱和的，以及可以包括二价和多价基团。“烷基”残基优选是C1至C10并且可以是未取代或取代的(例如用卤素)。优选的烷基残基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、正己基、正庚基或正辛基等。这同样也适用于优选具有3至10个碳原子的相应的环烷基化合物，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基等。不饱和烷基是具有一个或多个双键或三键的烷基。不饱和烷基的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、2-丁烯基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基、以及高级同系物和异构体。除非另有说明，否则术语"烷基"还用来包括烷基的那些衍生物，如"杂烷基"、"卤代烷基"和"高烷基"。
如在本文中所使用的，术语"芳基"是指闭环结构，其具有至少一个具有共轭π电子系统的环并且包括碳环芳基和杂环芳基(或"杂芳基"或"杂芳族的")基团。碳环或杂环芳族基团可以含有5至20个环原子。上述术语包括共价连接的单环或稠环多环(即，共享相邻对的碳原子的环)基团。芳族基团可以是未取代或取代的。"芳族"或"芳基"基团的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、2-联苯基、3-联苯基、4-联苯基、蒽基和菲基。用于每种上述芳基和杂芳基环系统的取代基选自本文中所描述的可接受的取代基(例如烷基、羰基、羧基或卤素)。当连同其他术语(包括但不限于芳氧基、芳硫氧基、芳烷基)一起使用时，术语"芳基"包括芳基和杂芳基环。因此，术语"芳烷基"或"烷芳基"用来包括那些基团，其中芳基连接于烷基(包括但不限于苄基、苯乙基、吡啶基甲基等)，其包括那些烷基，其中碳原子(包括但不限于亚甲基)已被杂原子取代，仅作为示例，被氧原子取代。这样的芳基的实例包括但不限于苯氧基甲基、2-吡啶氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基等。
“杂芳基"是指这样的芳基，其含有至少一个选自N、O和S的杂原子；其中氮和硫原子可以被可选地氧化，而氮原子可以被可选地季铵化。杂芳基可以是取代或未取代的。可以通过杂原子将杂芳基连接于分子的剩余部分。适宜的基团的非限制性实例包括1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异恶唑基、4-异恶唑基、5-异恶唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、4-苯并噻唑基、5-苯并噻唑基、6-苯并噻唑基、7-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、4-吲哚基、5-吲哚基、6-吲哚基、7-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、2-喹啉基、3-喹啉基、4-喹啉基、5-喹啉基、6-喹啉基、7-喹啉基或8-喹啉基。
术语"氨基酸"是指天然存在和非天然氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然氨基酸是20种常见的处于它们的D-或L-形式的氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸类似物是指这样的化合物，其具有和天然存在的氨基酸相同的基本化学结构，仅作为示例，离碳(ex-carbon)，其结合于氢、羧基、氨基和R基团。这样的类似物可以具有经修饰的R基团(通过举例的方式，正亮氨酸)或可以具有经修饰的肽主链，同时仍保留和天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸类似物的非限制性实例包括高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。在本文中可以通过它们的名称、它们的通常已知的三字母符号或通过单字母符号(由IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的)来提及氨基酸。"非天然氨基酸"是指这样的氨基酸，其不是20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸或硒代半胱氨酸的之一。可以与术语"非天然氨基酸"同义使用的其他术语是"非天然编码的氨基酸"、"非天然氨基酸"、"非天然存在的氨基酸"或“人造氨基酸"。术语"非天然氨基酸"包括但不限于这样的氨基酸，其是通过对天然编码氨基酸在它们的主链或侧链中的修饰而发生。在一些实施方式中，非天然氨基酸包含羰基、乙酰基、氨氧基、肼基团、酰肼基团、氨基脲基、叠氮基或炔基。
在本发明的含义内，除非在残基的定义中另有说明，否则所有残基被认为是可组合的。认为披露了它们的所有可以想象的亚组。
根据本发明，所有手性C原子应具有D-和/或L-构型；此外在一种化合物内的组合应该是可能的，即一些手性C原子可以是D-构型而其他手性C原子可以是L-构型。
适合的螯合剂包括，但不限于1,4,7-三氮杂环壬烷三乙酸(NOTA)，1,4,7-三氮杂环壬烷-4,7-二乙酸(NODA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1-戊二酸-4,7-二乙酸(NODAGA)、乙二铵四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、环己基-1,2-二胺四乙酸(CDTA)、乙二醇-O,O'-双(2-氨基乙基)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)、N,N-双(羟基苄基)-乙二胺-N,N'-二乙酸(HBED)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、羟基乙二胺三乙酸(HEDTA)和1,4,8,11-四氮杂环十四烷-N,N',N",N"'-四乙酸(TETA)，1,4,7,10-四氮杂-1,4,7,10-四-(2-氨基甲酰基甲基)-环十二烷(TCMC)和去铁胺B(DFO)。在一些实施方案中，所述的螯合剂为对异硫氰酸酯苄基-1,4,7-三氮杂环壬烷三乙酸(p-SCN-Bn-NOTA)。
有益效果
本发明通式(Ⅰ)-(Ⅱ)的化合物是通式(Ⅲ)-(Ⅳ)配合物的前体化合物。
本发明通式(Ⅲ)-(Ⅳ)的金属配合物可用于PET或SPECT成像方法测定免疫治疗疗效，为免疫治疗疗效评估提供新方法。本发明基于颗粒酶B抑制剂IEPD-CHO，设计合成了一种新的特异性靶向颗粒酶B的化合物及放射性金属配合物，能够定性和定量的反映免疫治疗直接生物标记物颗粒酶B的表达和活性，从而直接反映免疫疗效。
附图说明
图1为GSI-1的HPLC紫外谱图和质谱谱图
图2为68Ga-GSI-1的放射性HPLC谱图
图3为Al18F-GSI-1的放射性HPLC谱图
图4为68Ga-GSI-1和Al18F-GSI-1的体外稳定性
图5为B16F10模型治疗前后68Ga-GSI-1PET/CT连续显像
图6为B16F10模型PD-L1治疗后正常组合阻断组68Ga-GSI-1PET/CT显像验证颗粒酶B特异性
图7为免疫组化法和传统肿瘤体积法评估B16F10模型治疗疗效
具体实施方式
实施例
下面的实施例更详细地解释了本发明，但是不以任何方式解释为本发明仅限制于举例说明的实施方式。
实施例1：NOTA-Gly-Gly-Gly-Ile-Glu-Pro-Asp-CHO(GSI-1)的合成
采用固相合成法，以2-CTC树脂为固相，按顺序加入Fmoc-Asp(OBn)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Glu(OBn)-OH，Fmoc-Ile-OH以及Fmoc-Gly-OH，每步酰胺化反应均以HOBt和DIC作为催化剂，每步脱Fmoc保护采用20％吡啶，最后一个Gly连接上之后加入p-SCN-Bn-NOTA，反应结束后用三氟乙酸、三异丙基硅烷和水(95/2.5/2.5)组成的混合物去除保护和2-CTC树脂，得到(OBn)NOTA-Gly-Gly-Gly-Ile-Glu(OBn)-Pro-Asp(OBn)-OH。然后将Asp的羧基还原成醛基，最后脱去苄基的保护，得到NOTA-Gly-Gly-Gly-Ile-Glu-Pro-Asp-CHO，产物最终经过半制备液相纯化。最终产品通过HPLC(图1a)和质谱(图1b)表征，相关谱图见图1。
实施例2：68Ga-NOTA-Gly-Gly-Gly-Ile-Glu-Pro-Asp-CHO(68Ga-GSI-1)的合成
68Ga-NOTA-Gly-Gly-Gly-Ile-Glu-Pro-Asp-CHO(68Ga-GSI-1)的具体合成反应路线如下：
取20μg GSI-1，加入600μl 0.5M醋酸钠，然后再加入68GaCl3淋洗液约10mCi，混合液于40℃反应10min，然后经C-18小柱固相萃取，产品最后用1ml乙醇洗脱，得到68Ga-GSI-1。产物经radio-HPLC检测，放射化学纯度大于99％，相关分析谱图见图2。
实施例3：Al18F-NOTA-Gly-Gly-Gly-Ile-Glu-Pro-Asp-CHO(Al18F-GSI-1)的合成
Al18F-NOTA-Gly-Gly-Gly-Ile-Glu-Pro-Asp-CHO(Al18F-GSI-1)的具体合成反应路线如下：
加速器轰击产生的18F离子传输至QMA柱富集，传输结束后用2mL超纯水洗涤QMA柱，然后0.4M KHCO3溶液0.2mL×2洗脱18F离子。取100μL18F离子溶液(约10mCi)加入10μL冰醋酸混合，然后再加入100μL 2mM AlCl3溶液，于室温下孵育5分钟；接着加入160μL GSI-1(1μg/μL)和0.1M NaOAc溶液530μL，补足总体积1mL；105℃加热反应15分钟；反应结束后加0.1MNaOAc溶液1mL稀释，然后经C-18小柱固相萃取，2次5ml注射水洗涤，最后1ml乙醇洗脱得到产品Al18F-GSI-1。产物经radio-HPLC分析，放射化学纯度大于95％，分析谱图见图3。
实施例4：配合物体外稳定性实验
取一定量的68Ga-GSI-1和Al18F-GSI-1分别加入到PBS以及新鲜小鼠血清中，于不同时间点测定放射化学纯度，检测两个配合物的稳定性。结果见图4，68Ga-GSI-1和Al18F-GSI-1的稳定性分别如图4a和图4b所示。68Ga-GSI-1在3h后均能保持90％以上的放射化学纯度，而Al18F-GSI-1在6h后也仍能保持90％以上的放射化学纯度。
实施例5：68Ga-GSI-1显像评估肿瘤免疫治疗疗效
在正常Balb/c小白鼠上建立鼠源黑色素瘤B16F10模型，该肿瘤高表达PD-L1。取12只B16F10模型小鼠，随机分成2组，每组6只。实验组接受PD-L1单抗治疗(10mg/kg)，每3天给药一次；对照组于相同时间点给予同等体积的生理盐水。所有小鼠给药前进行68Ga-GSI-1PET/CT显像作为基线，然后每次治疗后1天均进行68Ga-GSI-1PET/CT显像，像结果见图5。
68Ga-GSI-1PET/CT成像显示治疗前对照组和实验组肿瘤均无明显放射性摄取。随着治疗的深入，实验组肿瘤的放射性摄取急剧升高；同时对照组肿瘤的放射性摄取仅仅有轻微的增加。实验组和对照组如此明显的差异可以证实该摄取应由PD-L1单抗治疗引起。利用PET/CT自带软件，定量计算获得肿瘤/对侧肌肉的T/M数据。结果显示实验组和对照组在基线显像时，T/M比值分别为1.06±0.05和1.01±0.15，显示肿瘤摄取和本底一致。治疗3天后，实验组的T/M比值即升高到6.68±0.35，而对照组为1.71±0.18，仅有轻微增高。治疗后12天实验组的T/M比值已经高达13.24±0.96，该结果要远远高于文献报道的68Ga-GZP(Larimer BM,et al.Cancer Res,2017,77,2318)。文献中肿瘤模型经免疫治疗后12天，68Ga-GZP PET/CT显像的定量结果显示T/M比值仅为1.90±0.55。该定量结果显示，68Ga-GSI-1要较68Ga-GZP更为灵敏，能更早地预测免疫疗效。
为证实68Ga-GSI-1确实为特异性靶向颗粒酶B，我们以IEPD-CHO抑制剂进行阻断实验。阻断实验小鼠提前半小时注射颗粒酶B抑制剂IEPD-CHO(1000倍摩尔当量)，同一只小鼠的正常显像和阻断显像见图6，从图示箭头肿瘤部位结果显示，过量的颗粒酶B抑制剂完全屏蔽了肿瘤的放射性摄取，证实68Ga-GSI-1确实特异性地靶向颗粒酶B。
为进一步证实PD-L1治疗后T细胞被重激活，释放出更多杀伤性的颗粒酶B，最后一次显像后分别于实验组和对照组随机各选取1只小鼠解剖后取肿瘤进行免疫组化分析。免疫荧光结果显示实验组肿瘤中存在大量的颗粒酶B表达，而对照组肿瘤仅有零星的颗粒酶B表达(图7a)。整个实验周期持续跟踪观察小鼠的肿瘤大小，结果显示PD-L1单抗治疗组肿瘤生长较为缓慢，第9天肿瘤大小达到峰值，之后肿瘤开始萎缩消退，部分小鼠中肿瘤完全消失，展示了PD-L1单抗非常优异的免疫治疗效果。而生理盐水治疗组肿瘤呈现快速增长，直至小鼠死亡(图7b)。
本文描述了包括用于实施本发明的本发明人已知的最佳模式的本发明的优选实施方案。在阅读前述描述之后，那些优选的实施方案的变化形式对于本领域的普通技术人员而言可以变得明显。本发明人预期技术人员适当地利用这样的变化形式，并且本发明人意图本发明与如本文特别描述的不同地被实施。因此，如被可适用的法律允许，本发明包括在此所附的权利要求中所叙述的主题的所有的变型和等效物。此外，除非本文另外指出或另外明显地与上下文矛盾，否则上面所描述的要素以其所有可能的变化形式的任何组合被本发明包括。
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