阅读说明：本技术 包括pd-l1抗原结合位点的fc结合片段 (FC-binding fragments comprising the PD-L1 antigen-binding site ) 是由 密里班·图纳 弗朗西斯卡·沃尔顿·范·霍克 瑞安·菲勒 穆斯塔法·法鲁迪 弗雷德里克·阿克勒 于 2018-12-19 设计创作，主要内容包括：本申请涉及特异性结合元件,其结合至程序性死亡配体(PD-L1)。该特异性结合元件优选包括位于特异性结合元件的恒定结构域的结构环中的PD-L1抗原结合位点。该特异性结合元件例如在癌症、以及感染性疾病、炎症、与炎症相关联的疾病和病症、及炎性疾病的治疗中获得应用。(The present application relates to a specific binding member that binds to programmed death ligand (PD-L1). The specific binding member preferably includes a PD-L1 antigen binding site located in a structural loop of the constant domain of the specific binding member. The specific binding members find use, for example, in the treatment of cancer, as well as infectious diseases, inflammation, diseases and disorders associated with inflammation, and inflammatory diseases.)

包括PD-L1抗原结合位点的FC结合片段

技术领域

本发明涉及一种结合到程序性死亡配体1(PD-L1)的特异性结合元件(specificbinding member)。所述特异性结合元件优选包括PD-L1抗原结合位点，所述PD-L1抗原结合位点位于所述特异性结合元件的恒定结构域的结构环中。本发明的特异性结合元件例如在癌症、以及感染性疾病和炎症的治疗中获得应用。

背景技术

程序性细胞死亡1(programmed cell death 1,PD-1)和它的配体PD-L1(CD274，B7-H1)和PD-L2(B7-DC)传递抑制性信号，该抑制性信号调节T细胞活化、耐受和免疫病理之间的平衡。PD-L1在多种免疫细胞类型和某些肿瘤细胞上结构性(constitutively)表达或瞬时表达。

PD-L1是I型跨膜蛋白，具有两个处于胞外区内的Ig-样结构域、跨膜结构域和短胞质结构域(short cytoplasmic domain)。完整的人PD-L1序列可以在通用蛋白质资源数据库(UniProt)登记号Q9NZQ7号下找到。胞质结构域不具有已知的信号转导基序(signaltransduction motif)，表明在该配体与它的受体的相互作用上没有PD-L1的信号传递。人PD-L1的分子重量为40kDa(290个氨基酸)，并且人PD-L1与PD-L1的鼠和食蟹猴(cynomolgus)同源序列分别共享70％和93％的氨基酸同一性。

人PD-L1以770nM的亲和性(K_D)结合至它的受体PD-1。PD-1在活化的T细胞、B细胞和骨髓细胞上表达，并调节细胞免疫应答的活化或抑制。PD-L1与PD-1的结合传递抑制性信号，降低细胞因子产生和T细胞的增殖。因此，细胞的PD-L1表达可以介导针对细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)杀伤的保护，并且细胞的PD-L1表达是一种在病毒感染期间抑制慢性免疫应答的调节机制。癌症作为慢性和促炎性(proinflammatory)疾病通过PD-L1表达的上调破坏这种免疫保护性途径，以逃避宿主免疫应答。在主动免疫应答的情镜下，IFNγ也上调PD-L1的表达。

PD-L1还通过与另一种蛋白质B7.1(也称为CD80)的相互作用来介导免疫抑制，阻断它通过CD28传递T细胞上的次级活化信号之一的能力。

已经显示了在各种各样的实体肿瘤(solid tumours)中的PD-L1表达。在跨越来自不同位点的19个肿瘤的一项研究中检查的654份样品中，14％的样品是PD-L1阳性的。最高的PD-L1阳性频率在头颈(31％)、宫颈(29％)、原发性未知的癌症(cancer of unknownprimary origin，CUP；28％)、多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM；25％)、膀胱癌(21％)、食道癌(20％)、三阴性(TN)乳腺癌(18％)和肝癌(15％)中观察到(Grosso等,2013)。已经表明，PD-L1的肿瘤相关表达赋予免疫抗性并潜在地保护肿瘤细胞免于T细胞介导的细胞凋亡。

在鼠体内研究中，靶向PD-L1的治疗已经显示了极好的结果。在黑素瘤的B16鼠模型中，在该研究结束时，与GVAX或FVAX疫苗接种策略联合的使用抗PD-L1的治疗，对于存活(对照组为30天，相对地，PD-L1治疗组为52天)和无肿瘤动物百分比(5％)都产生了显著的影响(Curran等,2010)。抗PD-L1疗法也已经用于研究P815鼠乳腺瘤(mastoma)模型中免疫抑制的机制。被注射到小鼠中的P815细胞通常触发强烈的免疫应答，这导致它们的排斥(rejection)。当PD-L1在P815细胞上表达时，这些细胞逃避免疫攻击，反过来，可以通过抗PD-L1抗体的施用使该免疫攻击无效(negate)(Iwai等，2002)。显然，在免疫原性的人类癌症中靶向PD-1/PD-L1轴(axis)(Herbst等,2014)通过抗癌免疫应答的刺激而产生生存优势(Wolchok等,2013；Larkin等,2015)。

临床试验已经表明靶向患者中PD-L1的临床益处，导致迄今为止三种抗PD-L1靶向单克隆抗体(anti-PD-L1 targeting monoclonal antibody)的批准。

阿特朱单抗(Atezolizumab)(Tecentriq^TM)是结合至PD-L1的人源化IgG1抗体。它在临床试验中作为单一疗法(monotherapy)并且还与其他生物疗法和/或小分子疗法相组合用于实体癌症的治疗，包括结直肠癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌和肾细胞癌。

阿维鲁单抗(Avelumab)(Bavencio^TM)是一种结合至PD-L1的全人IgG1抗体，并且正在许多癌症中进行临床测试，这些癌症包括膀胱癌、胃癌、头颈癌、间皮瘤(mesothelioma)、非小细胞肺癌、卵巢癌、肾癌、默克尔(Merkel)细胞癌和转移性尿路上皮癌(urothelialcarcinoma,UC)。

度伐鲁单抗(Durvalumab，Imfinzi^TM)是一种结合至PD-L1的人IgG1抗体，并且正在单独或与曲美母单抗(tremelimumab)联合地在头颈部鳞状细胞癌(squamous cellcarcinoma of the head and neck)、膀胱癌、胰腺癌的临床试验中进行测试，并与其他生物分子和小分子联合地在其他实体癌症中进行临床测试，这些实体癌症例如胃癌、黑素瘤和不可切除的肝细胞癌。

度伐鲁单抗已经被批准用于治疗患有局部晚期或转移性尿路上皮癌和不可切除的三期非小细胞肺癌(NSCLC)的患者。

更多抗PD-L1抗体，包括BMS-936559(NCT00729664)，已经在临床试验中进行了测试，并且其他抗体处于临床前的测试中。

感染性疾病显示出与肿瘤学的许多相似之处(parallel)。认为可以利用PD-L1在免疫调节中的作用来最大化针对病原体的免疫应答。感染性疾病中的免疫调节是医学的新兴领域，并且早期的论述表明PD-L1阻滞(blockade)可能会改进对感染的生物应答，特别是有助于抵消T细胞的衰竭、管理免疫介导的间隙、并且产生长期免疫(Wykes,M.N.和Lewin,S.R.,2018)。

此外，近期的研究也表明PD-1/PD-L1途径可以是一种治疗靶标(therapeutictarget)，用于治疗炎症、与炎症相关联的疾病和病症、诸如中风和中风相关炎症的炎性疾病(Bodhankar等,2015)、以及血管炎症(vascular inflammation)或血管炎(vasculitis)，例如中/大血管炎、或中央和/或周围神经系统的血管炎(Hid Cadena等,2018和Daxini等,2018)。

虽然正在开发各种抗PD-L1治疗剂，但目前的数据显示，使用现有抗PD-L1单一疗法的整体治疗在不到50％的癌症患者中导致应答。在临床测试中，报告的不良反应的范围(spectrum)和严重性在抗体之间有所不同。为了增加目标应答速率(objective responserate,ORR)，和/或力求降低副作用，抗PD-L1抗体可以与其他生物制剂联合，诸如针对其他检查点调节剂的抗体；以及与小分子疗法和其他免疫系统活化方法联合，诸如肿瘤疫苗。

因此，本领域仍然需要可以靶向PD-L1并且在癌症疗法中获得应用的其他分子。

另外，本领域仍然还需要可以靶向PD-L1并且在感染性疾病的治疗中获得应用的其他分子。

此外，本领域仍然还需要可以靶向PD-L1并且在炎症、与炎症相关联的疾病和病症、以及炎性疾病的治疗中获得应用的其他分子。

发明内容

本发明人已经制备了大量特异性结合元件，其在特异性结合元件的CH3结构域中包括针对PD-L1的非天然(non-native)结合位点。通过天然

CH3结构域噬菌体文库(phage library)的初始筛选(initial screen)，然后通过诱变(mutagenesis)、筛选和选择的迭代轮次(iterative round)的复杂程序，对这些特异性结合元件进行分离，从而分离具有改进的针对PD-L1的活性和亲和性的初选的特异性结合元件的变体。

本发明人发现，在天然CH3结构域噬菌体文库的初始筛选之后、从初始亲和性成熟程序识别的特异性结合元件，显示出增加的针对PD-L1的亲和性，以及增加的PD-L1和其配体PD-1之间相互作用的阻断(blocking)。然而，所选择的特异性结合元件意外地在T细胞活化试验中具有非常弱的活性。

在额外轮次的诱变、筛选和选择之后，发明人识别出特异性结合元件，该特异性结合元件不仅具有针对PD-L1的高亲和性，而且在T细胞活化试验中具有优异的活性。这些特异性结合元件出人意料地包括CH3结构域，该CH3结构域在AB结构环序列中具有缺失(位于AB结构环的残基14、15或16处)。该缺失被认为是由偶然截短的诱变引物导致的人为现象(artefact)。在它们的结构环区域中包括这样的缺失的特异性结合元件通常在选择过程中被去除，因为缺失很少导致保留抗原结合活性的特异性结合元件。然而，由于本发明人采用的诱变方法的特定序列，因此在AB环的诱变之后未识别出的该截短的AB环序列被认为已经作为稀有克隆或较低亲和性结合物(binder)而存在于选择的输出池(output pool)中。当该截短的AB结构环序列与其他结构环改组(shuffle)时，该截短的AB结构环序列变为占主导地位的(dominant)AB结构环序列，表明这种缺失对结构环序列改组后的特异性结合元件的抗原结合活性和/或结构有重要贡献。如果本发明人采用了更直接的改组方法，其中从AB结构环选择识别出的最有希望的序列与来自CD结构环选择的最有希望的序列组合，那么在它们的AB结构环中包括这样的缺失的特异性结合元件将不会被识别出。本发明人发现，在AB结构环中恢复缺失的残基意外地导致所得的特异性结合元件针对PD-L1的亲和性显著降低，证明了AB环中的缺失对于结合至PD-L1是重要的。

为了去除潜在的制造序列不利因素(manufacturing sequence liability)并改进选择的特异性结合元件的生物物理学性能，本发明人执行了更多轮次的诱变、筛选和选择。

上述方法允许本发明人识别出大量的特异性结合元件，该特异性结合元件在其CH3结构域中包括针对PD-L1的结合位点，并显示出至PD-L1的优异结合，并且该特异性结合元件显示出或预计在T细胞活化试验中具有高亲和性。基于这些性能，预计本发明的特异性结合元件将通过PD-L1的抑制而在人类癌症、以及感染性疾病、炎症、与炎症相关联的疾病和病症、和炎性疾病的治疗中获得应用。

特异性结合元件也显示出具有针对食蟹猴PD-L1的高亲和性，其与针对人PD-L1的亲和性相当、并且预计可用于食蟹猴疾病模型中特异性结合元件的性能评估。这一点的理由是，与在食蟹猴模型中测试对人和食蟹猴PD-L1的亲和性有更高变异性的特异性结合元件时相比，所获得的结果更有可能预示着对人类患者中的特异性结合元件的影响。

因此，在本发明的第一方面中，提供了一种结合至PD-L1的特异性结合元件，并且所述特异性结合元件包括位于恒定结构域中的PD-L1抗原结合位点，诸如CL、CH1、CH2或CH3结构域，优选CH1、CH2或CH3结构域，最优选特异性结合元件的CH3结构域。

本发明的特异性结合元件的PD-L1结合位点优选包括：

(i)第一序列，其位于CH3结构域的位置14-18的AB结构环中，其中，所述特异性结合元件包括CH3结构域的位置14、15或16处的氨基酸缺失，并且其中，所述第一序列由以下构成：

(a)氨基酸序列SGYW(SEQ ID NO：23)，或者

(b)SEQ ID NO：23的变体，其中

丝氨酸(S)由氨基酸A、E、F、G、H、I、L、P、R、T、V或Y取代，和/或

甘氨酸(G)由氨基酸A、D、E、F、H、K、L、N、P、R、T、V或Y取代；

(ii)第二序列，其位于CH3结构域的位置45.1-78处的CD结构环中，其中，所述第二序列由以下构成：

(a)氨基酸序列EPQYWA(SEQ ID NO：11)，或者

(b)SEQ ID NO：11的变体，其中

谷氨酸(E)由氨基酸A、G、H、I、L、N、Q、R、S或W取代，和/或

脯氨酸(P)由氨基酸A、D、E、G、H、N、Q、W或Y取代，和/或

谷氨酰胺(Q)由氨基酸H或N取代，和/或

酪氨酸(Y)由氨基酸A、D、H、T或V取代，和/或

丙氨酸(A)由氨基酸D、E、G、L、R、S或W取代；以及

(iii)第三序列，其位于CH3结构域的位置92-100处的EF结构环中，其中，所述第三序列由以下构成：

(a)氨基酸序列SNWRWQMDD(SEQ ID NO：19)，或者

(b)SEQ ID NO：19的变体，其中

位置92处的丝氨酸(S)由氨基酸A或G取代，和/或

位置93处的天冬酰胺(N)由氨基酸A、E、F、G、H、I、K、L、Q、R、S、T或Y取代，和/或

位置97处的谷氨酰胺(Q)由氨基酸A、D、E、F、G、H、K、L、N、R、S或V取代，和/或

位置98处的甲硫氨酸(M)由氨基酸F、I、L、V、W或Y取代，和/或

位置99处的天冬氨酸(D)由氨基酸E、A、I、L、R、S、T、V、W或Y取代，和/或

位置100处的天冬氨酸(D)由氨基酸A、E、F、I、K、L、N、R、V、W或Y取代；并且

其中，CH3结构域的位置101处的氨基酸为缬氨酸(V)或不存在；

其中，氨基酸残基编号根据国际免疫遗传学数据库(ImMunoGeneTics(IMGT))编号方案。

因此，本发明提供了：

[1]一种特异性结合元件，其结合至PD-L1，所述特异性结合元件包括位于所述特异性结合元件的CH3结构域中的PD-L1抗原结合位点，其中，所述PD-L1结合位点包括：

(i)第一序列，其位于所述CH3结构域的位置14-18处的AB结构环中，其中，所述特异性结合元件包括所述CH3结构域的位置14、15或16处的氨基酸缺失，

(ii)第二序列，其位于所述CH3结构域的位置45.1-78处的CD结构环中，以及

(iii)第三序列，其位于所述CH3结构域的位置92-100处的EF结构环中。

[2]根据[1]所述的特异性结合元件，其中，所述第一序列由氨基酸序列SGYW(SEQID NO：23)或其变体构成。

[3]根据[1]或[2]所述的特异性结合元件，其中，所述第二序列由氨基酸序列EPQYWA(SEQ ID NO：11)或其变体构成。

[4]根据[1]-[3]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由氨基酸序列SNWRWQMDD(SEQ ID NO：19)或其变体构成。

[5]根据[1]-[4]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第一序列由SEQ IDNO：23的变体构成，在该变体中丝氨酸(S)由氨基酸A取代。

[6]根据[1]-[4]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第一序列由SEQ IDNO：23的变体构成，在该变体中丝氨酸(S)由氨基酸E取代。

[7]根据[1]-[4]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第一序列由SEQ IDNO：23的变体构成，在该变体中丝氨酸(S)由氨基酸F取代。

[8]根据[1]-[4]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第一序列由SEQ IDNO：23的变体构成，在该变体中丝氨酸(S)由氨基酸G取代。

[9]根据[1]-[4]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第一序列由SEQ IDNO：23的变体构成，在该变体中丝氨酸(S)由氨基酸H取代。

[10]根据[1]-[4]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第一序列由SEQ IDNO：23的变体构成，在该变体中丝氨酸(S)由氨基酸I取代。

[11]根据[1]-[4]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第一序列由SEQ IDNO：23的变体构成，在该变体中丝氨酸(S)由氨基酸L取代。

[12]根据[1]-[4]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第一序列由SEQ IDNO：23的变体构成，在该变体中丝氨酸(S)由氨基酸P取代。

[13]根据[1]-[4]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第一序列由SEQ IDNO：23的变体构成，在该变体中丝氨酸(S)由氨基酸R取代。

[14]根据[1]-[4]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第一序列由SEQ IDNO：23的变体构成，在该变体中丝氨酸(S)由氨基酸T取代。

[15]根据[1]-[4]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第一序列由SEQ IDNO：23的变体构成，在该变体中丝氨酸(S)由氨基酸V取代。

[16]根据[1]-[4]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第一序列由SEQ IDNO：23的变体构成，在该变体中丝氨酸(S)由氨基酸Y取代。

[17]根据[1]-[16]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第一序列由SEQID NO：23的变体构成，在该变体中甘氨酸(G)由氨基酸A取代。

[18]根据[1]-[16]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第一序列由SEQID NO：23的变体构成，在该变体中甘氨酸(G)由氨基酸D取代。

[19]根据[1]-[16]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第一序列由SEQID NO：23的变体构成，在该变体中甘氨酸(G)由氨基酸E取代。

[20]根据[1]-[16]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第一序列由SEQID NO：23的变体构成，在该变体中甘氨酸(G)由氨基酸F取代。

[21]根据[1]-[16]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第一序列由SEQID NO：23的变体构成，在该变体中甘氨酸(G)由氨基酸H取代。

[22]根据[1]-[16]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第一序列由SEQID NO：23的变体构成，在该变体中甘氨酸(G)由氨基酸K取代。

[23]根据[1]-[16]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第一序列由SEQID NO：23的变体构成，在该变体中甘氨酸(G)由氨基酸L取代。

[24]根据[1]-[16]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第一序列由SEQID NO：23的变体构成，在该变体中甘氨酸(G)由氨基酸N取代。

[25]根据[1]-[16]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第一序列由SEQID NO：23的变体构成，在该变体中甘氨酸(G)由氨基酸P取代。

[26]根据[1]-[16]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第一序列由SEQID NO：23的变体构成，在该变体中甘氨酸(G)由氨基酸R取代。

[27]根据[1]-[16]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第一序列由SEQID NO：23的变体构成，在该变体中甘氨酸(G)由氨基酸T取代。

[28]根据[1]-[16]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第一序列由SEQID NO：23的变体构成，在该变体中甘氨酸(G)由氨基酸V取代。

[29]根据[1]-[16]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第一序列由SEQID NO：23的变体构成，在该变体中甘氨酸(G)由氨基酸Y取代。

[30]根据[1]-[29]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第二序列由SEQID NO：11的变体构成，在该变体中谷氨酸(E)由氨基酸A取代。

[31]根据[1]-[29]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第二序列由SEQID NO：11的变体构成，在该变体中谷氨酸(E)由氨基酸G取代。

[32]根据[1]-[29]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第二序列由SEQID NO：11的变体构成，在该变体中谷氨酸(E)由氨基酸H取代。

[33]根据[1]-[29]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第二序列由SEQID NO：11的变体构成，在该变体中谷氨酸(E)由氨基酸I取代。

[34]根据[1]-[29]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第二序列由SEQID NO：11的变体构成，在该变体中谷氨酸(E)由氨基酸L取代。

[35]根据[1]-[29]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第二序列由SEQID NO：11的变体构成，在该变体中谷氨酸(E)由氨基酸N取代。

[36]根据[1]-[29]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第二序列由SEQID NO：11的变体构成，在该变体中谷氨酸(E)由氨基酸Q取代。

[37]根据[1]-[29]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第二序列由SEQID NO：11的变体构成，在该变体中谷氨酸(E)由氨基酸R取代。

[38]根据[1]-[29]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第二序列由SEQID NO：11的变体构成，在该变体中谷氨酸(E)由氨基酸S取代。

[39]根据[1]-[29]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第二序列由SEQID NO：11的变体构成，在该变体中谷氨酸(E)由氨基酸W取代。

[40]根据[1]-[39]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第二序列由SEQID NO：11的变体构成，在该变体中脯氨酸(P)由氨基酸A取代。

[41]根据[1]-[39]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第二序列由SEQID NO：11的变体构成，在该变体中脯氨酸(P)由氨基酸D取代。

[42]根据[1]-[39]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第二序列由SEQID NO：11的变体构成，在该变体中脯氨酸(P)由氨基酸E取代。

[43]根据[1]-[39]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第二序列由SEQID NO：11的变体构成，在该变体中脯氨酸(P)由氨基酸G取代。

[44]根据[1]-[39]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第二序列由SEQID NO：11的变体构成，在该变体中脯氨酸(P)由氨基酸H取代。

[45]根据[1]-[39]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第二序列由SEQID NO：11的变体构成，在该变体中脯氨酸(P)由氨基酸N取代。

[46]根据[1]-[39]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第二序列由SEQID NO：11的变体构成，在该变体中脯氨酸(P)由氨基酸Q取代。

[47]根据[1]-[39]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第二序列由SEQID NO：11的变体构成，在该变体中脯氨酸(P)由氨基酸W取代。

[48]根据[1]-[39]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第二序列由SEQID NO：11的变体构成，在该变体中脯氨酸(P)由氨基酸Y取代。

[49]根据[1]-[48]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第二序列由SEQID NO：11的变体构成，在该变体中谷氨酰胺(Q)由氨基酸H取代。

[50]根据[1]-[48]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第二序列由SEQID NO：11的变体构成，在该变体中谷氨酰胺(Q)由氨基酸N取代。

[51]根据[1]-[50]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第二序列由SEQID NO：11的变体构成，在该变体中酪氨酸(Y)由氨基酸A取代。

[52]根据[1]-[50]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第二序列由SEQID NO：11的变体构成，在该变体中酪氨酸(Y)由氨基酸D取代。

[53]根据[1]-[50]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第二序列由SEQID NO：11的变体构成，在该变体中酪氨酸(Y)由氨基酸H取代。

[54]根据[1]-[50]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第二序列由SEQID NO：11的变体构成，在该变体中酪氨酸(Y)由氨基酸T取代。

[55]根据[1]-[50]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第二序列由SEQID NO：11的变体构成，在该变体中酪氨酸(Y)由氨基酸V取代。

[56]根据[1]-[55]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第二序列由SEQID NO：11的变体构成，在该变体中丙氨酸(A)由氨基酸D取代。

[57]根据[1]-[55]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第二序列由SEQID NO：11的变体构成，在该变体中丙氨酸(A)由氨基酸E取代。

[58]根据[1]-[55]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第二序列由SEQID NO：11的变体构成，在该变体中丙氨酸(A)由氨基酸G取代。

[59]根据[1]-[55]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第二序列由SEQID NO：11的变体构成，在该变体中丙氨酸(A)由氨基酸L取代。

[60]根据[1]-[55]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第二序列由SEQID NO：11的变体构成，在该变体中丙氨酸(A)由氨基酸R取代。

[61]根据[1]-[55]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第二序列由SEQID NO：11的变体构成，在该变体中丙氨酸(A)由氨基酸S取代。

[62]根据[1]-[55]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第二序列由SEQID NO：11的变体构成，在该变体中丙氨酸(A)由氨基酸W取代。

[63]根据[1]-[62]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置92处的丝氨酸(S)由氨基酸A取代。

[64]根据[1]-[62]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置92处的丝氨酸(S)由氨基酸G取代。

[65]根据[1]-[64]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置93处的天冬酰胺(N)由氨基酸A取代。

[66]根据[1]-[64]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置93处的天冬酰胺(N)由氨基酸E取代。

[67]根据[1]-[64]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置93处的天冬酰胺(N)由氨基酸F取代。

[68]根据[1]-[64]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置93处的天冬酰胺(N)由氨基酸G取代。

[69]根据[1]-[64]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置93处的天冬酰胺(N)由氨基酸H取代。

[70]根据[1]-[64]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置93处的天冬酰胺(N)由氨基酸I取代。

[71]根据[1]-[64]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置93处的天冬酰胺(N)由氨基酸K取代。

[72]根据[1]-[64]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置93处的天冬酰胺(N)由氨基酸L取代。

[73]根据[1]-[64]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置93处的天冬酰胺(N)由氨基酸Q取代。

[74]根据[1]-[64]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置93处的天冬酰胺(N)由氨基酸R取代。

[75]根据[1]-[64]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置93处的天冬酰胺(N)由氨基酸S取代。

[76]根据[1]-[64]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置93处的天冬酰胺(N)由氨基酸T取代。

[77]根据[1]-[64]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置93处的天冬酰胺(N)由氨基酸Y取代。

[78]根据[1]-[77]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置97处的谷氨酰胺(Q)由氨基酸A取代。

[79]根据[1]-[77]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置97处的谷氨酰胺(Q)由氨基酸D取代。

[80]根据[1]-[77]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置97处的谷氨酰胺(Q)由氨基酸E取代。

[81]根据[1]-[77]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置97处的谷氨酰胺(Q)由氨基酸F取代。

[82]根据[1]-[77]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置97处的谷氨酰胺(Q)由氨基酸G取代。

[83]根据[1]-[77]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置97处的谷氨酰胺(Q)由氨基酸H取代。

[84]根据[1]-[77]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置97处的谷氨酰胺(Q)由氨基酸K取代。

[85]根据[1]-[77]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置97处的谷氨酰胺(Q)由氨基酸L取代。

[86]根据[1]-[77]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置97处的谷氨酰胺(Q)由氨基酸N取代。

[87]根据[1]-[77]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置97处的谷氨酰胺(Q)由氨基酸R取代。

[88]根据[1]-[77]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置97处的谷氨酰胺(Q)由氨基酸S取代。

[89]根据[1]-[77]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置97处的谷氨酰胺(Q)由氨基酸V取代。

[90]根据[1]-[89]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置98处的甲硫氨酸(M)由氨基酸F取代。

[91]根据[1]-[89]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置98处的甲硫氨酸(M)由氨基酸I取代。

[92]根据[1]-[89]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置98处的甲硫氨酸(M)由氨基酸L取代。

[93]根据[1]-[89]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置98处的甲硫氨酸(M)由氨基酸V取代。

[94]根据[1]-[89]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置98处的甲硫氨酸(M)由氨基酸W取代。

[95]根据[1]-[89]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置98处的甲硫氨酸(M)由氨基酸Y取代。

[96]根据[1]-[95]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置99处的天冬氨酸(D)由氨基酸E取代。

[97]根据[1]-[95]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置99处的天冬氨酸(D)由氨基酸A取代。

[98]根据[1]-[95]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置99处的天冬氨酸(D)由氨基酸I取代。

[99]根据[1]-[95]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置99处的天冬氨酸(D)由氨基酸L取代。

[100]根据[1]-[95]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置99处的天冬氨酸(D)由氨基酸R取代。

[101]根据[1]-[95]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置99处的天冬氨酸(D)由氨基酸S取代。

[102]根据[1]-[95]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置99处的天冬氨酸(D)由氨基酸T取代。

[103]根据[1]-[95]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置99处的天冬氨酸(D)由氨基酸V取代。

[104]根据[1]-[95]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置99处的天冬氨酸(D)由氨基酸W取代。

[105]根据[1]-[95]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置99处的天冬氨酸(D)由氨基酸Y取代。

[106]根据[1]-[105]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置100处的天冬氨酸(D)由氨基酸A取代。

[107]根据[1]-[105]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置100处的天冬氨酸(D)由氨基酸E取代。

[108]根据[1]-[105]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置100处的天冬氨酸(D)由氨基酸F取代。

[109]根据[1]-[105]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置100处的天冬氨酸(D)由氨基酸I取代。

[110]根据[1]-[105]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置100处的天冬氨酸(D)由氨基酸K取代。

[111]根据[1]-[105]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置100处的天冬氨酸(D)由氨基酸L取代。

[112]根据[1]-[105]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置100处的天冬氨酸(D)由氨基酸N取代。

[113]根据[1]-[105]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置100处的天冬氨酸(D)由氨基酸R取代。

[114]根据[1]-[105]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置100处的天冬氨酸(D)由氨基酸V取代。

[115]根据[1]-[105]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置100处的天冬氨酸(D)由氨基酸W取代。

[116]根据[1]-[105]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQID NO：19的变体构成，在该变体中CH3结构域的位置100处的天冬氨酸(D)由氨基酸Y取代。

[117]根据[1]-[116]中任一项所述的特异性结合元件，其中，在所述CH3结构域的位置101处的氨基酸为缬氨酸(V)。

[118]根据[1]-[116]中任一项所述的特异性结合元件，其中，在所述CH3结构域的位置101处的氨基酸不存在。

[119]根据[1]-[118]中任一项所述的特异性结合元件，其中，在所述CH3结构域的位置38处的氨基酸为缬氨酸(V)。

[120]根据[1]-[118]中任一项所述的特异性结合元件，其中，在所述CH3结构域的位置38处的氨基酸为丙氨酸(A)。

氨基酸可以通过其一个字母或三个字母代码、或者其全称来表示。各20种标准氨基酸的一个和三个字母代码、以及全称如下列出。

本发明的特异性结合元件的PD-L1结合位点优选包括：第一序列、第二序列和第三序列，其中：

所述第一序列由以下构成：

(a)氨基酸序列SGYW(SEQ ID NO：23)，或者

(b)SEQ ID NO：23的变体，其中丝氨酸(S)由氨基酸E或T取代；

所述第二序列由氨基酸序列EPQYWA(SEQ ID NO：11)构成；并且

所述第三序列由以下构成：

(a)氨基酸序列SNWRWQMDD(SEQ ID NO：19)，或者

(b)SEQ ID NO：19的变体，其中位置98处的甲硫氨酸(M)

由氨基酸I、L或V取代；和/或

其中，CH3结构域的位置101处的氨基酸为缬氨酸(V)或不存在。

在优选的实施方案中，本发明的特异性结合元件的结合位点包括Fcab FS17-33-116的第一序列、第二序列和第三序列，其中，第一序列具有SEQ ID NO：23中列出的序列，第二序列具有SEQ ID NO：11中列出的序列，并且第三序列具有SEQ ID NO：19中列出的序列。

在另一优选的实施方案中，本发明的特异性结合元件的结合位点包括Fcab FS17-33-288的第一序列、第二序列和第三序列，其中，第一序列具有SEQ ID NO：23中列出的序列，第二序列具有SEQ ID NO：11中列出的序列，并且第三序列具有SEQ ID NO：27中列出的序列。

在另一优选的实施方案中，本发明的特异性结合元件的结合位点包括Fcab FS17-33-289和Fcab FS17-33-334的第一序列、第二序列和第三序列，其中，第一序列具有SEQ IDNO：23中列出的序列，第二序列具有SEQ ID NO：11中列出的序列，并且第三序列具有SEQ IDNO：31中列出的序列。

在另一优选的实施方案中，本发明的特异性结合元件的结合位点包括Fcab FS17-33-296的第一序列、第二序列和第三序列，其中，第一序列具有SEQ ID NO：23中列出的序列，第二序列具有SEQ ID NO：11中列出的序列，并且第三序列具有SEQ ID NO：35中列出的序列。

在另一优选的实施方案中，本发明的特异性结合元件的结合位点包括Fcab FS17-33-449的第一序列、第二序列和第三序列，其中，第一序列具有SEQ ID NO：42中列出的序列，第二序列具有SEQ ID NO：11中列出的序列，并且第三序列具有SEQ ID NO：43中列出的序列。

在另一优选的实施方案中，本发明的特异性结合元件的结合位点包括Fcab FS17-33-451的第一序列、第二序列和第三序列，其中，第一序列具有SEQ ID NO：47中列出的序列，第二序列具有SEQ ID NO：11中列出的序列，并且第三序列具有SEQ ID NO：43中列出的序列。

除了以上描述的实验性工作外，本发明人执行了进一步的诱变程序，以便识别出在特异性结合元件的CH3结构域中包括针对PD-L1的非天然结合位点的特异性结合元件，该特异性结合元件具有提高的解链温度(melting temperature)并因此预计更稳定。预计该提高的稳定性有益于特异性结合元件的制造和储存。

特别地，本发明人出人意料地发现，本发明的特异性结合元件的CH3结构域的位置99处的天冬氨酸(D)残基至野生型甘氨酸(G)残基的逆转增加了特异性结合元件的解链温度。除了增加解链温度外，该氨基酸逆转具有额外优势，其减少了所得的特异性结合元件的突变负担(mutational burden)。本发明人还发现，除了位置99处的逆转外，特异性结合元件的CH3结构域的位置113处的组氨酸(H)残基由精氨酸(R)残基的取代也导致了特异性结合元件具有增加的特异性结合元件解链温度。这些突变都单独地出现了两次，表明这些氨基酸变化可能对于特异性结合元件的解链温度的增加是重要的。

因此，在优选的实施方案中，本发明的特异性结合元件包括PD-L1结合位点，该PD-L1结合位点包括如本文公开的第一序列、第二序列和第三序列，其中，第三序列位于EF结构环中，优选处于CH3结构域的位置92至100处，并由SEQ ID NO：19的变体构成，其中，位置99处的天冬氨酸(D)由甘氨酸(G)取代，更优选地，其中位置99处的天冬氨酸(D)由甘氨酸(G)取代，并且位置98处的甲硫氨酸(M)由亮氨酸(L)取代。此外，本发明的特异性结合元件的CH3结构域的位置113处的组氨酸(H)可以由精氨酸(R)取代。特异性结合元件还可以包括以下CH3结构域中的额外的突变：

(i)位置84.1处的亮氨酸(L)可以由脯氨酸(P)取代；和/或

(ii)位置85.3处的丝氨酸(S)可以由苏氨酸(T)取代；和/或

(iii)位置101处的氨基酸可以为丙氨酸(A)。

由此，本发明还提供了：

[121]根据上述[1]-[95]或[106]-[120]中任一项所述的特异性结合元件，其中，所述第三序列由SEQ ID NO：19的变体构成，其中，CH3结构域的位置99处的天冬氨酸(D)由氨基酸G取代。

[122]根据上述[1]-[116]或[119]-[121]中任一项所述的特异性结合元件，其中，CH3结构域的位置101处的氨基酸为丙氨酸(A)。

[123]根据上述[1]-[122]中任一项所述的特异性结合元件，其中，CH3结构域的位置113处的氨基酸为精氨酸(R)。

[124]根据上述[1]-[123]中任一项所述的特异性结合元件，其中，CH3结构域的位置84.1处的氨基酸为脯氨酸(P)。

[125]根据上述[1]-[124]中任一项所述的特异性结合元件，其中，CH3结构域的位置85.3处的氨基酸为苏氨酸(T)。

在优选的实施方案中，本发明的特异性结合元件的PD-L1结合位点包括FcabFS17-33-488的第一序列、第二序列和第三序列，其中，第一序列具有SEQ ID NO：47中列出的序列，第二序列具有SEQ ID NO：11中列出的序列，并且第三序列具有SEQ ID NO：70中列出的序列，其中，特异性结合元件的CH3结构域的位置84.1、85.3、101和113处的残基分别为脯氨酸(P)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)和精氨酸(R)。

在进一步优选的实施方案中，本发明的特异性结合元件的PD-L1结合位点包括Fcab FS17-33-539的第一序列、第二序列和第三序列，其中，第一序列具有SEQ ID NO：42中列出的序列，第二序列具有SEQ ID NO：11中列出的序列，且第三序列具有SEQ ID NO：74中列出的序列，并且特异性结合元件的CH3结构域的位置113处的残基为精氨酸(R)。

在更进一步优选的实施方案中，特异性结合元件包括Fcab FS17-33-548的第一序列、第二序列和第三序列，其中，第一序列具有SEQ ID NO：47中列出的序列，第二序列具有SEQ ID NO：11中列出的序列，并且第三序列具有SEQ ID NO：78中列出的序列。

如本文所公开的，本发明的特异性结合元件的结合位点在第一序列、第二序列和第三序列中可以包括总数达12个、达11个、达10个、达9个、达8个、达7个、达6个、达5个、达4个、达3个、达2个、或1个(进一步的)氨基酸修饰。在优选的实施方案中，如本文所公开的，特异性结合元件在第一序列、第二序列和第三序列中可以包括总数达3个、达2个、或1个(进一步的)氨基酸修饰。在更优选的实施方案中，如本文所公开的，特异性结合元件在第一序列、第二序列和第三序列中可以包括总数达2个、或1个(进一步的)氨基酸修饰。第一序列、第二序列和第三序列中的修饰总数是指在这些组合的序列中形成的修饰的总数。

如本文所公开的，本发明的特异性结合元件的结合位点在第一序列中可以包括达2个、或1个(进一步的)氨基酸修饰。另外地或可替代地，如本文所公开的，特异性结合元件在第二序列中可以包括达5个、达4个、达3个、达2个、或1个(进一步的)氨基酸修饰。另外地或可替代地，如本文所公开的，本发明的特异性结合元件在第三序列中可以包括达6个、达5个、达4个、达3个、达2个、或1个(进一步的)氨基酸修饰。

在优选的实施方案中，如本文所公开的，本发明的特异性结合元件的结合位点在第一序列中可以包括达2个、或1个(进一步的)氨基酸修饰，和/或在第三序列中可以包括达2个、或1个(进一步的)氨基酸修饰。在更优选的实施方案中，如本文所公开的，结合元件在第一序列中可以包括1个(进一步的)氨基酸修饰，和/或在第三序列中可以包括1个(进一步的)氨基酸修饰。

在优选的实施方案中，如本文所公开的，本发明的特异性结合元件的结合位点在第一序列、第二序列或第三序列中包括1个(进一步的)氨基酸修饰。

本发明的特异性结合元件的结合位点可以包括第三序列，在第三序列中，位置98处的甲硫氨酸(M)由氨基酸L取代。此外，本发明的特异性结合元件的结合位点在第一序列、第二序列或第三序列中可以包括1个、2个或3个，优选1个或2个，更优选1个，进一步的氨基酸修饰。

在本发明的特异性结合元件在第一序列中包括1个或更多个额外的修饰的情况下，优选保持CH3结构域的位置14、15或16处的氨基酸缺失，和/或与亲本序列(parentsequence)相比优选不修饰CH3结构域的位置17、18处的氨基酸。

在本发明的特异性结合元件在第二序列中包括1个或更多个额外的修饰的情况下，与亲本序列相比优选不修饰CH3结构域的位置77、以及可选的位置45.3处的氨基酸。

在本发明的特异性结合元件在第三序列中包括1个或更多个额外的修饰的情况下，与亲本序列相比优选不修饰CH3结构域的位置94、以及可选的位置92处的氨基酸。

修饰可以为氨基酸取代、缺失或***。优选地，修饰为取代。

在优选的实施方案中，特异性结合元件的CH3结构域的位置101处的氨基酸为缬氨酸(V)。

在可替代的优选的实施方案中，特异性结合元件的CH3结构域的位置101处的氨基酸为丙氨酸(A)。

本发明人表明，在减小特异性结合元件的突变负担的情况下，AB环和EF环中的某些残基、以及框架区(framework region)可以转变回野生型(WT)残基(参见图1)，该野生型残基在结合至PD-L1时对特异性结合元件的解离速率(off-rate,koff)具有最小影响。

因此，在优选的实施方案中，本发明的特异性结合元件的结合位点包括第一序列，该第一序列具有：

氨基酸T取代丝氨酸(S)，和/或

氨基酸K取代甘氨酸(G)。

在另一优选的实施方案中，本发明的特异性结合元件的结合位点包括第三序列，该第三序列具有：

氨基酸K取代位置93处的天冬酰胺(N)，和/或

氨基酸N取代位置100处的天冬氨酸(D)。

特异性结合元件的CH3结构域的位置38处的氨基酸可以为缬氨酸或丙氨酸残基，优选为丙氨酸残基。

除了PD-L1抗原结合位点的序列之外，特异性结合元件的CH3结构域的序列没有特别的限制。优选地，CH3结构域是人免疫球蛋白G结构域，诸如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH3结构域，最优选人IgG1 CH3结构域。人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH3结构域的序列是本领域已知的。

在优选的实施方案中，特异性结合元件包括SEQ ID NO：24、28、32、36、39、44或48中列出的CH3结构域，更优选SEQ ID NO：28、32、36、39、44或48中列出的CH3结构域，最优选SEQ ID NO：32、44或48中列出的CH3结构域。

在进一步最优选的实施方案中，特异性结合元件包括SEQ ID NO：71、75或79中列出的CH3结构域。

可替代地，特异性结合元件可以包括具有氨基酸序列的CH3结构域，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：24、28、32、36、39、44或48中列出的序列，优选SEQ ID NO：28、32、36、39、44或48中列出的序列，最优选SEQ ID NO：32、44或48中列出的CH3结构域，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性(sequence identity)。

作为进一步最优选的实施方案，特异性结合元件包括具有氨基酸序列的CH3结构域，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：71、75或79中列出的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。

特异性结合元件还可以包括CH2结构域。正如人IgG分子的情况一样，CH2结构域优选位于CH3结构域的N-端处。特异性结合元件的CH2结构域优选为人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH2结构域，更优选人IgG1的CH2结构域。人IgG结构域的序列是本领域已知的。在优选的实施方案中，特异性结合元件包括：具有SEQ ID NO：5或6中列出的序列的IgG CH2结构域；或者具有氨基酸序列的CH2结构域，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：5或6中列出的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。可替代地，特异性结合元件包括：具有SEQ ID NO：82中列出的序列的IgG CH2结构域；或者具有氨基酸序列的CH2结构域，所述氨基酸序列与SEQ IDNO：82中列出的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。

在优选的实施方案中，特异性结合元件包括：(i)SEQ ID NO：24、28、32、36、39、44、48、71、75或79中列出的CH3结构域，更优选SEQ ID NO：28、32、36、39、44、48、71、75或79中列出的CH3结构域，最优选SEQ ID NO：32、44、48、71、75或79中列出的CH3结构域；以及(ii)SEQID NO：5中列出的CH2结构域。

在可替代的优选的实施方案中，特异性结合元件包括：(i)SEQ ID NO：24、28、32、36、39、44、48、71、75或79中列出的CH3结构域，更优选SEQ ID NO：28、32、36、39、44、48、71、75或79中列出的CH3结构域，最优选SEQ ID NO：32、44、48、71、75或79中列出的CH3结构域；以及(ii)SEQ ID NO：6中列出的CH2结构域。

优选地，特异性结合元件在CH2结构域的N-端处包括免疫球蛋白绞链区(hingeregion)或其部分。免疫球蛋白绞链区允许两个CH2-CH3结构域序列缔合(associate)并形成二聚体。优选地，绞链区或其部分是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4绞链区或其部分。更优选地，绞链区或其部分是IgG1绞链区或其部分。人IgG1绞链区的序列在SEQ ID NO：69中示出。可以形成特异性结合元件的一部分的适当截短的绞链区在SEQ ID NO：7中示出。该绞链区存在于实施例中测试的Fcab分子中，而全长(full-length)绞链区存在于模拟的mAb²形式中。因此，特异性结合元件优选在CH2结构域的N-端处包括免疫球蛋白绞链区或其部分，其中，绞链区具有在SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：7中列出的序列；或者其中，铰链区具有氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：69或7中列出的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。可替代地，特异性结合元件可以在CH2结构域的N-端处包括免疫球蛋白绞链区或其部分，其中，绞链区包括SEQ ID NO：69中列出的序列或其片段，其中，所述片段包括SEQ IDNO：69的至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个以上、至少十个、至少十一个、至少十二个、至少十三个或至少十四个氨基酸残基。

在优选的实施方案中，特异性结合元件包括：(i)SEQ ID NO：24、28、32、36、39、44、48、71、75或79中列出的CH3结构域，更优选SEQ ID NO：28、32、36、39、44、48、71、75或79中列出的CH3结构域，最优选SEQ ID NO：32、44、48、71、75或79中列出的CH3结构域；(ii)SEQ IDNO：5中列出的CH2结构域；以及(ii)CH2结构域的N-端处的免疫球蛋白铰链区或其部分，其中，该免疫球蛋白铰链区具有SEQ ID NO：69中列出的序列。

在可替代的优选的实施方案中，特异性结合元件包括：(i)SEQ ID NO：24、28、32、36、39、44、48、71、75或79中列出的CH3结构域，更优选SEQ ID NO：28、32、36、39、44、48、71、75或79中列出的CH3结构域，最优选SEQ ID NO：32、44、48、71、75或79中列出的CH3结构域；(ii)SEQ ID NO：6中列出的CH2结构域；以及(iii)CH2结构域的N-端处的免疫球蛋白铰链区或其部分，其中，该免疫球蛋白铰链区具有SEQ ID NO：69中列出的序列。

在优选的实施方案中，特异性结合元件包括SEQ ID NO：25、26、29、30、33、34、37、38、40、41、45、46、49或50中列出的序列，或者与SEQ ID NO：25、26、29、33、34、30、37、38、40、41、45、46、49或50中列出的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的序列。更优选地，特异性结合元件包括SEQ ID NO：29、30、33、34、37、38、40、41、45、46、49或50中列出的序列，或者与SEQ ID NO：29、30、33、34、37、38、40、41、45、46、49或50中列出的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的序列。最优选地，特异性结合元件包括SEQ ID NO：45、46、49或50中列出的序列，或者与SEQ ID NO：45、46、49或50中列出的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的序列。在可替代的最优选的实施方案中，特异性结合元件包括SEQ ID NO：33或34中列出的序列，或者与SEQ ID NO：33或34中列出的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的序列。

在进一步最优选的实施方案中，特异性结合元件包括SEQ ID NO：72、73、76、77、80或81中列出的序列，或者与SEQ ID NO：72、73、76、77、80或81中列出的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的序列。

近年来，基于单克隆抗体的癌症免疫疗法，诸如抗CTLA-4或抗PD-1/PD-L1抗体，在癌症患者的治疗中已经产生了重大影响。然而，尽管这些单一疗法在大量的恶性肿瘤中有着显著的临床功效，但是仅有小子集的癌症患者对这些治疗应答。最近，在黑素瘤和非小细胞肺癌中，PD-1和CTLA-4的组合抑制突显了通过将PD-1和CTLA-4与具有互补的作用机理的其他药剂联合而进一步增强此类单一疗法的临床益处的潜力。此外，本发明人出人意料地发现，当制备本发明的特异性结合元件，该特异性结合元件除了位于特异性结合元件的CH3结构域中的PD-L1抗原结合位点外、包括来自伊匹单抗(ipilimumab)的针对CTLA-4的基于CDR的抗原结合位点，并且这些特异性结合元件在葡萄球菌肠毒素B试验(StaphylococcalEnterotoxin B assay,SEB试验)中进行测试时，与(i)包括CH3结构域中相同的PD-L1抗原结合位点、和针对不相干抗原的基于CDR的抗原结合位点的特异性结合元件，(ii)伊匹单抗，或(i)和(ii)的组合相比，该特异性结合元件显示出更大的T细胞活化。这表明与包括相同抗原结合位点的两种单独的分子的联合使用相比，将抗PD-L1抗原结合位点并入CH3结构域、以及将针对第二抗原的基于CDR的抗原结合位点并入相同的特异性结合元件，均可以导致特异性结合元件活性的协同增加。

因此，除了特异性结合元件的CH3结构域中的PD-L1抗原结合位点之外，特异性结合元件还可以包括一个或更多个附加的抗原结合位点以产生双特异性或多特异性分子。优选地，特异性结合元件包括基于CDR的抗原结合位点。基于CDR的抗原结合位点存在于自然产生(naturally-occurring)的免疫球蛋白分子中，并且它们的结构在本领域中是已知的。在特异性结合元件包括基于CDR的抗原结合位点的情况下，特异性结合元件优选为抗体分子。该抗体分子没有特别地限制，只要它包括本文限定的CH3结构域和基于CDR的抗原结合位点即可。在优选的实施方案中，抗体分子是人免疫球蛋白G分子，诸如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子，更优选人IgG1分子。人免疫球蛋白G分子的序列是本领域已知的，并且如本文公开的，将CH3结构域或CH3结构域序列引入这样的分子中将不会给技术人员带来任何困难。

在优选的实施方案中，本发明的特异性结合元件包括：(i)SEQ ID NO：45、46、49、50、72、73、76、77、80、81、33、34、25、26、29、30、37、38、40或41中列出的序列，优选SEQ IDNO：45、46、49、50、72、73、76、77、80、81、33或34中列出的序列；以及(ii)基于CDR的抗原结合位点。

基于CDR的抗原结合位点可以结合抗原，其中，预计所述抗原的结合在癌症治疗方面是有益的。

在一个实施方案中，在特异性结合元件包括基于CDR的抗原结合位点的情况下，该基于CDR的抗原结合位点可以结合非冗余(non-redundant)且互补的检查点抑制剂(checkpoint inhibitor)，诸如CTLA-4、LAG-3、TIGIT、TIM-3、VISTA、CD73、CSF-1R、KIR.B7-H3、B7-H4、2B4、NKG2A、CD47、SIRPI、BTLA、CCR4、CD200R或TGFG。

PD-1/PD-L1轴的抑制和共刺激分子(costimulatory molecule)的刺激代表了增强人类患者中免疫应答的互补性策略。通过检查点阻滞的T细胞衰竭的逆转可能使得这些细胞更有效力地被激活并发展出完整的抗肿瘤活性。因此，在另一实施方案中，本发明的特异性结合元件可以包括基于CDR的抗原结合位点，该基于CDR的抗原结合位点结合至由T细胞表达的共刺激分子，并且是该共刺激分子的激动剂，该T细胞诸如OX40、ICOS、CD40、HVEM、NKG2D或TNFR2。

在进一步的实施方案中，本发明的特异性结合元件可以包括结合至肿瘤相关联抗原(tumour associated antigen,TAA)的基于CDR的抗原结合位点。预计这样的特异性结合元件通过局部免疫活化而导致肿瘤特异性T细胞应答。TAA的实施例为c-Met、B7-H3、B7-H4、EGFR、HER-2、EPCAM、CEACAM、FAP、VEGF、MSLN、GPC3、CD38、CD19和CD20。

如上详述的，感染性疾病显示出与肿瘤学的许多相似之处。可以利用PD-L1在免疫调节中的作用来最大化针对病原体的免疫应答。感染性疾病治疗情况下的免疫调节是医学的新兴领域，并且早期的论述表明PD-L1阻滞可能会改进对感染的生物应答，特别是有助于抵消T细胞衰竭、管理免疫介导的间隙、并且产生长期免疫(Wykes和Lewin，2018)。

在一些感染性疾病中，过度的促炎性应答和次优的抗原特异性T细胞活性是严重组织损伤的原因(Rao M等，2017)。不希望受到理论的约束，认为包括基于CDR的抗原结合位点的本发明的特异性结合元件的使用，可以通过将有益的免疫调节活性定位于病原体环境而在这些疾病的治疗中获得应用。

可替代地，包括基于CDR的抗原结合位点的本发明的特异性结合元件的使用可以导致T细胞的特异性和活性增加，该基于CDR的抗原结合位点对于激动(agonism)或拮抗(antagonism)都结合至免疫细胞靶标。

因此，在一个实施方案中，在特异性结合元件包括基于CDR的抗原结合位点的情况下，该基于CDR的抗原结合位点可以结合至免疫细胞靶标，诸如PD-1、PD-L2、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、TIM3、OX40、CD40、ICOS、CD28或CD80。

可替代地，在特异性结合元件包括基于CDR的抗原结合位点的情况下，该基于CDR的抗原结合位点可以结合至病原性靶标、即由人病原体表达的抗原。该病原体可以为病毒、细菌、真菌或寄生虫。优选地，该病原体为病毒、细菌或真菌。更优选地，该病原体为病毒或细菌。最优选地，该病原体为病毒。病毒抗原的实施例包括由人类免疫缺陷病毒(HIV)表达的蛋白p24、gp120和gp41，由乙型肝炎病毒(HBV)表达的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)，以及由流感病毒表达的血细胞凝集素和神经氨酸苷酶。细菌抗原的实施例包括由结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)表达的Rv1733、Rv2389和Rv2435n。

在一些实施方案中，本发明的特异性结合元件的基于CDR的抗原结合位点可以不结合至OX40。另外地或可替代地，本发明的特异性结合元件的基于CDR的抗原结合位点可以不结合至CD137。另外地或可替代地，本发明的特异性结合元件的基于CDR的抗原结合位点可以不结合至CD27。另外地或可替代地，本发明的特异性结合元件的基于CDR的抗原结合位点可以不结合至糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(glucocorticoid-induced TNFR-related protein,GITR)。另外地或可替代地，本发明的特异性结合元件的基于CDR的抗原结合位点可以不结合至淋巴细胞活化基因3(LAG-3)。另外地或可替代地，本发明的特异性结合元件的基于CDR的抗原结合位点可以不结合至诱导性T细胞共刺激物(inducible T-cell costimulator,ICOS)。例如，在以下情况下，本发明的特异性结合元件的基于CDR的抗原结合位点可以不结合至ICOS：(i)特异性结合元件的PD-L1结合位点包括：第一序列，其位于CH3结构域的位置14-18处的AB结构环中，其中，特异性结合元件包括CH3结构域的位置14、15或16处的氨基酸缺失，并且其中，第一序列由SEQ ID NO：23中列出的序列构成；第二序列，其位于CH3结构域的位置45.1-78处的CD结构环中，其中，第二序列由SEQ ID NO：11中列出的序列构成；以及第三序列，其位于CH3结构域的位置92-100处的EF结构环中，其中，第三序列由SEQ ID NO：31中列出的序列构成；(ii)特异性结合元件的CH3结构域包括SEQ IDNO：32中列出的序列；和/或(iii)在特异性结合元件包括SEQ ID NO：33或34中列出的序列的情况下。

特异性结合元件可以进一步与免疫系统调节器(immune system modulator)、细胞毒分子、放射性同位素或可检测标记缀合。免疫系统调节器可以是细胞毒分子(cytotoxic molecule)，诸如细胞因子。

本发明还提供了一种编码本发明的特异性结合元件或抗体分子的核酸，以及包括这样的核酸的载体(vector)。

还提供了一种包括本发明的核酸或载体的重组宿主细胞。这样的重组宿主细胞可以用于生产本发明的特异性结合元件。因此，还提供的是一种生产本发明的特异性结合元件或抗体分子的方法，所述方法包括在用于生产所述特异性结合元件或抗体分子的条件下培养所述重组宿主细胞。该方法还可以包括分离和/或纯化所述特异性结合元件或抗体分子的步骤。

预计本发明的特异性结合元件和抗体在治疗应用，特别是人类的治疗应用，诸如癌症治疗，感染性疾病的治疗，炎症、与炎症相关联的疾病和病症、以及炎性疾病的治疗中获得应用。因此，还提供的是一种包括根据本发明的特异性结合元件或抗体分子、以及药学可接受赋形剂的药物组合物。

本发明还提供了本发明的特异性结合元件或抗体分子，其用于治疗方法。还提供的是一种治疗患者的方法，其中，所述方法包括向患者施用治疗有效量的根据本发明的特异性结合元件或抗体分子。进一步提供的是根据本发明的特异性结合元件或抗体分子在制造药物中的用途。如本文提及的，患者优选为人类患者。

本发明还提供了本发明的特异性结合元件或抗体分子，其用于治疗患者的癌症的方法。还提供的是一种治疗患者的癌症的方法，其中，所述方法包括向患者施用治疗有效量的根据本发明的特异性结合元件或抗体分子。进一步提供的是根据本发明的特异性结合元件或抗体分子在制造用于治疗患者癌症的药物中的用途。该治疗还可以包括向患者施用第二抗癌剂和/或疗法，诸如抗肿瘤疫苗和/或化学治疗剂。可以与本发明的特异性结合元件或抗体分子同时地、分别地或依序地将第二抗癌剂和/或疗法施用给患者。

本发明还提供了本发明的特异性结合元件或抗体分子，其用于治疗患者的感染性疾病的方法。还提供的是一种治疗患者的感染性疾病的方法，其中，所述方法包括向患者施用治疗有效量的根据本发明的特异性结合元件或抗体分子。进一步提供的是根据本发明的特异性结合元件或抗体分子在制造用于治疗患者的感染性疾病的药物中的用途。该治疗还可以包括向患者施用用于治疗感染性疾病的第二剂和/或疗法。可以与本发明的特异性结合元件或抗体分子同时地、分别地或依序地将第二剂和/或疗法施用给患者。

本发明还提供了本发明的特异性结合元件或抗体分子，其用于治疗患者的炎症、与炎症相关联的疾病或病症、或炎性疾病的方法。还提供的是一种治疗患者的炎症、与炎症相关联的疾病或病症、或炎性疾病的方法，其中，所述方法包括向患者施用治疗有效量的根据本发明的特异性结合元件或抗体分子。进一步提供的是根据本发明的特异性结合元件或抗体分子在制造用于治疗患者的炎症、与炎症相关联的疾病或病症、或炎性疾病的药物中的用途。该治疗还可以包括向患者施用用于治疗炎症、与炎症相关联的疾病或病症、或炎性疾病的第二剂和/或疗法。可以与本发明的特异性结合元件或抗体分子同时地、分别地或依序地将第二剂和/或疗法施用给患者。

附图说明

图1A示出了Fcab FS17-33、FS17-33-37、FS17-33-116、FS17-33-288、FS17-33-289、FS17-33-296、FS17-33-334、FS17-33-449、FS17-33-451、FS17-33-488、FS17-33-539和FS17-33-548、以及野生型(WT)Fcab的CH3结构域的框架位置38、84.1、85.3和113处的AB、CD和EF环的序列。示出了根据IMGT编号系统对残基进行的编号。图1B和C示出了抗体残基编号系统的一致性，该抗体残基编号系统包括用于IgG1 CH3结构域的CH3结构域残基、以及野生型IgG1 CH3结构域氨基酸序列的IMGT、连续编号(IMGT外显子编号)、EU编号和Kabat编号系统。图1D示出了Fcab FS17-33、FS17-33-37、FS17-33-116、FS17-33-288、FS17-33-289、FS17-33-296、FS17-33-334、FS17-33-449、FS17-33-451、FS17-33-488、FS17-33-539和FS17-33-548、以及野生型(WT)Fcab的CH3结构域序列的比对(alignment)。

图2示出了两个Fcab(A和B)以及mAb²(C)的尺寸排除色谱(size exclusionchromatography,SEC)概况。亲本Fcab FS17-33示出了单肩峰(single peak with ashoulder)(A)。Fcab FS17-33-116示出了***峰(B)。SEC分析示出了mAb² FS17-33-116/40420(C)具有少量聚集，这是亲本4420mAb的典型特征。与Fcab不一样，不存在明显的***峰或肩峰。

图3A示出了抗PD-L1 Fcab、FS17-33-116AA抑制了人PD-L1活性，从而导致在DO11.10 T细胞活化试验中IL-2的释放。这种释放与阳性对照抗PD-L1mAb、YW243.55.S1(S1)是相当的。抗PD-L1 Fcab、FS17-33-37AA和野生型(WT)Fcab在该试验中未显示出显著的T细胞活化。图3B示出了抗PD-L1Fcab、FS17-33-288AA、FS17-33-289AA和FS17-33-296AA，全部示出了DO11.10 T细胞活化试验中的IL-2释放，该IL-2释放与阳性对照mAb、S1的IL-2释放是相当的。如由克隆名称中的“AA”所示，测试的全部Fcab包含CH2结构域中的LALA突变。

图4A示出了Fcab和模拟mAb²形式的抗PD-L1 Fcab、FS17-33-288AA、FS17-33-289AA和FS17-33-296AA以及FS17-33-334AA抑制人PD-L1，从而导致DO11.10 T细胞活化试验中IL-2的释放。Fcab到模拟mAb²形式的转变导致在该试验中IL-2释放的部分减少。图4B示出了模拟mAb²形式的抗PD-L1 Fcab、FS17-33-449和FS17-33-451也能够抑制PD-L1，并在DO11.10 T细胞活化试验中释放IL-2。

图5示出了来自SEB试验的代表性标绘图(plot)。与IgG1同型对照mAb HelD1.3相比，Fcab和模拟mAb²都示出了T细胞的提高的IFNγ释放(A和B)。Fcab的活性与抗PD-L1阳性对照mAb、YW243.55.S70(S70)接近或相当。模拟mAb²形式的Fcab在该试验中示出了IFNγ释放的轻微减少。图5C示出了Fcab中存在LALA突变(AA)并不妨碍Fcab在SEB试验中的活性。

图6A和B示出了来自SEB试验的代表性标绘图。与伊匹单抗(抗CTLA-4)相比，模拟mAb²和PD-L1/CTLA-4mAb²都示出了T细胞的提高的IFNγ释放。

具体实施方式

本发明涉及结合至PD-L1的特异性结合元件。特别地，本发明的特异性结合元件包括位于该特异性结合元件的恒定结构域中的PD-L1抗原结合位点。除非上下文另有需要，否则术语“PD-L1”可以指人PD-L1和/或食蟹猴PD-L1。优选地，术语“PD-L1”是指人PD-L1。

术语“特异性结合元件”描述了免疫球蛋白或其片段，该免疫球蛋白或其片段包括恒定结构域、优选CH3结构域，该恒定结构域包括PD-L1抗原结合位点。优选地，特异性结合元件包括CH2和CH3结构域，其中，CH2或CH3结构域、优选CH3结构域，包括PD-L1抗原结合位点。在优选的实施方案中，特异性结合元件还包括在CH2结构域的N-端处的免疫球蛋白绞链区或其部分。这样的分子在本文中也称为抗原结合Fc片段，或Fcab^TM。特异性结合元件可以是部分地或完全地合成产生。

因此，如本文使用的，术语“特异性结合元件”包括片段，只要所述片段包括位于特异性结合元件的恒定结构域中的PD-L1抗原结合位点即可，该恒定结构域诸如CL、CH1、CH2或CH3结构域，优选CH1、CH2或CH3结构域，最优选CH3结构域。因此，除非上下文另有需要，否则如本文使用的，术语“特异性结合元件”相当于“特异性结合元件或其片段”。

在优选的实施方案中，特异性结合元件是抗体分子。术语“抗体分子”涵盖抗体分子的片段，只要这样的片段包括恒定结构域、该恒定结构域包括PD-L1抗原结合位点即可，该恒定结构域诸如CH1、CH2或CH3结构域，优选CH3结构域。抗体分子可以是人的或人源化的(humanised)。抗体分子优选是单克隆抗体分子。抗体分子的实施例为免疫球蛋白同型(immunoglobulin isotypes)，诸如免疫球蛋白G及其同型子类，诸如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及其片段。

可以采用单克隆抗体和其他抗体，并使用重组DNA工艺(technology)的技术来产生保留原始抗体特异性的其他抗体或嵌合分子。这样的技术可能涉及将CDR或可变区引入不同的免疫球蛋白中。例如，在EP-A-184187、GB2188638A和EP-A-239400中描述了一个免疫球蛋白的CDR到另一个免疫球蛋白中的引入。可以通过将PD-L1抗原结合位点引入另一恒定结构域中，诸如不同的CH3结构域、或者CH1或CH2结构域，来针对相关的恒定结构域序列采用类似的技术。

由于可以以许多方式修饰抗体，因此术语“特异性结合元件”应当被解释为覆盖抗体的抗体片段、衍生物、功能等效物(function equivalent)和同系物(homologue)，无论是天然的、还是完全或部分合成的。包括CH3结构域的抗体片段的实施例是抗体的Fc结构域。包括CDR序列和CH3结构域两者的抗体片段的实施例是微抗体(minibody)，其包括连接到CH3结构域的单链抗体片段(scFv)(Hu等，1996)。

本发明的特异性结合元件结合至PD-L1。就此而言结合可以指特异性结合。术语“特异性”可以指以下情况，其中特异性结合元件将不显示出对除其特异性结合配体之外的分子的任何显著结合，其特异性结合配体此处是PD-L1。术语“特异性”在特异性结合元件特异于由多种抗原携带的特定表位(epitope)、诸如PD-L1上的表位的情况下也是可用的，在此情况下，特异性结合元件将能够结合至携带表位的各种抗原。特异性结合元件可以不结合至程序性死亡配体1(PD-1)和CD80、或者可以不显示出任何显著的至程序性死亡配体1(PD-1)和CD80的结合，该程序性死亡配体1(PD-1)和CD80诸如人和鼠CD80、以及人和鼠PD-1。

本发明的特异性结合元件优选包括PD-L1抗原结合位点。PD-L1抗原结合位点位于该特异性结合元件的恒定结构域中，诸如CH1、CH2、CH3或CH4结构域。优选地，PD-L1抗原结合位点位于特异性结合元件的CH3结构域中。

PD-L1结合位点优选包括：

(i)第一序列，其位于AB结构环中，其中，特异性结合元件包括恒定结构域的位置14、15或16处的氨基酸缺失，并且其中，该第一序列由以下构成：

(a)氨基酸序列SGYW(SEQ ID NO：23)，或者

(b)SEQ ID NO：23的变体，其中

丝氨酸(S)由氨基酸A、E、F、G、H、I、L、P、R、T、V或Y取代，和/或

甘氨酸(G)由氨基酸A、D、E、F、H、K、L、N、P、R、T、V或Y取代；

(ii)第二序列，其位于CD结构环中，其中，该第二序列由以下构成：

(a)氨基酸序列EPQYWA(SEQ ID NO：11)，或者

(b)SEQ ID NO：11的变体，其中

谷氨酸(E)由氨基酸A、G、H、I、L、N、Q、R、S或W取代，和/

或

脯氨酸(P)由氨基酸A、D、E、G、H、N、Q、W或Y取代，和/或

谷氨酰胺(Q)由氨基酸H或N取代，和/或

酪氨酸(Y)由氨基酸A、D、H、T或V取代，和/或

丙氨酸(A)由氨基酸D、E、G、L、R、S或W取代；以及

(iii)第三序列，其位于EF结构环中，其中，该第三序列由以下构成：

(a)氨基酸序列SNWRWQMD₁D₂(SEQ ID NO：19)或

(b)SEQ ID NO：19的变体，其中

丝氨酸(S)由氨基酸A或G取代，和/或

天冬酰胺(N)由氨基酸A、E、F、G、H、I、K、L、Q、R、S、T或Y取代，和/或

谷氨酰胺(Q)由氨基酸A、D、E、F、G、H、K、L、N、R、S或V取代，和/或

甲硫氨酸(M)由氨基酸H、S、F、I、L、V、W或Y取代，和/或

天冬氨酸(D₁)由氨基酸E、A、I、L、R、S、T、V、W、Y或G取代，和/或

天冬氨酸(D₂)由氨基酸A、E、F、I、K、L、N、R、V、W或Y取代；并且

其中，CH3结构域的位置101处的氨基酸为缬氨酸(V)、丙氨酸(A)，或不存在。

在可替代的优选的实施方案中，PD-L1结合位点包括：

(i)第一序列，其位于AB结构环中，其中，特异性结合元件包括恒定结构域的位置14、15或16处的氨基酸缺失，并且其中，该第一序列由以下构成：

(a)氨基酸序列SGYW(SEQ ID NO：23)，或者

(b)SEQ ID NO：23的变体，其中

丝氨酸(S)由氨基酸A、E、F、G、H、I、L、P、R、T、V或Y取代，和/或

甘氨酸(G)由氨基酸A、D、E、F、H、K、L、N、P、R、T、V或Y取代；

(ii)第二序列，其位于CD结构环中，其中，该第二序列由以下构成：

(a)氨基酸序列EPQYWA(SEQ ID NO：11)，或者

(b)SEQ ID NO：11的变体，其中

谷氨酸(E)由氨基酸A、G、H、I、L、N、Q、R、S或W取代，和/或

脯氨酸(P)由氨基酸A、D、E、G、H、N、Q、W或Y取代，和/或

谷氨酰胺(Q)由氨基酸H或N取代，和/或

酪氨酸(Y)由氨基酸A、D、H、T或V取代，和/或

丙氨酸(A)由氨基酸D、E、G、L、R、S或W取代；以及

(iii)第三序列，其位于EF结构环中，其中，该第三序列由以下构成：

(a)氨基酸序列SNWRWQMD₁D₂(SEQ ID NO：19)或

(b)SEQ ID NO：19的变体，其中

丝氨酸(S)由氨基酸A或G取代，和/或

天冬酰胺(N)由氨基酸A、E、F、G、H、I、K、L、Q、R、S、T或Y取代，和/或

谷氨酰胺(Q)由氨基酸A、D、E、F、G、H、K、L、N、R、S或V取代，和/或

甲硫氨酸(M)由氨基酸H、S、F、I、L、V、W或Y取代，和/或

天冬氨酸(D₁)由氨基酸E、A、I、L、R、S、T、V、W或Y取代，和/或

天冬氨酸(D₂)由氨基酸A、E、F、I、K、L、N、R、V、W或Y取代；并且

其中，CH3结构域的位置101处的氨基酸为缬氨酸(V)或不存在。

本发明的特异性结合元件还可以包括在特异性结合元件的CH3结构域的位置113处的精氨酸(R)。另外地或可替代地，本发明的特异性结合元件可以包括以下额外的突变：

(i)在CH3结构域的位置84.1处的氨基酸可以为脯氨酸(P)；和/或

(ii)在CH3结构域的位置85.3处的氨基酸可以为苏氨酸(T)；和/或

(iii)在CH3结构域的位置101处的氨基酸可以为丙氨酸(A)。

除非另有说明，否则本文中氨基酸残基根据国际免疫遗传学数据库(IMGT)编号方案进行编号。IMGT编号方案在Lefranc等,2005中描述。

优选地，第一序列位于CH3结构域的残基14-18处，第二序列位于CH3结构域的位置45.1-78处，和/或第三序列位于CH3结构域的位置92-100或92-101处，其中，氨基酸残基根据国际免疫遗传学数据库(IMGT)编号方案进行编号。

作为IMGT编号的替代方案，包括本文描述的修饰的CH3结构域的残基的位置，可以可替代地根据连续编号来表示，该连续编号也称为SEQ ID NO：4中列出的野生型IgG1 CH3结构域序列中的残基的IMGT外显子编号、EU编号或Kabat编号。

图1B和C中示出了WT IgG1 CH3结构域(SEQ ID NO：4)的残基的IMGT编号、连续编号(IMGT外显子编号)、EU编号和Kabat编号之间的一致性(concordance)。

图1A中示出，相对于SEQ ID NO：4中列出的野生型CH3结构域序列，Fcab FS17-33、FS17-33-37、FS17-33-116、FS17-33-288、FS17-33-289、FS17-33-296、FS17-33-334、FS17-33-449、FS17-33-451、FS17-33-488、FS17-33-539和FS17-33-548的CH3结构域中修饰的残基位置的IMGT编号和连续编号之间的一致性。

因此，例如，如图1A所示，在本申请涉及CH3结构域的位置14-18处的AB结构环、位置45.1-78处的CD结构环、和/或位置92-100处的EF结构环的修饰的情况下，在残基编号根据IMGT编号方案的情况下，依照SEQ ID NO：4的氨基酸残基的连续编号修饰的位置分别为CH3结构域的位置18-22、46-51和73-81。

在优选的实施方案中，PD-L1结合位点包括位于AB环中的第一序列、位于CD环中的第二序列和位于EF环中的第三序列，

其中，第一序列具有SEQ ID NO：23中列出的序列，第二序列具有SEQ ID NO：11中列出的序列，并且第三序列具有SEQ ID NO：19中列出的序列；

第一序列具有SEQ ID NO：23中列出的序列，第二序列具有SEQ ID NO：11中列出的序列，并且第三序列具有SEQ ID NO：27中列出的序列；

第一序列具有SEQ ID NO：23中列出的序列，第二序列具有SEQ ID NO：11中列出的序列，并且第三序列具有SEQ ID NO：31中列出的序列；

第一序列具有SEQ ID NO：23中列出的序列，第二序列具有SEQ ID NO：11中列出的序列，并且第三序列具有SEQ ID NO：35中列出的序列；

第一序列具有SEQ ID NO：42中列出的序列，第二序列具有SEQ ID NO：11中列出的序列，并且第三序列具有SEQ ID NO：43中列出的序列；

第一序列具有SEQ ID NO：47中列出的序列，第二序列具有SEQ ID NO：11中列出的序列，并且第三序列具有SEQ ID NO：43中列出的序列；

第一序列具有SEQ ID NO：47中列出的序列，第二序列具有SEQ ID NO：11中列出的序列，并且第三序列具有SEQ ID NO：78中列出的序列；或者

第一序列具有SEQ ID NO：42中列出的序列，第二序列具有SEQ ID NO：11中列出的序列，以及第三序列具有SEQ ID NO：74中列出的序列，并且特异性结合元件的CH3结构域的位置113处的残基为精氨酸(R)。

最优选地，PD-L1结合位点包括位于AB环中的第一序列、位于CD环中的第二序列和位于EF环中的第三序列，其中

第一序列具有SEQ ID NO：23中列出的序列，第二序列具有SEQ ID NO：11中列出的序列，并且第三序列具有SEQ ID NO：31中列出的序列；

第一序列具有SEQ ID NO：42中列出的序列，第二序列具有SEQ ID NO：11中列出的序列，并且第三序列具有SEQ ID NO：43中列出的序列；或者

第一序列具有SEQ ID NO：47中列出的序列，第二序列具有SEQ ID NO：11中列出的序列，并且第三序列具有SEQ ID NO：43中列出的序列。

在可替代的最优选的实施方案中，本发明的特异性结合元件的PD-L1结合位点可以包括位于AB环中的第一序列、位于CD环中的第二序列和位于EF环中的第三序列，

其中，第一序列具有SEQ ID NO：47中列出的序列，第二序列具有SEQ ID NO：11中列出的序列，并且第三序列具有SEQ ID NO：78中列出的序列；或者

第一序列具有SEQ ID NO：42中列出的序列，第二序列具有SEQ ID NO：11中列出的序列，以及第三序列具有SEQ ID NO：74中列出的序列，并且特异性结合元件的CH3结构域的位置113处的残基为精氨酸(R)；或者

第一序列具有SEQ ID NO：47中列出的序列，第二序列具有SEQ ID NO：11中列出的序列，并且第三序列具有SEQ ID NO：70中列出的序列，其中，特异性结合元件的CH3结构域的位置84.1、85.3、101和113处的残基分别为脯氨酸(P)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)和精氨酸(R)。

第一序列、第二序列和第三序列优选位于特异性结合元件的恒定结构域的结构环中。例如，在WO2006/072620和WO2009/132876中描述了将序列引入抗体恒定结构域的结构环区域中来创建新的抗原结合位点。

抗体恒定结构域的结构环包括AB、CD和EF环。在CH3结构域中，AB、CD和EF环位于CH3结构域的残基11-18、43-78和92-101处。优选地，第一序列位于CH3结构域的残基14-18处，第二序列位于CH3结构域的位置45.1-78处，和/或第三序列位于CH3结构域的位置92-100或92-101处。

本发明的特异性结合元件还可以包括位置38处的丙氨酸和缬氨酸残基，优选丙氨酸残基。特别地，特异性结合元件，其包括第一序列、第二序列和第三序列，其中，

第一序列具有SEQ ID NO：23中列出的序列，第二序列具有SEQ ID NO：11中列出的序列，并且第三序列具有SEQ ID NO：31中列出的序列；

第一序列具有SEQ ID NO：42中列出的序列，第二序列具有SEQ ID NO：11中列出的序列，并且第三序列具有SEQ ID NO：43中列出的序列；

第一序列具有SEQ ID NO：47中列出的序列，第二序列具有SEQ ID NO：11中列出的序列，并且第三序列具有SEQ ID NO：43中列出的序列；

第一序列具有SEQ ID NO：47中列出的序列，第二序列具有SEQ ID NO：11中列出的序列，并且第三序列具有SEQ ID NO：78中列出的序列；

第一序列具有SEQ ID NO：42中列出的序列，第二序列具有SEQ ID NO：11中列出的序列，以及第三序列具有SEQ ID NO：74中列出的序列，并且特异性结合元件的CH3结构域的位置113处的残基为精氨酸(R)；或者

第一序列具有SEQ ID NO：47中列出的序列，第二序列具有SEQ ID NO：11中列出的序列，并且第三序列具有SEQ ID NO：70中列出的序列，其中，特异性结合元件的CH3结构域的位置84.1、85.3、101和113处的残基分别为脯氨酸(P)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)和精氨酸(R)；

还可以包括位置38处的丙氨酸残基。

类似地，特异性结合元件，其包括第一序列、第二序列和第三序列，其中

第一序列具有SEQ ID NO：23中列出的序列，第二序列具有SEQ ID NO：11中列出的序列，并且第三序列具有SEQ ID NO：19中列出的序列；

第一序列具有SEQ ID NO：23中列出的序列，第二序列具有SEQ ID NO：11中列出的序列，并且第三序列具有SEQ ID NO：27中列出的序列；

第一序列具有SEQ ID NO：23中列出的序列，第二序列具有SEQ ID NO：11中列出的序列，并且第三序列具有SEQ ID NO：31中列出的序列；或者

第一序列具有SEQ ID NO：23中列出的序列，第二序列具有SEQ ID NO：11中列出的序列，并且第三序列具有SEQ ID NO：35中列出的序列，

还可以包括位置38处的缬氨酸残基。

另外地或可替代地，本发明的特异性结合元件还可以包括CH3结构域的位置101处的缬氨酸残基或氨基酸缺失(如图1A所示)。特别地，特异性结合元件，其包括第一序列、第二序列和第三序列，其中

第一序列具有SEQ ID NO：23中列出的序列，第二序列具有SEQ ID NO：11中列出的序列，并且第三序列具有SEQ ID NO：19中列出的序列；

第一序列具有SEQ ID NO：23中列出的序列，第二序列具有SEQ ID NO：11中列出的序列，并且第三序列具有SEQ ID NO：27中列出的序列；

第一序列具有SEQ ID NO：23中列出的序列，第二序列具有SEQ ID NO：11中列出的序列，并且第三序列具有SEQ ID NO：31中列出的序列；

第一序列具有SEQ ID NO：23中列出的序列，第二序列具有SEQ ID NO：11中列出的序列，并且第三序列具有SEQ ID NO：35中列出的序列；

可以包括CH3结构域的位置101处的氨基酸缺失。

可替代地，本发明的特异性结合元件还可以包括CH3结构域的位置101处的丙氨酸残基(A)(如图1A所示)。特别地，特异性结合元件，其包括第一序列、第二序列和第三序列，其中

第一序列具有SEQ ID NO：47中列出的序列，第二序列具有SEQ ID NO：11中列出的序列，并且第三序列具有SEQ ID NO：70中列出的序列，其中，特异性结合元件的CH3结构域的位置84.1、85.3、和113处的残基分别为脯氨酸(P)、苏氨酸(T)和精氨酸(R)，可以包括CH3结构域的位置101处的丙氨酸残基(A)。

在优选的实施方案中，本发明的特异性结合元件包括CH3结构域，该CH3结构域包括、具有或由SEQ ID NO：24、28、32、36、39、44、48、71、75或79中列出的序列组成，优选具有SEQ ID NO：28、32、36、39、44、48、75或79中列出的序列的CH3结构域。

本发明的特异性结合元件可以包括CH3结构域，该CH3结构域包括、具有或由SEQID NO：24、28、32、36、39、44、48、71、75或79中列出的序列组成，其中，SEQ ID NO：24、28、32、36、39、44、48、71、75或79中显示的序列的紧邻(immediate)C端处的赖氨酸残基(K)已经被删除。

此外，本发明的特异性结合元件可以包括免疫球蛋白G分子的CH2结构域，诸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子的CH2结构域。优选地，本发明的特异性结合元件包括IgG1分子的CH2结构域。该CH2结构域可以具有SEQ ID NO：6中列出的序列。

特异性结合元件的CH2结构域可以包括一个或多个突变，该一个或多个突变减少或取消(abrogate)CH2结构域与一个或多个Fcγ受体和/或与补体(complement)的结合，Fcγ受体诸如FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIII。本发明人假定减少或取消与Fcγ受体的结合将降低或消除由抗体分子介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)。类似地，预计减少或取消与补体的结合减少或消除由抗体分子介导的补体依赖性细胞毒性(CDC)。降低或取消CH2结构域与一种或多种Fcγ受体和/或补体的结合的突变是本领域已知的(Wang等,2018)。这些突变包括Bruhns等,2009和Hezareh等,2001中描述的“LALA突变”，该“LALA突变”涉及用丙氨酸取代CH2结构域的IMGT位置1.3和1.2处的亮氨酸残基(L1.3A和L1.2A)。可替代地，也已知通过保守的N链接糖基化位点的突变产生无糖基化(aglycosylated)抗体会降低IgG1效应子功能，该保守的N链接糖基化位点的突变通过将CH2结构域的IMGT位置84.4处的天冬酰胺(N)突变为丙氨酸、甘氨酸或谷氨酰胺(N84.4A、N84.4G或N84.4Q)进行(Wang等,2018)。作为进一步的替代方案，已知通过将CH2结构域的IMGT位置114处的脯氨酸突变为丙氨酸或甘氨酸(P114A或P114G)来减少补体活化(C1q结合)和ADCC(Idusogie等,2000；Klein等,2016)。还可以将这些突变组合，以便生成具有进一步减少或不具有ADCC或CDC活性的抗体分子。

因此，特异性结合元件可以包括CH2结构域，其中CH2结构域包括：

(i)位置1.3和1.2处的丙氨酸残基；和/或

(ii)位置114处的丙氨酸或甘氨酸；和/或

(iii)位置84.4处的丙氨酸、谷氨酰胺或甘氨酸；

其中，氨基酸残基编号根据IMGT编号方案。

在优选的实施方案中，特异性结合元件包括CH2结构域，其中CH2结构域包括：

(i)位置1.3处的丙氨酸残基；和

(ii)位置1.2处的丙氨酸残基；

其中，氨基酸残基编号根据IMGT编号方案。

例如，CH2结构域可以具有SEQ ID NO：5中列出的序列。

在可替代的优选的实施方案中，抗体分子包括CH2结构域，其中CH2结构域包括：

(i)位置1.3处的丙氨酸残基；

(ii)位置1.2处的丙氨酸残基；和

(iii)位置114处的丙氨酸；

其中，氨基酸残基编号根据IMGT编号方案。

例如，CH2结构域可以具有SEQ ID NO：82中列出的序列。

在优选的实施方案中，除了位于特异性结合元件的恒定结构域中的PD-L1抗原结合位点以外，特异性结合元件可以包括结合一个或多个其他抗原的一个或多个其他抗原结合位点。该一个或多个其他抗原结合位点优选特异性地结合它们的同源抗原。

该一个或多个其他抗原结合位点可以结合PD-L1或其他抗原。因此，特异性结合元件可以为多特异性分子，例如双特异性、三特异性或四特异性分子，优选双特异性分子。在优选的实施方案中，特异性结合元件能够同时结合至PD-L1、以及一个或多个其他抗原。

已知抗体分子具有包括离散结构域的模块化结构，该离散结构域可以以多种不同方式组合以创建多特异性抗体格式(antibody format)，例如双特异性、三特异性或四特异性抗体格式。例如，示例性的多特异性抗体格式在Spiess等(2015)和Kontermann(2012)中描述。本发明的特异性结合元件可以以这种多特异性抗体格式被利用。这具有以下额外优势：通过特异性结合元件的恒定结构域、例如CH3结构域中存在抗原结合位点，而将其他抗原结合位点引入这样的多特异性抗体格式中。

例如，本发明的特异性结合元件可以为异二聚体抗体分子，诸如异二聚体完整免疫球蛋白分子或其片段。在此情况下，抗体分子的一部分将具有如本文所述的一个或多个序列。例如，在本发明的特异性结合元件为双特异性异二聚体抗体分子的情况下，该特异性结合元件可以包括重链，该重链包括如本文所述的CH3结构域，该重链与结合除了PD-L1以外的抗原的重链配对。用于制备异二聚体抗体的技术在本领域中是已知的，并且该技术包括杵臼(knobs-into-holes,KIHs)工艺，该工艺涉及建造抗体分子的CH3结构域以创建“杵(knob)”或“杵(hole)”以促进链的异源二聚化(chain heterodimerization)。可替代地，可以通过将电荷对引入抗体分子中以通过静电排斥避免CH3结构域的同源二聚化并通过静电吸引指导异源二聚化，来制备异二聚体抗体。异二聚体抗体格式的实施例包括CrossMab、mAb-Fv、SEED-body和KIH IgG。

可替代地，本发明的多特异性特异性结合元件可以包括完整的免疫球蛋白分子或其片段、以及一个或多个额外的抗原结合部分。例如，抗原结合部分可以为Fv、scFv或单结构域抗体，并且可以与完整的免疫球蛋白分子或其片段融合。包括与完整的免疫球蛋白分子融合的额外的抗原结合部分的多特异性抗体分子的实施例包括DVD-IgG、DVI-IgG、scFv4-IgG、IgG-scFv和scFv-IgG分子(Spiess等,2015；图1)。例如，包括与免疫球蛋白片段融合的额外的抗原结合部分的多特异性抗体分子的实施例包括scDiabody-CH3、Diabody-CH3和scFv-CH3 KIH，该免疫球蛋白片段包括CH3结构域(Spiess等,2015；图1)。

其他合适的多特异性格式对技术人员将是显而易见的。

在优选的实施方案中，根据本发明的特异性结合元件包括第二抗原结合位点，其中该第二抗原结合位点优选为基于CDR的抗原结合位点。术语“基于CDR的抗原结合位点”是指由六个CDR残基构成的特异性结合元件可变区的抗原结合位点。

第二抗原结合位点优选特异于检查点抑制剂、共刺激分子或肿瘤相关联抗原。

针对诸如肿瘤相关联抗原的给定抗原的抗体分子、以及这样的抗体分子的CDR序列的确定完全在技术人员的能力范围之内，并且许多适合的技术在本领域是已知的。此外，针对各种免疫系统调节器的包括CDR序列的抗体，在本领域是已知的。因此，技术人员在制备特异性结合元件中将没有困难，该特异性结合元件除了本文描述的PD-L1结合位点之外，包括用于第二抗原的基于CDR的抗原结合位点。

在某些实施例中，本发明的特异性结合元件不包括基于CDR的抗原结合位点。

本发明的特异性结合元件还可以包括本文所公开的结构环、CH3结构域、CH2结构域、CH2和CH3结构域、CDR、VH结构域、VL结构域、轻链或重链序列的变体。可以通过序列改变、或突变、以及筛选的方法来获得适合的变体。在优选的实施方案中，包括一种或多种变体序列的特异性结合元件保持了亲本特异性结合元件的一个或多个功能特性，诸如对PD-L1的结合特异性和/或结合亲和性。例如，包括一种或多种变体序列的特异性结合元件，优选结合至具有与(亲本)特异性结合元件相同的亲和性或比(亲本)特异性结合元件更高的亲和性的PD-L1。该亲本特异性结合元件是不包括已经被合并到变体特异性结合元件中的氨基酸取代、缺失和/或***的特异性结合元件。

例如，本发明的特异性结合元件可以包括与本文公开的结构环、CH3结构域、CH2结构域、CH2和CH3结构域、CDR、VH结构域、VL结构域、轻链或重链序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％的序列同一性的结构环、CH3结构域、CH2结构域、CH2和CH3结构域、CDR、VH结构域、VL结构域、轻链或重链序列。

在优选的实施方案中，本发明的特异性结合元件包括CH3结构域序列，该CH3结构域序列与SEQ ID NO：24、28、32、36、39、44、48、71、75或79，优选SEQ ID NO：28、32、36、39、44、48、71、75或79，最优选SEQ ID NO：32、44、48、71、75或79中列出的CH3结构域序列具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％的序列同一性。特别地，本发明的特异性结合元件包括CH3结构域，该CH3结构域与SEQ ID NO：24中列出的CH3结构域序列具有至少96％的序列同一性。

在进一步优选的实施方式中，本发明的特异性结合元件包括CH2结构域序列，该CH2结构域序列与SEQ ID NO：5或6中列出的CH2结构域序列具有至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％的序列同一性。

在另一优选的实施方式中，本发明的特异性结合元件包括序列，或由该序列构成，该序列与SEQ ID NO：25、26、29、30、33、34、37、38、40、41、45、46、49、50、72、73、76、77、80或81，最优选SEQ ID NO：45、46、49、50、72、73、76、77、80或81中列出的序列具有至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％的序列同一性。在可替代的最优选的实施方案中，本发明的特异性结合元件包括序列，或由该序列构成，该序列与SEQ ID NO：33或34中列出的序列具有至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％的序列同一性。

表格9A、B和C示出了，在实施例中制备的分子的情况下，与亲本分子的解离速率相比，当结合至PD-L1时，在Fcab的解离速率未增加的情况下，无法修饰结构环中的某些残基。

因此，在以下情况下：

(i)特异性结合元件包括CH3结构域序列，该CH3结构域序列由其与SEQ ID NO：24、28、32、36、39、44、48、71、75或79中列出的(亲本)序列的序列同一性定义；或者

(ii)特异性结合元件包括序列，或由该序列构成，如前述段落或本文其他部分所列出的，该序列由其与SEQ ID NO：25、26、29、30、33、34、37、38、40、41、45、46、49、50、72、73、76、77、80或81中列出的(亲本)序列的序列同一性定义，

与亲本序列相比，优选保持CH3结构域的位置14、15或16处的氨基酸缺失，和/或优选不修饰CH3结构域的位置17、18处的氨基酸；

与亲本序列相比，优选不修饰CH3结构域的位置77处、且可选地位置45.3处的氨基酸；和/或

与亲本序列相比，优选不修饰CH3结构域的位置94处、且可选地位置92处的氨基酸。

序列同一性通常参考算法GAP来定义(Wisconsin GCG软件包,Accelerys公司,美国圣地亚哥)。GAP使用内德勒曼(Needleman)和文施(Wunsch)算法来比对两个完整的序列，从而使匹配数最大化并使空位(gap)数最小化。通常，使用缺省参数(default parameter)，空位创建罚分(gap creation penalty)等于12，且空位延伸罚分(gap extensionpenalty)等于4。可以优选GAP的使用，但也可以使用其他算法，例如通常采用缺省参数的BLAST(其使用Altschul等,1990的方法)、FASTA(其使用Pearson和Lipman,1988的方法)、或史密斯-沃特曼算法(Smith和Waterman,1981)、或上述Altschul等,1990的TBLASTN程序。特别地，可以使用psi-Blast算法(Altschul等,1997)。

本发明的特异性结合元件还可以包括：与本文公开的结构环、CH3结构域、CH2结构域、CH2和CH3结构域、CDR、VH结构域、VL结构域、轻链或重链序列相比，具有一个或多个氨基酸序列改变(氨基酸残基的添加、缺失、取代和/或***)，优选20个以下的改变、15个以下的改变、10个以下的改变、5个以下的改变、4个以下的改变、3个以下的改变、2个以下的改变、或1个改变的结构环、CH3结构域、CH2结构域、CH2和CH3结构域、CDR、VH结构域、VL结构域、轻链或重链序列。特别地，可以在特异性结合元件的一个或多个框架区中形成改变。

在优选的实施方案中，本发明的特异性结合元件可以包括CH3结构域序列，该CH3结构域序列与SEQ ID NO：24、28、32、36、39、44、48、71、75或79中列出的CH3结构域序列相比具有一个或多个氨基酸序列改变(氨基酸残基的添加、缺失、取代和/或***)，优选20个以下的改变、15个以下的改变、10个以下的改变、5个以下的改变、4个以下的改变、3个以下的改变、2个以下的改变、或1个改变。

在进一步优选的实施方案中，本发明的特异性结合元件包括CH2结构域序列，该CH2结构域序列与SEQ ID NO：5或6中列出的CH2结构域序列相比具有一个或多个氨基酸序列改变(氨基酸残基的添加、缺失、取代和/或***)，优选20个以下的改变、15个以下的改变、10个以下的改变、5个以下的改变、4个以下的改变、3个以下的改变、2个以下的改变、或1个改变。

在进一步优选的实施方案中，本发明的特异性结合元件包括序列或由该序列构成，该序列与SEQ ID NO：25、26、29、30、33、34、37、38、40、41、45、46、49、50、72、73、76、77、80或81中列出的序列相比具有一个或多个氨基酸序列改变(氨基酸残基的添加、缺失、取代和/或***)，优选40个以下的改变、30个以下的改变、20个以下的改变、15个以下的改变、10个以下的改变、5个以下的改变、4个以下的改变、3个以下的改变、2个以下的改变、或1个改变。

还预期的是一种特异性结合元件，其与用于结合至PD-L1的本发明的特异性结合元件竞争、或结合至与本发明的特异性结合元件相同的PD-L1上的表位，其中，该特异性结合元件优选包括位于特异性结合元件的CH3结构域中的PD-L1抗原结合位点。用于确定两种抗体对抗原的竞争的方法在本领域中是已知的。例如，可以使用表面等离子体共振、诸如生物大分子相互作用分析仪(Biacore)来确定两种抗体对结合至抗原的竞争。用于绘制由抗体结合的表位的方法在本领域中同样是已知的。

本发明的特异性结合元件可以结合至人PD-L1和/或食蟹猴PD-L1。优选地，本发明的特异性结合元件结合至人PD-L1。

本发明的特异性结合元件优选能够结合至在细胞表面上表达的PD-L1。该细胞优选为癌细胞。

在特异性结合元件包括特异于第二抗原的、诸如基于CDR的抗原结合位点的第二抗原结合位点的情况下，特异性结合元件优选地能够同时结合至PD-L1和该第二抗原。优选地，特异性结合元件能够同时结合至PD-L1和第二抗原，其中，PD-L1和第二抗原在单个细胞的表面上表达，或在两个独立的细胞的表面上表达。

本发明的特异性结合元件优选地以5nM、4nM、3nM或2nM的亲和性(K_D)或更大的亲和性结合至单体PD-L1、优选人单体PD-L1。优选地，本发明的特异性结合元件以2nM的亲和性(K_D)或更大的亲和性结合至PD-L1、优选人PD-L1。

本发明的特异性结合元件优选地以20nM、19nM、18nM、17nM或16nM的亲和性(K_D)或更大的亲和性结合至在细胞表面上表达的PD-L1、优选人PD-L1。优选地，本发明的特异性结合元件以16nM的亲和性(K_D)或更大的亲和性结合至在细胞表面上表达的PD-L1、优选人PD-L1。

例如，可以通过表面等离子体共振(SPR)、诸如Biacore来确定特异性结合元件对同源抗原、诸如PD-L1的结合亲和性。可以通过流式细胞计(flow cytometry)来确定特异性结合元件对在细胞表面上表达的同源抗原、诸如PD-L1的结合亲和性。

Fcab具有比单克隆抗体更小的结合界面，因为Fcab的结合位点与位于近处的两个结合位点形成相对紧凑的抗体片段。相比之下，典型的mAb的Fab臂(arm)被柔性铰链区分开。与典型的mAb的抗原结合位点相比，Fcab的两个抗原结合位点也在空间上相互靠近。基于两个结合位点的这种较小的结合界面和减小的柔性，令人惊讶的是，抗PD-L1 Fcab能够以与特异于PD-L1的单克隆抗体类似的亲和性和效价(potency)结合至PD-L1并抑制PD-L1。

当特异性结合元件为完整的免疫球蛋白分子的形式时，本文中也称为mAb²，特异性结合元件可以在T细胞活化试验中、诸如DO11.10试验中具有9nM以下、8nM以下、7nM以下、6nM以下、5nM以下、4nM以下、3nM以下、或者2nM以下，优选2nM以下的EC₅₀。

当特异性结合元件为由CH3结构域、CH2结构域和位于CH2结构域的N端处的截短的免疫球蛋白铰链区构成的Fcab形式时，特异性结合元件可以在T细胞活化试验中、诸如DO11.10试验中具有2nM以下、1nM以下或0.5nM以下，优选0.5nM以下的EC₅₀。

DO11.10试验是基于T淋巴细胞和B淋巴细胞杂交瘤细胞系的IL-2释放试验，并且可以用于本发明的特异性结合元件的功能性筛选。IL-2释放是T细胞活化的标记物。DO11.10试验可以为如本文实施例6中描述的DO11.10试验。

例如，DO11.10试验可以包括例如在实验培养基中、诸如在没有嘌呤毒素的完整DO11.10培养基中制备感兴趣的特异性结合元件的稀释物。可以将特异性结合元件与4×10⁵/ml的B细胞杂交瘤细胞1：1混合，该B细胞杂交瘤细胞用含有人PD-L1的慢病毒载体(lentiviral vector)转导，以在每孔、例如在96圆底板中存在2.46μM的OVA肽(例如，100μL的B细胞杂交瘤细胞/特异性结合元件)的情况下在实验培养基中过度表达人PD-L1(称为“B细胞杂交瘤细胞”)，并且可以在37℃、5％CO₂下将特异性结合元件温育1小时。可以将100μL体积实验培养基中的用空慢病毒载体转导的每ml 2×10⁵的DO11.10T细胞杂交瘤细胞(被称为“DO11.10 T细胞”；(例如，DO11.10 pLVX细胞))添加到100μL的B细胞杂交瘤细胞/特异性结合元件混合物中。随后，可以在细胞在37℃、5％CO₂下温育24小时之前将细胞混合。可以收集上清液并用小鼠IL-2酶联免疫吸附测定试剂盒(ELISA kit)(例如，来自eBioscience、88-7024-88或R&D系统、SM2000)进行试验。可以使用板读取器(platereader)在450nm处读取板，板读取器诸如带有Gen5软件,美国伯腾(BioTek)的板读取器。出于校正目的，可以从450nm的吸光度值中减去570nm的吸光度值。用于计算细胞因子浓度的标准曲线可以基于四参数逻辑曲线拟合(诸如，Gen5软件，BioTek)。可以将小鼠IL-2浓度对特异性结合元件的log浓度进行作图。所得到的曲线可以使用log(激动剂)对应答方程式(response equation)、例如使用GraphPad Prism进行拟合。

在DO11.10 T细胞活化试验的情况下，可以使用慢病毒转导方法论制备以空慢病毒载体转导的DO11.10 T细胞杂交瘤细胞，例如以使用Lenti-X HTX封装系统来生成含有空慢病毒载体pLVX的DO11.10细胞。可以将Lenti-X表达载体(pLVX)与Lenti-X HTX封装混合物一起共转染到Lenti-X 293T细胞系中以生成病毒。可以使用以Lenti-X HTX封装系统产生的慢病毒粒子来转导DO11.10细胞系。

在DO11.10 T细胞活化试验的情况下，可以使用慢病毒转导方法论、例如使用Lenti-X HTX封装系统，来制备用含有人PD-L1的慢病毒载体转导以过度表达人PD-L1的B细胞杂交瘤细胞、诸如LK35.2 B细胞杂交瘤细胞(ATCC、HB-98)。可以将含有人PD-L1 cDNA的Lenti-X表达载体(pLVX)与Lenti-X HTX封装混合物一起共转染到Lenti-X 293T细胞系中以生成病毒。可以使用以Lenti-X HTX封装系统产生的慢病毒载体来转导B细胞杂交瘤细胞系。

当特异性结合元件为完整的免疫球蛋白分子的形式时，本文中也称为mAb²，特异性结合元件可以在葡萄球菌肠毒素B(Staphylococcal Enterotoxin B,SEB)试验中具有5nM以下、4nM以下、3nM以下或者2nM以下，优选2nM以下的EC₅₀。

当特异性结合元件为由CH3结构域、CH2结构域和位于CH2结构域的N端处的截短的免疫球蛋白铰链区构成的Fcab的形式时，特异性结合元件可以在葡萄球菌肠毒素B(SEB)试验中具有5nM以下、4nM以下、3nM以下、2nM以下、1nM以下、0.5nM以下、0.3nM以下或0.2nM以下，优选0.2nM以下的EC₅₀。

葡萄球菌肠毒素B是一种超抗原，并结合至抗原呈递细胞(antigen presentingcell，APC)上的MHC II类分子、以及T细胞受体(TCR)的vβ链，从而引起T细胞的非特异性活化和细胞因子释放。不需要存在抗原特异性TCR用于T细胞活化。SEB试验使用具有生理水平的检查点抑制剂的经刺激的人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，并且SEB试验可以用于确认在人系统中T细胞活化被特异性结合元件增强。

SEB试验可以为如本文实施例7中描述的SEB试验。

例如，SEB试验可以包括：

(i)例如通过聚蔗糖梯度分离(Ficoll gradient separation)而将PBMC从白细胞锥(leukocyte cones)分离。例如可以使用人CD4+T细胞分离试剂盒(例如来自美天旎生物技术有限公司(Mitenyi Biotec Ltd)，130-096-533)来分离CD4+T细胞。可以通过涡流(vortexing)将人T-活化剂CD3/CD28免疫磁珠(例如，来自生命技术(Life technologies)，11131D)重悬。可以将珠子转移到无菌的15ml试管中，并且可以添加具有10％FBS(例如，来自生命技术，10270106)和1×青霉素链霉素(Penicillin Streptomycin)(例如，来自生命技术，15140122)的10ml RPMI(例如，来自生命技术，61870044)来洗涤免疫磁珠。可以丢弃上清液。可以将具有10％FBS、1×青霉素链霉素溶液和50IU/ml重组人IL2(例如，来自派普泰克(Peprotech)，200-02-50μg)的RPMI中的1.0×10⁶个细胞/ml的CD4+T细胞的所需量以3:1磁珠与细胞比例转移至T75烧瓶(例如，来自葛莱纳第一生化(Greiner Bio-one)，690195)，并在37℃+5％CO₂下温育。3天后，可以将细胞轻轻重悬并计数。可以通过添加新鲜培养基(例如，RPMI-10％FBS+青霉素链霉素溶液1X+50IU/ml rhuIL2)，将细胞密度保持在0.8-1×10⁶个细胞/ml之间。在第7天或第8天，可以去除CD3/28磁珠。可以将CD4+T细胞以1×10⁶个细胞/ml新鲜培养基RPMI-10％FBS+青霉素链霉素溶液1X与减少的10IU/ml rhuIL2下静置过夜；

(ii)例如使用人泛(Pan)单核细胞分离试剂盒(诸如来自美天旎生物技术有限公司，130-096-537)、例如使用(i)中描述的方法，从人PBMC分离未接触的单核细胞。可以使用人Mo-DC分化培养基(诸如来自美天旎生物技术有限公司，130-094-812)来将单核细胞分化成iDC；和/或

(iii)例如在AIM培养基(诸如来自Gibco，12055-091)中制备感兴趣的特异性结合元件的稀释物。例如如(ii)中所述制备的MoiDC可以与来自相同供体的T细胞以1:10的比例混合(5ml的2×10⁵个细胞/ml的iDC可以与5ml的2×10⁶个细胞/ml的T细胞组合)。可以将20μl的0.1μg/ml的SEB(例如来自西格玛(Sigma)，S4881)添加到10ml的细胞中。在圆底96孔板中，可以将100μl的细胞/SEB混合物添加到100μl的特异性结合元件稀释物中，从而用每孔200μl培养基(例如AIM培养基)中的0.1ng/ml SEB得到10⁴个iDC细胞与10⁵个T细胞的比例。细胞可以在37℃、5％CO₂下温育4天。可以使用ELISA、诸如人IFNγELISA试剂盒(例如，来自R&D系统，PDIF50)，针对IFNγ来试验上清液。可以使用由PBA(DPBS，2％BSA(诸如来自西格玛，A7906-100G))以1:30稀释的上清液来执行该试验。可以将人IFNγ的浓度对特异性结合元件的log浓度作图。所得到的曲线可以使用log(激动剂)对应答方程式、例如在GraphPadPrism软件中进行拟合。

特异性结合元件可能能够以30nM以下、20nM以下、15nM以下、14nM以下、13nM以下、12nM以下或11nM以下，优选11nM以下的EC₅₀阻断PD-L1与PD-1之间的相互作用，优选人PD-L1和人PD-1。

当特异性结合元件为完整的免疫球蛋白分子的形式时，本文中也称为mAb²，特异性结合元件可能能够以50nM以下、45nM以下、40nM以下或30nM以下，优选30nM以下的EC₅₀阻断PD-L1与CD80之间的相互作用，优选人PD-L1和人CD80。

当特异性结合元件为由CH3结构域、CH2结构域和位于CH2结构域的N端处的截短的免疫球蛋白铰链区构成的Fcab的形式时，特异性结合元件可能能够以20nM以下、15nM以下、14nM以下、13nM以下、12nM以下、11nM以下、10nM以下，优选10nM以下的EC₅₀阻断PD-L1和CD80之间的相互作用，优选人PD-L1和人CD80。

用于测试本发明的特异性结合元件阻断人PD-L1、和人PD-1或人CD80之间的相互作用的能力的方法在本领域中是已知的，并在本文中进行了描述。例如，可以使用基于细胞的受体结合试验来测试人PD-L1、和人PD-1或人CD80之间的相互作用的阻断。可以将2μg/mL的生物素化人PD-L1与滴定浓度范围从400nM到3pM的Fcab一起温育1小时。该混合物可以与过度表达人PD-1或人CD80的细胞、诸如HEK293细胞一起温育再一小时。可以使用链霉亲和素647检测细胞上结合的生物素化人PD-L1的水平，并且可以使用FACS测量荧光水平，借此，所检测的荧光水平指示PD-L1与细胞上表达的PD-1或人CD80的水平。

特异性结合元件可以具有60℃以上、61℃以上、62℃以上、63℃以上、64℃以上、65℃以上、66℃以上、67℃以上或68℃以上，优选65℃以上、66℃以上、67℃以上或68℃以上，更优选66℃以上、67℃以上或68℃以上的解链温度。当测量解链温度时，特异性结合元件可以为完整的免疫球蛋白分子的形式，本文中也称为mAb²。

本发明的特异性结合元件的解链温度可以通过已知的方法来测量。例如，本发明的特异性结合元件的解链温度可以通过差示扫描热量法(differential scanningcolorimetry,DSC)或差示扫描荧光法(differential scanning fluorimetry,DSF)进行测量。

治疗性抗体的聚集可能导致药物效力的丧失，并且可能引起不必要的免疫原性。因此，为此目的，优选显示很少聚集或不显示聚集的抗体。当特异性结合元件在水溶液中时，该特异性结合元件可以显示不超过5％、4％或3％，优选3％的聚集。例如，可以使用尺寸排除色谱(SEC)来确定水溶液中特异性结合元件的聚集。

本发明的特异性结合元件可以缀合到生物活性剂、治疗剂或可检测标记。在这种情况下，该特异性结合元件可以被称为缀合物(conjugate)。这样的缀合物在如本文所述的疾病和病症的治疗中获得应用。

例如，特异性结合元件可以缀合到免疫系统调节器、细胞毒分子、放射性同位素或可检测标记。免疫系统调节器或细胞毒分子可以是细胞因子。免疫系统调节器还可以是细胞表面受体或其生物活性片段，例如，包括受体的配体结合结构域或由其构成的片段。可替代地，免疫系统调节器可以是例如细胞表面受体的配体、例如肽配体，或者是该配体的生物活性片段、例如包括配体的受体结合结构域或由其构成的片段。可检测标记可以是放射性同位素，例如，非治疗性放射性同位素。

特异性结合元件可以通过肽键或接头(linker)而缀合到生物活性剂、治疗剂或可检测标记，即，在包括所述生物活性剂、治疗剂或可检测标记以及特异性结合元件或其多肽链组件(polypeptide chain component)的融合多肽(fusion polypeptide)内。用于缀合的其他方式包括化学缀合，特别是使用双功能试剂的交联(例如，采用双试剂(DOUBLE-REAGENTS)^TM交联试剂选择指南(Cross-linking Reagents Selection Guide)，皮尔斯(Pierce))。

因此，特异性结合元件以及生物活性剂、治疗剂或可检测标记可以直接相互连接，例如通过任何适合的化学键或通过接头，例如肽接头。

肽接头可以是短的(2-20个、优选2-15个氨基酸的残基延伸)。肽接头序列的适合实施例在本领域中是已知的。可以使用一个或多个不同的接头。接头的长度可以是约5个氨基酸。

例如，化学键可以是共价键或离子键。共价键的实施例包括肽键(酰胺键)和二硫键。例如，特异性结合元件以及生物活性剂、治疗剂或可检测标记(诊断剂)可以例如通过肽键(酰胺键)共价链接。生物活性剂、治疗剂或可检测标记可以通过共价键、例如肽键(酰胺键)直接连接至特异性结合元件的C端或N端。在特定实施方案中，生物活性剂、治疗剂或可检测标记通过肽键(酰胺键)直接连接至特异性结合元件的N端。因此，特异性结合元件以及生物活性剂、治疗剂或可检测标记(诊断剂)可以作为单链多肽而产生(分泌(secrete))。

本发明还提供了编码本发明的抗体分子的分离的核酸。技术人员使用本领域公知的方法制备这样的核酸将没有困难。分离的核酸可以用于表达本发明的特异性结合元件，例如通过在细菌、酵母、昆虫或哺乳动物宿主细胞中的表达。优选的宿主细胞是哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、人胚胎肾细胞(HEK)或骨髓瘤细胞(NS0)。核酸通常将以用于表达的重组载体的形式提供。

包括此类核酸和载体的体外宿主细胞是本发明的一部分，该体外宿主细胞用于表达本发明的特异性结合元件的用途也是本发明的一部分，该特异性结合元件随后可以从细胞培养物(culture)中纯化，且可选地配制成药物组合物。因此，本发明进一步提供了一种产生本发明的特异性结合元件的方法，该方法包括在用于产生特异性结合元件的条件下培养本发明的重组宿主细胞。如上所述的培养适合宿主细胞的方法在本领域是公知的。该方法可以进一步包括分离和/或纯化特异性结合元件。该方法还可以包括将特异性结合元件、可选地与如下文描述的药学可接受赋形剂或其他物质一起配制成药物组合物。

已知PD-L1在许多癌细胞上、以及免疫系统的细胞上表达。

因此，本发明的特异性结合元件可以用于治疗患者的癌症的方法中。该患者优选是人类患者。

待使用本发明的特异性结合元件治疗的癌症的细胞可以例如在它们的细胞表面上表达PD-L1。在一个实施方案中，可能已经确定待治疗的癌症的细胞例如在它们的细胞表面上表达PD-L1。用于确定细胞表面上的抗原表达的方法在本领域中是已知的，并且包括例如流式细胞术。

已经在临床试验中研究了使用抗PD-L1或抗PD-1抗体针对各种类型癌症的治疗，并显示出了满意的结果。这些癌症包括实体肿瘤，诸如卵巢癌、***癌、结直肠癌、纤维肉瘤、肾细胞癌、黑素瘤(晚期转移性黑素瘤)、胰腺癌、乳腺癌、多形性胶质母细胞瘤、肺癌(诸如非小细胞肺癌和小细胞肺癌)、头颈癌(诸如头颈部鳞状细胞癌)、胃癌(stomach cancer)(胃癌(gastric cancer))、膀胱癌、***、子宫癌(子宫内膜癌、子宫***)、外阴癌、睾丸癌、***癌、食道癌、肝细胞癌、鼻咽癌、默克尔细胞癌、间皮瘤、DNA错配修复缺陷结直肠癌、DNA错配修复缺陷子宫内膜癌、甲状腺癌、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)、非霍奇金淋巴瘤(诸如弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、无痛性非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤)、白血病(诸如慢性淋巴细胞白血病、髓性白血病、急性类淋巴母细胞(lymphoblastoid)白血病、或慢性类淋巴母细胞白血病)、多发性骨髓瘤和周围T细胞淋巴瘤。因此，本发明的特异性结合元件可以在这些癌症的治疗中获得应用。已知或预计这些癌症的肿瘤含有表达P-L1的免疫细胞、诸如肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。

特别地，已经在临床试验中研究了使用抗PD-L1抗体治疗黑素瘤、结直肠癌、乳腺癌、膀胱癌、肾细胞癌、胃癌、头颈癌(诸如头颈部鳞状细胞癌)、间皮瘤、肺癌(诸如非小细胞肺癌)、卵巢癌、默克尔细胞癌、胰腺癌、黑素瘤和肝细胞癌，并显示出了满意的结果。因此，待使用本发明的抗体分子治疗的癌症可以是黑素瘤、结直肠癌、乳腺癌、膀胱癌、肾细胞癌、膀胱癌、胃癌、头颈癌(诸如头颈部鳞状细胞癌)、间皮瘤、肺癌(诸如非小细胞肺癌)、卵巢癌、默克尔细胞癌、胰腺癌、黑素瘤或肝细胞癌。

在该应用涉及特定类型的癌症的情况下，诸如乳腺癌，这涉及相关组织的恶性转化，在这种情况下为乳腺组织。源自不同组织、例如卵巢组织的恶性转化的癌症，可能在身体的其他位置、诸如乳腺中引起转移性病变，但并不因此就是本文所提及的乳腺癌，而是卵巢癌。

癌症可以为原发的(primary)或继发的(secondary)癌症。因此，本发明的特异性结合元件可以用于治疗患者的癌症的方法中，其中，该癌症是原发肿瘤和/或肿瘤转移(tumour metastasis)。

还预计本发明的特异性结合元件在感染性疾病的治疗中获得应用，感染性疾病诸如病毒性、细菌性、真菌性和/或寄生性感染。优选地，该感染性疾病为病毒性、细菌性或真菌性疾病；更优选为病毒性或细菌性疾病；最优选为病毒性疾病。该感染性疾病可以为慢性的或急性的，但优选为慢性的。

可以使用根据本发明的特异性结合元件治疗的病毒性疾病的实施例包括：人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、流感病毒感染、肠病毒感染、乙型肝炎病毒(HBV)感染、丙型肝炎病毒(HCV)感染、甲型肝炎病毒(HAV)感染、丁型肝炎病毒(HDV)感染和戊型肝炎病毒(HEV)感染、呼吸道合胞病毒(RSV)感染、疱疹病毒(诸如爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barrvirus)、单纯性疱疹病毒1(HSV-1)、单纯性疱疹病毒2(HSV-2)、巨细胞病毒(CMV))感染、和***瘤病毒感染。

可以用本发明的特异性结合元件治疗的细菌性疾病的实施例包括：结核分支杆菌感染、革兰氏阴性菌(gram-negative bacteria)(诸如不动杆菌属(Acinetobacter)、克雷伯菌属(Klebisella)、肠杆菌属(Enterobacter))感染、格兰仕阳性菌(gram-positivebacteria)(诸如艰难梭菌属(Clostridium difficile)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus))感染、以及李斯特菌属(Listeria)(例如产单核细胞李斯特菌(Listeriamonocytogenes))感染。

可以用本发明的特异性结合元件治疗的真菌性疾病的实施例包括：曲霉属(Aspergillus)感染、和念珠菌属(Candidia)感染。

可以用本发明的特异性结合元件治疗的寄生性疾病的实施例包括：疟疾感染、弓形虫感染、和利什曼虫(Leishmania)感染。

还预计本发明的特异性结合元件在炎症、与炎症相关联的疾病和病症、以及炎性疾病中获得应用，诸如中风，中风相关炎症，和血管炎症或血管炎、例如中/大血管血管炎，或者中央和/或周围神经系统的血管炎。

本发明的特异性结合元件被设计为用于患者、优选人类患者的治疗的方法中。特异性结合元件将通常以药物组合物的形式施用，所述药物组合物可以包括除了特异性结合元件之外的至少一种组分，诸如药学可接受赋形剂。例如，除了活性成分之外，本发明的药物组合物可以包括药学可接受赋形剂、载体(carrier)、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员公知的其他材料。这样的材料应当是无毒的，并且不应干扰活性成分的功效。载体或其他材料的确切性质将取决于施用途径，施用途径可以是通过注射，例如，静脉内注射或皮下注射。特异性结合元件可以静脉内施用或皮下施用。

液体药物组合物一般包括液体载体，诸如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐溶液、葡萄糖或其他糖溶液或甘醇，诸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。

对于静脉内注射或在患病位点(site of affliction)处的注射，特异性结合元件或包括特异性结合元件的药物组合物优选为无热原的、并具有适合的pH值、等渗性和稳定性的肠道外可接受水溶液的形式。本领域相关技术人员完全能够使用例如等渗的媒介物(isotonic vehicles)来制备适合的溶液，该等渗的媒介物诸如氯化钠注射液、林格(Ringer’s)注射液、乳酸林格注射液。可以根据需要采用防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。制备药物制剂的许多方法是本领域技术人员已知的。例如参见Robinsoned.,Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。

根据待治疗的病症，可以单独地或与其他治疗联合地、与其他一种或多种治疗剂同时地、依序地、或作为与其他一种或多种治疗剂的联合制剂施用包括根据本发明的特异性结合元件的组合物。例如，可以与用于待治疗疾病、例如上文所述的癌症的现有治疗剂联合地施用本发明的特异性结合元件。例如，本发明的特异性结合元件可以与第二抗癌疗法联合施用给患者，诸如化疗，抗肿瘤疫苗接种(也称为癌症疫苗接种)，放疗，免疫疗法，溶瘤病毒(oncolytic virus)、嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)T细胞疗法，或激素疗法。

预计本发明的特异性结合元件可以用作抗癌疗法诸如化疗、抗肿瘤疫苗接种或放疗中的佐剂。不希望受到理论的限制，认为与单独用化疗、抗肿瘤免疫接种或放疗来实现相比，将特异性结合元件作为化疗、抗肿瘤疫苗接种或放疗的一部分施用给患者将触发针对癌症相关联的抗原PD-L1的更大的免疫应答。

因此，治疗患者的癌症的方法可以包括：与化学治疗剂、抗肿瘤疫苗、放射性核素、免疫治疗剂、溶瘤病毒、CAR-T细胞或用于激素疗法的药剂联合地向患者施用治疗有效量的根据本发明的特异性结合元件。该化学治疗剂、抗肿瘤疫苗、放射性核素、免疫治疗剂、溶瘤病毒、CAR-T细胞或用于激素疗法的药剂优选为用于讨论的癌症的化学治疗剂、抗肿瘤疫苗、放射性核素、免疫治疗剂、溶瘤病毒、CAR-T细胞或用于激素疗法的药剂，即，已经在治疗讨论的癌症中显示有效的化学治疗剂、抗肿瘤疫苗、放射性核素、免疫治疗剂、溶瘤病毒、CAR-T细胞或用于激素疗法的药剂。已经对讨论的癌症显示有效的适合的化学治疗剂、抗肿瘤疫苗、放射性核素、免疫治疗剂、溶瘤病毒、CAR-T细胞或用于激素疗法的药剂的选择完全在技术熟练的医师的能力范围之内。

例如，在该方法包括与化学治疗剂联合地向患者施用治疗有效量的根据本发明的特异性结合元件的情况下，该化学治疗剂可以选自由以下组成的组：紫杉烷(taxanes)、细胞毒抗生素、酪氨酸激酶抑制剂、聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(PARP)抑制剂、B_RAF酶抑制剂、烷化剂(alkylating agent)、铂类似物(platinum analogues)、核苷类似物(nucleoside analogues)、沙利度胺衍生物(thalidomide derivatives)、抗肿瘤化学治疗剂及其他。紫杉烷包括多西紫杉醇(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)和白蛋白结合型紫杉醇(nab-paclitaxel)；细胞毒抗生素包括放线菌素(actinomycin)、博来霉素(bleomycin)、蒽环类(anthracyclines)、多柔比星(doxorubicin)和戊柔比星(valrubicin)；酪氨酸激酶抑制剂包括舒尼替尼(sunitinib)、埃罗替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、阿西替尼(axitinib)、PLX3397、伊马替尼(imatinib)、可比替尼(cobemitinib)和曲美替尼(trametinib)；PARP抑制剂包括皮拉帕尼(piraparib)；B-Raf酶抑制剂包括威罗菲尼(vemurafenib)和达拉菲尼(dabrafenib)；烷化剂包括达卡巴嗪(dacarbazine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、替莫唑胺(temozolomide)；铂类似物包括顺羧酸铂(carboplatin)、顺氯氨铂(cisplatin)和奥沙利铂(oxaliplatin)；核苷类似物包括吉西他滨(gemcitabine)和阿扎胞苷(azacitidine)；抗肿瘤药包括氟达拉滨(fludarabine)。适用于本发明的其他化学治疗剂包括甲氨蝶呤(methotrexate)、黛菲替尼(defactinib)、恩替诺特(entinostat)、培美曲塞(pemetrexed)、卡培他滨(capecitabine)、艾日布林(eribulin)、伊立替康(irinotecan)、氟尿嘧啶(fluorouracil)和长春碱(vinblastine)。

用于癌症的治疗的疫苗接种策略已经在临床中实施并在科学文献(诸如Rosenberg,S.2000)内详细讨论。这主要涉及通过使用这些细胞作为免疫接种方法来提示免疫系统对自体或异源癌细胞表达的各种细胞标记物作出应答的策略，无论是否使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。GM-CSF在抗原呈递中引起强应答，并且在与所述策略一起采用时效果特别好。

在该方法包括与免疫治疗剂联合地向患者施用治疗有效量的根据本发明的特异性结合元件的情况下，该免疫治疗剂可以选自由以下组成的组：结合至检查点抑制剂、共刺激分子或可溶性因子的抗体，诸如结合至CTLA-4、LAG-3、TIGIT、TIM-3、VISTA、CD73、CSF-1R、KIR、OX40、CD40、HVEM、TGFB、IL-10、CSF-1的抗体。可替代地，该免疫治疗剂可以是一种或多种细胞因子或基于细胞因子的疗法，该细胞因子或基于细胞因子的疗法选自由以下组成的组：IL-2；缀合IL2、GM-CSF、IL-7、IL-12、IL-9、IL-15、IL-18、IL-21的前药；以及I型干扰素(type I interferon)。

施用可以是以“治疗有效量”，这是足以显示对患者的益处的量。这样的益处至少可以是至少一种症状的改善。因此，特定疾病的“治疗”是指至少一种症状的改善。施用的实际量、施用的速率和时序(time-course)将取决于正在治疗的疾病的性质和严重度、正在治疗的特定患者、个体患者的临床状况、障碍的原因、组合物的递送位点、特异性结合元件的类型、施用的方法、施用的方案、以及医师已知的其他因素。治疗的处方，例如，剂量的决定等，在全科医师和其他医生的职责之内，并且可以取决于正在治疗的疾病的症状和/或进展的严重度。特异性结合元件的适当剂量在本领域中是公知的(Ledermann等,1991；和Bagshawe等,1991)。可以使用本文中指明的具体剂量、或医师手册(Physician's DeskReference,2003)中指明的适用于所施用的特异性结合元件的具体剂量。特异性结合元件的治疗有效量或适合剂量可以通过比较其在动物模型中的体外活性和体内活性来确定。将小鼠和其他测试动物中的有效剂量外推至人的方法是已知的。确切的剂量将取决于许多因素，包括要治疗的区域的大小和位置，以及特异性结合元件的确切性质。在医师的判定下，可以以每日、每周两次、每周或每月间隔重复治疗。可以在手术之前和/或之后给予治疗，并且可以在外科治疗的解剖位点处直接施用或施加。

考虑到包括以下实验性例证的本公开，本发明的进一步的方面和实施方案对于本领域技术人员而言将是显而易见的。

本文中使用的“和/或”被视为两个指定特征或组件具有或不具有另一个中的每一个的具体公开。例如，“A和/或B”被视为(i)A，(ii)B和(iii)A和B中的每一个的具体公开，正如在本文中分别列出每一个一样。

除非上下文另有指示，否则上述特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方案，并且同样适用于所描述的所有方面和实施方案。

现在将通过实施例并参照上文描述的附图来说明本发明的某些方面和实施方案。

实施例

实施例1-抗人PD-L1Fcab的天然选择

1.1蛋白质生物素化

购买重组人PD-L1(R&D系统，157-B7)、人PD-1(R&D系统，1086-PD)和具有C端人IgG标签的小鼠PD-L1(R&D系统，1019-B7)，并使用闪电链接(Lightning Link)A型生物素化试剂盒(英诺华生物科学(Innova Biosciences)，370-0010)来进行生物素化。简单地，将100μg的冻干蛋白在100μl的PBS中重构至最终浓度为1mg/ml，并将10μl的改性剂试剂(ModifierReagent)添加到稀释的蛋白中并轻轻地混合。将该溶液添加到一瓶闪电链接混合物中、轻轻地重悬，并且将该混合物在室温下温育过夜。在将生物素化的蛋白在-80℃下储存在10μl的等分试样(aliquot)中之前，添加淬灭剂(quencher)溶液(10μl)并在室温下温育30分钟。

1.2噬菌体文库

在AB(残基11-18)和EF(残基92-101)环内具有随机性的展示人IgG1的CH3结构域(IMGT编号1.4-130)的天然噬菌体文库(

phage libraries)用于选择上述PD-L1抗原。使用链霉亲和素免疫磁珠(赛默飞世尔(Thermo Fisher)，11205D)及耦合到免疫磁珠的中性抗生物素蛋白(Neutravidin)结合蛋白(赛默飞世尔，31000)在三轮中选择文库，以分离结合至生物素化PD-L1Fc的噬菌体。此外，将人血浆的过量IgG Fc片段添加到各选择步骤中，以避免Fc结合剂的分离。

通过ELISA筛选用于结合至PD-L1和阳性结合物(positive binder)的输出(outputs)，该阳性结合物进行亚克隆(sub-cloned)，并使用易选择毕赤酵母表达试剂盒(EasySelect Pichia Expression Kit)(生命科技，K1740-01)在巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)中表达为可溶性Fcab(含有截短的铰链)。在选择的30个独特的Fcab克隆中，18个克隆在从噬菌体转移到可溶性表达平台时表达为可溶性蛋白。

1.3基于ELISA的阻断试验

在基于ELISA受体结合试验(RBA)中，使用(在实施例1.1中描述的)重组生物素化人PD-L1、和重组人PD-1Fc(R&D系统，1086-PD)或CD80 Fc(R&D系统，140-B1)，研究了人PD-L1结合Fcab阻断人PD-L1 Fc、和PD-1或CD80之间的相互作用的能力。

简单地，将重组人PD-1Fc或CD80 Fc以0.5或1.0Fc人l分别包被(coat)到马克西索普(Maxisorp)板(赛默飞世尔，439454)上。该板在4℃下温育过夜，在PBS中洗涤一次，并随后用含有1％吐温(Tween)的300μl PBS在室温下阻断2小时。将相关浓度的Fcab(0.5至500nM，2倍稀释物)、对照IgG Fc(10-10000nM，2倍稀释物)或对照抗体(0.010至10nM，2倍稀释物)与250ng/μl的生物素化PD-L1 Fc在100μl的PBS中、在室温下以450rpm摇动下温育1小时。测试对照IgG Fc直至浓度为10000nM，以确定任何非特异性阻断活性。所使用的对照mAb为抗人PD-L1 mAb(MIH1，昂飞生物科学(Affymetrix eBioscience)，14-5983-82)和PD-L1mAb YW243.55.S70(“S70”)(专利公开号：US 2013/0045202 A1)。

丢弃阻断溶液，并将生物素化PD-L1 Fc/Fcab或对照抗体混合物添加到马克西索普板，并在室温下、在450rpm摇动下温育1小时。板用300μl的PBS/吐温0.05％洗涤3次，接着用1×PBS洗涤3次。缀合到山葵过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)的链霉亲和素在PBS中以1:1000稀释，并将100μl添加到孔，并在4℃下、在450rpm摇动下温育1小时。板用300μl的PBS/吐温0.05％洗涤3次，接着用1×PBS洗涤3次。将100μl的四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)基质(eBioscience，00-4201-56)添加到各孔。在添加TMB后的2-10分钟之间，通过添加50μl的1M硫酸溶液来停止反应。在硫酸添加的30分钟内，在96孔板读取器中于450-630nm处读取OD，并使用GraphPad Prism软件(GraphPad软件有限公司)进行分析。

测试18个克隆，其中的三个，FS17-19、FS17-26和FS17-33能够阻断人PD-L1 Fc和PD-1之间的相互作用。对于这些克隆，执行全剂量响应RBA，并分析它们阻断PD-L1与CD80的相互作用的能力。FS17-19、FS17-26和FS17-33都显示出了对PD-L1:PD-1相互作用和PD-L1:CD80相互作用二者的有效的阻断活性(数据未示出)。

1.4Fcab与重组PD-L1的结合

通过使用BIAcore 3000(GE医疗保健(Healthcare))的表面等离子体共振测试了FS17-19、FS17-26和FS17-33与人和小鼠PD-L1 Fc的结合。

简单地，链霉亲和素传感器芯片(GE医疗保健，BR100032)用于将人PD-L1 Fc(实施例1.1中描述的)包被在流动池2上、将小鼠PD-L1 Fc(实施例1.1中描述的)包被在流动池4上，且流动池1上不进行包被，并将流动池1用作参照。人PD-L1 Fc和小鼠PD-L1 Fc在约10000RU下耦合。将在HBS-EP缓冲液中稀释的Fcab(GE医疗保健，BR100669)以10μM或3.3μM和3倍稀释物注射5分钟，然后在缓冲液中解离3分钟。由于Fcab在缓冲液中完全解离，因此不需要再生。使用BIA评估(BIAevaluation)3.2分析减去的数据(流动池2-流动池1、或者流动池4-流动池1)以识别结合。

结合数据(未示出)表明，FS17-19、FS17-26和FS17-33结合到人PD-L1Fc。也发现FS17-19与小鼠PD-L1 Fc的交叉反应较弱，但FS17-26和FS17-33没有交叉反应。

1.5表达人PD-L1、食蟹猴PD-L1、小鼠PD-L1、人CD80、小鼠CD80和人PD-1的HEK293 细胞的开发

使用Kpnl和Notl限制位点将人、小鼠和食蟹猴PD-L1序列(SEQ ID No：61、62和63)亚克隆到pcDNA5FRT载体(生命技术)中。对于人和小鼠CD80，以及人PD-1(SEQ ID No：65、66和64)，使用HindIII和Notl限制位点。然后使用Lipofectamine 2000(生命技术，11668-019)将这些载体转化为Flp-In T-REx 293细胞系(生命技术，R780-07)。细胞在含有10％FBS、100μg/ml潮霉素(Hygromycin)B(梅尔福德实验室有限公司(Melford LaboratoriesLtd)，Z2475)、和15μg/ml杀稻瘟菌素(Blasticidin)(梅尔福德实验室有限公司，B1105)的细胞培养基(DMEM)中生长3-4周，直到形成稳定转化的细胞的集落。这些集落在1μg/ml的脱氧土霉素(西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich)，D9891)的存在下扩增，并使用PE缀合的抗人PD-L1(MIH1)抗体(BD生物科学，557924)、PE缀合的抗小鼠PD-L1(MIH5)抗体(BD生物科学，558091)、PE缀合的抗人CD80抗体(L307.4，BD生物科学557227)、PE缀合的抗人PD-1抗体(MIH4，BD生物科学，557946)、或FITC缀合的抗小鼠CD80抗体(16-10A1，BD生物科学，553768)来测试PD-L1、CD80或PD-1的表达。使用细胞解离缓冲液剥离细胞，并使用PBS洗涤一次，将2×10⁵个细胞铺板在96孔板的孔中，随后用在PBS中1:20稀释的抗体将细胞在4℃下温育1小时。细胞在PBS中洗涤一次，随后在Accuri C6细胞计数器(BD生物科学)中测量，并使用FlowJoX分析数据。在各自的细胞系中检测人、食蟹猴和小鼠PD-L1，以及人CD80、小鼠CD80和人PD-1的表达。

1.6基于细胞的结合试验

随后，测试FS17-19、FS17-26和FS17-33 Fcab与HEK 293细胞表达的人PD-L1、人CD80、人PD-1、小鼠CD80或小鼠PD-L1(关于这些细胞系的产生，具体参见实施例1.5)。

简单地，过度表达这些蛋白的HEK 293细胞在含有10％FBS(生命技术，10270-1-6)、100μg/ml潮霉素B(梅尔福德实验室有限公司，Z2475)、15μg/ml杀稻瘟菌素(梅尔福德实验室有限公司，B1105)的DMEM(生命技术，61965-026)中生长，并使用细胞解离缓冲液(生命技术，13151-014)从组织培养烧瓶分离，并且以2×10⁵个细胞/孔接种在V形底96孔板中。Fcab与1μM细胞以100μl体积在4℃下温育1小时。PE-或FITC缀合的对照mAb以制造商推荐的浓度在4℃下以100μl体积添加1小时。在实施例1.5中使用的抗体在该实验中用作对照抗体。通过在4℃下以1500rpm离心该板3分钟，来将该板用PBS洗涤一次，并去除上清液。二抗(山羊抗人Fc荧光染料(Alexa Fluor)488，杰克逊免疫研究(Jackson ImmunoResearch)，190-546-098)在PBS中以1:1000稀释，并将100μl该稀释液在4℃下添加到细胞30分钟(板保持在黑暗中)。在用PBS洗涤板一次之后，如之前一样，将沉淀物(pellet)重悬在含有1μg/ml的DAPI(生物素(Biotium)，40043)的100μl PBS中。在Accuri C6细胞计数器(BD生物科学)上读取该板，并使用FlowJoX分析数据。

发现FS17-19、FS17-26和FS17-33具体地结合至细胞表面人PD-L1，而没有结合至人PD-1、人CD80、小鼠PD-L1或小鼠CD80。

1.7基于细胞的阻断试验

在基于细胞的阻断试验中确定Fcab FS17-19、FS17-26和FS17-33阻断重组PD-L1与细胞结合PD-1的结合的能力。

简单地说，将表达人PD-1的HEK 293细胞(参见实施例1.5)在PBS中以每孔1×10⁵个细胞接种在V型底96孔板中。将相关浓度的Fcab(78至10000nM，2倍稀释物)、对照IgG Fc(10000nM)或对照抗体(500nM)与250ng/μl的生物素化PD-L1 Fc一起在100μl的1×PBS中、在室温下以450rpm摇动下温育1小时。抗人PD-L1 mAb(MIH1)用作对照。板在4℃下以1500rpm离心3分钟来沉淀细胞。丢弃PBS，并将预温育的Fcab或对照抗体/生物素化hPD-L1Fc混合物在4℃下添加到孔中1小时。板在4℃下以1500rpm离心3分钟来沉淀细胞，丢弃上清液，并在PBS中重悬细胞。缀合到Alexa 647的链霉亲和素在PBS中以1:1000稀释，并将100μl该稀释液在4℃下添加到孔中30分钟。如之前执行的，将该板离心，丢弃上清液，并在PBS中重悬细胞。在Accuri C6细胞计数器(BD生物科学)上读取该平板，并使用FlowJoX分析数据。

与基于ELISA阻断试验的结果一致，FS17-19、FS17-26和FS17-33在所测试的浓度下显示出了有效的阻断活性。Fcab FS17-19和FS17-33显示出了比FS17-26更高的阻断活性，并因此选择FS17-19和FS17-33进行亲和性成熟(affinity maturation)。

1.8天然选择程序的总结

在通过天然噬菌体文库的初始筛选而识别出的30个Fcab中，3个抗人PD-L1 Fcab(FS17-19、FS17-26和FS17-33)显示出了有效的PD-L1/PD-1和PD-L1/CD80阻断活性。FcabFS17-19和FS17-33在ELISA试验和基于细胞的试验中都显示出比Fcab FS17-26更高的阻断活性，以及与重组和细胞表面PD-L1 Fc的特异性结合，并因此选择Fcab FS17-19和FS17-33进行如下述实施例2中描述的进一步的亲和力成熟。

实施例2-实施例1中识别的Fcab克隆的亲和力成熟以及功能改进

2.1 Fcab FS17-19的亲和力成熟和功能改进

使用与下述2.2.1中描述的方法相类似的方法，Fcab FS17-19从AB和EF环的NNK行走(NNKwalk)开始，经历了多轮亲和力成熟。NNK行走导致衍生自FS17-19的克隆，当在DO11T细胞活化试验(方法参见实施例6)中测量时，该克隆具有非常低的功能活性，EC₅₀比阳性对照抗PD-L1抗体S1少300倍。考虑到改进功能活性，使用与下述3.1中描述的方法相类似的方法进行AB、CD和EF环的随机化。包含AB环中的突变的克隆在DO11 T细胞活化试验中显示出了改进到对照抗体S1的80倍以内的活性。从AB环文库选择的一个Fcab克隆经历了另外轮次的亲和力成熟，仅着眼于CD和EF环。与上一轮的克隆相比，这种成熟的克隆在功能活性方面并未显示出任何改进。

尽管有上述广泛的亲和力成熟策略，但无法从FS17-19谱系(lineage)识别出在DO11 T细胞活化试验中具有可接受的功能活性水平的克隆，因此放弃了对该谱系的研究。

2.2 Fcab FS17-33的亲和力成熟和功能改进

如上述实施例1中描述的，从天然噬菌体选择中分离出抗人PD-L1 Fcab FS17-33。该研究的目的是通过由执行经AB和EF环的NNK行走而在结合环中随机化单独的残基，来获得FS17-33活性的改进。

2.2.1结合环的NNK行走

为了识别改进的PD-L1/PD-1阻断活性的Fcab FS17-33中的突变，通过在FcabFS17-33的AB或EF环中一次使一个氨基酸残基多样化来生成限定性突变文库(parsimonious mutagenesis library)，从而导致总共生成12个单独的文库(参见下表1)。用低冗余NNK密码子制成文库，以表示感兴趣位置中的所有可能的氨基酸。根据用于创建文库的Quickchange闪电定点突变试剂盒(Quickchange Lightning Site-DirectedMutagenesis Kit)(安捷伦(Agilent)，200518)来设计正向和反向引物。

表1：FS17-33的AB和EF结合环的氨基酸序列。“～”符号表示与野生型IgG1 Fc相比FS17-33序列中的缺失。X表示在NNK行走中当时扫描的单个氨基酸。

简单地，将FS17-33 Fcab序列(CH3、CH2和截短的铰链，额外地包含CH2结构域中的LALA突变)克隆到pTT5表达载体(加拿大国家研究委员会)中，从而产生载体pTT5-FS17-33AA。已知在人IgG1的CH2结构域中引入LALA突变减少Fcγ受体结合(Bruhns,P.等,2009和Hezareh等,2001)。这用作诱变文库的模板。在37℃下用Dpnl处理PCR反应5分钟，以在被转化到大肠杆菌(E.coli)(Mix和Go,Zymo研究，T3009)中之前去除任何亲本DNA，并在含有氨苄青霉素(ampicillin)的LB板上铺板。在随后一天拾取转化子(transformant)并测序该转化子以确认突变。

使用标准DNA分离法制备用于转染的DNA，并且在HEK Expi293细胞中表达限定性文库(使用ExipFectamine 293转染试剂盒(生命技术，A14524)转染到Expi293F细胞(生命技术，A14527)中的DNA)。通过使用Octet(福泰生物(ForteBio))的BLI确定转染的HEK上清液中的Fcab浓度。使用mAb选择SuRe蛋白A柱纯化Fcab。

随后在两种浓度(10nM和50nM，方法参见实施例1.3)下的基于ELISA的RBA中分析HEK 293上清液。在该试验中，选择和测序与FS17-33蛋白相比具有潜在改进的PD-L1/PD-1阻断活性的Fcab。这识别了FS17-33的序列中对于结合PD-L1至关重要的特定位置，即，其中很少或没有可替代的氨基酸被识别为合适的取代(参见表2)，以及可能的多种潜在可替代的氨基酸的位置。多次识别出多个突变体(mutant)，从而增强了对试验结果的信心。

表2：针对FS17-33的AB和EF环内突变的各位置识别出的氨基酸取代数。

残基编号根据IMGT编号。

在基于细胞的阻断试验中，表达、纯化并测试了在基于ELISA的阻断试验中具有最高活性的27个Fcab(方法参见实施例2.2.2)。然后，通过拼接重叠延伸(splice overlapextension)PCR将四个AB环和三个EF环克隆改组以生成新的组合(Horton等,2013)。将改组的Fcab克隆到在基于ELISA的阻断(如

1.3中描述的)和基于细胞的阻断试验(如下述2.2.2中描述的)二者中均再次表达和测试了PD-L1/PD-1阻断的pTT5表达载体中。

环改组后识别出的克隆之一是FS17-33-37，其与FS17-33相比，在AB环中具有单一变化(S15V)，且在EF环中具有单一变化(G99D)。克隆FS17-33-37的AB和EF环在表3中示出。

表3：FS17-33-37和FS17-33 Fcab的AB和EF环内残基的比较。残基编号根据IMGT编号。“～”符号表示与野生型IgG1 Fc相比测序的FS17-33中的缺失。

2.2.2阻断活性

在基于细胞的试验中使用过度表达人PD-L1的HEK 293细胞分析了实施例2.2.1中产生的克隆的阻断活性(细胞系的开发参见1.5)。简单地说，将表达人PD-L1的HEK 293细胞在PBS中以每孔1×10⁵个细胞接种在V型底96孔板中。相关浓度的Fcab或阳性对照抗PD-L1mAb YW243.55.S1(“S1”)(专利公布号为US 2013/0045202A1)与500ng/ml的生物素化PD-1Fc在100μl1×PBS中、在450rpm摇动下温育45分钟。板在4℃下以1500rpm离心3分钟来沉淀细胞。丢弃PBS，并将预温育的Fcab或阳性对照/生物素化hPD-1Fc混合物在4℃下添加到孔中1小时。板在4℃下以1500rpm离心3分钟来沉淀细胞，丢弃上清液，并在PBS中重悬细胞。缀合到Alexa 488的链霉亲和素在PBS中以1:1000稀释，并将100μl该稀释液在4℃下添加到孔中30分钟。板在4℃下以1500rpm离心3分钟来沉淀细胞，丢弃上清液，并在具有DAPI的PBS中重悬细胞。在FACS Canto(BD生物科学)上读取该板，并使用FlowJoX分析数据。

识别与FS17-33相比具有改进的活性的Fcab克隆。下表4中示出了该Fcab克隆的实施例，其显示出FS17-33-37与亲本FS17-33克隆相比改进的阻断活性。该结合活性与阳性对照S1 mAb相类似。

表4：与亲本FS17-33 Fcab相比，FS17-33-37Fcab的PD-L1/PD-1阻断活性

克隆	PD-L1/PD-1阻断活性(IC<sub>50</sub>)
		FS17-33	17.7nM
FS17-33-37	8.1nM

2.2.3结合至人和食蟹猴PD-L1的细胞

为了测试结合至细胞表面人和食蟹猴PD-L1，对包括FS17-33-37的、在基于细胞的阻断试验中具有最高活性的11个Fcab克隆，针对结合至过度表达人或食蟹猴PD-L1的HEK293细胞进行了测试(方法参见实施例1.5)。所有Fcab显示出了与人PD-L1的剂量依赖性结合，EC₅₀值在5-10nM左右，且结合至食蟹猴PD-L1的EC₅₀值在100-200nM左右。

2.2.4 DO11.10 T细胞活化试验

已知PD-L1/PD-1相互作用的抑制导致增加的T细胞活化(Stewart等,2015)。由于FS17-33衍生的Fcab显示出了有效的PD-L1/PD-1相互作用阻断活性，因此预计它们也可以增加T细胞活化。为了对此进行测试，使用DO11.10T细胞活化试验测试了20个FS17-33衍生的Fcab，并与作为阳性对照的抗PD-L1 mAb S1进行比较。该试验在实施例6中更详细地描述。

该结果显示出了FS17-33衍生的克隆能够在该试验中增强T细胞活化，但是与抗PD-L1阳性对照抗体S1(数据未示出)相比，活性非常弱。这是想不到的，因为所测试的Fcab克隆的PD-L1/PD-1阻断活性差异在阳性对照的3-10倍之内。

2.2.5 FS17-33-37的表征

基于Fcab克隆FS17-33-37在DO11.10 T细胞活化试验中低的/最小的非特异性活性(不具有OVA肽)并基于其尺寸排阻(size exclusion,SE)-HPLC谱图，选择用于进一步亲和力成熟的Fcab克隆FS17-33-37。关于单体蛋白的百分比和洗脱时间评估尺寸排阻色谱(SEC)谱图，从而有利于洗脱时间更接近于野生型IgG Fc的洗脱时间的克隆(参见图2)。执行细胞结合中的FS17-33-37的全剂量调整、基于细胞的阻断试验和DO11.10 T细胞活化试验，以进一步表征FS17-33-37(数据未示出)。该结果确认了FS17-33-37在DO11.10 T细胞活化试验中显示出了有效的细胞结合和阻断活性，但活性较弱。

2.2.6 Fcab FS17-33的亲和力成熟和功能改进的总结

FS17-33 Fcab的NNK步行诱变导致多个克隆的识别，这些克隆具有增加到与抗PD-L1阳性对照S1 mAb相似水平的PD-L1:PD-1阻断活性。额外地，抗人PD-L1结合FS17-33衍生Fcab与食蟹猴PD-L1具有交叉反应性。

然而，令人惊讶地，与阳性对照S1 mAb相比，DO11.10 T细胞活化试验中的FS17-33谱系的活性非常弱。该数据似乎与阻断数据不一致。由于DO11.10 T细胞活化试验是比阻断试验更生理学相关的效力试验，因此FS17-33衍生Fcab克隆的功能活性比阳性对照抗体低1000倍以上。

不希望受到理论的约束，假设当通过DO11.10 T细胞活化试验确定时，FS17-33衍生Fcab可能无法以足够高的亲和力结合至单体PD-L1以产生功能活性。从阻断试验和结合试验获得的结果可能已经受到结合力(avidity)作用的影响，该结合力作用是在这些试验中使用的高水平人PD-L1的结果。

因此，为了识别具有更高的对PD-L1亲和力和功能活性的Fcab，进行了结合环的更大量随机化。如以下实施例3所描述的，基于其特异性活性和SEC-HPLC谱图，选择FS17-33-37作为亲本克隆进行进一步亲和力成熟。

实施例3-Fcab克隆FS17-33-37的亲和力成熟和功能改进

3.1亲和力成熟

为了获得具有改进活性的Fcab，使FS17-33-37亲和力成熟，以引入最大多样性。具体地，将FS17-33-37PTT5质粒DNA(参见2.2.1)用作模板，以制备包含随机化的环的文库。使用NNK引物(AB环)或ELLA引物(CD和EF环)对AB环(残基14-18)、CD环(残基45.1-78)和EF环(残基92-94和97-101)的一部分进行随机化。ELLA引物规定了用于各氨基酸的密码子，及其在混合物中的相对丰度。从混合物中仅排除了半胱氨酸，且对任何其他氨基酸没有偏倚(bias)。单独的环文库(AB、CD和EF环各一个文库)经历几轮选择，以富集Fcab克隆，与亲本克隆FS17-33-37相比，Fcab克隆具有至生物素化hPD-L1-组氨酸(his)(包括组氨酸标签(his-tag))的改进的结合。

为了进一步改进成熟的克隆对PD-L1的亲和力，以无偏倚的(unbiased)方式改组来自各单个环文库的输出，以识别具有最高的对hPD-L1亲和力的环组合。通过将DNA从来自各单个环文库选择的细胞分离、以及通过拼接重叠延伸PCR而改组DNA，来该组来自选择的输出，以生成无偏倚的环重组。然后，将该DNA用于创建新的酵母展示文库(yeast displaylibrary)。使用扩增的PCR产物连同酵母载体(pYD1dem，英杰公司(Invitrogen)V835-01)来转化酵母细胞(EBY100，英杰公司V835-01)。然后，改组的文库经历多轮选择以富集具有最高的对单体PD-L1亲和力的克隆。

筛选所选择的Fcab，用于结合至重组蛋白单体和二聚体PD-L1抗原。在生物素化的二聚体抗原可商购获得的情况下(BPS生物科学(BPS Bioscience)#71105)，使用皮尔斯(Pierce)LC-LC生物素化试剂盒(赛默飞世尔科学21338)，将单体组氨酸标记的抗原(艾可生物系统(Acro biosystems)Cat#PD1-H5229)生物素化。

从筛选中，选择104个Fcab克隆用于可溶性表达。可溶性Fcab在来自pTT5Fcab表达载体的HEK细胞中表达，并使用mAb选择SuRe蛋白A柱进行纯化。

3.2SEC谱图

进行尺寸排阻色谱(SEC)以确定在3.1中识别的任何亲和力成熟的Fcab是否显示出聚集。通过使用具有Zorbax GF-250柱(安捷伦)的安捷伦1100系列HPLC的SE-HPLC来分析所有纯化的Fcab。包含EF环中的MFYGP基序的所有克隆显示出了过度的聚集，或根本没有进入柱。因此，不认为这些克隆代表合适的候选Fcab，并且未对这些克隆进一步测试。剩余的40个克隆未显示出聚集峰，但是它们确实具有***峰或肩峰。例如，如图2所示，克隆FS17-33-116显示出了***峰(B)，该***峰(B)在亲本FS17-33-37克隆(A)中不存在。将在后面讨论这些偏差的潜在原因，但是该潜在原因不认为是从候选选择过程中去除这些Fcab克隆的原因。

3.3表达的Fcab的解离速率筛选

在HEK细胞中的可溶性表达后，在结合至人PD-L1时，使用BIAcore筛选使用单体选择的Fcab、组氨酸标记的抗原的解离速率。简单地，将生物素化的抗原以10μg/mL至585RU包被在芯片上，并且来自表达的克隆的上清液以30μL/分钟流过芯片。用单体和二聚体PD-L1抗原进行该试验。解离进行6分钟。使用BIA评估(BIAevaluate)软件进行分析。从空白流动池和无Fcab的运行中两次减去曲线。然后将曲线对齐并归一化以进行比较。假设与PD-L1结合时具有较慢解离速率的克隆会由于结合至其配体的PD-L1的连续阻断而具有增强的T细胞活化活性。结合至PD-L1时，与亲本克隆FS17-33-37相比，所测试的40个Fcab克隆中的33个显示出了显著改进(较慢)的解离(dissociation)(解离(off))速率，并对所测试的40个Fcab克隆中的33个进行选择，以用于如以下3.4中描述的进一步的功能筛选。

3.4功能筛选

为了确定3.1中描述的亲和力成熟是否会导致功能活性的改进，使用DO11.10 T细胞活化试验测试了3.3中识别的33个Fcab克隆的活性，并与作为阳性对照(实验细节参见实施例6.1)的抗PD-L1抗体S70进行比较。将各Fcab的滴定用于计算该试验中各Fcab的EC₅₀值，以便于比较。五个克隆(FS17-33-85、FS17-33-87、FS17-33-114和FS17-33-116)全部具有介于0.28至0.5nM之间的EC₅₀值，这与阳性对照S70抗体是相当的。

克隆FS17-33-85、FS17-33-87、FS17-33-114和FS17-33-116具有非常相似的序列，仅有1个或2个氨基酸差异，而这些氨基酸差异均没有在AB或CD环中(参见表5，其识别了这些克隆之间的序列差异，所有这些序列差异均位于EF环或框架区中)。出人意料的是，在来自改组文库(参见3.1)的所有克隆中存在的AB环序列在筛选单独的AB环文库时并未被识别出来，并且含有氨基酸缺失，其结果是残基14至18之间的AB环序列仅有四个氨基酸的长度，而非五个。该缺失的确切位置未知。由于当Fcab结合至PD-L1时，在解离速率没有显著恶化(更快)的情况下，AB环的位置17和18处的残基不能被其他氨基酸取代(参见以下表9A)，所以该缺失必须位于AB环的残基14、15或16处。认为该缺失是由偶然截短的诱变引物导致的改组文库中的人为现象。在其环区域中包括这样的缺失的Fcab克隆通常在选择过程期间被去除，因为缺失很少导致保留抗原结合活性的Fcab克隆。即使未从AB克隆的筛选中识别出具有缺失的AB序列，该序列也必须作为稀有(rare)克隆或较低亲和力结合物而存在于来自选择的输出池中。然而，当该截短的AB环与其他环改组时，该截短的AB环变为显性AB环，这表明了在Fcab包含新的CD环序列的情况下该缺失对改组的Fcab克隆的抗原结合活性和/或结构的强烈贡献。如果已经实施了更直接的改组方法，则在其AB环中包括这样的缺失的Fcab克隆将不会被识别出，其中从AB环选择中识别出的最佳序列将不会与来自CD环选择的最佳序列组合。图1中示出了与野生型Fcab序列相比代表性FS17-33-116克隆的AB环中的缺失。此外，如以下4.3中更详细描述地，在AB环中恢复该缺失的残基产生了结合亲和力的显著损失。因此，AB环中该缺失的存在对Fcab至PD-L1的结合很重要。

表5：

3.5 Fcab FS17-33-116的进一步表征

由于3.4中识别的所有Fcab克隆已经包含了非常相似的序列，因此选择代表性克隆(FS17-33-116)进行进一步表征。考虑到所有这些Fcab克隆在DO11.10 T细胞活化试验中具有与阳性对照、S70抗体的EC₅₀相当的EC₅₀，可以选择表5中列出的任何其他Fcab克隆以用于进一步表征。使用Biacore、利用蛋白A以捕获Fcab来测量FS17-33-116对PD-L1的亲和力。单体PD-L1-组氨酸人类抗原以滴定浓度在高流速下流过芯片，以最小化质量传输限制(mass transport limitation)。使用无折射率校正并将R_max设为局部的1:1拟合分析来测量K_D。Fcab克隆FS17-33-116与亲本克隆FS17-33-37相比显示出了亲和力的显著改进，并且与阳性对照抗体S70相比也显示出了改进的亲和力(参见表6)。这主要是由于当结合至PD-L1时Fcab的解离速率较慢。

表6：

克隆ID	K<sub>D</sub>(nM)	K<sub>d</sub>(1/s)	K<sub>a</sub>(1/Ms)
				FS17-33-37	270	0.02	7.6×10<sup>4</sup>
FS17-33-116	0.49	4.4×10<sup>-4</sup>	1.5×10<sup>6</sup>
				S70mAb	1.1	3.0×10<sup>-4</sup>	2.7×10<sup>5</sup>

为了测试克隆FS17-33-116对PD-L1的特异性，将PD-1(R&D系统1086-PD)和PD-L2(R&D系统1224-PL)连同PD-L1包被到Biacore芯片上。然后，Fcab以1000倍的浓度范围流过芯片。在这些浓度下未观察到至PD-1或PD-L2的结合。然而，Fcab确实结合至PD-L1。这表明Fcab FS17-33-116特异性地结合至PD-L1。

为了进一步评估FS17-33-116的功能活性，在SEB试验中测试了Fcab(实验细节参见实施例7.1)。由于此试验使用了由患者捐赠的细胞，因此这些细胞表达内源性水平的PD-L1。这些表达水平明显低于DO11.10试验中使用的LK35.2细胞。在SEB试验中，FS17-33-116Fcab在效力和功效上均与阳性对照S70抗体匹配(参见表7)。未观察到作为阴性对照的抗FITC抗体4420的活性。由于S70抗体已经在临床中显示为具有功效，因此预计FS17-33-116Fcab将同样具有临床功效。

表7：SEB试验

克隆ID	EC<sub>50</sub>(nM)
		阴性对照4420mAb	没有活性
FS17-33-116	0.07527
		阳性对照S70mAb	0.07605

3.6 mAb²格式的FS17-33-116的构建和表达

可以将Fcab掺入常规的免疫球蛋白分子中以提供双特异性抗体，该双特异性抗体包括免疫球蛋白分子的基于CDR的抗原结合位点、以及由于Fcab的掺入导致的免疫球蛋白的恒定结构域中的额外结合位点。此类分子也称为mAb²分子。也可以制备“模拟”mAb²。“模拟”mAb²是感兴趣的Fcab已掺入免疫球蛋白分子中的mAb²，该免疫球蛋白分子包括针对抗原的基于CDR的抗原结合位点，所述抗原预计不会在待使用“模拟”mAb²的情况下进行结合。这允许Fcab以与完整免疫球蛋白分子相当的格式被测试，而不受该分子的基于CDR的抗原结合位点的任何影响。

制备了由包括上述的FS17-33-116抗人PD-L1 Fcab的IgG1构成的“模拟”mAb²，以允许该mAb²格式的Fcab的表征。通过将FS17-33-116的CH3结构域的一部分，包括AB、CD和EF环，取代为抗FITC抗体4420的CH3结构域的相应区域来制备该模拟mAb²，且该模拟mAb²还包括抗体重链的CH2结构域中的LALA突变。抗体4420的重链和轻链序列分别在SEQ ID NO：51和52中示出(Bedzyk,W.D.等，1989和Bedzyk,W.D.等，1990)。模拟mAb²被称为FS17-33-116/4420mAb²。通过HEK293-6E细胞中的瞬时表达产生模拟mAb²，并使用mAb选择SuRe蛋白A柱纯化模拟mAb²。

将“模拟”FS17-33-116/4420mAb²与Fcab FS17-33-116比较，以确保保持所需的质量。mAb²的SEC谱图显示mAb²不再具有***峰或肩峰(参见图2C)。如对于4420mAb所预计的，观察到少量的聚集，因为已知该抗体会聚集。随后测试了FS17-33-116/4420mAb²的结合和功能活性。

在DO11.10 T细胞活化试验中测试了FS17-33-116/4420mAb²(方法参见实施例6)。与FS17-33-116Fcab相比，FS17-33-116/4420mAb²显示出了活性的下降。该下降很显著，但很小。FS17-33-116/4420mAb²的EC₅₀保持低于1nM。由于FS17-33-116/4420mAb²对PD-L1的内在亲和力与FS17-33-116相同，因此认为在DO11.10试验中观察到的FS17-33-116/4420mAb²的活性下降的最有可能的原因是由于与FS17-33-116/4420mAb²相比，FS17-33-116Fcab的结合力更高。由于在使用SEC分析时，是Fcab、而不是mAb²显示出***峰，因此推测Fcab正在形成二聚体，在基于细胞的试验、诸如DO11.10试验的情况下，该二聚体可通过亲和力促进Fcab的活性。为了解决这个问题，使用贝克曼欧迪玛(Beckman Optima)XL-1仪器通过分析超速离心对分子进行分析。

来自该实验的数据显示Fcab有两个峰，且mAb²只有一个峰。Fcab的计算质量与第一个峰的单体(monomer)和第二个峰的二聚体一致。二聚化的量取决于浓度，而相互作用的K_D估计为2μM。尽管这种相互作用微弱，但这些数据支持以下观点：在基于细胞的功能试验中，Fcab通过由自我相互作用介导的细胞表面结合力促进了活性。此外，阳性对照抗体S70对PD-L1的内在亲和力类似于FS17-33-116，并且在混合淋巴细胞反应(MLR)试验中的活性等同于FS17-33-116。由于抗体是二价的，因此推测单价Fab由于结合力的损失将具有与mAb²相似的活性。为了测试该假设，从铰链上方的Fc部分消化掉S70 Fab臂，从而产生单价Fab结构域。然后，使用蛋白A去除Fc结构域、使用抗组氨酸去除酶、最后经过SEC纯化单体片段，来纯化这些结构域。随后，这些Fab臂在MLR试验中进行测试、并显示出了与在该试验中Fcab和mAb²之间观察到的活性下降等同的活性损失，这为该假设提供了额外支持，即Fcab和mAb²之间的活性降低是由于Fcab的结合力。

3.7 Fcab克隆FS17-33-37的亲和力成熟和功能改进的总结

FS17-33-37的亲和力成熟产生了在解离速率和功能活性方面具有显著改进的Fcab克隆。这些克隆之一、FS17-33-116在DO11.10和SEB试验中都显示了与临床证明的阳性对照S70抗体相类似的活性。由于阳性对照mAb已经在临床中显示为具有功效，因此预计FS17-33-116Fcab和包括该Fcab的分子、诸如mAb²分子也将具有临床功效。

FS17-33-116Fcab也被***到“模拟”mAb²格式中，并观察到与针对Fcab格式报道的相类似的结果，尽管在DO11.10 T细胞活化试验中测量时活性有轻微降低。不希望受到理论的束缚，认为在基于细胞的试验的情况下是Fcab、而不是mAb²自缔合并形成二聚体，并认为这可以解释Fcab与FS17-33-116的模拟mAb²格式之间的活性差异。

实施例4-Fcab克隆FS17-33-116的进一步改进

在实施例3中描述的FS17-33-116Fcab展示了对PD-L1的高亲和力以及在DO11.10T细胞活化试验中的高活性的情况下，认为可以对Fcab做出进一步改进以去除潜在的制造序列不利因素(manufacturing sequence liability)，并改进生物物理性能。具体地，FS17-33-116Fcab在EF环中包含甲硫氨酸，并示出了小程度的二聚化。因此，进一步设计FS17-33-116克隆以解决这些问题。

4.1甲硫氨酸取代

在天然选择阶段，甲硫氨酸出现在FS17-33谱系的EF环中。由于这可能是序列不利因素，并且该残基通过多轮亲和力成熟而得以保留，因此，找到可改进活性的取代的可能性非常小。取而代之的目的是找到一种残基，该残基能够替代甲硫氨酸，且活性损失以及所得Fcab与PD-1的结合变差最小。

使用引物进行定点诱变，该引物包含FS17-33-116的EF环中IMGT位置M98处的简并密码子NNK。该引物不包括为半胱氨酸和甘氨酸编码的密码子，因为这些氨基酸也被认为是潜在的序列不利因素。

甲硫氨酸(Met)克隆在解离速率筛选中作为Fcab进行表达并测试，以识别具有与作为克隆FS17-33-116的人PD-L1相似的结合动力学的克隆。从该实验中可以看出，疏水残基在结合至PD-L1时以Fcab的解离速率的最小增加(在亲本克隆FS17-33-116的解离速率的两倍以内)替代甲硫氨酸。唯一的例外是脯氨酸，脯氨酸显示出了所有测试的Fcab克隆中的最快解离速率。

随后，在蛋白A柱中纯化全部Fcab克隆以进一步测试。Fcab克隆中的十个未从蛋白A柱中洗脱，并因此并未包括在进一步的分析中。这包括其中色氨酸由甲硫氨酸取代的Fcab，该Fcab显示出了亲本克隆的两倍以内的解离速率。

随后，将纯化的Fcab克隆放到SEC柱上，以评估聚集。从该分析中，甲硫氨酸被苯丙氨酸或酪氨酸取代的Fcab显示出了显著的聚集和在柱上的滞留(retention)。因此，从进一步的分析中排除了这些克隆。识别出具有亲本克隆两倍以内的解离速率的三个Fcab克隆。这些Fcab克隆包含代替位置98处的甲硫氨酸的亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸。如图1和下述的SEQ ID No：31、37和35所示，这些克隆分别为Fcab FS17-33-289、FS17-33-288和FS17-33-296。

此外，制备了Fcab克隆，其中框架突变A38V回复为野生型丙氨酸，以减小Fcab的突变负荷。在克隆FS17-33-116中观察到A38V突变，但在具有类似活性的兄弟克隆(siblingclone)中未观察到A38V突变(参见表5)。基于FS17-33-289Fcab进行了逆转突变，并且所得的Fcab被称为FS17-33-334。图1中提供了这些克隆的AB、CD和EF环的序列和位置38处的残基的总结。

随后，如下述实施例6和7所描述的，以Fcab和模拟mAb²两种格式测试了FS17-33-289、FS17-33-288、FS17-33-296和FS17-33-334的对PD-L1结合亲和力、阻断PD-1/PD-L1相互作用的能力以及在DO11.10 T细胞活化试验中的活性(关于模拟mAb²的生成的细节，参见4.2)。

4.2 mAb²格式的Fcab FS17-33-289、FS17-33-288、FS17-33-296、FS17-33-334、 FS17-33-449和FS17-33-451的构建和表达

为了测试PD-L1结合亲和力、PD-1/PD-L1阻断活性和完整免疫球蛋白分子格式的Fcab的DO11.10 T细胞活化试验中的功能活性，如下所述地构建和表达了包括Fcab的各种mAb²。

4.2.1“模拟”mAb²构建和表达

制备了由包括Fcab的IgG1构成的“模拟”mAb²，从而允许这些mAb²格式的Fcab的表征，该Fcab包括上述4.1中描述的FS17-33-289、FS17-33-288、FS17-33-296和FS17-33-334以及下面4.3描述的FS17-33-449和FS17-33-451。通过将包括AB、CD和EF环的Fcab的CH3结构域的一部分取代为抗鸡蛋清溶菌酶抗体HelD1.3的CH3结构域的相应区域，来制备这些模拟mAb²，而无论抗体HelD1.3具有或不具有抗体重链的CH2结构域中的LALA突变。具有LALA突变的抗体HelD1.3的重链和轻链序列分别显示于SEQ ID No：53和54中。在Tello等，1993中描述了HelD1.3抗体的生成。通过HEK293-6E细胞中的瞬时表达产生模拟mAb²，并使用mAb选择SuRe蛋白A柱纯化该模拟mAb²。表8中列出了所产生的模拟mAb²。

此外，如前段中所述、但使用抗巨细胞病毒(CMV)gH糖蛋白抗体MSL109来制备包括在下面4.3中描述的FS17-33-449和FS17-33-451抗人PD-L1 Fcab的“模拟”mAb²。在WO1994/016730A1中描述了MSL109抗体的生成。制备这些在CH2结构域中具有LALA突变的mAb²。具有LALA突变的抗体MSL109的重链和轻链序列分别显示于SEQ ID No：55和56中。通过HEK293-6E细胞中的瞬时表达来产生mAb²，并使用mAb选择SuRe蛋白A柱纯化该mAb²。

4.2.2抗CTLA-4mAb²构建和表达

如上所述但使用抗CTLA-4mAb伊匹单抗来制备包括FS17-33-289、FS17-33-449和FS17-33-451抗人PD-L1 Fcab的mAb²。制备这些在CH2结构域中不具有LALA突变的mAb²。伊匹单抗的重链和轻链序列显示于SEQ ID No：67和68中。通过HEK293-6E细胞中的瞬时表达来产生包含mAb²的CTLA-4，并使用mAb选择SuRe蛋白A柱纯化该包含mAb²的CTLA-4。

表8中提供了生成和表达的mAb²的总结。

表8

mAb<sup>2</sup>名称	Fcab克隆	Fab克隆	包含LALA？
				F17-33-288AA/HelD1.3	F17-33-288	HelD1.3	是
F17-33-289AA/HelD1.3	F17-33-289	HelD1.3	是
				F17-33-296AA/HelD1.3	F17-33-296	HelD1.3	是
FS17-33-296/HelD1.3	F17-33-296	HelD1.3	否
				F17-33-334AA/HelD1.3	F17-33-334	HelD1.3	是
F17-33-449AA/HelD1.3	F17-33-449	HelD1.3	是
				FS17-33-449/HelD1.3	F17-33-449	HelD1.3	否
F17-33-451AA/HelD1.3	F17-33-451	HelD1.3	是
				FS17-33-449AA/MSL	F17-33-449	MSL109	是
FS17-33-451AA/MSL	F17-33-451	MSL109	是
				FS17-33-289/CTLA-4	F17-33-289	CTLA-4	否
FS17-33-449/CTLA-4	F17-33-449	CTLA-4	否
				FS17-33-451/CTLA-4	F17-33-451	CTLA-4	否

4.3结合环的NNK行走

为了识别具有改进的生物物理性能、降低的突变负荷和优化的对PD-L1亲和力的Fcab，亲本Fcab克隆(AB和EF环的Fcab FS17-33-116、以及CD环的模拟mAb² F17-33-334AA/HelD1.3)的AB、CD和EF环中的各位置突变成所有可能的氨基酸取代，并针对与PD-L1的结合以及功能活性筛选所得到的Fcab，随后评估它们的生物物理性能。

表9A-C列出了AB、CD和EF环的各位置处的不同氨基酸取代数，以及相关位置处的特异性氨基酸取代，与亲本Fcab、AB和EF环突变体的Fcab FS17-33-116、以及CD环突变体的模拟mAb² F17-33-334AA/HelD1.3相比，这不会导致PD-L1上Fcab/mAb²的解离速率的降低大于两倍。注意，在天然或亲和力成熟文库中，EF环中位置95和96处的残基没有突变，因为已知这些位置处的残基对于EF环的结构完整性是重要的(Hasenhindl等，2013)。

使用Octet系统测量与PD-L1的结合。在基于抗体HelD1.3以模拟mAb²格式测试CD环突变体的情况下，以Fcab格式测试AB和EF环突变体与PD-L1的结合。如上文实施例4.2.1所述，构建这些模拟mAb²。

通过蛋白A尖端捕获Fcab和模拟mAb²，然后将Fcab和模拟mAb²暴露于单体PD-L1-组氨酸。随后使用Octet分析软件计算Fcab/模拟mAb²在结合至PD-L1时的解离速率，并与亲本克隆、FS17-33-116或F17-33-334AA/HelD1.3进行比较。通常，解离速率的两倍差异在该类型试验的误差之内，因此认为落入该范围内的克隆在结合至PD-L1时具有与亲本克隆、FS17-33-116或F17-33-334AA/HelD1.3等同的解离速率。

AB环中的两个位置、CD环中的两个位置和EF环中的三个位置(残基15、16、45.1、45.2、93、97和100)可以被超过半数的测试氨基酸取代，从而导致与相关亲本Fcab/模拟mAb²相比，当Fcab/模拟mAb²结合至PD-L1时，解离速率不会变差(更快)大于两倍。因此，认为这些位置是被允许的。在其他位置可以接受更少的取代，一些位置完全不接受任何取代(表9A-C)。没有发现与相关亲本克隆相比改进了与PD-L1的结合或功能活性的突变。

表9A

表9B

表9C

接下来，在亲本克隆尚未包括野生型(WT)氨基酸的各允许位置处(残基15、16、45.1、93和100；“WT Fcab”的序列参见图1)，在该位置处具有WT氨基酸的Fcab克隆以模拟mAb²格式进行测试，以确定当结合至PD-L1时它们的解离速率。如上文实施例4.2.1所描述的，基于HelD1.3抗体构建这些模拟mAb²。使用Biacore 3000仪器来确定解离速率，其中，在蛋白A芯片上捕获模拟mAb²，并且使单体hPD-L1流过捕获的抗体。随后使用来自GE的Biaevaluate软件计算解离速率。发现与相同模拟mAb²格式的亲本克隆相比，AB环的位置15和16处、以及EF环的位置93和100处的WT逆转在结合至PD-L1时对模拟mAb²的解离速率具有最小的影响。

此外，制备了Fcab，其中AB和EF环中缺失的残基14和101被恢复成WT残基，并进行了测试。当结合至PD-L1时显示出模拟mAb²的解离速率最小甚至没有变差(更快)的具有WT逆转的Fcab，还与AB和EF环中的残基14和101处的缺失组合。出人意料的是，恢复AB环中位置14处的缺失的残基导致当模拟mAb²结合至PD-L1时解离速率的显著变差(更快)，并且未使用这些Fcab克隆完成进一步的研究。然而，恢复EF环中的缺失的残基本身对PD-L1结合没有影响，但是将其与EF环中的任何其他WT逆转组合确实导致亲和力的显著下降。最终，位置15和16处的AB环中的WT逆转与EF环的位置101中的缺失的恢复重组。这些克隆之一、在AB环中的位置15处和EF环的位置101处包括WT逆转的FS17-33-449，显示出与亲本克隆相当的与PD-L1的结合，并且如下所述地进行进一步分析。

在如DO11.10 T细胞活化试验(实验细节参见实施例6)中所测得的、与亲本克隆FS17-33-334AA/HELD1.3相比(该模拟mAb²的制备参见4.2.1)克隆未显示出大于两倍的活性损失的基础上，从上述NNK行走诱变筛选中选择模拟mAb²格式的Fcab克隆的子集(基于FS17-33-334AA/HELD1.3制备模拟mAb²)。活性的两倍差异在该试验的误差之内，因此认为落入该范围内的模拟mAb²在DO11.10 T细胞活化试验中具有与亲本克隆FS17-33-334AA/HELD1.3相当的活性。如SEC分析(实验细节参见3.2)所测量的，模拟mAb²克隆的该子集也未显示出大于总蛋白的3％的聚集迹象(indication of aggregation)。结果在表9D中示出。

Fcab的子集包括在AB环的位置15处和EF环的位置93、97和100处具有突变的Fcab，借此，S可以在位置15处变为E、H、L、F或Y，N可以在位置93处变为A、Q或H，Q可以在位置97处变为R、H或S，并且D可以在位置100处变为A。

表9D

随后通过替换EF环中位置101处的缺失的氨基酸来进一步修饰上述模拟mAb²的子集，从而创建第二组模拟mAb²分子，该第二组模拟mAb²分子与WT Fcab相比包括减少数量的突变(参见图1)，并因此具有减少的突变负担。测试该第二组模拟mAb²在DO11.10 T细胞活化试验(实验计划参见实施例6)中的功能以及与hPD-L1的结合，该第二组模拟mAb²包括在允许位置15处包含野生型逆转的FS17-33-449AA/HELD1.3。结果在表9E中示出。所有的克隆在DO11.10试验中显示出了与亲本mAb² FS17-33-334AA/HELD1.3等同的功能活性(除了FS17-33-456AA/HELD1.3、FS17-33-457AA/HELD1.3和FS17-33-462AA/HELD1.3，这些从进一步的分析中排除)，表明了在CH3结构域中EF环的位置101处引入缬氨酸被很好地耐受。当通过动态光散射(DLS)、蛋白A纯化和溶解度分析进行分析时，两个克隆展示出了改进的生物物理特性。这些克隆是FS17-33-449AA/HELD1.3和FS17-33-451AA/HELD1.3，因此将其选做该最终组的主要候选对象。

表9E

克隆ID	修饰的残基	氨基酸取代	DO11 EC<sub>50</sub>	Kd 1/s
					FS17-33-334AA/HELD1.3	N/A	N/A	0.6721	2.91E-04
FS17-33-449AA/HELD1.3	15/101	T/V	0.7665	3.11E-04
					FS17-33-451AA/HELD1.3	15/101	E/V	0.9079	2.53E-04
FS17-33-452AA/HELD1.3	15/101	H/V	0.5646	3.38E-04
					FS17-33-453AA/HELD1.3	15/101	L/V	0.6323	3.03E-04
FS17-33-454AA/HELD1.3	15/101	F/V	0.5094	2.69E-04
					FS17-33-455AA/HELD1.3	15/101	Y/V	0.6801	3.43E-04
FS17-33-456AA/HELD1.3	93/101	A/V	1.891	6.19E-04
					FS17-33-457AA/HELD1.3	93/101	Q/V	1.005	5.89E-04
FS17-33-458AA/HELD1.3	93/101	H/V	0.741	4.56E-04
					FS17-33-459AA/HELD1.3	97/101	R/V	0.6632	3.80E-04
FS17-33-460AA/HELD1.3	97/101	H/V	0.5217	2.02E-04
					FS17-33-461AA/HELD1.3	97/101	S/V	0.593	3.59E-04
FS17-33-462AA/HELD1.3	100/101	A/V	2.025	8.99E-04

实施例5-Fcab和mAb²的结合亲和力、以及PD-1/PD-L1阻断活性

随后，以Fcab(具体参见4.1和4.2)和mAb²格式(具体参见实施例4)测试了FS17-33-288、FS17-33-289、FS17-33-296、FS17-33-334、FS17-33-449和FS17-33-451Fcab克隆的结合人PD-L1和阻断PD-1/PD-L1相互作用的能力。如实施例4中所述，生成这些Fcab和mAb²背后的目的在于去除序列文库并改进生物物理性能，并保持Fcab FS17-33-116的结合、阻断和功能性能。

5.1与PD-L1的结合

通过BIAcore并在细胞结合试验中评估了结合至人PD-L1的Fcab和mAb²。为了测量克隆对单体hPD-L1-组氨酸的亲和力，使用包被在CM5芯片(GE28-9582-20AC)上的抗Fab抗体捕获mAb²，并使用蛋白A芯片(GE 29127556)、使用Biacore T200(GE)捕获Fcab。为了最小化质量传输影响，将捕获水平最小化至200RU，并使用75μl/min的快流速。对人(艾可生物科学PD1-H5229)和食蟹猴(艾可生物科学PD1-C52H4)单体抗原进行滴定，并使其流过捕获的mAb²。使用Biacore T200评估软件完成数据的分析。使用不具有体积分析的1:1拟合模型和局部分析的Rmax，分析减去空白流动池的曲线以及无抗原的运行。

通过在4℃下将Fcab或mAb²蛋白与过度表达hPD-L1或食蟹猴PD-L1细胞的对照HEK293细胞或HEK293细胞温育1小时，来执行细胞结合试验。随后使用抗人Fc 488检测抗体检测Fcab/mAb结合。使用FACS canto测量荧光信号强度。

在表10中总结了这些结合实验的结果。表10显示出所测试的全部克隆对单体和细胞表达的人和食蟹猴PD-L1具有高亲和力。

表10：

5.2阻断活性

在基于细胞的受体结合试验(RBA)中测试了Fcab和模拟mAb²阻断hPD-1/hPD-L1以及hPD-L1/hCD80相互作用的能力。简单地说，将生物素化的hPD-L1-Fc-Avi与滴定浓度范围从400nM到3pM的Fcab一起温育1小时。混合物与过度表达hPD-1或hCD80的HEK293细胞一起温育再一小时。使用链霉亲和素647检测HEK293细胞上的结合的生物素化hPD-L1-Fc-Avi的水平，且使用FACS Canto(BD生物科学)测试荧光水平。

在表11中示出了这些阻断实验的结果。表11显示出测试的所有克隆都能够有效阻断hPD-1/hPD-L1和hPD-L1/hCD80相互作用。

表11

*PD-L1浓度在这些实验中从2μg/mL增加至50μg/mL，从而导致更高的EC₅₀值。

实施例6-Fcab分子在DO11.10T细胞活化试验中的活性

6.1 Fcab在人PD-L1 DO11.10T细胞活化试验中的活性

在基于DO11.10的T细胞活化试验中以Fcab和mAb²格式测试了包含LALA突变的Fcab组。如实施例4中所述制备了mAb²并在如下所述的DO11.10T细胞试验中对其进行测试。

基于DO11.10 OVA特异性T-淋巴细胞和LK35.2 B-淋巴细胞杂交瘤细胞系的IL-2释放试验用于mAb²的功能筛选。IL-2释放是T细胞活化的标记物。用空载体(pLVX)转染表达内源性鼠PD-1的T细胞。用人PD-L1构建体转染B细胞。

根据所讨论的mAb²，在具有和不具有LALA突变(AA)的情况下测试了mAb²。mAb²的Fab部分是针对鸡蛋清溶菌酶(HelD1.3)、FITC分子(4420)、人CTLA-4(伊匹单抗)定向的单克隆抗体的可变区。实施例4中提供了关于这些mAb²的构建的细节。

6.1.1使用空载体产生T细胞系

慢病毒转导方法用于使用Lenti-X HTX封装系统(Cat.No 631249)生成包含空的慢病毒载体pLVX的DO11.10细胞(国立犹太医学中心(National Jewish Health))。将Lenti-X表达载体(pLVX)(Cat.No 631253)与Lenti-X HTX封装混合物一起共转染到Lenti-X 293T细胞系(Cat.No 632180)中以生成病毒。使用以Lenti-X HTX封装系统产生的慢病毒粒子来转导DO11.10细胞系。

6.1.2过度表达PD-L1的抗原呈递细胞的产生

慢病毒转导方法用于使用Lenti-X HTX封装系统(Cat.No 631249)生成过度表达人PD-L1的LK35.2 B细胞淋巴细胞(ATCC，HB-98)。将包含人PD-L1 cDNA的Lenti-X表达载体(pLVX)(Cat.No 631253)与Lenti-X HTX封装混合物一起共转染到Lenti-X 293T细胞系(Cat.No 632180)中以生成病毒。使用以Lenti-X HTX封装系统产生的慢病毒粒子来转导LK35.2细胞系。

6.1.3培养基和肽

细胞培养基：DMEM(Gibco，61965-026)10％FBS(Gibco，10270-106)，1mM丙酮酸钠(Gibco，11360-070)，1μg/ml嘌呤霉素(Gibco，A11138-03)

实验培养基：没有嘌呤霉素的完全DO11.10培养基。

OVA肽(MW＝1773.9Da)：H-ISQAVHAAHAEINEAGR-OH(肽扫描(pepscan))

细胞：

·DO11.10 pLVX：用空的慢病毒载体转导的DO11.10T细胞杂交瘤；

·LK 35.2hPD-L1：用包含hPD-L1的慢病毒载体转导以过度表达人PD-L1的B细胞杂交瘤

在实验培养基中制备Fcab、mAb²、抗人阳性对照mAb(S1或S70)或人IgG1亚型对照mAb(抗-HELD1.3或MSL)的稀释物。Fcab、mAb²或对照mAb在实验培养基中、在2.46μM OVA肽存在下与4×10⁵/ml LK35.2 hPD-L1细胞1:1混合(在96孔圆底板中每孔100μL LK35.2hPD-L1/(Fcab,mAb²或对照mAb)混合物)并在37℃、5％CO₂下温育1小时。将100μl体积实验培养基中的2×10⁵个DO11.10 pLVX细胞/ml添加到100μl的LK35.2 hPD-L1/(Fcab,mAb²或对照mAb)混合物中。随后，细胞在37℃、5％CO₂下温育24小时之前进行混合。采集上清液，并根据制造商的说明书用小鼠IL-2ELISA试剂盒(电子生物科学，88-7024-88或R&D系统，SM2000)进行试验。使用带有BioTek Gen5软件的平板读取器在450nm下读取平板。从450nm的吸光度值中减去570nm的吸光度值(校正)。用于计算细胞因子浓度的标准曲线基于四参数逻辑曲线拟合(Gen5软件，BioTek)。在GraphPad Prism中，将小鼠IL-2的浓度相对于Fcab、mAb²或阳性对照mAb的log浓度作图，并使用log(激动剂)相对于应答方程式将所得的曲线进行拟合。

结果在图3和4、及表12中示出。人Fcab在T细胞活化试验中显示出显著的活性，效力(EC₅₀)在与阳性对照mAbS1抗体相当的0.2nM范围内。Fcab和模拟mAb²都释放了介导T细胞抑制的PD-L1。然而，Fcab转变为模拟mAb²格式导致IL-2释放的部分减少。

表12：DO11.10 T细胞活化试验中抗人PD-L1 Fcab和模拟mAb²的EC₅₀值

实施例7-SEB试验中mAb²分子的活性

接下来，在SEB试验中测试mAb²格式的这些Fcab的活性。如实施例4所述地产生mAb²。

7.1葡萄球菌肠毒素B试验

在基于葡萄球菌肠毒素B试验(SEB试验)的人PBMC中测试Fcab、PD-L1模拟mAb²和PD-L1/CTLA-4mAb²。葡萄球菌肠毒素B是一种超抗原，并结合至抗原呈递细胞(APC)上的II类MHC分子以及T细胞受体(TCR)的vβ链，从而引起T细胞的非特异性活化和细胞因子释放。不需要存在抗原即可看到T细胞活化。SEB试验使用具有生理水平的检查点抑制剂的刺激的人细胞(PBMC)，并且SEB试验可以用于确认在人类系统中T细胞活化被mAb²增强。

7.1.1扩展的T细胞的生成

通过Ficoll梯度分离从白细胞锥中分离PBMC。根据制造商的说明，使用人CD4+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec Ltd，130-096-533)分离CD4+T细胞。通过涡流重悬人T-活化剂CD3/CD28免疫磁珠(生命技术，11131D)。将磁珠转移到无菌的15ml试管中，并添加具有10％FBS(生命技术，10270106)和1×青霉素链霉素(生命技术，15140122)的10ml RPMI(生命技术，61870044)来洗涤免疫磁珠。丢弃上清液。以3:1的磁珠与细胞比例，将所需量的在具有10％FBS、1×青霉素链霉素溶液和50IU/ml重组人IL2(派普泰克，200-02-50μg)的RPMI中1.0×10⁶个细胞/ml的CD4+T细胞转移至T75烧瓶(葛莱纳，690195)，并在37并在9％CO₂下温育。3天后，轻轻地重悬细胞并计数。根据需要，通过添加新鲜培养基(RPMI-10％FBS+青霉素链霉素溶液1霉素50IU/ml rhuIL2)将细胞密度保持在0.8-1度l ⁶个细胞/ml之间。在第7天或第8天，去除CD3/28磁珠并将CD4+T细胞以1×10⁶个细胞/ml新鲜培养基RPMI-10％FBS+青霉素链霉素溶液1×与降低的10IU/ml rhuIL2静置过夜。冷冻保存细胞待用。

7.1.2 MoiDC的生成

遵照制造商的说明，使用人泛单核细胞分离试剂盒(美天旎生物技术有限责任公司，130-096-537)从人PBMC分离出未接触的单核细胞。遵照制造商的说明，使用人Mo-DC分化培养基(美天旎生物技术有限责任公司，130-094-812)将单核细胞分化为iDC。

7.1.3 SEB试验

在实验前，解冻扩展的T细胞和MoiDC，用AIM培养基(Gibco，12055-091)洗涤，并在AIM培养基中在37℃、5％CO₂下进行温育。

在AIM培养基中制备Fcab、mAb²、抗人阳性对照mAb(S1(具有或不具有LALA突变)或S70)或人IgG1亚型对照mAb(抗HELD1.3或抗FITC克隆4420)的稀释物。MoiDC与来自相同供体的T细胞以1:10的比例混合(5ml的2×10⁵个细胞/ml的iDC与5ml的2×10⁶个细胞/ml的T细胞组合)。将20μl的0.1μg/ml的SEB(西格玛，S4881)添加到10ml的细胞中。在圆底96孔板中，将100μl的细胞/SEB混合物添加到100μl的抗体稀释物中，从而在每孔200μl的AIM培养基中0.1ng/ml SEB的情况下得到10⁴个iDC细胞与10⁵个T细胞的比例。细胞在37℃、5％CO₂下温育4天。收集上清液并立即用人IFN_γELISA试剂盒(R&D系统，PDIF50)进行试验、或在-20℃下冷冻用于进一步分析。根据试剂盒制造商的说明，使用由PBA 1:30稀释的上清液(DPBS，2％BSA(Sigma，A7906-100G))执行该试验。在GraphPad Prism软件中，将人IFN_γ的浓度相对于mAb²或mAb的log浓度作图，并使用log(激动剂)相对于响应方程式将产生的曲线拟合。表13示出了使用来自各个细胞供体的细胞的SEB试验中的EC₅₀值和IFNγ释放的跨度(span)。图5示出了使用单个供体的SEB试验的代表性图。如DO11.10 T细胞活化试验所示，一些Fcab克隆示出了与抗PD-L1阳性对照(S70)接近的活性。然而，Fcab转变为模拟mAb²格式导致了IFN_γ释放的部分减少。此外，该结果表明，Fcab中LALA突变的存在不会干扰Fcab的活性，如图5C所示。如上述3.6中解释的，Fcab自缔合导致二聚体的形成。在模拟mAb²格式中，该自缔合被取消。不希望受到理论的束缚，认为二聚体Fcab的形成可以通过结合力促进Fcab在基于细胞的试验、诸如SEB试验中的活性。

表13

PD-L1 Fcab、FS17-33-449和FS17-33-451还与抗CTLA-4Fab伊匹单抗(构建细节参见实施例4)配对，且在SEB试验中单独地与模拟mAb²(用FS17-33-449/HELD1.3或FS17-33-451/HELD1.3)、和伊匹单抗对比，或与模拟mAb²和伊匹单抗的组合对比，来评估mAb²的活性。PD-L1/CTLA-4mAb²显示出了比模拟mAb²和伊匹单抗作为单一剂或其组合更大的活化。在三个试验中的一个试验中，FS17-33-449/CTLA-4mAb²确实示出了不比模拟mAb²和伊匹单抗的组合高、但相当的活性。该结果示出了使用mAb²可以获得更好的协同活性。图6B提供了说明这些结果的SEB试验的代表性图。

实施例8-具有改进的稳定性的抗PD-L1 Fcab分子的选择

如通过动态光散射(DLS)、蛋白A纯化和溶解度分析(参见实施例4.3)所确定的，Fcab分子、FS17-33-449和FS17-33-451具有改进的生物物理性能。然而，这些分子的Fc结构域的解链温度(T_m)比野生型Fc结构域的解链温度低。降低的解链温度表明这些分子可能没有野生型Fc结构域稳定，这可能潜在地影响这些分子在制造期间的完整性和溶解度、和/或这些分子在长期储存期间的稳定性。

为了识别具有增加的解链温度的分子，如下所述，在易错(error prone)噬菌体展示文库的选择期间将Fcab FS17-33-449和FS17-33-451热应激。该选择活动(campaign)的目的是识别在不降低Fcab的靶向结合和活性的情况下增加Fcab分子的解链温度并因此增加其热稳定性的突变。

8.1 从易错文库选择具有改进的稳定性的抗PD-L1 Fcab分子

由于结合环和框架中的突变可以潜在地改进克隆的稳定性，因此，跨整个CH3结构域执行易错PCR(

PCR随机诱变试剂盒(宝生物出品公司(TakaraClontech)，630703)，以从各Fcab克隆、FS17-33-449和FS17-33-451生成CH3结构域文库。执行连续两轮PCR以实现每CH3片段平均6±2个突变。随后，将突变的CH3结构域连接(ligate)到噬菌粒载体pADL-23c(从抗体设计实验室得到许可的)中并转化到大肠杆菌(E.Coli)(TG1，Lucigen，60502-PQ997-A)中。随后，通过首先将噬菌体加热至80℃10分钟，对CH3结构域文库进行选择以选择具有较高解链温度的CH3结构域，然后选择以20nM的浓度与人PD-L1(hPD-L1)抗原的结合。如实施例3.1所述的生物素化的人PD-L1-组氨酸(艾可生物科学，PD1-H5229)用作用于选择的抗原来源。在一轮选择之后，在噬菌体ELISA中筛选结合至hPD-L1的输出，并对命中(hits)进行测序。识别了86个独特的CH3结构域序列。一个突变、即CH3结构域(在EF环中)的位置99处的天冬氨酸残基(D)改变为甘氨酸残基(G)，在所得的克隆群组中被过度呈现(overrepresent)。有趣的是，该突变代表向CH3结构域位置99处的野生型序列的逆转(例如参见图1A)。

如实施例4.2.1所述，选择的CH3结构域序列被亚克隆并以在CH2结构域中具有LALA突变的“模拟”(MSL109)mAb²格式表达，用于进一步筛选。在CH2结构域中具有LALA突变的“模拟”(MSL109)mAb²格式的亲本FS17-33-449和FS17-33-451克隆被用作对照。随后使用Octet系统测试上清液与hPD-L1抗原的结合，并且显示有29个克隆保持与该抗原的结合。随后，将这些克隆大规模表达，并且表达后可以纯化这些克隆中的21个。随后如实施例5.1中所述地测量这些21个克隆的K_D值，并且在表14中总结了结果。在它们具有低于1nM的结合至hPD-L1的K_D值的基础上，在21个克隆中选择17个，并在DO11.10 T细胞活化试验中使用实施例6中描述的方法测试它们的活性(试验结果参见表14)。随后通过使用差示扫描量热法(DSC)确定这些Fcab的解链温度，来评估基于在DO11.10试验中它们的EC₅₀值而具有最高活性的六个Fcab克隆的热力学稳定性(结果参见表14)。由于Fcab克隆的CH2和CH3结构域的T_m仅显示较小差异，因此无法从谱图中分别确定哪个峰代表CH2结构域，哪个峰代表CH3结构域。因此，表14报道了峰1和峰2的T_m，最低的转变温度最能代表整个分子的T_m。与亲本Fcab相比，三个Fcab显示出了解链温度的显著增加、即Fcab FS17-33-488、FS17-33-539和FS17-33-548。表15显示出了这三个Fcab的EF环序列和这些Fcab包含的CH3结构域中的任何额外框架突变。三个Fcab都包含CH3结构域位置99处的天冬氨酸(D)到野生型甘氨酸(G)的逆转。此外，Fcab FS17-33-488和FS17-33-539都包含CH3结构域位置113处的组氨酸(H)到精氨酸(R)残基的突变。由于这两个Fcab具有不同的亲本克隆(具体参见表15)，该突变以及D99G逆转独立出现两次，表明这些突变在增加这些Fcab的解链温度、并因此增加Fcab的稳定性中起到重要的作用。Fcab FS17-33-488也包括位置101处的丙氨酸残基，以及CH3结构域框架中的额外突变(具体参见表15)。

从一组测试的Fcab中选择Fcab克隆FS17-33-539和FS17-33-548，用于进一步分析，因为这些Fcab与包括更大量突变的FS17-33-448Fcab相比，结合了改进的解链温度与低的突变负担。此外，与相关亲本克隆(FS17-33-449或FS17-33-451；具体参见表15)相比，观察到这两个克隆(增加3-4℃)比FS17-33-488克隆(增加约2℃)在解链温度上具有更大的改进(表14)。

表14

表15

8.2具有改进的稳定性的Fcab分子与PD-L1的结合

在实施例8.1中识别的Fcab，FS17-33-539AA/MSL109和FS17-33-548AA/MSL109被大规模产生，并如实施例4.2.1中描述地进行纯化。通过使用Biacore T200系统(GE医疗保健)的SPR并在如实施例5.1中所述的细胞结合试验中对模拟mAb²与hPD-L1的结合进行评估。为了测量克隆与单体hPD-L1-组氨酸的亲和力，使用通过Biacore T200系统包被在CM5芯片(GE28-9582-20AC)上的抗Fab抗体来捕获模拟mAb²。为了最小化质量传输影响，将捕获水平最小化至200RU，并使用75μl/min的快流速。对人(艾可生物科学，PD1-H5229)和食蟹猴(艾可生物科学，PD1-C52H4)单体抗原都进行滴定，并使其流过捕获的模拟mAb²。使用Biacore T200评估软件完成数据的分析。使用不具有体积分析并局部分析R_max的1:1拟合模型，分析了减去空白流动池的曲线以及无抗原的运行。

通过在4℃下将模拟mAb²与对照HEK293细胞或过度表达hPD-L1或食蟹猴PD-L1细胞的HEK293细胞一起温育1小时，来执行细胞结合试验。随后使用抗人Fc 488检测抗体检测模拟mAb²结合。使用FACS Canto流式细胞分析仪(BD生物科学)测量荧光信号强度。

在表16中总结了这些结合实验的结果。表16显示出了所测试的全部模拟mAb²对单体和细胞表达的人和食蟹猴PD-L1具有高亲和力。

表16

8.3具有改进的稳定性的Fcab分子的阻断活性

在基于细胞的受体阻断试验(RBA)中测试了模拟mAb²阻断hPD-1/hPD-L1及hPD-L1/hCD80相互作用的能力。IgG1框架中的、且包括LALA突变(G1AA/S70)的抗PD-L1抗体S70用作阳性对照。简而言之，将生物素化的hPD-L1-Fc-Avi与滴定浓度范围从2000nM到3pM的模拟mAb²一起温育1小时。混合物与过度表达hPD-1或hCD80的HEK293细胞一起温育再一小时。使用链霉亲和素647检测HEK293细胞上的结合的生物素化hPD-L1-Fc-Avi的水平，且使用FACS Canto流式细胞仪测量荧光水平。

表17中显示出了这些阻断实验的结果。表17显示出了测试的所有克隆都能够完全阻断hPD-1/hPD-L1和hPD-L1/hCD80相互作用。

表17：

8.4具有改进的稳定性的Fcab在人T细胞活化试验中的活性

如实施例6.1中所述在基于DO11.10细胞的T细胞活化试验、以及如实施例7.1中所述在SEB试验中测试模拟mAb²的活性。结果在表18中示出。由于可能会在试验之间看到可变性，例如，取决于SEB试验中使用的刺激的PBMC的供体来源，亲本克隆之一、FS17-33-451(“模拟”MSL109 mAb²格式，并包括LALA突变)也作为直接比较器(comparator)包括在两个试验中。在两个试验中测试了两种模拟mAb²保留的T细胞活化活性。在这些试验中模拟mAb²的EC₅₀与亲本克隆FS17-33-451AA/MSL109的EC₅₀相比或者是改进的、或者是相当的。

表18：

mAb<sup>2</sup>	DO11.10 EC<sub>50</sub>(nM)	SEB EC<sub>50</sub>(nM)
			FS17-33-539AA/MSL109	2.91	0.97
FS17-33-548AA/MSL109	7.59	3.21
			FS17-33-451AA/MSL109(亲本)	8.28	1.11

8.5通过差示扫描热量法(DSC)评估热稳定性

使用微热量VP毛细管差示扫描量热计(Microcal VP-capillary differentialscanning calorimeter)测量了FS17-33-539和FS1733-548 Fcab(模拟MSL109mAb²格式且具有LALA突变)的解链温度(T_m)。在该分析中包括作为阳性对照的G1AA/MSL109 mAb²，因为它包含野生型CH3结构域和含有CH2结构域的LALA突变。样品在浓度为0.2mg/ml的样品缓冲剂中进行测量。扫描速率设为60℃/hr并在35℃和100℃之间收集数据。用Origin 7.0软件执行数据分析。结果在表19中示出。如在克隆以较小规模产生时所看到的(参见表14)，模拟mAb²格式的FS17-33-539和FS17-33-548Fcab分子与相关亲本克隆相比，展示出Fc结构域的解链温度改进了3-4℃。

表19：

参考文献

本说明书中所提及的全部文件，其全部内容均通过引用而结合到本文中。

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序列表

WT Fcab CH3结构域结构环的氨基酸序列

WT Fcab AB环-LTKNQ(SEQ ID NO：1)

WT Fcab CD环-QPENNY(SEQ ID NO：2)

WT Fcab EF环-DKSRWQQGNV(SEQ ID NO：3)

WT Fcab CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)

GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

具有LALA突变的WT Fcab、FS17-33和FS17-33-37/116/288/289/296/334/449/ 451/488/539/548的CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)

LALA突变的位置以下划线标出

APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK

Fcab FS17-33-116/288/289/296/334/449/451CH3结构域结构环的一致序列

AB环-X1GYW(SEQ ID NO：10)

CD环-EPQYWA(SEQ ID NO：11)

EF环-SNWRWQX2DDX3(SEQ ID NO：12)

X₁＝V、S、T或E

X₂＝M、I、L、V

X₃＝V或不存在

Fcab FS17-33 CH3结构域结构环的氨基酸序列

FS17-33 AB环-QSGYW(SEQ ID NO：13)

FS17-33 CD环-QPENNY(SEQ ID NO：2)

FS17-33 EF环-SNWRWQMGD(SEQ ID NO：14)

Fcab FS17-33 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：15)

GQPREPQVYTLPPSRDEQSGYWVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQMGDFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

具有LALA突变的Fcab FS17-33的氨基酸序列(SEQ ID NO：16)

铰链区(下划线)、CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)

不具有LALA突变的Fcab FS17-33的氨基酸序列(SEQ ID NO：17)

铰链区(下划线)、CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)

不具有LALA突变的WT Fcab、FS17-33和FS17-33-37/116/288/289/296/334/449/ 451/488/539/548的CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)

APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK

WT Fcab、FS17-33和FS17-33-37/116/288/289/296/334/449/451/488/539/548的 截短的铰链区的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)

TCPPCP

具有LALA突变的WT Fcab的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)

铰链区(下划线)、CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)

不具有LALA突变的WT Fcab的氨基酸序列(SEQ ID NO：9)

铰链区(下划线)、CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)

Fcab FS17-33-37CH3结构域结构环的氨基酸序列

FS17-33 AB环-QVGYW(SEQ ID NO：18)

FS17-33 CD环-QPENNY(SEQ ID NO：2)

FS17-33 EF环-SNWRWQMDD(EQ ID NO：19)

Fcab FS17-33-37 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：20)

GQPREPQVYTLPPSRDEQVGYWVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQMDDFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

具有LALA突变的FcabFS17-33-37的氨基酸序列(SEQ ID NO：21)

铰链区(下划线)、CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)

不具有LALA突变的Fcab FS17-33-37的氨基酸序列(SEQ ID NO：22)

铰链区(下划线)、CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)

Fcab FS17-33-116CH3结构域结构环的氨基酸序列

FS17-33-116AB环-SGYW(EQ ID NO：23)

FS17-33-116CD环-EPQYWA(SEQ ID NO：11)

FS17-33-116EF环-SNWRWQMDD(SEQ ID NO：19)

Fcab FS17-33-116CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：24)

GQPREPQVYTLPPSRDESGYWVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGEPQYWAKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQMDDFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

具有LALA突变的Fcab FS17-33-116的氨基酸序列(SEQ ID NO：25)

铰链区(下划线)、CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)

不具有LALA突变的Fcab FS17-33-116的氨基酸序列(SEQ ID NO：26)

铰链区(下划线)、CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)

Fcab FS17-33-288CH3结构域结构环的氨基酸序列

FS17-33-288 AB环-SGYW(SEQ ID NO：23)

FS17-33-288 CD环-EPQYWA(SEQ ID NO：11)

FS17-33-288 EF环-SNWRWQIDD(SEQ ID NO：27)

FS17-33-288 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：28)

GQPREPQVYTLPPSRDESGYWVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGEPQYWAKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQIDDFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

具有LALA突变的Fcab FS17-33-288的氨基酸序列(SEQ ID NO：29)

铰链区(下划线)、CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)

不具有LALA突变的Fcab FS17-33-288的氨基酸序列(SEQ ID NO：30)

铰链区(下划线)、CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)

Fcab FS17-33-289CH3结构域结构环的氨基酸序列

FS17-33-289AB环-ABSGYW(SEQ ID NO：23)

FS17-33-289CD环-EPQYWA(SEQ ID NO：11)

FS17-33-289EF环-SNWRWQLDD(SEQ ID NO：31)

Fcab FS17-33-289CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：32)

GQPREPQVYTLPPSRDESGYWVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGEPQYWAKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQLDDFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

具有LALA突变的Fcab FS17-33-289的氨基酸序列(SEQ ID NO：33)

铰链区(下划线)、CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)

不具有LALA突变的Fcab FS17-33-289的氨基酸序列(SEQ ID NO：34)

铰链区(下划线)、CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)

Fcab FS17-33-296CH3结构域结构环的氨基酸序列

FS17-33-296AB环-SGYW(SEQ ID NO：23)

FS17-33-296CD环-EPQYWA(SEQ ID NO：11)

FS17-33-296EF环-SNWRWQVDD(SEQ ID NO：35)

Fcab FS17-33-296CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：36)

GQPREPQVYTLPPSRDESGYWVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGEPQYWAKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQVDDFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

具有LALA突变的Fcab FS17-33-296的氨基酸序列(SEQ ID NO：37)

铰链区(下划线)、CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)

不具有LALA突变的Fcab FS17-33-296的氨基酸序列(SEQ ID NO：38)

铰链区(下划线)、CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)

Fcab FS17-33-334CH3结构域结构环的氨基酸序列

FS17-33-334AB环-SGYW(SEQ ID NO：23)

FS17-33-334CD环-EPQYWA(SEQ ID NO：11)

FS17-33-334EF环-SNWRWQLDD(SEQ ID NO：31)

Fcab FS17-33-334 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：39)

GQPREPQVYTLPPSRDESGYWVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEPQYWAKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQLDDFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

具有LALA突变的Fcab FS17-33-334的氨基酸序列(SEQ ID NO：40)

铰链区(下划线)、CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)

不具有LALA突变的Fcab FS17-33-334的氨基酸序列(SEQ ID NO：41)

铰链区(下划线)、CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)

Fcab FS17-33-449CH3结构域结构环的氨基酸序列

FS17-33-449AB环-TGYW(SEQ ID NO：42)

FS17-33-449CD环-EPQYWA(SEQ ID NO：11)

FS17-33-449EF环-SNWRWQLDDV(SEQ ID NO：43)

Fcab FS17-33-449CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：44)

GQPREPQVYTLPPSRDETGYWVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEPQYWAKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQLDDVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

具有LALA突变的Fcab FS17-33-449的氨基酸序列(SEQ ID NO：45)

铰链区(下划线)、CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)

不具有LALA突变的Fcab FS17-33-449的氨基酸序列(SEQ ID NO：46)

铰链区(下划线)、CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)

Fcab FS17-33-451CH3结构域结构环的氨基酸序列

FS17-33-451AB环-SEGYW(SEQ ID NO：47)

FS17-33-451CD环-SEPQYWA(SEQ ID NO：11)

FS17-33-451EF环-SNWRWQLDDV(SEQ ID NO：43)

Fcab FS17-33-451 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：48)

GQPREPQVYTLPPSRDEEGYWVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEPQYWAKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQLDDVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

具有LALA突变的Fcab FS17-33-451的氨基酸序列(SEQ ID NO：49)

铰链区(下划线)、CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)

不具有LALA突变的Fcab FS17-33-451的氨基酸序列(SEQ ID NO：50)

铰链区(下划线)、CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)

具有LALA突变的IgG1 4420抗体的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：51)

在以下重链序列、以及下面列出的抗体HelD1.3、MSL109、S70和S1的重链序列中，可变结构域的序列以斜体示出，CH1结构域的序列以下划线示出，铰链区的序列以双下划线示出，CH2结构域的序列以加粗示出，且CH3结构域的序列以普通字体示出。

具有LALA突变的IgG1 4420抗体的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：52)

在以下轻链序列、以及下面列出的抗体HelD1.3、MSL109、S70和S1的轻链序列中，可变结构域的序列以斜体示出，恒定结构域的序列以下划线示出。

具有LALA突变的HelD1.3抗体的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：53)

具有LALA突变的HelD1.3抗体的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：54)

具有LALA突变的MSL109抗体的重链氨基酸序列(SEQ ID NO：55)

具有LALA突变的MSL109抗体的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：56)

具有LALA突变的S70抗体的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：57)

具有LALA突变的S70抗体的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：58)

具有LALA突变的S1抗体的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：59)

具有LALA突变的S1抗体的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：60)

人PD-L1的氨基酸序列(SEQ ID NO：61)

MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET

鼠PD-L1的氨基酸序列(SEQ ID NO：62)

MRIFAGIIFTACCHLLRAFTITAPKDLYVVEYGSNVTMECRFPVERELDLLALVVYWEKEDEQVIQFVAGEEDLKPQHSNFRGRASLPKDQLLKGNAALQITDVKLQDAGVYCCIISYGGADYKRITLKVNAPYRKINQRISVDPATSEHELICQAEGYPEAEVIWTNSDHQPVSGKRSVTTSRTEGMLLNVTSSLRVNATANDVFYCTFWRSQPGQNHTAELIIPELPATHPPQNRTHWVLLGSILLFLIVVSTVLLFLRKQVRMLDVEKCGVEDTSSKNRNDTQFEET

食蟹猴PD-L1的氨基酸序列(SEQ ID NO：63)

MRIFAVFIFTIYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLTSLIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSNYRQRAQLLKDQLSLGNAALRITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLLNVTSTLRINTTANEIFYCIFRRLDPEENHTAELVIPELPLALPPNERTHLVILGAIFLLLGVALTFIFYLRKGRMMDMKKCGIRVTNSKKQRDTQLEET

人PD-1的氨基酸序列(SEQ ID NO：64)

MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPN

GRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSP

RPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPV

FSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQP

LRPEDGHCSWPL

人CD80的氨基酸序列(SEQ ID NO：65)

MGHTRRQGTSPSKCPYLNFFQLLVLAGLSHFCSGVIHVTKEVKEVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNLSIV

ILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSVKADFPTPSISDFEIPTSNIRRI

ICSTSGGFPEPHLSWLENGEELNAINTTVSQDPETELYAVSSKLDFNMTTNHSFMCLI

KYGHLRVNQTFNWNTTKQEHFPDNLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRR

NERLRRESVRPV

小鼠CD80的氨基酸序列(SEQ ID NO：66)

MACNCQLMQDTPLLKFPCPRLILLFVLLIRLSQVSSDVDEQLSK

SVKDKVLLPCRYNSPHEDESEDRIYWQKHDKVVLSVIAGKLKVWPEYKNRTLYDNTTY

SLIILGLVLSDRGTYSCVVQKKERGTYEVKHLALVKLSIKADFSTPNITESGNPSADT

KRITCFASGGFPKPRFSWLENGRELPGINTTISQDPESELYTISSQLDFNTTRNHTIK

CLIKYGDAHVSEDFTWEKPPEDPPDSKNTLVLFGAGFGAVITVVVIVVIIKCFCKHRS

CFRRNEASRETNNSLTFGPEEALAEQTVFL

不具有LALA突变的伊匹单抗的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：67)

CDR以下划线表示。CH3序列以加粗显示

不具有LALA突变的伊匹单抗的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：68)

CDR序列以下划线表示

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

人IgG1铰链区的氨基酸序列(SEQ ID NO：69)

EPKSCDKTHTCPPCP

Fcab FS17-33-488CH3结构域结构环的氨基酸序列

FS17-33-488 AB环-EGYW(SEQ ID NO：47)

FS17-33-488 CD环-EPQYWA(SEQ ID NO：11)

FS17-33-488 EF环-SNWRWQLGDA(SEQ ID NO：70)

Fcab FS17-33-488 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：71)

GQPREPQVYTLPPSRDEEGYWVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEPQYWAKTTPPVPDSDGTFFLYSKLTVSNWRWQLGDAFSCSVMHEALRNHYTQKSLSLSPGK

具有LALA突变的Fcab FS17-33-488的氨基酸序列(SEQ ID NO：72)

铰链区(下划线)、CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)

不具有LALA突变的Fcab FS17-33-488的氨基酸序列(SEQ ID NO：73)

铰链区(下划线)、CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)

Fcab FS17-33-539CH3结构域结构环的氨基酸序列

FS17-33-539 AB环-TGYW(SEQ ID NO：42)

FS17-33-539 CD环-EPQYWA(SEQ ID NO：11)

FS17-33-539 EF环-SNWRWQLGDV(SEQ ID NO：74)

Fcab FS17-33-539 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：75)

GQPREPQVYTLPPSRDETGYWVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEPQYWAKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQLGDVFSCSVMHEALRNHYTQKSLSLSPGK

具有LALA突变的Fcab FS17-33-539的氨基酸序列(SEQ ID NO：76)

铰链区(下划线)、CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)

不具有LALA突变的Fcab FS17-33-539的氨基酸序列(SEQ ID NO：77)

铰链区(下划线)、CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)

FS17-33-548 CH3结构域结构环的氨基酸序列

FS17-33-548 AB环-EGYW(SEQ ID NO：47)

FS17-33-548 CD环-EPQYWA(SEQ ID NO：11)

FS17-33-548 EF环-SNWRWQLGDV(SEQ ID NO：78)

Fcab FS17-33-548 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：79)

GQPREPQVYTLPPSRDEEGYWVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEPQYWAKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQLGDVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

具有LALA突变的Fcab FS17-33-548的氨基酸序列(SEQ ID NO：80)

铰链区(下划线)、CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)

不具有LALA突变的Fcab FS17-33-548的氨基酸序列(SEQ ID NO：81)

铰链区(下划线)、CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)

具有LALA突变和P114A突变的CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：82)

LALA突变加下划线；P114A突变加粗和加下划线