可以自组装形成ph响应载药水凝胶的多肽、水凝胶及其制备方法和用途
阅读说明：本技术 可以自组装形成ph响应载药水凝胶的多肽、水凝胶及其制备方法和用途 (Polypeptide capable of self-assembling to form PH-responsive drug-loaded hydrogel, preparation method and application thereof ) 是由 葛亮 朱颖 沈娟 于 2021-09-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了可以自组装形成PH响应载药水凝胶的多肽、水凝胶及其制备方法和用途,多肽序列为：FOVVVEF,其中,F＝苯丙氨酸,O＝鸟氨酸,V＝缬氨酸,E＝谷氨酸。通过固相合成法合成具有七个氨基酸的多肽,该多肽自组装形成包裹盐酸阿霉素的多肽水凝胶。本发明的多肽具有良好的生物相容性和生物可降解性,机械性能好,在包裹药物后可以达到缓释效果,对PH具有较高的敏感性,通过肿瘤部位原位注射方式将载药凝胶注射到肿瘤周围,该载药多肽水凝胶在酸性肿瘤微环境的刺激下,可以实现抗肿瘤药物的靶向缓释给药,提高化疗效果,提高抗肿瘤效果,降低毒副作用。(The invention discloses a polypeptide capable of self-assembling to form PH response drug-loaded hydrogel, a preparation method and application thereof, wherein the polypeptide sequence is as follows: FOVVEF, wherein F ═ phenylalanine, O ═ ornithine, V ═ valine, E ═ glutamic acid. The polypeptide with seven amino acids is synthesized by a solid phase synthesis method, and the polypeptide self-assembles to form polypeptide hydrogel wrapping the doxorubicin hydrochloride. The polypeptide has good biocompatibility and biodegradability and good mechanical property, can achieve a slow release effect after being wrapped by a medicament, has higher sensitivity to PH, and can realize targeted slow release administration of an anti-tumor medicament under the stimulation of an acid tumor microenvironment, improve the chemotherapy effect, improve the anti-tumor effect and reduce toxic and side effects by injecting the medicament-carrying gel around a tumor in an in-situ injection mode at a tumor part.)
技术领域
本发明涉及生物医药材料及其制备方法和用途，特别涉及可以自组装形成PH响应载药水凝胶的多肽、水凝胶及其制备方法和用途。
背景技术
目前治疗癌症主要有手术治疗、化疗、放疗等。其中传统的化学药物治疗存在许多的问题和不足，如代谢速度快、生物利用度差、药物吸收和分布不理想，选择性差、毒副作用大等，一直是癌症联合治疗的局限性。为了克服上述缺点，越来越多的新型载药材料被研发出来。多肽水凝胶作为一种特殊的药物载体，由于其优异的生物相容性、可控的降解性和缓控性，引起了人们的极大关注。可注射多肽水凝胶可以通过注射器或导管直接注射进入体内，作为局部和持续给药的载体，具有良好的注射性和延缓药物释放，提高治疗效果的作用。
随着研究探索的不断深入，智能响应型多肽水凝胶收到人们极大青睐。智能响应型多肽水凝胶是指在受到外界物理或化学刺激(如PH、温度、溶剂、压力、光照和离子强度)下，能够发生溶胶-凝胶转变。因此，根据肿瘤微环境特性(例如PH较低，谷胱甘肽含量较高)，设计能够在肿瘤微环境中智能响应的多肽水凝胶载体，在抗癌化学药物控制释放方面有着广阔的应用前景。
发明内容
发明目的：本发明目的是提供具有较好生物相容性、降解性、机械性能等的可以自组装形成PH响应载药水凝胶的多肽和水凝胶。
本发明的另一目的是提供所述具有较好生物相容性、降解性、机械性能等的可以自组装形成PH响应载药水凝胶的多肽和水凝胶的制备方法和用途。
技术方案：本发明提供一种可以自组装形成PH响应载药水凝胶的多肽，多肽序列为：FOVVVEF，其中，F＝苯丙氨酸，O＝鸟氨酸，V＝缬氨酸，E＝谷氨酸。
一种PH响应自组装载药多肽水凝胶的制备方法，将权利要求1所述多肽溶于去离子水中，涡旋至充分溶解，调节PH，于室温下静置成胶。
进一步地，所述成胶浓度为15-20mg/ml。所述装载药为盐酸阿霉素。所述在室温下静置时间为20min-1day。
所述的可以自组装形成PH响应载药水凝胶的多肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)将第一个氨基酸共价连接到树脂上：
称取C端第一个氨基酸(4mmol)于50mL的离心管中，加入20mL DMF将其溶解，然后加入2mL DIEA(12mmol)振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入反应器中，将反应器置于30℃的摇床中反应。然后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，抽干待用。
(2)去保护：
将上述合成的连有首个氨基酸的树脂置于反应器中，并加入30mL 20％的哌啶/DMF溶液浸没树脂，放在脱色摇床上摇晃20min，以此脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，抽干。取少量树脂用茚三酮法检测，树脂显色(蓝色或蓝紫色)，说明脱保护成功。
(3)激活和交联：
称取第二个氨基酸(4mmol)和0.541g(4mmol)HOBt于50mL的离心管中，加入25mL的DMF将其溶解，然后加入0.622mL(4mmol)DIC振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入反应器中，将反应器置于30℃的摇床中反应。1h后，取少量树脂用茚三酮法检测，若树脂为无色，说明反应完全；若树脂显色，说明缩合不完全，继续反应。采用活化剂HBTU和HOBt活化下一个氨基上的羧基，与树脂上的氨基交联，形成肽键；
(4)重复(2)和(3)，反复循环添加单体氨基酸，按照FOVVVEF序列的顺序从右到左合成，直到合成完成；
(5)乙酰化：
采用碱性溶剂20％哌啶去除氨基上的Fmoc，暴露出氨基，加入2ml20％乙酸酐和200微升DIEA，反应30min。
(6)洗脱和脱保护：
将上述合成的多肽树脂于反应器中加入95切割液(TFA/TIS/EDT/H2O＝95/2/2/1)(每1g树脂加10mL切割液)，于0℃振荡反应0.5h，逐渐升温至室温，在室温下反应2h，抽滤除去树脂，用少量裂解液洗涤树脂，将冲洗液与裂解液合并，倒入装有冰乙醚的离心管中，待沉淀析出后用冷冻离心机于4℃，7000rmp下离心5min，除去上清液，重复上述步骤，离心沉降四次，得到多肽粗品。将所得粗品用HPLC分析纯化，冻干保存。
所述的可以自组装形成PH响应载药水凝胶在制备载抗癌药水凝胶中的用途。
有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优势：
1、本发明的多肽，多肽序列长度短，合成简单，多肽水凝胶制备方便。
2、本发明的多肽具有良好的生物相容性和生物可降解性，机械性能好，在包裹药物后可以达到缓释效果，是具有潜力的药物递送载体。
3、本发明提供的PH响应多肽水凝胶，对PH具有较高的敏感性，通过肿瘤部位原位注射方式将载药凝胶注射到肿瘤周围，该载药多肽水凝胶在酸性肿瘤微环境的刺激下，可以实现抗肿瘤药物的靶向缓释给药，提高化疗效果，延长治疗时间，减少抗肿瘤药物对正常组织的毒副作用。
附图说明
图1为载药水凝胶不同载药浓度不同PH下的累积释放图；
图2为FOVVVEF序列肽水凝胶CD光谱图；
图3为PH＝5.8FOVVVEF透射电镜图；
图4为PH＝7.4FOVVVEF透射电镜图。
具体实施方式
实施例1(请将下列原辅料的具体用量补充上)
本发明所述的多肽合成方法为常规的固相合成法，即以不溶性树脂作为固相载体，将多肽链的C末端固定在树脂上，从C端到N端依次缩合氨基酸延长多肽链的方法。
1.多肽合成步骤
第一步，将第一个氨基酸共价连接到树脂上
称取2g 2-CTC树脂(取代度0.9mmol/g)至150mL的反应器中，用50mLDCM浸泡2h使其溶胀，然后用3倍树脂体积的DMF洗涤树脂，抽干，如此重复四次，将树脂抽干备用。称取C端第一个氨基酸(4mmol)于50mL的离心管中，加入20mL DMF将其溶解，然后加入2mL DIEA(12mmol)振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入反应器中，将反应器置于30℃的摇床中反应。2h后加入2mL甲醇继续反应0.5h进行封端，抽掉反应液后，用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，抽干待用
加入缩合剂HBTU和HOBt，使被保护氨基酸羧基端与树脂形成共脂以完成氨基酸的固定；
第二步，去保护
采用碱性溶剂20％哌啶去除氨基上的Fmoc，暴露出氨基；
第三步，激活和交联
采用活化剂HBTU和HOBt活化下一个氨基上的羧基，与树脂上的氨基交联，形成肽键；
第四步，重复第二步和第三步，反复循环添加单体氨基酸，按照FOVVVEF序列的顺序从右到左合成，直到合成完成。
第五步，乙酰化
采用碱性溶剂20％哌啶去除氨基上的Fmoc，暴露出氨基，加入2ml20％乙酸酐和200微升DIEA，反应30min；
第六步，洗脱和脱保护
采用脱保护剂三氟乙酸(TFA)将肽链从树脂上洗脱下来，并脱除保护基，HPLC分析纯化，冻干保存。
2.自组装多肽水凝胶制备方法
将合成的多肽溶于去离子水中，涡旋至充分溶解后形成浓度为20mg/ml的多肽溶液，用浓度为0.5M NaOH溶液调节PH，于室温下静置20min，形成PH响应型自组装多肽水凝胶。实施例2
多肽的合成方法同实施例1。将合成的多肽溶于去离子水中，涡旋至充分溶解后得到多肽浓度为10mg/ml的多肽溶液，用0.5M NaOH溶液调节多肽溶液PH7.4，于室温下静置20min成胶。
实施例3
多肽的合成方法同实施例1。将合成的多肽溶于去离子水中，涡旋至充分溶解后得到多肽浓度为15mg/ml的多肽溶液，用0.5M NaOH溶液调节多肽溶液PH7.4，于室温下静置20min成胶。
实施例4
多肽的合成方法同实施例1。将合成的多肽溶于去离子水中，涡旋至充分溶解后得到多肽浓度为20mg/ml的多肽溶液，用0.5M的NaOH溶液调节多肽溶液PH7.4，于室温下静置20min成胶。
对比实施例
对比实施例2-4在不同多肽浓度下制备的PH响应型多肽水凝胶，如表1所示。
表1不同多肽浓度下制备的PH响应型多肽水凝胶
表1中表示多肽浓度对其成胶性能具有较大影响。该多肽成胶的浓度范围为15-30mg/ml，在此浓度范围内，多肽溶液浓度越高，所需成胶时间越短，但当多肽浓度高达30mg/ml时，形成的水凝胶呈混浊状态，说明在该浓度下，多肽浓度过高，部分多肽粉末无法完全溶解。因此综合成胶时间和成胶效果考虑，我们选择多肽浓度为20mg/ml，该浓度下成胶时间较短，且形成透明澄清的凝胶。
实施例5
多肽的合成方法为实例1，多肽浓度为实施例4，选用盐酸阿霉素作为多肽水凝胶的装载药物，将合成的多肽分别溶于1mg/ml的盐酸阿霉素溶液，涡旋至充分溶解，得到多肽浓度为20mg/ml载药多肽溶液，用0.5M的NaOH调节多肽溶液PH至7.4，于室温下静置20min，形成PH响应载药多肽水凝胶。
在载DOX水凝胶中加入1ml浓度为10mM的PBS溶液(PH分别为7.4和5.8)置于37℃摇床中，转速为120rpm，在特定的时间点取出释放介质用于药物含量测试，并补加相同体积的新鲜释放介质。
实施例6
多肽的合成方法为实例1，多肽浓度为实施例4，选用盐酸阿霉素作为多肽水凝胶的装载药物，将合成的多肽分别溶于2mg/ml的盐酸阿霉素溶液，涡旋至充分溶解，得到多肽浓度为20mg/ml载药多肽溶液，用0.5M的NaOH调节多肽溶液PH至7.4，于室温下静置20min，形成PH响应载药多肽水凝胶。
在载DOX水凝胶中加入1ml浓度为10mM的PBS溶液(PH分别为7.4和5.8)置于37℃摇床中，转速为120rpm，在特定的时间点取出释放介质用于药物含量测试，并补加相同体积的新鲜释放介质。
对比实施例
对比实施例5-6，比较不同药物浓度在PH响应自组装水凝胶中的释放行为，如图1所示。
在PH为5.8时，阿霉素浓度为2mg/ml载药水凝胶释药量远远大于阿霉素浓度为1mg/ml载药水凝胶的释药量；在PH为7.4时，阿霉素浓度为2mg/ml的载药水凝胶和阿霉素浓度为1mg/ml的载药水凝胶的释药量无明显差距。可见在PH为5.8时，多肽水凝胶的凝胶结构被破坏，转变为溶胶状态，使原来被包封的药物更容易释放出来，因此，载药水凝胶的阿霉素浓度越高的释药量越高。而在PH＝7.4时，多肽水凝胶为凝胶状态，对药物具有较好的包封作用，即使水凝胶载药浓度不同，释药量仍然无明显差距。结果表明，该自组装载药多肽水凝胶具有良好的PH响应性，作为抗肿瘤药物的载体，具有广阔的应用前景。
实施例7
用圆二色谱对实施例1中合成的多肽进行二级结构表征，具体实验步骤如下：
(1)配制浓度为0.1mg/ml的多肽溶液；
(2)分别调节多肽溶液的PH为7.4和5.8；
(3)将15uL样品放入0.1cm石英比色皿；
(4)将石英比色皿置于圆二色谱仪中，设置扫描波长范围为190nm～260nm，带宽为1nm，响应时间1s，扫描速度为100nm/min，温度25℃；
(5)扫描后，将数据转出并作图。
其中圆二色谱图检测结果如图2所示。在中性条件下，该多肽呈现B折叠结构特有的单负峰形；而在酸性条件下，呈无规则卷曲构象的色谱特点，即在波长较短的地方出负峰，说明该多肽能够在中性条件下发生β-折叠从而形成稳定的水凝胶，在酸性条件下多肽二级结构发生改变，β-折叠和无规则卷曲结构共存，从宏观上看，短肽即从纤维网络水凝胶状态向溶液状态转变。说明该多肽具有良好的PH响应性。
实施例8
用透射电镜对实施例1中的多肽进行微观形态表征，具体实验步骤如下：
(1)配制浓度为20mg/ml的多肽水凝胶，分别调节PH为7.4和5.8；
(2)将上述多肽水凝胶用不同PH的超纯水稀释10倍；
(3)吸取一滴多肽溶液轻轻滴至碳涂层铜网表面，1min后用滤纸移去多余液体，在室温下干燥3-5min；
(4)滴加适量磷钨酸溶液染色3-5min，将铜网移至红外灯下干燥；
(5)通过透射电镜观察不同PH条件下的多肽微观形态。
其中透射电镜检测结果如图3所示。当PH为5.8时，稀释的肽水凝胶的透射电子显微镜成像图显示肽段松散分布，形态为条状细长型，略带蜷曲，直径约50nm以内，长度在0.5μm-1.5μm之间(图3)。当PH为7.4时，稀释的肽水凝胶结构为聚集的直棒状，交织扎堆层叠。条带直径200nm-600nm，长度2μm-7μm不等(图4)。多肽水凝胶在不同酸碱度下的微观形态差异明显，显示出明显的PH敏感性。根据TEM所得图像初步判断FOVVVEF肽段以β片层结构为主。
实施例9
多肽的合成方法同实施例1。选用盐酸阿霉素作为多肽水凝胶的装载药物，将合成的多肽溶于1mg/ml的盐酸阿霉素溶液，涡旋至溶解后形成浓度为20mg/ml的多肽溶液，以0.5M的NaOH调节多肽溶液的PH值至7.4，于室温下静置20min形成PH响应多肽水凝胶。
用PH7.4的PBS缓冲液轻轻润洗凝胶表面2次，收集润洗液用紫外分光光度计测试药物含量，从而计算载药凝胶的包封率(EE)，计算公式如下：
表3-2包封率测定
(标曲：A＝0.0178X+0.0047)
当载药浓度为1mg/ml和2mg/ml时，该多肽水凝胶的包封率均在98％以上，说明具有良好的包封性。
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