B7-h4抗体制剂
阅读说明：本技术 B7-h4抗体制剂 (B7-H4 antibody formulations ) 是由 全勇 黄清仪 H·S·甘达 于 2019-02-21 设计创作，主要内容包括：本公开提供了药物组合物,所述药物组合物包含特异性地结合至人B7-H4(和任选的食蟹猴、小鼠和/或大鼠B7-H4)的抗体及其抗原结合片段。本公开还提供了通过施用此类药物组合物来治疗诸如癌症的病症的方法。(The present disclosure provides pharmaceutical compositions comprising antibodies and antigen-binding fragments thereof that specifically bind to human B7-H4 (and optionally cynomolgus monkey, mouse, and/or rat B7-H4). The present disclosure also provides methods of treating disorders such as cancer by administering such pharmaceutical compositions.)
1.技术领域
提供了包含B7-H4抗体的药物组合物和使用此类制剂的方法。
2.背景技术
B7-H4(也称为B7x、B7-S1和VTCN1)是与其他B7家族成员(包括PD-L1)具有同源性的免疫调控分子。它是由IgV和IgC胞外结构域组成的I型跨膜蛋白。尽管健康组织中B7-H4的表达在蛋白质水平上相对有限，但B7-H4在几种实体瘤(如乳腺、卵巢和子宫内膜的妇科癌)中表达。B7-H4在肿瘤中的表达往往与不良预后相关。B7-H4的受体是未知的，但据信所述受体在T细胞上表达。据信B7-H4直接抑制T细胞活性。
鉴于B7-H4的表达和功能，正在开发特异性地结合至B7-H4的抗体用于涉及B7-H4的调节的疗法，例如用于治疗癌症。因此，需要用于施用此类治疗的包含B7-H4抗体及其抗原结合片段的药物组合物。
3.
发明内容
本文提供了药物组合物，所述药物组合物包含特异性地结合至人B7-H4的抗体或其抗原结合片段。
在某些方面，药物组合物包含(i)特异性地结合至人B7-H4的抗体或其抗原结合片段，(ii)选自由乙酸盐或柠檬酸盐组成的组的缓冲剂，和(iii)糖，其中所述组合物的pH是约4.5至约6，或是4.5至6。
在某些方面，所述抗体或其抗原结合片段包含20502的CDR。
在某些方面，药物组合物包含(i)特异性地结合至人B7-H4并包含20502的CDR的抗体或其抗原结合片段，(ii)缓冲剂，和(iii)约4.5至约6或4.5至6的pH。
在某些方面，20502的CDR是Kabat定义的CDR、Chothia定义的CDR或AbM定义的CDR。在某些方面，所述抗体或其抗原结合片段包含分别SEQ ID NO:5-10的重链可变区(VH)互补决定区(CDR)1、VH CDR2、VH CDR3和轻链可变区(VL)CDR1、CDR2和CDR3序列。
在某些方面，药物组合物包含特异性地结合至人B7-H4的抗体或其抗原结合片段，其中在5℃下6个月后，所述组合物包含不超过45％的所述抗体或其抗原结合片段的酸性变体。在某些方面，药物组合物包含特异性地结合至人B7-H4的抗体或其抗原结合片段，其中在5℃下6个月后，所述组合物包含不超过40％的所述抗体或其抗原结合片段的酸性变体。在某些方面，药物组合物包含特异性地结合至人B7-H4的抗体或其抗原结合片段，其中在5℃下6个月后，所述组合物包含约35％至约45％的所述抗体或其抗原结合片段的酸性变体。在某些方面，药物组合物包含特异性地结合至人B7-H4的抗体或其抗原结合片段，其中在5℃下6个月后，所述组合物包含35％至45％的所述抗体或其抗原结合片段的酸性变体。在某些方面，在5℃下6个月后，所述组合物包含不超过20％的所述抗体或其抗原结合片段的碱性变体。
在某些方面，药物组合物包含特异性地结合至人B7-H4的抗体或其抗原结合片段，其中在5℃下6个月后，所述组合物包含不超过20％的所述抗体或其抗原结合片段的碱性变体。在某些方面，药物组合物包含特异性地结合至人B7-H4的抗体或其抗原结合片段，其中在5℃下6个月后，所述组合物包含约9％至约18％的所述抗体或其抗原结合片段的碱性变体。在某些方面，药物组合物包含特异性地结合至人B7-H4的抗体或其抗原结合片段，其中在5℃下6个月后，所述组合物包含9％至18％的所述抗体或其抗原结合片段的碱性变体。在某些方面，在5℃下6个月后，所述组合物包含不超过45％的所述抗体或其抗原结合片段的酸性变体。在某些方面，在5℃下6个月后，所述组合物包含不超过40％的所述抗体或其抗原结合片段的酸性变体。
在某些方面，药物组合物包含特异性地结合至人B7-H4的抗体或其抗原结合片段，其中在5℃下6个月后，所述组合物包含不超过60％的所述抗体或其抗原结合片段的酸性和碱性变体。在某些方面，在5℃下6个月后，所述组合物包含不超过55％的所述抗体或其抗原结合片段的酸性和碱性变体。在某些方面，在5℃下6个月后，所述组合物包含不超过45％的所述抗体或其抗原结合片段的酸性变体。在某些方面，在5℃下6个月后，所述组合物包含不超过40％的所述抗体或其抗原结合片段的酸性变体。在某些方面，在5℃下6个月后，所述组合物包含不超过20％的所述抗体或其抗原结合片段的碱性变体。
在某些方面，在5℃下6个月后，所述药物组合物包含约30％至约40％的所述抗体或其抗原结合片段的酸性变体。在某些方面，在5℃下6个月后，所述药物组合物包含30％至40％的所述抗体或其抗原结合片段的酸性变体。在某些方面，在5℃下6个月后，所述药物组合物包含约35％至约40％的所述抗体或其抗原结合片段的酸性变体。在某些方面，在5℃下6个月后，所述药物组合物包含35％至40％的所述抗体或其抗原结合片段的酸性变体。
在某些方面，在5℃下6个月后，所述药物组合物包含约10％至约17％的所述抗体或其抗原结合片段的碱性变体。在某些方面，在5℃下6个月后，所述药物组合物包含10％至17％的所述抗体或其抗原结合片段的碱性变体。在某些方面，在5℃下6个月后，所述药物组合物包含约11％至约16％的所述抗体或其抗原结合片段的碱性变体。在某些方面，在5℃下6个月后，所述药物组合物包含11％至16％的所述抗体或其抗原结合片段的碱性变体。
在某些方面，在5℃下6个月后，所述组合物包含不超过55％的所述抗体或其抗原结合片段的酸性和碱性变体。
在某些方面，所述抗体或其抗原结合片段包含20502的CDR。在某些方面，20502的CDR是Kabat定义的CDR、Chothia定义的CDR或AbM定义的CDR。在某些方面，所述抗体或其抗原结合片段包含分别SEQ ID NO:5-10的重链可变区(VH)互补决定区(CDR)1、VH CDR2、VHCDR3和轻链可变区(VL)CDR1、CDR2和CDR3序列。
在某些方面，所述组合物的pH是约4.5至约6，或是4.5至6。
在某些方面，所述组合物包含缓冲剂。在某些方面，所述缓冲剂是乙酸盐或柠檬酸盐。
在某些方面，所述组合物还包含糖。在某些方面，所述糖选自由蔗糖、山梨糖醇和海藻糖组成的组。
在某些方面，所述缓冲剂的浓度是约15至约25mM。在某些方面，所述缓冲剂的浓度是15至25mM。在某些方面，所述缓冲剂的浓度是约18mM至约22mM。在某些方面，所述缓冲剂的浓度是18mM至22mM。在某些方面，所述缓冲剂的浓度是约20mM。在某些方面，所述缓冲剂的浓度是约20mM。
在某些方面，所述糖的浓度是约225mM至约300mM。在某些方面，所述糖的浓度是225mM至300mM。在某些方面，所述糖的浓度是约250mM至约290mM。在某些方面，所述糖的浓度是250mM至290mM。在某些方面，所述糖的浓度是约270mM。在某些方面，所述糖的浓度是270mM。
在某些方面，所述糖的浓度是所述缓冲剂的浓度的约10至约15倍。在某些方面，所述糖的浓度是所述缓冲剂的浓度的10至15倍。在某些方面，所述糖的浓度是所述缓冲剂的浓度的约13.5倍。在某些方面，所述糖的浓度是所述缓冲剂的浓度的13.5倍。
在某些方面，所述组合物还包含表面活性剂。在某些方面，所述表面活性剂是聚山梨醇酯。在某些方面，所述聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20。在某些方面，所述聚山梨醇酯的浓度是约0.025％至约0.075％重量/体积(w/v)。在某些方面，所述组合物还包含表面活性剂。在某些方面，所述表面活性剂是聚山梨醇酯。在某些方面，所述聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20。在某些方面，所述聚山梨醇酯的浓度是0.025％至0.075％重量/体积(w/v)。在某些方面，所述聚山梨醇酯的浓度是约0.035％至约0.065％重量/体积(w/v)。在某些方面，所述聚山梨醇酯的浓度是0.035％至0.065％重量/体积(w/v)。在某些方面，所述聚山梨醇酯的浓度是约0.005％重量/体积(w/v)。在某些方面，所述聚山梨醇酯的浓度是0.005％重量/体积(w/v)。
在某些方面，所述抗体或其抗原结合片段(包括其酸性和碱性变体)的浓度是约5mg/ml至约30mg/ml。在某些方面，所述抗体或其抗原结合片段(包括其酸性和碱性变体)的浓度是5mg/ml至30mg/ml。在某些方面，所述抗体或其抗原结合片段(包括其酸性和碱性变体)的浓度是约10至约25mg/ml。在某些方面，所述抗体或其抗原结合片段(包括其酸性和碱性变体)的浓度是10至25mg/ml。在某些方面，所述抗体或其抗原结合片段(包括其酸性和碱性变体)的浓度是约20mg/ml。在某些方面，所述抗体或其抗原结合片段(包括其酸性和碱性变体)的浓度是20mg/ml。
在某些方面，所述组合物的pH是约5.0至约6.0。在某些方面，所述组合物的pH是5.0至6.0。在某些方面，pH是约5。在某些方面，pH是5。在某些方面，pH是约5.5。在某些方面，pH是5.5。
在某些方面，所述组合物是液体。在某些方面，所述组合物用于胃肠外施用。在某些方面，所述组合物用于静脉内施用。
在某些方面，所述缓冲剂是乙酸盐，并且赋形剂是蔗糖。在某些方面，所述组合物包含约20mM乙酸盐、约270mM蔗糖、约20mg/ml的所述抗体或其抗原结合片段和约0.05％的聚山梨醇酯20，其中pH是约5.0。在某些方面，所述组合物包含为乙酸盐浓度的约13.5倍的浓度的蔗糖、约20mg/ml的所述抗体或其抗原结合片段和约0.05％的聚山梨醇酯20，其中pH是约5.0。在某些方面，所述组合物包含20mM乙酸盐、270mM蔗糖、20mg/ml的所述抗体或其抗原结合片段和0.05％的聚山梨醇酯20，其中pH是约5.0。在某些方面，所述组合物包含为乙酸盐浓度的13.5倍的浓度的蔗糖、20mg/ml的所述抗体或其抗原结合片段和0.05％的聚山梨醇酯20，其中pH是5.0。
在某些方面，所述缓冲剂是柠檬酸盐，并且所述赋形剂是蔗糖。在某些方面，所述组合物包含约20mM柠檬酸盐、约270mM蔗糖、约20mg/ml的所述抗体或其抗原结合片段和约0.05％的聚山梨醇酯20，其中pH是约5.5。在某些方面，所述组合物包含为柠檬酸盐浓度的约13.5倍的浓度的蔗糖、约20mg/ml的所述抗体或其抗原结合片段和约0.05％的聚山梨醇酯20，其中pH是约5.5。在某些方面，所述组合物包含20mM柠檬酸盐、270mM蔗糖、20mg/ml的所述抗体或其抗原结合片段和0.05％的聚山梨醇酯20，其中pH是5.5。在某些方面，所述组合物包含为柠檬酸盐浓度的13.5倍的浓度的蔗糖、20mg/ml的所述抗体或其抗原结合片段和0.05％的聚山梨醇酯20，其中pH是5.5。
在某些方面，所述抗体包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:11中列出的氨基酸序列；和/或VL，所述VL包含SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列。在某些方面，所述抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:21中列出的氨基酸序列；和/或轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:22中列出的氨基酸序列。
在某些方面，所述组合物中至少95％的所述抗体或其抗原结合片段无岩藻糖基化。在某些方面，岩藻糖基化在所述组合物中不可检测到。
在某些方面，所述组合物包含全长抗体。
在某些方面，所述组合物包含抗原结合片段。在某些方面，所述抗原结合片段包含Fab、Fab'、F(ab’)2、单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、胞内抗体、IgGΔCH2、微型抗体、F(ab’)3、四价抗体、三价抗体、二价抗体、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。
在某些方面，所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合至食蟹猴B7-H4。在某些方面，所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合至大鼠B7-H4。在某些方面，所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合至小鼠B7-H4。
在某些方面，所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合至人B7-H4的IgV结构域。
在某些方面，所述抗体或其抗原结合片段的pI是约8.2。在某些方面，所述抗体或其抗原结合片段的pI是8.2。
在某些方面，药物组合物由以下组成：(i)抗体，所述抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:21中列出的氨基酸序列，和/或轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:22中列出的氨基酸序列；(ii)约20mM乙酸盐；(iii)约270mM蔗糖；和(iv)约0.05％重量/体积的聚山梨醇酯20，其中所述组合物的pH是约5.0。在某些方面，药物组合物由以下组成：(i)抗体，所述抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:21中列出的氨基酸序列，和/或轻链，所述轻链包含SEQID NO:22中列出的氨基酸序列；(ii)20mM乙酸盐；(iii)270mM蔗糖；和(iv)0.05％重量/体积的聚山梨醇酯20，其中所述组合物的pH是5.0。
在某些方面，药物组合物由以下组成：(i)抗体，所述抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:21中列出的氨基酸序列，和/或轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:22中列出的氨基酸序列；(ii)约20mM柠檬酸盐；(iii)约270mM蔗糖；和(iv)约0.05％重量/体积的聚山梨醇酯20，其中所述组合物的pH是约5.5。在某些方面，药物组合物由以下组成：(i)抗体，所述抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:21中列出的氨基酸序列，和/或轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:22中列出的氨基酸序列；(ii)20mM柠檬酸盐；(iii)270mM蔗糖；和(iv)0.05％重量/体积的聚山梨醇酯20，其中所述组合物的pH是5.5。
在某些方面，注射器或小瓶包括本文提供的药物组合物。
在某些方面，一种治疗受试者的表达B7-H4的癌症的方法包括向所述受试者施用本文提供的药物组合物。在某些方面，所述癌症是实体瘤。在某些方面，所述癌症选自由以下组成的组：乳腺癌、导管癌、子宫内膜癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、甲状腺癌、肾癌和膀胱癌。在某些方面，所述乳腺癌是三阴性乳腺癌或激素受体阳性乳腺癌。在某些方面，所述非小细胞肺癌是鳞状细胞癌。
在某些方面，所述受试者是人。
在某些方面，胃肠外施用所述药物组合物。在某些方面，静脉内施用所述药物组合物。
4.附图说明
图1示出通过UNit系统测量的在不同pH条件下B7-H4抗体“20502”(无岩藻糖基化)的解折叠温度(Tm1)。(参见实施例3。)
图2示出如通过尺寸排阻高效液相色谱法(SE-HPLC)所确定，在40℃下缓冲剂pH对B7-H4抗体“20502”(无岩藻糖基化)的聚集体形成的影响。表13中列出了针对每种pH的配方。对于所测试的所有pH，高分子量(HMW)的百分比在T0时是约0。(参见实施例3。)
图3示出如通过SE-HPLC所确定，在40℃下缓冲剂pH对片段形成的影响。表13中列出了针对每种pH的配方。对于所测试的所有pH，低分子量(LMW)的百分比在T0时是约0。(参见实施例3。)
图4示出在含有20mM柠檬酸盐、270mM蔗糖和0.05％的聚山梨醇酯20(PS20)的制剂中，在40℃下缓冲剂pH对聚集体形成的影响(如通过SE-HPLC所确定)。(参见实施例4。)
图5示出在含有20mM柠檬酸盐、270mM蔗糖和0.05％的PS20的制剂中，在40℃下缓冲剂pH对片段形成的影响(如通过SE-HPLC所确定)。对于所测试的所有pH，LMW的百分比在T0时是约0。(参见实施例4。)
图6示出在40℃下缓冲剂pH对酸性变体的影响(如通过成像毛细管等电聚焦(iCE)所确定)。(参见实施例4。)
图7示出在40℃下缓冲剂类型对聚集体形成的影响(如通过SE-HPLC所确定)。(参见实施例5。)
图8示出在40℃下缓冲剂类型对片段形成的影响(如通过SE-HPLC所确定)。(参见实施例5。)
图9示出在40℃下缓冲剂类型对酸性变体形成的影响(如通过iCE所确定)。(参见实施例5。)
图10示出在40℃下缓冲剂类型对碱性变体形成的影响(如通过iCE所确定)。(参见实施例5。)
图11示出在40℃下赋形剂对聚集体形成的影响(如通过SE-HPLC所确定)。(参见实施例6。)
图12示出在40℃下赋形剂对片段形成的影响(如通过SE-HPLC所确定)。(参见实施例6。)
图13示出在40℃下赋形剂对酸性变体的影响(如通过iCE所确定)。(参见实施例6。)
图14示出在40℃下赋形剂对碱性变体的影响(如通过iCE所确定)。(参见实施例6。)
图15示出在所选择的制剂中，20502(无岩藻糖基化)的差示扫描量热法(DSC)曲线。(参见实施例6。)
5.
具体实施方式
本文提供了药物组合物，所述药物组合物包含特异性地结合至人B7-H4的抗体或其抗原结合片段。所述药物组合物可例如在长期储存条件下，在重复的冻融循环(例如，至少5个循环)和/或搅拌后稳定。
如本文所提供的，包含B7-H4抗体或其抗原结合片段的药物组合物可具有约4.5至约6的pH、B7-H4抗体或其抗原结合片段(例如，浓度为约5至约25mg/ml)、缓冲剂(包括但不限于乙酸盐或柠檬酸盐)、赋形剂(包括但不限于蔗糖、海藻糖和山梨糖醇)和/或表面活性剂(包括但不限于聚山梨醇酯，例如，聚山梨醇酯20(PS20))。
在一个特定实施方案中，本文提供了一种pH为5.0的液体水性药物组合物，所述药物组合物含有在20mM乙酸盐、270mM蔗糖和0.05％PS20中的20mg/mL的抗B7-H4抗体(例如，无岩藻糖基化抗体20502)。在另一个特定实施方案中，本文提供了一种pH为5.5的液体水性药物组合物，所述药物组合物含有在20mM柠檬酸盐、270mM蔗糖和0.05％PS20中的20mg/mL的抗B7-H4抗体(例如，无岩藻糖基化抗体20502)。
本文提供的药物组合物可用于治疗诸如癌症的疾患。
5.1术语
如本文所用，术语“B7-H4”是指哺乳动物B7-H4多肽，包括但不限于天然B7-H4多肽和B7-H4多肽的同工型。“B7-H4”涵盖全长、未加工的B7-H4多肽以及由细胞内的加工产生的B7-H4多肽的形式。“B7-H4多核苷酸”、“B7-H4核苷酸”或“B7-H4核酸”是指编码B7-H4的多核苷酸。
术语“抗体”意指通过位于免疫球蛋白分子的可变区内的至少一个抗原识别位点识别并特异性地结合至靶标(诸如蛋白、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或它们的组合)的免疫球蛋白分子。如本文所用，术语“抗体”涵盖完整的多克隆抗体、完整的单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的融合蛋白以及任何其他经修饰的免疫球蛋白分子，只要所述抗体表现出所需的生物活性即可。抗体可具有以下五种主要类别的免疫球蛋白中的任一种：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM或其亚类(同种型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1以及IgA2)，基于它们的重链恒定结构的特性分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同种类的免疫球蛋白具有不同且众所周知的亚基结构和三维构型。抗体可以是裸的或与其他分子(诸如毒素、放射性同位素等)缀合。
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分。“抗原结合片段”、“抗原结合结构域”或“抗原结合区”是指完整抗体的与抗原结合的一部分。抗原结合片段可含有完整抗体的抗原识别位点(例如，足以特异性地结合抗原的互补决定区(CDR))。抗体的抗原结合片段的实例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段、线性抗体和单链抗体。抗体的抗原结合片段可源自任何动物物种，如啮齿动物(例如，小鼠、大鼠或仓鼠)和人，或者可人工产生。
术语“抗B7-H4抗体”、“B7-H4抗体”和“结合至B7-H4的抗体”是指能够以足够的亲和力特异性地结合B7-H4，以使得抗体在靶向B7-H4中可用作诊断剂和/或治疗剂的抗体。如本文所用，术语“特异性地结合”、“免疫特异性地结合”、“免疫特异性地识别”和“特异性地识别”在抗体或其抗原结合片段的背景下是类似术语。这些术语表明，抗体或其抗原结合片段经由其抗原结合结构域结合至表位，并且结合需要在抗原结合结构域与表位之间具有一定的互补性。因此，“特异性地结合”至人B7-H4(SEQ ID NO:1)的抗体也可结合至来自其他物种的B7-H4(例如，食蟹猴、小鼠和/或大鼠B7-H4)和/或由其他人等位基因产生的B7-H4蛋白，但与不相关的非B7-H4蛋白(例如，其他B7蛋白家族成员，如PD-L1)结合的程度小于所述抗体与B7-H4的结合的约10％，如例如通过放射免疫测定(RIA)所测量。在一个具体实施方案中，用于本文提供的制剂中的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至人、食蟹猴、小鼠和大鼠B7-H4。
“单克隆”抗体或其抗原结合片段是指参与单个抗原决定簇或表位的高度特异性识别和结合的同质性抗体或抗原结合片段群体。这与通常包括针对不同抗原决定簇的不同抗体的多克隆抗体形成对照。术语“单克隆抗体”或其抗原结合片段涵盖完整和全长单克隆抗体以及抗体片段(诸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)突变体、包含抗体部分的融合蛋白和包含抗原识别位点的任何其他经修饰的免疫球蛋白分子。此外，“单克隆”抗体或其抗原结合片段是指以任何数量的方式制备的此类抗体及其抗原结合片段，所述方式包括但不限于杂交瘤、噬菌体选择、重组表达和转基因动物。
如本文所用，术语“可变区”或“可变结构域”可互换使用并且在本领域中是常见的。可变区通常是指抗体的一部分，一般而言是轻链或重链的一部分，通常是成熟重链中的约氨基末端110至120个氨基酸或110至125个氨基酸和成熟轻链中的约90至115个氨基酸，其在抗体之间的序列方面不同并且用于特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。序列的变异性集中在称为互补决定区(CDR)的那些区域中，而可变结构域中保守性更高的区域被称为框架区(FR)。不希望受任何特定机制或理论的束缚，据信轻链和重链的CDR主要负责抗体与抗原的相互作用和特异性。在某些实施方案中，可变区是人可变区。在某些实施方案中，可变区包含啮齿动物或鼠类CDR和人框架区(FR)。在特定实施方案中，可变区是灵长类动物(例如，非人灵长类动物)可变区。在某些实施方案中，可变区包含啮齿动物或鼠类CDR和灵长类动物(例如，非人灵长类动物)框架区(FR)。
术语“VL”和“VL结构域”可互换使用来指抗体的轻链可变区。
术语“VH”和“VH结构域”可互换使用来指抗体的重链可变区。
术语“Kabat编号”和类似术语在本领域中是公认的，并且是指对抗体或其抗原结合片段的重链和轻链可变区中的氨基酸残基进行编号的系统。在某些方面，可根据Kabat编号系统来确定CDR(参见例如，Kabat EA和Wu TT(1971)Ann NY Acad Sci 190:382-391以及Kabat EA等人,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,美国卫生和公共服务部,NIH出版号91-3242)。使用Kabat编号系统，抗体重链分子内的CDR通常存在于氨基酸位置31至35(其任选地可在35之后包含一个或两个另外氨基酸(在Kabat编号方案中称为35A和35B))(CDR1)、氨基酸位置50至65(CDR2)和氨基酸位置95至102(CDR3)。使用Kabat编号系统，抗体轻链分子内的CDR通常存在于氨基酸位置24至34(CDR1)、氨基酸位置50至56(CDR2)和氨基酸位置89至97(CDR3)。在一个具体实施方案中，已经根据Kabat编号方案确定了本文所述的抗体的CDR。
相反，Chothia是指结构环的位置(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。当使用Kabat编号惯例编号时，Chothia CDR-H1环的末端根据环的长度而在H32与H34之间变化(这是由于Kabat编号方案将***放置于H35A和H35B处；如果35A或35B不存在，则环结束于32处；如果仅35A存在，则环结束于33处；如果35A和35B均存在，则环结束于34处)。AbM高变区代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷，并且通过Oxford Molecular的AbM抗体建模软件来使用。
如本文所用，术语“恒定区”和“恒定结构域”是可互换的，并且在本领域中具有它们的共同含义。恒定区是不直接参与抗体与抗原的结合、但可表现出多种效应子功能，如与Fc受体的相互作用的抗体部分，例如轻链和/或重链的羧基末端部分。相对于免疫球蛋白可变结构域，免疫球蛋白分子的恒定区通常具有更保守的氨基酸序列。在某些方面，抗体或抗原结合片段包含足以用于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的恒定区或其部分。
如本文所用，基于恒定结构域的氨基酸序列，术语“重链”在关于抗体使用时可指任何不同的类型，例如，α(α)、δ(δ)、ε(ε)、γ(γ)和μ(μ)，分别产生IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类别的抗体，包括IgG的亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。重链氨基酸序列是本领域众所周知的。在具体实施方案中，重链是人重链。
如本文所用，基于恒定结构域的氨基酸序列，术语“轻链”在关于抗体使用时可指任何不同的类型，例如κ(κ)或λ(λ)。轻链氨基酸序列是本领域众所周知的。在具体实施方案中，轻链是人轻链。
术语“嵌合”抗体或其抗原结合片段是指其中氨基酸序列源自两种或更多种物种的抗体或其抗原结合片段。通常，轻链和重链的可变区对应于源自一种哺乳动物物种(例如小鼠、大鼠、兔等)的抗体或其抗原结合片段的具有所需特异性、亲和力和能力可变区，而恒定区与源自另一物种(通常为人)的抗体或其抗原结合片段中的序列同源，以避免在所述物种中引发免疫应答。
术语“人源化抗体”或其抗原结合片段是指作为含有最少非人(例如，鼠类)序列的特异性免疫球蛋白链、嵌合免疫球蛋白或其片段的非人(例如，鼠类)抗体或其抗原结合片段形式。通常，人源化抗体或其抗原结合片段是其中来自互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(例如，小鼠、大鼠、兔、仓鼠)的CDR的具有所需特异性、亲和力和能力的残基置换的人免疫球蛋白(“CDR移植”)(Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science 239:1534-1536(1988))。在一些情况下，人免疫球蛋白的某些Fv框架区(FR)残基被来自非人物种的抗体或片段中的具有所需特异性、亲和力和能力的对应残基置换。人源化抗体或其抗原结合片段可通过取代Fv框架区中和/或非人CDR残基内的另外残基来进一步修饰，以改善和优化抗体或其抗原结合片段的特异性、亲和力和/或能力。一般来说，人源化抗体或其抗原结合片段将包含可变结构域，所述可变结构域含有所有或基本上所有对应于非人免疫球蛋白的CDR区，而所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体或其抗原结合片段还可包含免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的至少一部分。用于产生人源化抗体的方法的实例描述于美国专利5,225,539；Roguska等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,91(3):969-973(1994)；和Roguska等人,Protein Eng.9(10):895-904(1996)中。在一些实施方案中，“人源化抗体”是表面重构的抗体。
术语“人”抗体或其抗原结合片段是指具有源自人免疫球蛋白基因座的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段，其中使用本领域中已知的任何技术来制备这种抗体或其抗原结合片段。人抗体或其抗原结合片段的此定义包括完整或全长抗体及其片段。
“无岩藻糖基化”抗体或其抗原结合片段或“缺乏岩藻糖”的抗体或其抗原结合片段是指在其恒定区糖基化中缺乏岩藻糖的IgG1或IgG3同种型抗体或其抗原结合片段。人IgG1或IgG3的糖基化发生在Asn297处，因为核心岩藻糖基化的双触角复合物寡糖糖基化终止于至多2个Gal残基。在一些实施方案中，无岩藻糖基化抗体在Asn297处缺乏岩藻糖。取决于末端Gal残基的量，将这些结构命名为G0、Gl(a 1,6或a 1,3)或G2聚糖残基。参见例如，Raju,T.S.,BioProcess Int.1:44-53(2003)。抗体Fc的CHO型糖基化描述于例如Routier,F.FL,Glycoconjugate J.14:201-207(1997)中。
测量岩藻糖的方法包括本领域中已知的任何方法。出于本文的目的，通过WO2015/017600的实施例1中描述的方法来检测岩藻糖，所述专利以引用的方式整体并入本文。简言之，通过从抗体中释放聚糖(例如，通过酶促释放)、用邻氨基苯甲酸(2-AA)标记所述聚糖、然后纯化所述标记的聚糖来进行聚糖分析。使用具有荧光检测的正相HPLC来分离聚糖，并测量抗体中每种聚糖的相对含量。可通过质谱法将聚糖明确地鉴定为缺乏或包括岩藻糖。在一些实施方案中，岩藻糖在包含多种无岩藻糖基化抗体或其抗原结合片段的组合物中不可检测到。在一些实施方案中，无岩藻糖基化抗体或其抗原结合片段具有增强的ADCC活性，其可通过本文实施例12中提供的测定来测量。在一些实施方案中，无岩藻糖基化抗体或其抗原结合片段对FcγRIIIA具有增强的亲和力。在一些实施方案中，无岩藻糖基化抗体或其抗原结合片段对FcγRIIIA(V158)具有增强的亲和力。在一些实施方案中，无岩藻糖基化抗体或其抗原结合片段对FcγRIIIA(F158)具有增强的亲和力。FcγRIIIA或其等位基因的亲和力可通过本文实施例10中提供的测定来测量。
“结合亲和力”通常是指分子(例如，抗体或其抗原结合片段)的单一结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文中所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映结合对的成员(例如，抗体或其抗原结合片段与抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可由解离常数(KD)表示。亲和力可以本领域中已知的多种方式来测量和/或表示，包括但不限于平衡解离常数(KD)和平衡缔合常数(KA)。KD是根据koff/kon的商计算的，而KA是根据kon/koff的商计算的。kon是指例如抗体或其抗原结合片段与抗原的缔合速率常数，并且koff是指例如抗体或其抗原结合片段与抗原的解离。kon和koff可通过本领域普通技术人员已知的技术，如或KinExA来确定。
如本文所用，“表位”是本领域中的术语，并且是指抗体或其抗原结合片段可与其特异性地结合的抗原的局部区域。表位可以是例如多肽的连续氨基酸(线性或连续表位)，或者表位可例如来自一种或多种多肽的两个或更多个非连续区域(构象性、非线性、不连续或非连续的表位)。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段所特异性地结合的表位可通过例如NMR光谱法、X射线衍射晶体学研究、ELISA测定、结合质谱法的氢/氘交换(例如，液相色谱电喷雾质谱法)、基于阵列的寡肽扫描测定和/或诱变作图(例如，定点诱变作图)来确定。对于X射线晶体学，可使用本领域中任何已知的方法来完成结晶(例如，GiegéR等人,(1994)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4):339-350；McPherson A(1990)Eur J Biochem 189:1-23；Chayen NE(1997)Structure 5:1269-1274；McPherson A(1976)J Biol Chem 251:6300-6303)。抗体/其抗原结合片段:抗原晶体可使用众所周知的X射线衍射技术进行研究，并且可使用计算机软件如X-PLOR(Yale University,1992,由Molecular Simulations,Inc.分售；参见例如，Meth Enzymol(1985)第114和115卷,Wyckoff HW等人编辑；U.S.2004/0014194)和BUSTER(Bricogne G(1993)Acta CrystallogrD Biol Crystallogr 49(Pt 1):37-60；Bricogne G(1997)Meth Enzymol 276A:361-423,Carter CW编辑；Roversi P等人,(2000)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt10):1316-1323)进行改善。诱变作图研究可使用本领域技术人员已知的任何方法来完成。关于诱变技术的描述，包括丙氨酸扫描诱变技术，参见例如Champe M等人,(1995)J BiolChem 270:1388-1394和Cunningham BC&Wells JA(1989)Science 244:1081-1085。
“经分离”的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物为处于自然界中不存在的形式中的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括已经被纯化至不再呈它们在自然界被发现的形式的程度的那些。在一些实施方案中，经分离的抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是基本上纯的。如本文所用，“基本上纯的”是指至少50％纯的(即，不含污染物)、至少90％纯的、至少95％纯的、至少98％纯的或至少99％纯的材料。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用来指任何长度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是线性或支化的，它可包含经修饰的氨基酸，并且它可被非氨基酸间断。所述术语还涵盖已经天然地或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰，诸如与标记组分缀合。还包括在定义内的是例如，含有氨基酸(包括例如，非天然氨基酸等)的一种或多种类似物以及本领域中已知的其他修饰的多肽。应了解，因为本发明的多肽是基于抗体，所以在某些实施方案中，所述多肽可作为单链或缔合的链而存在。
如本文所用，术语“宿主细胞”可以是任何类型的细胞，例如原代细胞、培养中的细胞或来自细胞系的细胞。在具体实施方案中，术语“宿主细胞”是指用核酸分子转染的细胞和这种细胞的子代或潜在子代。这种细胞的子代可与用核酸分子转染的亲本细胞不相同，例如这归因于可发生在传代或核酸分子整合至宿主细胞基因组中的过程中的突变或环境影响。
术语“药物制剂”或“药物组合物”是指以下制剂：其呈允许活性成分的生物活性有效的形式，且不含对将向其施用所述制剂的受试者有不可接受的毒性的额外组分。所述制剂可以是无菌的。
术语“药物产品”是指最终剂型，例如，包含药物物质的液体制剂，通常但非必须地与一种或多种其他成分缔合。
术语“药物物质”是指旨在在疾病的诊断、治愈、缓解、治疗或预防中提供药理或生物学活性或其他直接作用的活性成分，例如B7-H4抗体或其抗原结合片段(例如，无岩藻糖基化抗体20502)，但不包括用于合成这种成分的中间体。
如本文所用，“缓冲剂”是指溶液中允许溶液抵抗pH b变化的组分。缓冲剂包括例如乙酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐和组氨酸。
“稳定的”制剂是其中的活性成分(例如，B7-H4抗体或其抗原结合片段)在储存时基本上保留其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性的制剂。可在选定的条件(例如温度)下在选定的时间段内测量稳定性。本文提供的制剂可在室温(约25℃)下稳定至少6个月和/或在约2℃-8℃下稳定至少1年。本文提供的制剂在冷冻(至例如-70℃)和解冻(此后称为“冻/融循环”)之后也可以是稳定的。本文提供的制剂在搅拌后也可以是稳定的。
如本文所用，术语“施用(administer)”、“施用(administering)”、“施用(administration)”等是指可用于实现将药物，例如抗B7-H4抗体或其抗原结合片段递送至所需的生物作用部位的方法(例如，静脉内施用)。可与本文所述的剂和方法一起使用的施用技术在例如Goodman和Gilman,The Pharmacological Basis of Therapeutics,现行版,Pergamon；和Remington’s,Pharmaceutical Sciences,现行版,Mack Publishing Co.,Easton,Pa中找到。
如本文所用，术语“受试者”和“患者”可互换使用。受试者可以是动物。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，如非人动物(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠、小鼠、猴或其他灵长类动物等)。在一些实施方案中，受试者是食蟹猴。在一些实施方案中，受试者是人。
术语“治疗有效量”是指可有效治疗受试者的疾病或病症的药物，例如抗B7-H4抗体或其抗原结合片段的量。在癌症的情况下，药物的治疗有效量可减少癌细胞的数量；减小肿瘤尺寸或负担；在一定程度上抑制癌细胞浸润至周围器官中；在一定程度上抑制肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状；和/或产生有利的应答，如无进展存活(PFS)、无疾病存活(DFS)、总体存活(OS)、完全应答(CR)、部分应答(PR)增加，或者在一些情况下，稳定疾病(SD)、进行性疾病(PD)减少、进展时间(TTP)减少或它们的任何组合。在所述药物可防止生长和/或杀死现有的癌细胞的程度上，它可为细胞抑制的和/或细胞毒性的。
诸如“治疗”、“治疗”、“治疗”、“减轻”和“减轻”的术语是指能够治愈、减缓、减轻病理性疾患或病症的症状和/或阻止其进展的治疗措施。因此，需要治疗的那些包括已经诊断患有或疑似患有所述病症的那些。在某些实施方案中，如果患者显示出一种或多种以下情况，则受试者的癌症被成功地根据本发明的方法“治疗”：癌细胞的数量减少或完全不存在；肿瘤尺寸减小；抑制或未出现癌细胞浸润至周围器官中，包括例如癌症扩散到软组织和骨中；抑制或未出现肿瘤转移；抑制或未出现肿瘤生长；与特定癌症相关的一种或多种症状减轻；发病率和死亡率降低；生活品质改善；致瘤性、致瘤性频率或肿瘤的致瘤能力降低；肿瘤中癌症干细胞的数量或频率降低；致瘤性细胞分化成非致瘤性状态；无进展存活(PFS)、无疾病存活(DFS)、总体存活(OS)、完全应答(CR)、部分应答(PR)增加，稳定疾病(SD)，进行性疾病(PD)减少，进展时间(TTP)减少或它们的任何组合。
术语“癌症”和“癌性的”是指或描述哺乳动物中的生理疾患，其中细胞群体以不受调控的细胞生长为特征。癌症的实例包括但不限于妇科癌症(例如，乳腺癌(包括三阴性乳腺癌、导管癌、卵巢癌和子宫内膜癌)、非小细胞肺癌、胰腺癌、甲状腺癌、肾癌(例如，肾细胞癌)和膀胱癌(例如，尿路上皮细胞癌)。癌症可以是“表达B7-H4的癌症(cancer thatexpresses B7-H4)”或“表达B7-H4的癌症(B7-H4 expressing cancer)”。此类术语是指包含表达B7-H4的细胞的癌症。癌症可以是原发性肿瘤，或者可以是晚期或转移性癌症。
“难治性”癌症是即使向癌症患者施用了抗肿瘤治疗(如化学疗法)，仍会进展的癌症。
“复发性”癌症是对初始疗法产生应答后在初始部位或远处再生长的癌症。
“复发性”患者是指缓解后具有癌症征兆或症状的患者。任选地，患者在辅助或新辅助疗法后复发。
如本公开和权利要求书中所使用，除非上下文另外明确指明，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括复数形式。
应当理解，当在本文用语言“包含”来描述实施方案时，还提供了就“由……组成”和/或“主要由……组成”而言所描述的其他类似实施方案。在本公开中，“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“含有(containing)”和“具有(having)”等可具有美国专利法赋予它们的含义，并且可意指“包括(includes)”、“包括(including)”等；“基本上由……组成(consisting essentially of”)”或“基本上由……组成(consistsessentially)”同样具有美国专利法赋予的含义，并且所述术语是开放式的，从而允许超出所叙述的存在，只要所叙述的基本或新颖特征不被超过叙述的存在改变，但是排除现有技术实施方案。
除非明确固定或从上下文显而易见，否则如本文所使用的，术语“或”被理解为包括在内。如在本文中在诸如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”意图包括“A和B”两者、“A或B”、“A”以及“B”。同样，如在诸如“A、B和/或C”的短语中所使用的术语“和/或”意图涵盖以下实施方案中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。
如本文所用，术语“约”和“大约”在用于修饰数值或数字范围时表示所述值或范围之上5％至10％和之下5％至10％的偏差仍在所叙述值或范围的预期含义范围内。
本文提供的任何组合物或方法可与本文提供的任何其他组合物和方法中的一者或多者组合。
5.2包含B7-H4抗体的药物组合物
本文提供了包含抗B7-H4抗体或其抗原结合片段(例如，如以下章节5.3中所论述)的药物组合物(例如，水性药物组合物)。
在某些实施方案中，本文提供的药物组合物对多个冻融循环而言是稳定的。冻融循环可包括冷冻药物组合物(例如，在约-70℃的温度下)，然后使药物组合物(例如，在室温下)解冻。所述药物组合物可在至少五个冻融循环后稳定。冻融循环(例如，至少五个冻融循环)可导致外观、可溶性聚集体或亚可见微粒物质没有变化。
在某些实施方案中，本文提供的药物组合物在搅拌后稳定。搅拌可包括在室温下(例如在轨道振荡器上以每分钟约300转)振荡。搅拌可导致外观、可溶性聚集体、电荷变体分布或亚可见的微粒物质没有变化。
在某些实施方案中，本文提供的药物组合物在长期储存条件下是稳定的。长期储存条件可包括在约5℃(例如约2℃至约8℃)下储存约6个月或约1年。长期储存条件可包括在约25℃下储存约6个月或约1年。长期储存条件可包括在约40℃下储存约3个月、约6个月或约1年。
在某些实施方案中，本文提供的药物组合物对于多个(例如，至少五个)冻融循环而言是稳定的，在搅拌后稳定，和/或在长期储存条件下稳定。
在某些实施方案中，本文提供的药物组合物当在约-70℃下储存并且在约2℃至约8℃下储存约1年时是稳定的。
在某些实施方案中，所述药物组合物可含有B7-H4抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，所述制剂中B7-H4抗体或其抗原结合片段(包括其酸性和碱性变体)的浓度是约5mg/ml至约30mg/ml。在某些实施方案中，所述药物组合物中B7-H4抗体或其抗原结合片段(包括其酸性和碱性变体)的浓度是约10mg/ml至约25mg/ml。在某些实施方案中，所述药物组合物中B7-H4抗体或其抗原结合片段(包括其酸性和碱性变体)的浓度是约20mg/ml。
在某些实施方案中，所述制剂中B7-H4抗体或其抗原结合片段(包括其酸性和碱性变体)的浓度是5mg/ml至30mg/ml。在某些实施方案中，所述药物组合物中B7-H4抗体或其抗原结合片段(包括其酸性和碱性变体)的浓度是10mg/ml至25mg/ml。在某些实施方案中，所述药物组合物中B7-H4抗体或其抗原结合片段(包括其酸性和碱性变体)的浓度是20mg/ml。
如本文所提供，药物组合物可含有缓冲剂。在某些实施方案中，缓冲剂是乙酸盐。在某些实施方案中，缓冲剂是柠檬酸盐。在某些实施方案中，缓冲剂(例如，乙酸盐或柠檬酸盐)的浓度是约15mM至约25mM。在某些实施方案中，缓冲剂(例如，乙酸盐或柠檬酸盐)的浓度是约18mM至约22mM。在某些实施方案中，缓冲剂(例如，乙酸盐或柠檬酸盐)的浓度是约20mM。
在某些实施方案中，缓冲剂(例如，乙酸盐或柠檬酸盐)的浓度是15mM至25mM。在某些实施方案中，缓冲剂(例如，乙酸盐或柠檬酸盐)的浓度是18mM至22mM。在某些实施方案中，缓冲剂(例如乙酸盐或柠檬酸盐)的浓度是20mM。
如本文所提供，药物组合物可含有赋形剂，例如糖，诸如蔗糖、山梨糖醇或海藻糖。在一些实施方案中，赋形剂(例如，蔗糖)的浓度是约225mM至约300mM。在一些实施方案中，赋形剂(例如，蔗糖)的浓度是约250mM至约290mM。在一些实施方案中，赋形剂(例如，蔗糖)的浓度是约270。
在一些实施方案中，赋形剂(例如，蔗糖)的浓度是225mM至mM。在一些实施方案中，赋形剂(例如，蔗糖)的浓度是250mM至290mM。在一些实施方案中，赋形剂(例如，蔗糖)的浓度是270。
如本文所提供，药物组合物可含有缓冲剂(例如乙酸盐或柠檬酸盐)和赋形剂如糖(例如，蔗糖)。在一些实施方案中，赋形剂如糖(例如，蔗糖)的浓度是缓冲剂(例如，乙酸盐或柠檬酸盐)的浓度的约10至约15倍。在一些实施方案中，赋形剂如糖(例如，蔗糖)的浓度是缓冲剂(例如，乙酸盐或柠檬酸盐)的浓度的约13.5倍。
在一些实施方案中，赋形剂如糖(例如，蔗糖)的浓度是缓冲剂(例如，乙酸盐或柠檬酸盐)的浓度的10至15倍。在一些实施方案中，赋形剂如糖(例如，蔗糖)的浓度是缓冲剂(例如，乙酸盐或柠檬酸盐)的浓度的13.5倍。
如本文所提供，药物组合物可含有表面活性剂，例如聚山梨醇酯。聚山梨醇酯可以是例如，聚山梨醇酯20(PS20)。在一些实施方案中，表面活性剂(例如，PS20)的浓度是约0.025％-0.075％重量/体积(w/v)。在一些实施方案中，表面活性剂(例如,PS20)的浓度是约0.035％至约0.065％w/v。在一些实施方案中，表面活性剂(例如，PS20)的浓度是约0.05％w/v。
在一些实施方案中，表面活性剂(例如，PS20)的浓度是0.025％-0.075％重量/体积(w/v)。在一些实施方案中，表面活性剂(例如,PS20)的浓度是0.035％至0.065％w/v。在一些实施方案中，表面活性剂(例如，PS20)的浓度是0.05％w/v。
如本文所提供，在一些实施方案中，药物组合物具有约4.5至约6的pH。在一些实施方案中，药物组合物的pH是约5至约6。在一些实施方案中，药物组合物的pH是约5。在一些实施方案中，药物组合物的pH是约5.5。在一些实施方案中，药物组合物的pH是约6。
在一些实施方案中，药物组合物具有4.5至6的pH。在一些实施方案中，药物组合物的pH是5至6。在一些实施方案中，药物组合物的pH是5。在一些实施方案中，药物组合物的pH是5.5。在一些实施方案中，药物组合物的pH是6。
如本文所提供，药物组合物可以是液体。药物组合物(例如，液体药物组合物)可用于胃肠外施用，例如用于静脉内施用。
在一个实施方案中，药物组合物包含在约15mM至约25mM乙酸盐、约225mM至约300mM蔗糖和约0.025％至约0.075％PS20中的约5mg/mL至约30mg/mL的B7-H4抗体或其片段(例如，无岩藻糖基化抗体20502)。在一个实施方案中，药物组合物具有约4.5至约6，例如约5的pH。在一个实施方案中，药物组合物是液体。
在一个实施方案中，药物组合物包含在15mM至25mM乙酸盐、225mM至300mM蔗糖和0.025％至0.075％PS20中的5mg/mL至30mg/mL的B7-H4抗体或其片段(例如，无岩藻糖基化抗体20502)。在一个实施方案中，药物组合物具有4.5至6，例如5的pH。在一个实施方案中，药物组合物是液体。
在一个实施方案中，药物组合物包含在约18mM至约22mM乙酸盐、约250mM至约290mM蔗糖和约0.035％至约0.065％PS20中的约10mg/mL至约25mg/mL的B7-H4抗体或其片段(例如，无岩藻糖基化抗体20502)。在一个实施方案中，药物组合物具有约4.5至约6，例如约5的pH。在一个实施方案中，药物组合物是液体。
在一个实施方案中，药物组合物包含在18mM至22mM乙酸盐、250mM至290mM蔗糖和0.035％至0.065％PS20中的10mg/mL至25mg/mL的B7-H4抗体或其片段(例如，无岩藻糖基化抗体20502)。在一个实施方案中，药物组合物具有4.5至6，例如5的pH。在一个实施方案中，药物组合物是液体。
在一个实施方案中，药物组合物包含在20mM乙酸盐、270mM蔗糖和0.05％PS20中的20mg/mL的B7-H4抗体或其片段(例如，无岩藻糖基化抗体20502)。在一个实施方案中，药物组合物具有5.0的pH。在一个实施方案中，药物组合物是液体。
在一个实施方案中，药物组合物包含在约15mM至约25mM柠檬酸盐、约225mM至约300mM蔗糖和约0.025％至约0.075％PS20中的约5mg/mL至约30mg/mL的B7-H4抗体或其片段(例如，无岩藻糖基化抗体20502)。在一个实施方案中，药物组合物具有约4.5至约6，例如约5.5的pH。在一个实施方案中，药物组合物是液体。
在一个实施方案中，药物组合物包含在15mM至25mM柠檬酸盐、225mM至300mM蔗糖和0.025％至0.075％PS20中的5mg/mL至30mg/mL的B7-H4抗体或其片段(例如，无岩藻糖基化抗体20502)。在一个实施方案中，药物组合物具有4.5至6，例如5.5的pH。在一个实施方案中，药物组合物是液体。
在一个实施方案中，药物组合物包含在约18mM至约22mM柠檬酸盐、约250mM至约290mM蔗糖和约0.035％至约0.065％PS20中的约10mg/mL至约25mg/mL的B7-H4抗体或其片段(例如，无岩藻糖基化抗体20502)。在一个实施方案中，药物组合物具有约4.5至约6，例如约5.5的pH。在一个实施方案中，药物组合物是液体。
在一个实施方案中，药物组合物包含在18mM至22mM柠檬酸盐、250mM至290mM蔗糖和0.035％至0.065％PS20中的10mg/mL至25mg/mL的B7-H4抗体或其片段(例如，无岩藻糖基化抗体20502)。在一个实施方案中，药物组合物具有4.5至6，例如5.5的pH。在一个实施方案中，药物组合物是液体。
在一个实施方案中，液体药物组合物包含在20mM柠檬酸盐、270mM蔗糖和0.05％PS20中的20mg/mL的抗体或其片段(例如，无岩藻糖基化抗体20502)。在一个实施方案中，液体药物组合物具有5.5的pH。
在一些实施方案中，药物组合物包含特异性地结合至人B7-H4的抗体或其抗原结合片段(例如，无岩藻糖基化抗体20502)，其中在5℃下6个月后，所述组合物包含不超过40％的所述抗体或其抗原结合片段的酸性变体和/或不超过20％的所述抗体或其抗原结合片段的碱性变体。
在一些实施方案中，药物组合物包含特异性地结合至人B7-H4的抗体或其抗原结合片段(例如，无岩藻糖基化抗体20502)，其中在5℃下6个月后，所述组合物包含约30％至约45％、约30％至约40％或约35％至约40％的所述抗体或其抗原结合片段的酸性变体和/或约11％至约16％、约10％至约17％或约9％至约18％的所述抗体或其抗原结合片段的碱性变体。在一些实施方案中，药物组合物包含特异性地结合至人B7-H4的抗体或其抗原结合片段(例如，无岩藻糖基化抗体20502)，其中在5℃下6个月后，所述组合物包含30％至45％、30％至40％或35％至40％的所述抗体或其抗原结合片段的酸性变体和/或11％至16％、10％至17％或9％至18％的所述抗体或其抗原结合片段的碱性变体。
在一些实施方案中，药物组合物包含特异性地结合至人B7-H4的抗体或其抗原结合片段，其中在5℃下6个月后，所述组合物包含不超过60％或55％的所述抗体或其抗原结合片段的酸性和碱性变体。在一些实施方案中，在5℃下6个月后，所述组合物还包含不超过40％的所述抗体或其抗原结合片段的酸性变体和/或不超过20％的碱性变体。
在一些实施方案中，提供了药物组合物，其中所述药物组合物包含无岩藻糖基化抗B7-H4抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。在具体实施方案中，提供了药物组合物，其中所述药物组合物包含无岩藻糖基化抗B7-H4抗体或抗原结合片段，例如，其中所述组合物中至少80％的所述抗体无岩藻糖基化。在具体实施方案中，提供了药物组合物，其中所述药物组合物包含无岩藻糖基化抗B7-H4抗体或抗原结合片段，例如，其中所述组合物中至少85％的所述抗体无岩藻糖基化。在具体实施方案中，提供了药物组合物，其中所述药物组合物包含无岩藻糖基化抗B7-H4抗体或抗原结合片段，例如，其中所述组合物中至少90％的所述抗体无岩藻糖基化。在具体实施方案中，提供了药物组合物，其中所述药物组合物包含无岩藻糖基化抗B7-H4抗体或抗原结合片段，例如，其中所述组合物中至少95％的所述抗体无岩藻糖基化。在具体实施方案中，提供了药物组合物，其中所述药物组合物包含无岩藻糖基化抗B7-H4抗体或抗原结合片段，例如，其中所述组合物中至少96％的所述抗体无岩藻糖基化。在具体实施方案中，提供了药物组合物，其中所述药物组合物包含无岩藻糖基化抗B7-H4抗体或抗原结合片段，例如，其中所述组合物中至少97％的所述抗体无岩藻糖基化。在具体实施方案中，提供了药物组合物，其中所述药物组合物包含无岩藻糖基化抗B7-H4抗体或抗原结合片段，例如，其中所述组合物中至少98％的所述抗体无岩藻糖基化。在具体实施方案中，提供了药物组合物，其中所述药物组合物包含无岩藻糖基化抗B7-H4抗体或抗原结合片段，例如，其中所述组合物中至少99％的所述抗体无岩藻糖基化。在具体实施方案中，提供了药物组合物，其中所述药物组合物包含无岩藻糖基化抗B7-H4抗体或抗原结合片段，其中岩藻糖在所述组合物中不可检测到。
在一些实施方案中，提供了药物组合物，其中所述药物组合物包含(i)特异性地结合至人B7-H4的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含(a)分别SEQ ID NO:5-10重链可变区(VH)互补决定区(CDR)1、VH CDR2、VH CDR3和轻链可变区(VL)CDR1、CDR2和CDR3序列，(b)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的可变重链区和包含SEQ IDNO:12的氨基酸序列的可变轻链区，或(c)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链；和(ii)药学上可接受的赋形剂。
本文还提供了药物组合物，其中所述药物组合物包含(i)抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合至人B7-H4并且包含分别SEQ ID NO:5-10的重链可变区(VH)互补决定区(CDR)1、VH CDR2、VH CDR3和轻链可变区(VL)CDR1、CDR2和CDR3序列，和(ii)药学上可接受的赋形剂，其中所述组合物中至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的所述抗体或其抗原结合片段无岩藻糖基化。在一个实施方案中，(i)所述抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的可变重链区和含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的可变轻链区，或(ii)所述抗体包含含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链。
5.3 B7-H4抗体
本文提供了药物组合物，所述药物组合物包含特异性地结合至B7-H4(例如，人B7-H4)的抗体(例如，单克隆抗体，如嵌合、人源化或人抗体)及其抗原结合片段。可用于本文提供的药物组合物中的示例性B7-H4抗体及其抗原结合片段是本领域中已知的。人、食蟹猴、鼠类和大鼠B7-H4的氨基酸序列是本领域中已知的，并且也在本文中提供，分别由SEQ IDNO:1-4表示。
人B7-H4：
MASLGQILFWSIISIIIILAGAIALIIGFGISGRHSITVTTVASAGNIGEDGILSCTFEPDIKLSDIVIQWLKEGVLGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGNASLRLKNVQLTDAGTYKCYIITSKGKGNANLEYKTGAFSMPEVNVDYNASSETLRCEAPRWFPQPTVVWASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVTESEIKRRSHLQLLNSKASLCVSSFFAISWALLPLSPYLMLK(SEQ ID NO:1)
食蟹猴B7-H4：
MASLGQILFWSIISIIFILAGAIALIIGFGISGRHSITVTTVASAGNIGEDGILSCTFEPDIKLSDIVIQWLKEGVIGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGNASLRLKNVQLTDAGTYKCYIITSKGKGNANLEYKTGAFSMPEVNVDYNASSETLRCEAPRWFPQPTVVWASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVTESEIKRRSHLQLLNSKASLCVSSFLAISWALLPLAPYLMLK(SEQ ID NO:2)
鼠类B7-H4
MASLGQIIFWSIINIIIILAGAIALIIGFGISGKHFITVTTFTSAGNIGEDGTLSCTFEPDIKLNGIVIQWLKEGIKGLVHEFKEGKDDLSQQHEMFRGRTAVFADQVVVGNASLRLKNVQLTDAGTYTCYIRTSKGKGNANLEYKTGAFSMPEINVDYNASSESLRCEAPRWFPQPTVAWASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVTDSEVKRRSQLQLLNSGPSPCVFSSAFVAGWALLSLSCCLMLR(SEQ ID NO:3)
大鼠B7-H4
MASLGQIIFWSIINVIIILAGAIVLIIGFGISGKHFITVTTFTSAGNIGEDGTLSCTFEPDIKLNGIVIQWLKEGIKGLVHEFKEGKDDLSQQHEMFRGRTAVFADQVVVGNASLRLKNVQLTDAGTYTCYIHTSKGKGNANLEYKTGAFSMPEINVDYNASSESLRCEAPRWFPQPTVAWASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVTDSEVKRRSQLELLNSGPSPCVSSVSAAGWALLSLSCCLMLR(SEQ ID NO:4)
在某些实施方案中，本文提供的药物组合物中的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至人B7-H4。在某些实施方案中，本文提供的药物组合物中的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至人和食蟹猴B7-H4。在某些实施方案中，本文提供的药物组合物中的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至人、鼠类和大鼠B7-H4。在某些实施方案中，本文提供的药物组合物中的抗体或其抗原结合片段结合至人、食蟹猴、鼠类和大鼠B7-H4。
B7-H4含有IgC胞外结构域(SEQ ID NO:1的氨基酸153-241)和IgV胞外结构域(SEQID NO:1的氨基酸35-146)。在某些实施方案中，本文提供的药物组合物中的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至人B7-H4的IgV结构域。因此，本文提供了包含药物组合物，所述药物组合物包含特异性地结合至由SEQ ID NO:1的氨基酸35-146组成的多肽的抗体及其抗原结合片段。
在某些实施方案中，本文提供的药物组合物中的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至人B7-H4，并且包含表1和表2中列出的20502抗体的六个CDR。
表1.VH CDR氨基酸序列1
1表1中的VH CDR是根据Kabat确定的。
表2.VL CDR氨基酸序列2
2表2中的VL CDR是根据Kabat确定的。
在某些实施方案中，本文提供的药物组合物中的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至人B7-H4，并且包含表3中列出的20502抗体的VH。
表3：可变重链(VH)氨基酸序列
在某些实施方案中，本文提供的药物组合物中的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至人B7-H4，并且包含表4中列出的20502的VL。
表4：可变轻链(VL)氨基酸序列
在某些实施方案中，本文提供的药物组合物中的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至人B7-H4，并且包含表3和表4中列出的20502抗体的VH和VL。
在某些实施方案中，本文提供的药物组合物中的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至人B7-H4，并且包含表5中列出的20502抗体的VH框架区。
表5.VH FR氨基酸序列3
3表5中描述的VH框架区是基于CDR的Kabat编号系统的边界确定的。因此，VH CDR由Kabat确定，并且框架区是可变区中围绕CDR的氨基酸残基，呈形式FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4
在某些实施方案中，本文提供的药物组合物中的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至人B7-H4，并且包含表6中列出的20502抗体的VL框架区。
表6.VL FR氨基酸序列4
4表6中描述的VL框架区是基于CDR的Kabat编号系统的边界确定的。因此，VL CDR由Kabat确定，并且框架区是可变区中围绕CDR的氨基酸残基，呈形式FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4
在某些实施方案中，本文提供的药物组合物中的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至人B7-H4，并且包含表5和表6中列出的20502抗体的四个VH框架区和四个VL框架区。
在某些实施方案中，本文提供的药物组合物中的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至人B7-H4，并且包含表7中列出的20502抗体的重链序列。
表7：全长重链氨基酸序列
在某些实施方案中，本文提供的药物组合物中的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至人B7-H4，并且包含表8中列出的20502抗体的轻链序列。
表8：全长轻链氨基酸序列
在某些实施方案中，本文提供的药物组合物中的抗体或抗原结合片段特异性地结合至人B7-H4，并且包含表7和表8中列出的20502抗体的重链序列和轻链序列。
在某些方面，本文提供的药物组合物中的抗体或其抗原结合片段通过其单独的VL结构域、或单独的VH结构域、或单独的3个VL CDR或单独的3个VH CDR进行描述。参见例如，Rader C等人,(1998)PNAS 95:8910-8915，所述文献以引用的方式整体并入本文，其描述通过以下方式来进行小鼠抗αvβ3抗体的人源化：鉴定分别来自人轻链或重链文库的互补轻链或重链，从而产生亲和力与原始抗体的亲和力一样高或高于原始抗体的亲和力的人源化抗体变体。也参见Clackson T等人,(1991)Nature 352:624-628，所述文献以引用的方式整体并入本文，描述了通过以下方式产生特异性地结合特异性抗原的抗体的方法：使用特异性VL结构域(或VH结构域)并筛选文库中的互补VH结构域(或VL结构域)。通过ELISA，所述筛选产生了针对特异性VH结构域的14个新的配偶体和针对特异性VL结构域的13个新的配偶体，所述配偶体是强结合剂，如通过ELISA所确定。还参见Kim SJ和Hong HJ,(2007)JMicrobiol 45:572-577，所述文献以引用的方式整体并入本文，描述了通过以下方式产生特异性地结合特异性抗原的抗体的方法：使用特异性VH结构域并筛选文库(例如，人VL文库)中的互补VL结构域；所选择的VL结构域进而可用于指导其他互补(例如人)VH结构域的选择。
在某些方面，可根据Chothia编号方案来确定抗体或其抗原结合片段的CDR，Chothia编号方案是指免疫球蛋白结构环的位置(参见例如,Chothia C和Lesk AM,(1987),J Mol Biol 196:901-917；Al-Lazikani B等人,(1997)J Mol Biol 273:927-948；ChothiaC等人,(1992)J Mol Biol 227:799-817；Tramontano A等人,(1990)J Mol Biol 215(1):175-82；以及美国专利号7,709,226)。通常，当使用Kabat编号惯例时，Chothia CDR-H1环存在于重链氨基酸26至32、33或34处，Chothia CDR-H2环存在于重链氨基酸52至56处，并且Chothia CDR-H3环存在于重链氨基酸95至102，而Chothia CDR-L1环存在于轻链氨基酸24至34处，Chothia CDR-L2环存在于轻链氨基酸50至56处，并且Chothia CDR-L3环存在于轻链氨基酸89至97处。当使用Kabat编号惯例编号时，Chothia CDR-H1环的末端根据环的长度而在H32与H34之间变化(这是由于Kabat编号方案将***放置于H35A和H35B处；如果35A或35B不存在，则环结束于32处；如果仅35A存在，则环结束于33处；如果35A和35B均存在，则环结束于34处)。
在某些方面，本文提供了药物组合物，所述药物组合物包含特异性地结合至B7-H4(例如，人B7-H4)并且包含表3和表4中列出的20502抗体的Chothia VH和VL CDR的抗体及其抗原结合片段。在某些实施方案中，本文提供了药物组合物，所述药物组合物包含特异性地结合至B7-H4(例如，人B7-H4)并且包含一个或多个CDR的抗体或其抗原结合片段，其中Chothia和Kabat CDR具有相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，本文提供了药物组合物，所述药物组合物包含特异性地结合至B7-H4(例如，人B7-H4)并且包含Kabat CDR和ChothiaCDR的组合的抗体及其抗原结合片段。
在某些方面，可根据如Lefranc M-P,(1999)The Immunologist 7:132-136和Lefranc M-P等人,(1999)Nucleic Acids Res 27:209-212中所述的IMGT编号系统来确定抗体或其抗原结合片段的CDR。根据IMGT编号方案，VH-CDR1位于位置26至35处，VH-CDR2位于位置51至57处，VH-CDR3位于位置93至102处，VL-CDR1位于位置27至32处，VL-CDR2位于位置50至52处，并且VL-CDR3位于位置89至97处。在一个特定实施方案中，本文提供了药物组合物，所述药物组合物包含特异性地结合至B7-H4(例如，人B7-H4)并且包含表3和表4中列出的20502抗体的IMGT VH和VL CDR的抗体及其抗原结合片段，例如Lefranc M-P(1999)同上和Lefranc M-P等人,(1999)同上中所描述)。
在某些方面，可根据MacCallum RM等人,(1996)J Mol Biol 262:732-745来确定抗体或其抗原结合片段的CDR。还参见例如，Martin A.“Protein Sequence and StructureAnalysis of Antibody Variable Domains,”于Antibody Engineering,Kontermann和Dübel,编辑,第31章,第422-439页,Springer-Verlag,Berlin(2001)中。在一个特定实施方案中，本文提供了药物组合物，所述药物组合物包含特异性地结合至B7-H4(例如，人B7-H4)并且包含如通过MacCallum RM等人的方法确定的表3和表4中列出的20502抗体的VH和VL CDR的抗体或其抗原结合片段。
在某些方面，可根据AbM编号方案来确定抗体或其抗原结合片段的CDR，AbM编号方案是指表示Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷的AbM高变区，并且由OxfordMolecular的AbM抗体建模软件(Oxford Molecular Group，Inc.)使用。在一个特定实施方案中，本文提供了药物组合物，所述药物组合物包含特异性地结合至B7-H4(例如，人B7-H4)并且包含如通过AbM编号方案确定的表3和表4中列出的20502抗体的VH和VL CDR的抗体或其抗原结合片段。
在特定方面，本文提供了包含抗体的药物组合物，所述抗体包含重链和轻链。
关于轻链，在一个具体实施方案中，本文描述的抗体的轻链是κ轻链。人κ轻链的恒定区可包含以下氨基酸序列：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:23)。
人κ轻链的恒定区可由以下核苷酸序列编码：
CGGACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT(SEQ ID NO:24)。
在一个特定实施方案中，本文所述的药物组合物中的免疫特异性地结合至B7-H4多肽(例如，人B7-H4)的抗体包含轻链，其中VL结构域的氨基酸序列包含表4中列出的序列，并且其中所述轻链的恒定区包含人κ轻链恒定区的氨基酸序列。
在一个特定实施方案中，本文所述的药物组合物中的免疫特异性地结合至B7-H4(例如，人B7-H4)的抗体包含重链，其中VH结构域的氨基酸序列包含表3中列出的氨基酸序列，并且其中所述重链的恒定区包含人γ(γ)重链恒定区的氨基酸序列。
人IgG1重链的恒定区可包含以下氨基酸序列：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:25)。
人IgG1重链的恒定区可由以下核苷酸序列编码：
GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA。(SEQ ID NO:26)
在一个具体实施方案中，本文所述的药物组合物中的免疫特异性地结合至B7-H4(例如，人B7-H4)的抗体包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域和VL结构域包含本文所述的任何VH和VL结构域的氨基酸序列，并且其中恒定区包含IgG(例如，人IgG)免疫球蛋白分子的恒定区的氨基酸序列。在另一个具体实施方案中，用于本文所述的药物组合物中的免疫特异性地结合至B7-H4(例如，人B7-H4)的抗体包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域和VL结构域包含本文所述的任何VH和VL结构域的氨基酸序列，并且其中恒定区包含IgG1(例如人IgG1)免疫球蛋白分子的恒定区的氨基酸序列。
据报告，岩藻糖含量降低的抗体对Fc受体，例如像FcγRIIIA的亲和力增加。因此，在某些实施方案中，本文所述的药物组合物中的抗体或其抗原结合片段具有降低的岩藻糖含量或缺乏岩藻糖(即“无岩藻糖基化”)。此类抗体或其抗原结合片段可使用本领域技术人员已知的技术来产生。例如，它们可在缺乏或缺少岩藻糖基化能力的细胞中表达。在一个具体实例中，具有α1，6-岩藻糖基转移酶基因(FUT8)的两个等位基因敲除的细胞系可用于产生岩藻糖含量降低的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，与具有相同氨基酸序列的岩藻糖基化B7-H4抗体或其抗原结合片段相比，无岩藻糖基化B7-H4抗体或其抗原结合片段在体外具有增强的ADCC活性。在一些实施方案中，与使用岩藻糖基化B7-H4抗体情况下的特异性溶解相比，无岩藻糖基化B7-H4抗体或其抗原结合片段引起高至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少65、至少70或至少75个百分点的特异性溶解。
在一些实施方案中，与具有相同氨基酸序列的岩藻糖基化B7-H4抗体或其抗原结合片段相比，B7-H4抗体或其抗原结合片段对FcγRIIIA具有增强的亲和力。在一些实施方案中，与岩藻糖基化B7-H4抗体或其抗原结合片段相比，无岩藻糖基化B7-H4抗体或其抗原结合片段以高至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少7倍、至少10倍、至少12倍、至少15倍、至少17倍或至少20倍的亲和力结合至FcγRIIIA。在一些实施方案中，使用表面等离振子共振来测定对FcγRIIIA的亲和力。在一些实施方案中，FcγRIIIA选自FcγRIIIA(V158)和FcγRIIIA(F158)。在一些实施方案中，FcγRIIIA是FcγRIIIA(V158)。
在一些实施方案中，可通过包括高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳或MALDI-TOF质谱法的方法来确定岩藻糖的存在。
在具体实施方案中，抗体或其抗原结合片段(i)包含20502的CDR序列、20502的VH和VL序列或20502的重链和轻链序列，并且(ii)无岩藻糖基化。
在具体实施方案中，组合物包含抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段(i)包含20502的CDR序列、20502的VH和VL序列或20502的重链和轻链序列，并且(ii)无岩藻糖基化，例如，其中所述组合物中至少95％的所述抗体无岩藻糖基化，或其中岩藻糖基化在所述组合物中不可检测到。
工程改造的糖型可适用于多种目的，包括但不限于增强或减小效应功能。用于产生本文所述的抗体或其抗原结合片段中的工程改造的糖型的方法包括但不限于例如以下中公开的那些：
在某些实施方案中，可将本文所述的任何恒定区突变或修饰引入具有两个重链恒定区的本文所述的抗体或其抗原结合片段的一个或两个重链恒定区中。
在另一个特定实施方案中，本文所述的免疫特异性地结合至B7-H4(例如，人B7-H4)的抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中(i)所述重链包含VH结构域，所述VH结构域包含表1中列出的20502抗体的VH CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列；(ii)所述轻链包含VL结构域，所述VL结构域包含表2中列出的20502抗体的VL CDR1、VH CDR2和VH CDR3氨基酸序列；(iii)所述重链还包含恒定重链结构域，所述恒定重链结构域包含人IgG1重链的恒定结构域的氨基酸序列；并且(iv)所述轻链还包含恒定轻链结构域，所述恒定轻链结构域包含人κ轻链的恒定结构域的氨基酸序列。
在另一个特定实施方案中，本文所述的免疫特异性地结合至B7-H4(例如，人B7-H4)的抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中(i)所述重链包含VH结构域，所述VH结构域包含表3中列出的20502抗体的VH结构域的氨基酸序列；(ii)所述轻链包含VL结构域，所述VL结构域包含表4中列出的20502抗体的VL结构域的氨基酸序列；(iii)并且所述重链还包含恒定重链结构域，所述恒定重链结构域包含人IgG1重链的恒定结构域的氨基酸序列；并且(iv)所述轻链还包含恒定轻链结构域，所述恒定轻链结构域包含人κ轻链的恒定结构域的氨基酸序列。
在具体实施方案中，本文所述的免疫特异性地结合至B7-H4(例如，人B7-H4)的抗体或其抗原结合片段表现出T细胞检查点阻断活性。在具体实施方案中，本文所述的免疫特异性地结合至B7-H4(例如，人B7-H4)的抗体或其抗原结合片段增加T细胞中的干扰素-γ(IFNγ)产生。在具体实施方案中，本文所述的免疫特异性地结合至B7-H4(例如，人B7-H4)的抗体或其抗原结合片段增加T细胞增殖。在具体实施方案中，本文所述的免疫特异性地结合至B7-H4(例如，人B7-H4)的抗体或其抗原结合片段增加CD4+ T细胞增殖。在具体实施方案中，本文所述的免疫特异性地结合至B7-H4(例如，人B7-H4)的抗体或其抗原结合片段增加CD8+ T细胞增殖。
在具体实施方案中，本文所述的免疫特异性地结合至B7-H4(例如，人B7-H4)的抗体或其抗原结合片段表现出抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。在具体实施方案中，本文所述的免疫特异性地结合至B7-H4(例如，人B7-H4)的抗体或其抗原结合片段在具有至少300,000个细胞表面B7-H4分子的细胞系(例如，SK-BR-3细胞)上表现出抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。在具体实施方案中，本文所述的免疫特异性地结合至B7-H4(例如，人B7-H4)的抗体或其抗原结合片段在具有至少100,000个细胞表面B7-H4分子的细胞系(例如，HCC1569细胞)上表现出抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。在具体实施方案中，本文所述的免疫特异性地结合至B7-H4(例如，人B7-H4)的抗体或其抗原结合片段在具有至少50,000个细胞表面B7-H4分子的细胞系(例如，ZR-75-1细胞)上表现出抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。在具体实施方案中，本文所述的免疫特异性地结合至B7-H4(例如，人B7-H4)的抗体或其抗原结合片段在具有至少30,000个细胞表面B7-H4分子的细胞系(例如，MDA-MB-468细胞)上表现出抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。在具体实施方案中，本文所述的免疫特异性地结合至B7-H4(例如，人B7-H4)的抗体或其抗原结合片段在具有至少15,000个细胞表面B7-H4分子的细胞系(例如，HCC1964细胞)上表现出抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。
在一个具体方面，如本文所述的免疫特异性地结合至B7-H4(例如，人B7-H4)的抗原结合片段选自由以下组成的组：Fab、Fab’、F(ab’)2和scFv,，其中所述Fab、Fab’、F(ab’)2或scFv包含如本文所述的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段的重链可变区序列和轻链可变区序列。Fab、Fab’、F(ab’)2或scFv可通过本领域技术人员已知的任何技术来产生。在某些实施方案中，Fab、Fab’、F(ab’)2或scFv还包含延长体内抗体半衰期的部分。所述部分也被称为“延长半衰期的部分”。可使用本领域技术人员已知的用于在体内延长Fab、Fab’、F(ab’)2或scFv的半衰期的任何部分。例如，延长半衰期的部分可包括Fc区、聚合物、白蛋白或白蛋白结合蛋白或化合物。所述聚合物可包括天然或合成的、任选取代的直链或支链的聚亚烷基、聚亚烯基、聚氧化烯、多糖、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、甲氧基聚乙二醇、乳糖、直链淀粉、葡聚糖、糖原或它们的衍生物。取代基可包括一个或多个羟基、甲基或甲氧基。在某些实施方案中，可通过添加一个或多个用于连接延长半衰期的部分的C-末端氨基酸来修饰Fab、Fab’、F(ab’)2或scFv。在某些实施方案中，延长半衰期的部分是聚乙二醇或人血清白蛋白。在某些实施方案中，Fab、Fab’、F(ab’)2或scFv融合至Fc区。
5.4抗体产生和多核苷酸
免疫特异性地结合至B7-H4(例如，人B7-H4)的抗体及其抗原结合片段可通过本领域已知的用于合成抗体及其抗原结合片段的任何方法，例如通过化学合成或通过重组表达技术来产生。除非另有说明，否则本文描述的方法采用分子生物学、微生物学、遗传分析、重组DNA、有机化学、生物化学、PCR、寡核苷酸合成和修饰、核酸杂交以及本领域技术范围内的相关领域中的常规技术。例如，这些技术在本文引用的参考文献中描述了，并且在所述文献中进行了充分说明。参见例如，Sambrook J等人,(2001)Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Ausubel FM等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons(1987and annualupdates)；Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons(1987and annualupdates)Gait(编辑)(1984)Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRLPress；Eckstein(编辑)(1991)Oligonucleotides and Analogues:A PracticalApproach,IRL Press；Birren B等人,(编辑)(1999)Genome Analysis:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press。
在某些方面，本文提供了包含抗B7-H4抗体或抗原结合片段的药物组合物，其中所述抗体或片段通过在宿主细胞中重组表达包含核苷酸序列的多核苷酸来产生。
在某些方面，本文提供的药物组合物中的抗B7-H4抗体或抗原结合片段包含由包含表9中所示的核苷酸序列(即SEQ ID NO:27)的多核苷酸编码的重链可变区。在某些方面，本文提供的药物组合物中的抗B7-H4抗体或抗原结合片段包含由包含表9中所示的核苷酸序列(即SEQ ID NO:27)的多核苷酸编码的重链可变区和编码人γ(γ)重链恒定区的核苷酸序列。在某些方面，本文提供的药物组合物中的抗B7-H4抗体或抗原结合片段包含由包含表9中所示的核苷酸序列(即SEQ ID NO:27)的多核苷酸编码的重链可变区和由包含SEQ IDNO:26的核苷酸序列的多核苷酸编码的重链恒定结构域。
表9：编码重链可变区的多核苷酸序列
在某些方面，本文提供的药物组合物中的抗B7-H4抗体或抗原结合片段包含由包含表10中所示的核苷酸序列(即SEQ ID NO:28)的多核苷酸编码的轻链可变区。在某些方面，本文提供的药物组合物中的抗B7-H4抗体或抗原结合片段包含由包含表10中所示的核苷酸序列(即SEQ ID NO:28)的多核苷酸编码的轻链可变区和编码人λ轻链恒定区的核苷酸序列。在某些方面，本文提供的药物组合物中的抗B7-H4抗体或抗原结合片段包含由包含表10中所示的核苷酸序列(即SEQ ID NO:28)的多核苷酸编码的轻链可变区和由包含SEQ IDNO:24的核苷酸序列的多核苷酸编码的轻链恒定结构域。
表10：编码轻链可变区的多核苷酸序列
在某些方面，本文提供的药物组合物中的抗B7-H4抗体或抗原结合片段包含由包含表9中所示的编码可变重链的核苷酸序列(即SEQ ID NO:27)的多核苷酸编码的可变重链和由包含表10中所示的编码可变轻链的核苷酸序列(即SEQ ID NO:28)的多核苷酸编码的可变轻链。
在某些方面，本文提供的药物组合物中的抗B7-H4抗体或抗原结合片段包含(i)由包含表9中所示的编码可变重链的核苷酸序列(即SEQ ID NO:27)的多核苷酸编码的重链和编码人γ(γ)重链恒定区的核苷酸序列，以及(ii)由包含表10中所示的编码可变轻链的核苷酸序列(即SEQ ID NO:28)的多核苷酸编码的轻链和编码人λ轻链恒定区的核苷酸序列。
在某些方面，本文提供的药物组合物中的抗B7-H4抗体或抗原结合片段包含(i)由包含表9中所示的编码可变重链的核苷酸序列(即SEQ ID NO:27)的多核苷酸编码的重链和SEQ ID NO:26的编码重链恒定结构域的核苷酸序列，以及(ii)由包含表10中所示的编码可变轻链的核苷酸序列(即SEQ ID NO:28)的多核苷酸编码的轻链和SEQ ID NO:24的编码轻链恒定结构域的核苷酸序列。
在某些方面，本文提供的药物组合物中的抗B7-H4抗体或抗原结合片段由编码抗B7-H4抗体或其抗原结合片段或其结构域的经优化的多核苷酸编码，所述优化例如，通过密码子/RNA优化、用异源信号序列置换以及消除mRNA不稳定元件。通过引入密码子变化(例如，由于遗传密码的简并性而编码相同氨基酸的密码子变化)和/或消除mRNA中的抑制区域来产生用于重组表达的编码抗B7-H4抗体或其抗原结合片段或其结构域(例如，重链、轻链、VH结构域或VL结构域)的优化的核酸的方法因此可通过采用例如在美国专利号5,965,726；6,174,666；6,291,664；6,414,132；以及6,794,498中描述的优化方法来进行。
多核苷酸可以例如呈RNA形式或DNA形式。DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA。DNA可以是双链或单链。如果是单链，则DNA可以是编码链或非编码(反义)链。在某些实施方案中，多核苷酸是缺少一个或多个内含子的cDNA或DNA。在某些实施方案中，多核苷酸是非天然存在的多核苷酸。在某些实施方案中，多核苷酸是重组产生的。在某些实施方案中，多核苷酸是分离的。在某些实施方案中，多核苷酸是基本上纯的。在某些实施方案中，多核苷酸是从天然组分中纯化的。
在某些方面，载体(例如，表达载体)包含编码抗B7-H4抗体及其抗原结合片段或其结构域的核苷酸序列，以在宿主细胞中、优选在哺乳动物细胞中重组表达。在某些方面，细胞(例如宿主细胞)包含用于重组表达本文所述的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段(例如，人或人源化抗体或其抗原结合片段)的此类载体。因此，用于产生用于本文所述的药物组合物中的抗体或其抗原结合片段的方法可包括在宿主细胞中表达这种抗体或其抗原结合片段。
可通过常规技术将表达载体转移至细胞(例如宿主细胞)，并且然后可通过常规技术培养所得细胞以产生本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如，包含20502的六个CDR、VH、VL、VH和VL、重链、轻链或重链和轻链的抗体或抗原结合片段)或其结构域(例如，20502的VH、VL、VH和VL、重链或轻链)。
在某些实施方案中，在
在一些实施方案中，在缺乏功能性α-1,6-岩藻糖基转移酶基因(FUT8)基因的宿主细胞中产生本文提供的药物组合物中的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段(例如，包含20502的CDR的抗体或其抗原结合片段)。在一些实施方案中，宿主细胞是CHO细胞。
在具体实施方案中，本文提供的药物组合物中的抗体或其抗原结合片段是分离或纯化的。通常，分离的抗体或其抗原结合片段是基本上不含与分离的抗体或其抗原结合片段具有不同抗原特异性的其他抗体或其抗原结合片段的抗体或其抗原结合片段。例如，在一个特定的实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段的制剂基本上不含细胞材料和/或化学前体。
5.5治疗用途和方法
在一个方面，本文提供了用于调节受试者的一种或多种免疫功能的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用包含B7-H4抗体或其抗原结合片段的本文提供的药物组合物。
在另一个实施方案中，将本文提供的包含抗B7-H4抗体或其抗原结合片段的药物组合物施用至患者(例如，人患者)，以增加所述患者体内的T细胞、CD4+ T细胞或CD8+ T细胞的增殖。在另一个实施方案中，将本文提供的包含抗B7-H4抗体或其抗原结合片段的药物组合物施用至患者(例如，人患者)，以增加所述患者体内的干扰素-γ(IFNγ)的产生。在另一个实施方案中，将本文提供的包含抗B7-H4抗体或其抗原结合片段的药物组合物施用至患者(例如，人患者)，以阻断所述患者体内的B7-H4针对T细胞的抑制活性。在另一个实施方案中，将本文提供的包含抗B7-H4抗体或其抗原结合片段的药物组合物施用至患者(例如，人患者)，以消减所述患者体内的表达B7-H4的癌细胞。在另一个实施方案中，施用本文提供的包含抗B7-H4抗体或其抗原结合片段的药物组合物以实现上述作用中的两种或更多种。
在某些实施方案中，本文提供了治疗癌症(例如,表达B7-H4的癌症)的方法，所述方法包括向有需要的患者(例如，人患者)施用包含本文提供的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段的药物组合物。在某些实施方案中，本文提供了治疗实体瘤(例如,表达B7-H4的实体瘤)的方法，所述方法包括向有需要的患者(例如，人患者)施用包含本文提供的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段的药物组合物。
在某个实施方案中，本文提供了用于治疗选自由以下组成的组的癌症的药物组合物：乳腺癌(例如，晚期乳腺癌、三阴性乳腺癌、激素受体(HR)阳性乳腺癌或导管癌)、子宫内膜癌、卵巢癌、尿路上皮癌、非小细胞肺癌(例如，鳞状细胞癌)、胰腺癌、甲状腺癌、肾癌(例如，肾细胞癌)和膀胱癌(例如，尿路上皮细胞癌)。在某些实施方案中，本文提供了用于治疗晚期乳腺癌(包括三阴性乳腺癌和激素受体(HR)阳性乳腺癌)、卵巢癌、子宫内膜癌或尿路上皮癌的药物组合物。在某些实施方案中，本文提供了用于治疗乳腺癌的药物组合物。在某些实施方案中，本文提供了用于治疗卵巢癌的药物组合物。在某些实施方案中，本文提供了用于治疗子宫内膜癌的药物组合物。在某些实施方案中，本文提供了用于治疗尿路上皮癌的药物组合物。
在一些实施方案中，所述癌症是表达B7-H4的癌症。
在另一个实施方案中，将本文提供的药物组合物施用至被诊断为患有癌症的患者(例如，人患者)，以增加所述患者体内的T细胞、CD4+T细胞或CD8+ T细胞的增殖。在另一个实施方案中，将本文提供的药物组合物施用至被诊断为患有癌症的患者(例如，人患者)，以增加所述患者体内的干扰素-γ(IFNγ)产生。在另一个实施方案中，将本文提供的药物组合物施用至被诊断为患有癌症的患者(例如，人患者)，以阻断所述患者体内的B7-H4针对T细胞的抑制活性。在另一个实施方案中，将本文提供的药物组合物施用至被诊断为患有癌症的患者(例如，人患者)，以消减所述患者体内的表达B7-H4的癌细胞。
本文所述的药物组合物可通过静脉内途径递送至患者。通常，患者是人，但是也可治疗非人哺乳动物，包括转基因哺乳动物。
6.实施例
本章节(即，第6章节)中的实施例以说明的方式提供，并且不是作为限制。
实施例1：制剂研究中使用的方法
I.抗体产生
在缺乏FUT8基因(α1,6-岩藻糖基转移酶)的CHO细胞系中产生了20502抗体，因此在全部实施例2-9中使用的20502抗体无岩藻糖基化。它们在抗体的Fc部分中的ASN297处缺乏末端岩藻糖。
II.通用配制程序
通过使用20kD截留分子量(MWCO)透析膜设备透析不含聚山梨醇酯的药物物质(无岩藻糖基化20502)，以各种配方制备单克隆抗体(mAb)的样品。在透析后，使用1.47cm-1[g/L]-1的消光系数通过UV光谱法测量mAb的浓度。用透析缓冲液将缓冲液交换样品的蛋白质浓度调节至所需值，并且将10％PS20储备溶液加标至每种制剂中，获得0.05％(w/v)PS20的最终浓度。使用0.22μm过滤器单元对制剂进行无菌过滤，并将其填充到层流罩中的适当容器/密闭系统中。根据研究设计，将样品置于各种储存条件下，并在指定的时间点使用各种方法分析它们的稳定性。
III.分析方法
目视检查(AD-Gen-002/00)：在荧光灯下针对黑白背景进行目视评估。检查样品的颜色、透明度和可见颗粒的存在。
蛋白质浓度(TM-150-001/00)：使用1.47cm-1[g/L]-1的理论吸收系数，通过280nm处的UV吸光度来确定蛋白质浓度。用杜尔贝科氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)将样品稀释至线性范围内的吸光度内，并针对作为空白的DPBS进行测量。使用Agilent Cary 8454紫外-可见分光光度计(Agilent Technologies,CA)测量吸光度。
pH(AD-GEN-001/00)：使用校准的Beckman Coulter pHi560计(Beckman Coulter,Inc.,CA)确定缓冲剂的pH。
克分子渗透压重量浓度(TM-GEN-004/00)：使用Wescor VAPRO系统(Wescor,Inc.,UT)通过蒸气压测量缓冲剂的克分子渗透压重量浓度。
差示扫描量热法(DSC)分析：DSC测量在MicroCal VP-毛细管DSC平台(GEHealthcare,UK)上进行。将mAb样品在各种配制缓冲液中稀释至1mg/mL的浓度。匹配的配制缓冲液用作参考。以1℃/分钟的速率从15℃至110℃扫描样品。首先将数据针对蛋白质浓度归一化，然后使用Origin 7.0软件(OriginLab,MA)进行基线校正并减去缓冲液。使用origin软件中的非二态展开模型，使用光标起始的DSC峰拟合函数对熔融转变进行了分析。
UNit系统的解折叠温度TM：蛋白质的解折叠温度(Tm)提供分子的物理稳定性的度 量。解折叠温度被定义为相等量的天然和变性蛋白质平衡存在的温度。Unchained Labs(CA)的UNit系统使用固有的荧光光谱变化来确定热诱导蛋白质解折叠发生的温度。以1℃/分钟的速率从20℃到90℃扫描1mg/mL的样品。使用来自Unchained Labs(CA)的UNcle软件来确定Tm。
成像毛细管等电聚焦(iCE)(TM-150-003/02)：通过成像毛细管等电聚焦(iCE)在 配备有720NV自动进样器的Protein Simple iCE3仪器(ProteinSimple,CA)上分析电荷变 体。使用iCE CFR软件对数据进行分析，并主峰、酸性峰和碱性峰的相对量通过对曲线中观察到的峰的面积进行积分来确定，并用于计算酸性和碱性变体的百分比。
尺寸排阻色谱法(SEC)(TM-150-004/00)：在配备有二极管阵列检测器的Agilent 1100系列HPLC上分析样品，并监测280 nm处的吸光度。在流动相(100mM磷酸钠、400mM氯化钠pH 6.8)中将样品稀释至1mg/ml，并且将50μL注入预先平衡的Sepax Zenix SEC-3007.8X200mm柱(Sepax Technologies,Inc.,Delaware)上。SEC分离柱和保护柱在25℃下使用。使用1.0mL/min的流速，运行时间为12分钟。使用仪器软件对聚集体、单体和片段峰进行定量。
用十二烷基硫酸钠凝胶(CE-SDS)(TM-150-002/00)进行的毛细管电泳：CE-SDS用 于确定在还原和非还原条件下B7-H4抗体20502的纯度。使用未包被的50μM I.D.毛细管在Beckman Coulter PA800 plus系统(Beckman Coulter,CA)上分析样品。监测220nm处的吸光度。通过测量重链和轻链峰的峰面积并将其与所有检测到的峰的总面积进行比较来确定在还原条件下20502的纯度。通过测量主要完整蛋白质峰的峰面积并将其与所有检测到的峰的总面积进行比较来确定在非还原条件下20502的纯度。
通过HIAC的亚可见微粒物质(AD-GEN-006)：使用配备有HRDL-150检测器和1mL注 射器的HIAC 9703+颗粒计数器(Hach,CO)。在使用前，用无颗粒的Milli-Q水(Millipore,MA)冲洗系统以产生干净的基线。从样品中取得四个连续的0.4mL等分试样，并对来自最后三个等分试样的颗粒计数取平均值并报告。
实施例2：抗体20502的氨基酸残基的生物化学分析
抗B7-H4抗体20502是单克隆抗体。基于知识的制剂开发方法用于鉴定为蛋白质提供最大稳定性的适当组合物。为此，考虑了可能影响蛋白质的稳定性的分子内在性质和外在制剂组分。
表11中示出抗体20502的全长重链和轻链氨基酸序列。
表11：抗体20502的全长重链和轻链的一级氨基酸序列
对20502主要序列的分析表明，一些氨基酸残基可潜在经历生物化学修饰。这些包括天冬酰胺的脱酰胺、天冬氨酸的异构化以及甲硫氨酸、半胱氨酸、组氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的氧化。经受脱酰胺、异构化和氧化的天冬酰胺、天冬氨酸和甲硫氨酸在表11中的序列中分别以粗体和灰色方块指示。表12中列出20502中的潜在生物化学降解斑点。这些潜在降解斑点在CDR区域之外。
表12：20502中化学降解途径的潜在氨基酸残基.
为了开发能够为20502提供良好稳定性的液体制剂，评价了不同条件，如pH、缓冲剂类型和赋形剂。在每个实施例中，基于20502的生物物理和生物化学性质来监测蛋白质的稳定性。研究的细节及其结果在此处进行了描述。
实施例3：初始pH筛选研究
制剂的pH影响蛋白质稳定性。制剂的pH可影响生物化学降解途径，如脱酰胺、异构化和氧化；以及生物物理降解，如由于蛋白质之间以及与其环境之间的相互作用所致的聚集和片段化。
进行了pH筛选研究，以确定为20502提供最大稳定性的pH范围，并了解在这些条件下蛋白质的降解机制。表13中列出研究中评价的制剂组成的细节。
表13：评价pH对蛋白质稳定性的影响的制剂
#
20502(mg/mL)
制剂成分和浓度
％PS20(w/v)
pH
1
1.0
20mM柠檬酸盐，270mM蔗糖
0.05
4.0
2
1.0
20mM柠檬酸盐，270mM蔗糖
0.05
5.0
3
1.0
20mM组氨酸，270mM蔗糖
0.05
6.0
4
1.0
20mM磷酸盐，270mM蔗糖
0.05
7.0
5
1.0
20mM Tris，270mM蔗糖
0.05
8.0
为了确定蛋白质在不同pH条件下的热稳定性，使用UNit仪器通过在不同温度下的固有荧光变化来测量解折叠温度。色氨酸荧光发射波长的偏移(Barycentric Mean,BCM)表明在加热样品时发生了解折叠事件。图1示出在不同pH条件下测量的20502的解折叠温度(Tm1)。结果表明Tm1是pH依赖性的。在较高的pH(例如，pH≥7)下，观察到74℃的解折叠温度。在pH 5和6下，解折叠温度分别是66℃和70℃。在pH 4下，解折叠温度是55℃。另外，使用pH 4，起始温度似乎是约50℃，但使用pH 5-8，起始温度是62℃或以上。这些结果表明，与pH4的制剂相比，pH≥5的组合物将提供更好的热稳定性。
还在40℃的应力条件下评价了20502在不同pH下的稳定性长达4周。对于研究的持续时间，所有样品均保持澄清且无色，未观察到颗粒。通过SE-HPLC测定聚集体和片段的变化。在时间零点(T0)，在所研究的制剂中在1mg/mL浓度下未观察到的20502的明显聚集体。在40℃下4周后，pH 4、7和8制剂中的可溶性聚集体明显增加；在pH 5或6制剂中仅观察到少量的聚集体增加(图2)。观察到pH对片段形成的类似影响(图3)。来自这项研究的结果表明，如对所示性质的SE-HPLC测量所表明的，20502在pH 5-6左右最稳定。
实施例4：详细的pH筛选研究
初步pH筛选研究的结果表明，抗体20502在pH 5-6左右最稳定。进行了详细的pH研究，以鉴定在4.5至6.5范围内提供最大稳定性的pH。表14中列出制剂组成的细节。此研究使用柠檬酸盐缓冲剂进行，以使缓冲剂类型对mAb稳定性的可能影响最小化。基于视觉外观、聚集、片段化(通过SE-HPLC)和电荷变体(iCE)在应力(40℃)条件下检查抗体20502在10mg/mL下的稳定性长达三周。
表14：评价对蛋白质稳定性的详细pH影响的制剂
#
制剂
％PS20(w/v)
pH
抗体浓度(mg/mL)
1
20mM柠檬酸盐，270mM蔗糖
0.05
4.5
10
2
20mM柠檬酸盐，270mM蔗糖
0.05
5.0
10
3
20mM柠檬酸盐，270mM蔗糖
0.05
5.5
10
4
20mM柠檬酸盐，270mM蔗糖
0.05
6.0
10
5
20mM柠檬酸盐，270mM蔗糖
0.05
6.5
10
对于研究的持续时间，所有样品均保持澄清且无色，未观察到颗粒。SE-HPLC结果表明，在研究开始时(T0)，对于10mg/ml浓度的20502观察到低水平的聚集体。在40℃下三周的热应力导致pH依赖性的聚集增加，顺序为4.5<5.0<5.5<6.0<6.5，而片段化显示相反的趋势(图4和图5)。
iCE数据表明，在40℃下3周后，酸性变体增加。酸性变体的增加是pH依赖性的，pH的增加顺序为6.5/6.0/5.5<5.0<4.5(图6)。
较高的pH与增加的聚集相关，并且较低的pH与增加的片段化相关的事实增加了鉴定合乎需要的药物制剂的难度。总的来说，研究结果表明，pH 5-6的制剂为20502提供最佳的总体稳定性特性。
实施例5：缓冲剂种类筛选研究
像pH一样，缓冲剂类型在不同程度上影响蛋白质稳定性。以0.5单位递增在pH 5.0至pH 6.5的乙酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐和组氨酸缓冲剂中基于它们的pKa评估10mg/mL的20502的加速稳定性，目的是确定在pH 5.0-6.5下提供最大稳定性的缓冲剂。表15中提供详细的制剂组成。基于外观、聚集、片段化和电荷变体来检查这些缓冲剂对蛋白质稳定性的影响。
表15：评价蛋白质稳定性的制剂缓冲剂种类
对于研究的持续时间，所有样品均保持澄清且无色，未观察到颗粒。图16中所示的SE-HPLC结果揭示这项研究中聚集体的缓冲剂(pH)依赖性增加。与较低pH下的那些相比，在较高pH下以较高的速率形成聚集体；顺序为组氨酸(pH 6.5)>琥珀酸盐(pH 6)>柠檬酸盐(pH 5.5)>乙酸盐(pH 5)。在另一方面，与组氨酸(pH 6.5)和琥珀酸盐(pH 6)缓冲剂中的那些相比，在乙酸盐(pH 5)和柠檬酸盐(pH 5.5)缓冲剂中观察到略少的片段，尽管总体水平在40℃下3周内较低(0.5％–0.7％)(图8)。
iCE结果表明，缓冲剂对20502电荷分布有一定影响，如图9和图10中所示。但是，在40℃下储存三周后，它们之间的总体差异在酸性变体中略高于10％，并且在碱性变体中为约2％。
在含有组氨酸的两种其他标准制剂中对20502抗体进行了测试，但均未产生具有所需稳定性的组合物。基于这些结果，可以得出结论，在所有测试的配制条件中，20502在pH5的乙酸盐缓冲剂中最稳定。pH 5.5的柠檬酸盐缓冲剂也可为20502提供相对稳定的缓冲剂。
实施例6：赋形剂选择研究
诸如填充剂的制剂赋形剂可影响产物稳定性。为了评估赋形剂对抗体20502稳定性的影响，将20mg/mL的抗体配制成含有等渗浓度的氯化钠(NaCl)、海藻糖、山梨糖醇或蔗糖的乙酸盐和柠檬酸盐制剂。在pH 5.5下配制柠檬酸盐制剂，并且在pH 5.0下配制乙酸盐制剂。还在pH 4.5和5.5下制备了两种另外具有蔗糖的乙酸盐制剂。表16中提供详细的制剂组成。在40℃、25℃和5℃的储存条件下，基于外观、聚集、片段化和电荷变体检查了赋形剂对蛋白质稳定性的影响。
表16：评估蛋白质稳定性的制剂赋形剂
对于研究的4周持续时间，所有样品均保持澄清且无色，未观察到颗粒。图11中所示的SE-HPLC结果揭示与乙酸盐制剂相比，在柠檬酸盐制剂中20502聚集体以更快的速率形成。在NaCl制剂中，聚集形成的速率最高，并且对于柠檬酸盐和乙酸盐制剂均是如此。山梨糖醇、海藻糖和蔗糖制剂在柠檬酸盐和乙酸盐缓冲剂中显示出相似的聚集变化。对于片段，除了含有乙酸盐和NaCl的制剂(其这显示稍微更多的片段)外，所有制剂都是相似的(图12)。因此，尽管NaCl广泛用于药物组合物中，但其导致20502的聚集和片段化增加。与早期研究中的那些相比，本研究中观察到的片段的量略高。这可能是由于本研究中使用的蛋白质浓度较高(20mg/mL)。
制剂赋形剂在储存后对20502电荷分布的影响较小。如图13所示，在所有制剂中观察到小于10％的酸性变体差异。类似地，在每种缓冲剂类型内的所有制剂中观察到小于2％的碱性变体差异(图14)。
基于赋形剂选择研究的结果，由于观察到的聚集体水平，因此选择了蔗糖而不是NaCl。蔗糖显示出与山梨糖醇和海藻糖相似的聚集和电荷分布。然而，从原材料供应的角度看，蔗糖更可靠，并且具有更好的质量和监管经验。
总体而言，pH、缓冲剂种类和赋形剂筛选研究的结果表明20502抗体在包含20mM乙酸盐、270mM蔗糖和0.05％PS20的pH 5.0的制剂中最稳定。含有20mM柠檬酸盐、270mM蔗糖、0.05％PS20的pH 5.5的制剂也提供了良好的稳定性。
收集含有20mM乙酸盐、270mM蔗糖、0.05％PS20的pH 5.0的制剂中的20502抗体的差示扫描量热法(DSC)曲线并在图15中示出。观察到两个峰，Tm1＝69℃和Tm2＝84℃。
实施例7：20502的冻融稳定性
通过在-70℃下将配制为pH 5.0的20mM乙酸盐、270mM蔗糖、0.05％PS20制剂中的20mg/mL蛋白质的20502原料药物物质以500mL规模冷冻并在环境温度下解冻来进行冻融研究持续5个周期。未检测到外观、可溶性聚集体或亚可见微粒物质的明显变化(表17)。
表17：冻融后20502制剂的稳定性
实施例8：20502的搅拌稳定性
通过将20502药物物质填充到3cc玻璃小瓶中，将样品小瓶水平放置在轨道振荡器上，并在室温下以300RPM振荡样品72小时来对20502施加搅拌应力。将20502配制为在pH5.0的20mM乙酸盐、270mM蔗糖、0.05％PS20制剂中的20mg/mL蛋白质。在20502制剂样品中未检测到外观、可溶性聚集体、电荷变体分布或亚可见微粒物质的明显变化(表18)。所有研究均在室温下在20℃±5℃下进行。所有样品均具有澄清且无色的外观，没有可见的颗粒。
表18：搅拌72小时后20502制剂的稳定性
实施例9：确认稳定性研究
进行稳定性研究以评价20502在两种制剂(i)包含20mM乙酸盐、270mM蔗糖和0.05％PS20中的20mg/mL蛋白质的pH 5.0的制剂和(ii)包含20mM柠檬酸盐、270mM蔗糖和0.05％PS20中的20mg/mL蛋白质的pH 5.5的制剂中的稳定性。将1.5mL的配制溶液填充到3cc的具有13mm颈部的1型玻璃小瓶中，用13mm West 4023/50灰色溴丁基血清塞子封盖，并用铝密封件密封。通过将小瓶置于倒置位置来评估容器封闭系统与抗体20502的相容性。对于这一稳定性研究使用5℃、25℃和40℃的储存条件。六个月稳定性数据对于乙酸盐制剂在表19至表21中示出；并且对于柠檬酸盐制剂在表22至表24中示出。
表19：在5℃下乙酸盐制剂中的20502药物产品的稳定性
缩写：NP＝未计划；NT＝未测试；T0＝时间零点。
表20：在25℃下乙酸盐制剂中的20502药物产品的稳定性
表21：在40℃下乙酸盐制剂中的20502药物产品的稳定性
表22：在5℃下柠檬酸盐制剂中的20502药物产品的稳定性
表23：在25℃下柠檬酸盐制剂中的20502药物产品的稳定性
表24：在40℃下柠檬酸盐制剂中的20502药物产品的稳定性
在乙酸盐和柠檬酸盐制剂中实时收集在2℃-8℃的长期储存条件下20502药物产品的稳定性数据持续6个月。所有稳定性数据均符合接受标准(表19和表22)。在任何测试的属性中均未观察到明显的稳定性变化趋势。结果表明，在2℃-8℃的长期储存条件下20502药物产品在两种制剂中稳定至少6个月。
在乙酸盐和柠檬酸盐制剂中收集在25℃的加速条件下的稳定性数据持续6个月。总体而言，在加速条件下储存6个月导致如通过iCE所测定，酸性峰增加和主峰减少；如通过SE-HPLC所测定，聚集体和片段稍微增加；如通过还原和非还原CE-SDS所测定，纯度稍微降低；以及如通过基于细胞的ADCC测定所确定，效力稍微降低。未观察到其他产品属性的变化。所有稳定性数据均在接受标准之内。
收集在40℃的应力条件下的稳定性数据持续3个月。随时间推移，一些变化在所收集的数据中更加明显。所述趋势类似于在加速储存条件(25℃)下所示的那些。通过iCE观察到酸性峰增加以及主峰和碱性峰减少。通过SE-HPLC观察到聚集体和片段增加以及单体减少。另外，如通过还原和非还原CE-SDS分析所证明，在这种条件下纯度降低。还观察到了基于细胞的ADCC测定中效力的降低。这些结果与在此条件下储存的蛋白质治疗剂的预期变化一致。
进行以上研究以鉴定为20502提供最大稳定性的制剂条件。这些包括pH筛选、缓冲剂种类选择和赋形剂选择研究。在乙酸盐或柠檬酸盐缓冲剂中，20502在pH 5-6的范围内最稳定。当使用蔗糖作为赋形剂时，20502也是稳定的。选择含有20mM乙酸盐、270mM蔗糖和0.05％PS20中的20mg/mL蛋白质的pH 5.0的制剂。还选择了作为在20mM柠檬酸盐、270mM蔗糖、0.05％PS20中的20mg/mL蛋白质的pH 5.5的备用制剂。
在冻融和搅拌条件下，抗体20502在乙酸盐制剂中也是稳定的。乙酸盐制剂中的20502预期在-70℃下储存时作为药物物质和在2℃-8℃下储存至少12个月时作为药物产品均是稳定的。
***
本发明的范围不受本文所述的具体实施方案限制。实际上，除所描述的那些以外，根据前述描述和附图，本文提供的多种修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。此类修改意图属于所附权利要求的范围之内。
本文所引用的所有参考文献(例如，公布或专利或专利申请)均以引用的方式整体并入本文，并且出于所有目的，所述引用的程度就好像具体地且单独地出于所有的目的将每个单独的参考文献(例如，公布或专利或专利申请)以引用的方式整体并入。
其他实施方案在以下权利要求内。
序列表
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<120> B7-H4抗体制剂
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<212> PRT
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<223> 人B7-H4
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Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 22
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 全长轻链氨基酸序列
<400> 22
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Phe Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 23
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人κ轻链的恒定区
<400> 23
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 24
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人κ轻链核苷酸序列的恒定区
<400> 24
cggaccgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180
agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240
aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300
agcttcaaca ggggagagtg t 321
<210> 25
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IgG1重链的恒定区
<400> 25
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 26
<211> 990
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人IgG1重链核苷酸序列的恒定区
<400> 26
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540
agcacgtacc gggtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990
<210> 27
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码重链可变区的多核苷酸序列20502
<400> 27
cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcaaa agtggtagtt actactgggg ctggatccgc 120
cagcccccag ggaaggggct ggagtggatt gggaacatct attatagtgg gagcacctac 180
tacaacccgt ccctcagaag tcgagtcacc atatccgtag acacgtccaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgagttctgt gaccgccgca gacacggcgg tgtactactg cgccagagaa 300
ggatcttacc ccaatcagtt tgatccatgg ggacagggta cattggtcac cgtctcctca 360
<210> 28
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码轻链可变区的多核苷酸序列20502
<400> 28
gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcaacttag cctggtacca gcagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag taccactcct tccctttcac ttttggcgga 300
gggaccaagg ttgagatcaa a 321
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