非洲猪瘟基因缺失弱毒株的构建及其作为疫苗的应用
阅读说明：本技术 非洲猪瘟基因缺失弱毒株的构建及其作为疫苗的应用 (Construction of African swine fever gene deletion low virulent strain and application of African swine fever gene deletion low virulent strain as vaccine ) 是由 郑海学 李攀 冯涛 齐晓兰 刘华南 张克山 李丹 吴盼雪 马昭 党文 刘迎琦 于 2020-07-10 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物工程技术领域,具体涉及一种可用作疫苗的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株及其构建方法,该病毒株是亲本非洲猪瘟病毒ASFV CN/GS/2018分离株的基因缺失弱毒株。本发明发现了DP71L基因是对猪致病性致弱的新靶标基因,并发现联合丧失MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码蛋白的功能,降低了亲本毒株的毒性,获得了一株安全性高的减毒非洲猪瘟候选疫苗株；所述减毒非洲猪瘟候选疫苗株高剂量(10<Sup>4</Sup>HAD<Sub>50</Sub>)免疫猪后,对猪完全致弱,免疫猪健康,不发病,与免疫猪同居猪核酸也呈阴性,不水平传播,具有较好安全性；且能够对ASFV CN/GS/2018强毒株的攻毒提供100％免疫保护,可作为安全和有效的防控非洲猪瘟疫情的候选疫苗,具有极大的社会价值。(The invention belongs to the technical field of bioengineering, and particularly relates to a gene deletion attenuated African swine fever virus strain capable of being used as a vaccine and a construction method thereof, wherein the virus strain is a gene deletion weak African swine fever virus ASFV CN/GS/2018 isolateA strain. The DP71L gene is found to be a new target gene for weakening the pathogenicity of the pig, and the combined loss of the functions of MGF360-18R gene, DP71L gene and DP96R gene encoding protein is found, so that the toxicity of parent strains is reduced, and an attenuated African swine fever candidate vaccine strain with high safety is obtained; the attenuated African swine fever candidate vaccine strain has high dose (10) 4 HAD 50 ) After the pigs are immunized, the pigs are completely weakened, the immunized pigs are healthy and do not get ill, the nucleic acid of the pigs living with the immunized pigs is negative and does not spread horizontally, and the safety is better; and can provide 100% immune protection for the challenge of ASFV CN/GS/2018 virulent strain, can be used as a safe and effective candidate vaccine for preventing and controlling African swine fever epidemic situation, and has great social value.)
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码蛋白功能丧失的非洲猪瘟基因缺失弱毒株的构建及其作为疫苗的应用。
背景技术
非洲猪瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染引起的一种以猪发热和猪全身脏器出血为特征的急性烈性传染病，对于家猪的病死率高达100％。该病首先于1921在肯尼亚爆发，随后在整个非洲的家猪和野猪中广泛流行。20世纪50年代传入欧洲，整个欧洲用了40年消除该病。然而，该病自2007年再次从东非传入格鲁吉亚，随后便广泛在东欧散播，并于2017年传入俄罗斯远东地区伊尔库斯克。2018年8月初，扈荣良研究员率先报道我国第一例非洲猪瘟疫情，短短一年之内，该病蔓延至全国30个省市自治区，继续对养猪业构成威胁，其中与2018年8月相比，2019年9月中国生猪产量下降了40％，猪肉价格自2019年8月以来上涨了一倍，已造成全国40％以上减产率，损失严重。当前没有商品化的有效疫苗，非洲猪瘟疫情一旦发生，只能通过扑杀手段进行控制，但是这种方式不仅导致经济损失，而且需要花费漫长的时间，无法满足我国规模化养猪的需求。因此，疫苗作为预防和控制病毒传染病最有效、最经济的手段，对于我国规模养猪模式下的非洲猪瘟的防治至关重要。但非洲猪瘟病毒(ASFV)结构复杂、基因组庞大，大部分功能未知，感染与致病机制不清，疫苗创制的理论认知有限，其流行已逾百年，但仍未有商品化的疫苗问世。
目前对于非洲猪瘟疫苗的制备主要通过三种方式：一是直接对原始非洲猪瘟病毒进行灭活得到灭活疫苗；二是筛选出有效诱导免疫应答的病毒蛋白，进而制备亚单位疫苗和活载体疫苗；三是采用基因缺失手段，敲除毒力基因后获得重组病毒疫苗。其中第一种方法是制备病毒疫苗最常用、最直接的方法，但是，由于非洲猪瘟病毒编码免疫抑制、免疫耐受和抗体依赖增强作用(ADE)等蛋白，灭活疫苗免疫猪体内无法提供有效的免疫保护作用；第二种方法的困难在于非洲猪瘟病毒结构复杂，目前诱导免疫应答的蛋白还未清楚，获得的抗原还不足以诱导坚强的免疫保护作用。而目前最有望突破的疫苗就是基因敲除疫苗，通过对免疫抑制、耐受、ADE等毒力相关基因的敲除，获得既具有免疫原性，又能降低致病性，免疫猪获得免疫保护作用的疫苗候选毒株。例如，中国专利CN110551695A提供了一种非洲猪瘟病毒四基因缺失弱毒株，该弱毒株是非洲猪瘟病毒SY18分离株的四基因缺失弱毒株，其缺失以下基因的功能蛋白：CD2v基因编码产物和三个多基因家族基因(MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L)编码产物，接种仔猪免疫28天后，以ASFV原始毒进行攻毒试验，结果免疫猪群均获得完全保护；又如中国专利CN110093324B公开了一种基因Ⅱ型的非洲猪瘟病毒MGF360-505R缺失和CD2V与MGF360-505R联合缺失的基因缺失病毒，这两种毒株均能提供对非洲猪瘟中国流行强毒株的100％免疫保护，这两株基因缺失病毒免疫后21天能够提供充分的强毒攻击保护。
综上，对于猪瘟病毒毒力基因的敲除，往往需要考虑到对猪的免疫应答和保护性，又要兼顾致病性和安全性能。但是现有技术中猪瘟病毒毒力基因敲除疫苗还是存在如下问题：①不同毒株缺失同一基因产生的效果不同，缺失不充分还会有毒力和致病性残留，以及多基因缺失造成的病毒滴度低，也会使致弱毒株降低免疫原性或保护作用等风险；②敲除的毒力基因是否减少带毒和排毒是生物安全的一个重要指标，最好能够获得免疫清除的疫苗候选毒株，减少散毒和排毒的风险；③非洲猪瘟的全基因组测序工作虽然已经完成，但是组成非洲猪瘟病毒的调控基因和结构基因高达160多个，虽然对所有基因的功能进行研究是一项巨大的工程，但全面研究每一个调控基因和结构基因的功能对其致病机理和疫苗研制至关重要。
因此，在非洲猪瘟减毒疫苗的制备过程中，鉴定基因功能及其对致病性和免疫应答的影响，为敲除靶标基因的选择和基因敲除的构建提供依据，新靶标基因的筛选至关重要，决定着疫苗候选株的安全性和免疫有效性。本发明发现DP71L具有较强的免疫抑制作用，是新发现的新靶标基因；在非洲猪瘟原始毒株中联合缺失DP71L、DP96R和MGF360-18R基因，获得了一株肌肉注射高剂量(每头猪免疫104HAD50)猪仍不发病的基因缺失毒株，与免疫猪同居的猪的核酸和抗体均是阴性，显示该毒株肌肉注射不能够致猪发病死亡、无水平传播现象，表明它是安全性良好的减毒非洲猪瘟病毒株。本发明的非洲猪瘟病毒弱毒株能对ASFV亲本毒株的攻击提供完全的免疫保护作用，且安全性高，适于作为预防非洲猪瘟的疫苗候选株。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供一种构建非洲猪瘟减毒株的策略，所述策略是通过以下技术方案实现的：
本发明首先发现了DP71L基因具有较强的免疫抑制作用，是新发现的使非洲猪瘟病毒减弱的靶标基因。基于此，本发明的目的在于提供一种使非洲猪瘟病毒毒力减弱的靶标基因DP71L，所述DP71L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的另一目的在于提供一种通过联合丧失非洲猪瘟病毒中MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码蛋白的功能制备非洲猪瘟减毒株的应用；由于MGF360-18R基因位于DP71L基因的一端，并与DP71L基因部分重叠(CDS的部分序列及启动子序列)，DP96R基因与DP71L基因的另一端相邻，中间含有部分无基因功能的连接序列，因此可以通过分别缺失MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因的全部核苷酸序列导致其编码蛋白功能的丧失；为了简化操作步骤，也可以通过一次操作缺失MGF360-18R基因的部分序列(CDS的部分序列及启动子序列)、DP71L基因全部核苷酸序列、DP96R基因的部分序列及DP71L基因和DP96R基因之间的无基因功能序列的连接序列，使MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码的蛋白无法正常表达，导致其编码蛋白功能的丧失；根据本领域技术人员的公知常识，除了上述基因编辑手段，还可以采用其它基因编辑手段使MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码的蛋白功能同时丧失，例如：移码突变、点突变、缺失或***核苷酸序列等。
优选地，所述MGF360-18R基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述DP71L基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述DP96R基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
优选地，所述MGF360-18R基因的核苷酸酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述DP71L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述DP96R基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
优选地，所述使MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码蛋白的功能丧失的方法包括基因缺失技术、基因突变技术、基因***技术。
本发明的另一目的在于提供一种通过联合丧失非洲猪瘟病毒中MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码蛋白的功能制备非洲猪瘟疫苗的应用；由于MGF360-18R基因位于DP71L基因的一端，并与DP71L基因部分重叠(MGF360-18R基因CDS的部分序列及启动子序列)，DP96R基因与DP71L基因的另一端相邻，中间含有部分无基因功能的连接序列，因此可以通过分别缺失MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因的全部核苷酸序列导致其编码蛋白功能的丧失；为了简化操作步骤，也可以通过一次操作缺失MGF360-18R基因的部分序列(CDS的部分序列及启动子序列)、DP71L基因全部核苷酸序列、DP96R基因的部分序列及DP71L基因和DP96R基因之间的无基因功能序列的连接序列，使MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码的蛋白无法正常表达，导致其编码蛋白功能的丧失；根据本领域技术人员的公知常识，除了上述基因编辑手段，还可以采用其它基因编辑手段使MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码的蛋白功能同时丧失，例如：移码突变、点突变、缺失或***核苷酸序列等。
优选地，所述MGF360-18R基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述DP71L基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述DP96R基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
优选地，所述MGF360-18R基因的核苷酸酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述DP71L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述DP96R基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
优选地，所述使MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码蛋白功能丧失的方法包括基因缺失技术、基因突变技术、基因***技术。
本发明的另一目的在于提供一种通过在非洲猪瘟病毒中联合缺失基因片段制备非洲猪瘟减毒病毒株的应用，所述基因片段包括MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因的全部或部分核苷酸序列；由于MGF360-18R基因位于DP71L基因的一端，并与DP71L基因部分重叠(MGF360-18R基因CDS的部分序列及启动子序列)，DP96R基因与DP71L基因的另一端相邻，中间含有部分无基因功能的连接序列，因此可以通过分别缺失MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因的全部核苷酸序列导致其编码蛋白功能的丧失；为了简化操作步骤，也可以通过一次操作缺失MGF360-18R基因的部分序列(CDS的部分序列及启动子序列)、DP71L基因全部核苷酸序列、DP96R基因的部分序列及DP71L基因和DP96R基因之间的无基因功能序列的连接序列，使MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码的蛋白无法正常表达，导致其编码蛋白功能的丧失；根据本领域技术人员的公知常识，除了上述基因编辑手段，还可以采用其它基因编辑手段使MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码的蛋白功能同时丧失，例如：移码突变、点突变、缺失或***核苷酸序列等。
优选地，所述缺失基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明的另一目的在于提供一种通过在非洲猪瘟病毒中缺失基因片段制备非洲猪瘟减毒疫苗的应用，所述基因片段包括MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因的全部或部分核苷酸序列；由于MGF360-18R基因位于DP71L基因的一端，并与DP71L基因部分重叠(MGF360-18R基因CDS的部分序列及启动子序列)，DP96R基因与DP71L基因的另一端相邻，中间含有部分无基因功能的连接序列，因此可以通过分别缺失MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因的全部核苷酸序列导致其编码蛋白功能的丧失；为了简化操作步骤，也可以通过一次操作缺失MGF360-18R基因的部分序列(CDS的部分序列及启动子序列)、DP71L基因全部核苷酸序列、DP96R基因的部分序列及DP71L基因和DP96R基因之间的无基因功能序列的连接序列，使MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码的蛋白无法正常表达，导致其编码蛋白功能的丧失；根据本领域技术人员的公知常识，除了上述基因编辑手段，还可以采用其它基因编辑手段使MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码的蛋白功能同时丧失，例如：移码突变、点突变、缺失或***核苷酸序列等。
优选地，所述缺失基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
优选地，所述非洲猪瘟病毒为基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒。
优选地，所述非洲猪瘟病毒为ASFV CN/GS/2018分离株。
本发明的另一目的在于提供一种基因缺失减毒非洲猪瘟病毒，将原始非洲猪瘟病毒MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码蛋白的功能丧失；由于MGF360-18R基因位于DP71L基因的一端，并与DP71L基因部分重叠(MGF360-18R基因CDS的部分序列及启动子序列)，DP96R基因与DP71L基因的另一端相邻，中间含有部分无基因功能的连接序列，因此可以通过分别缺失MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因的全部核苷酸序列导致其编码蛋白功能的丧失；为了简化操作步骤，也可以通过一次操作缺失MGF360-18R基因的部分序列(CDS的部分序列及启动子序列)、DP71L基因全部核苷酸序列、DP96R基因的部分序列及DP71L基因和DP96R基因之间的无基因功能序列的连接序列，使MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码的蛋白无法正常表达，导致其编码蛋白功能的丧失；根据本领域技术人员的公知常识，除了上述基因编辑手段，还可以采用其它基因编辑手段使MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码的蛋白功能同时丧失，例如：移码突变、点突变、缺失或***核苷酸序列等。
优选地，所述MGF360-18R基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述DP71L基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述DP96R基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
优选地，所述MGF360-18R基因的核苷酸酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述DP71L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述DP96R基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
优选地，所述原始非洲猪瘟病毒为ASFV CN/GS/2018分离株。
优选地，所述基因缺失减毒非洲猪瘟病毒相对于ASFV CN/GS/2018分离株全长序列缺失了第184062-184456位的核苷酸。
本发明的另一目的在于提供一种非洲猪瘟减毒疫苗，所述非洲猪瘟疫苗包括上述的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒。
本发明的另一目的在于提供一种制备减毒非洲猪瘟病毒株的方法，所述的方法是通过基因工程手段将原始毒株的MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码蛋白的功能丧失；由于MGF360-18R基因位于DP71L基因的一端，并与DP71L基因部分重叠(MGF360-18R基因CDS的部分序列及启动子序列)，DP96R基因与DP71L基因的另一端相邻，中间含有部分无基因功能的连接序列，因此可以通过分别缺失MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因的全部核苷酸序列导致其编码蛋白功能的丧失；为了简化操作步骤，也可以通过一次操作缺失MGF360-18R基因的部分序列(CDS的部分序列及启动子序列)、DP71L基因全部核苷酸序列、DP96R基因的部分序列及DP71L基因和DP96R基因之间的无基因功能序列的连接序列，使MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码的蛋白无法正常表达，导致其编码蛋白功能的丧失；根据本领域技术人员的公知常识，除了上述基因编辑手段，还可以采用其它基因编辑手段使MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码的蛋白功能同时丧失，例如：移码突变、点突变、缺失或***核苷酸序列等。
优选地，所述方法为同源重组技术。
优选地，所述方法包括如下步骤：
(1)pX330载体优化；通过ClonExpressⅡ一步法克隆法去除pX330载体中Cas9酶两端的核定位信号NLS，命名为pX330ΔN；
(2)设计靶向寡核苷酸181/UK-gRNA-L和181/UK-gRNA-R，将寡核苷酸配对***pX330-ΔN载体中，制备阳性克隆质粒pX330ΔN-181/UKL和pX330ΔN-181/UKR；其中，所述181/UK-gRNA-L的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，181/UK-gRNA-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示；
(3)设计MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因组合片段的上下游序列作为同源重组臂，并同时克隆入pUC19载体中，获得重组转移载体p181/UKLR；
(4)在重组转移载体p181/UKLR左、右臂基因序列中间***eGFP筛选表达盒基因片段p72-eGFP-SV40poly，获得同源重组转移载体p181/UKLR-eGFP；
(5)将同源重组转移载体p181/UKLR-eGFP、pX330ΔN-181/UKL、pX330ΔN-181/UKR和
(6)病毒株筛选：利用181/UK-check-F/R引物对重组病毒株筛选，获得基因片段缺失的减毒非洲猪瘟病毒株Δ181/UK，所述181/UK-check-F/R引物对为的核苷酸序列如SEQID NO.16-17所示。
优选地，所述原始毒株为非洲猪瘟病毒ASFV CN/GS/2018分离株。
优选地，所述减毒非洲猪瘟病毒株相较于原始毒株ASFV CN/GS/2018全长序列缺失了第184062-184456位的核苷酸，所述缺失的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明的另一目的在于提供一种根据上述的方法制备获得的减毒非洲猪瘟病毒株。
本发明的另一目的在于提供一种MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码蛋白的功能联合丧失的非洲猪瘟疫苗。
优选地，还包括CD2v基因、MGF360-12L基因、MGF360-13L基因、MGF360-14L基因或MGF360-505R基因中一种或多种基因编码蛋白的功能丧失。
本发明的有益效果是：本发明通过联合丧失包括MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码蛋白的功能，获得了一种减毒非洲猪瘟病毒株；所述的减毒非洲猪瘟病毒株毒力显著致弱，高剂量不产生发病和致死现象，用此减毒非洲猪瘟毒株免疫后，猪对亲本毒株ASFV CN/GS/2018分离株具有100％保护作用。且与免疫猪同居的猪不存在感染现象，具有良好的安全性能。上述策略为未来成功制备非洲猪瘟疫苗提供了理论依据和实践参考，研究人员可以通过同时丧失MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因及已公开的一种或几种基因(例如CD2v基因、MGF360-12L基因、MGF360-13L基因、MGF360-14L基因、MGF360-505R基因等)编码的蛋白功能，最终制备出安全有效的非洲猪瘟疫苗。
附图说明
图1基因敲除策略示意图；
图2重组毒纯化过程中初始代次(F0)和高代次(F6)的细胞在显微镜下观察的结果，比例尺＝100μm；
图3基因缺失病毒株Δ181/UK纯净度的PCR检测结果，p72为内参基因，NC是以超纯水为模板的结果；
图4基因缺失病毒株Δ181/UK免疫实验的致死结果图，其中，左边为免疫部分，右边为攻毒部分，每条曲线代表一头动物，横坐标分别为免疫后(dpi)天数或攻毒后(dpc)天数，纵坐标为存活率；免疫期间以野生毒株ASFV CN/GS/2018为对照评价Δ181/UK的致病性，攻毒期间以未经过免疫的猪为对照评价Δ181/UK的免疫保护效果；
图5基因缺失病毒株Δ181/UK免疫和攻毒后动物的体温变化图，其中，左边为免疫部分，右边为攻毒部分，每条曲线代表一头动物，横坐标分别为免疫后(dpi)或攻毒后(dpc)天数，纵坐标为体温；亲本ASFV CN/GS/2018分离株作为免疫阶段的对照，未经免疫的猪作为攻毒阶段的对照；
图6基因缺失病毒株Δ181/UK免疫和攻毒后动物的血液带毒结果图，其中，左边为免疫部分，右边为攻毒部分，每条曲线代表一头动物，横坐标分别为免疫后(dpi)或攻毒后(dpc)天数，纵坐标为病毒拷贝数。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。但本发明的保护范围并不局限于以下实施例所述。
以下实施例中所述的实验获得生物安全许可和非洲猪瘟实验室活动许可：
中国农业科学院兰州兽医研究所根据生物安全3级实验室(BSL-3)和非洲猪瘟相关生物安全的相关要求，经兰州兽医研究所生物安全委员会、实验动物伦理委员会、中国农业科学院生物安全委员会、兰州兽医研究所实验动物伦理委员会、兰州兽医研究所生物安全委员会逐级上报，获得农业部关于开展高致病性ASFV病原及动物研究许可，并已在农业农村部备案，符合国家生物安全等级的要求。
以下实施例中所述的实验细胞、病毒以及质粒来源：
原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)及原代骨髓巨噬细胞(BMDM)取自2-4月龄健康SPF巴马小型猪，无菌采集细胞后，用红细胞裂解液(购自Biosharp公司)，去除红细胞，低速离心后，弃上清，将细胞沉淀重悬于含有10％FBS(购自PAN公司)的RPMI 1640完全培养基(购自Gibco公司)中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。BMDM细胞培养需在RPMI 1640完全培养基中额外添加10ng/mL终浓度的重组猪GM-CSF(购自R&D Systems公司)，置于37℃、5％CO2培养箱中诱导，每2-3天洗涤一次，将未贴壁细胞离心后重新加入新的细胞皿中，换液继续诱导，3-7天后冻存或使用。利用PAM细胞扩增ASFV，并进行病毒含量的滴定，BMDM细胞用于质粒转染和病毒重组实验。
ASFV CN/GS/2018分离株来自国家非洲猪瘟区域实验室(兰州)，属于基因Ⅱ型，公众可通过农业部兽医局批示的委托函获得；病毒效价为5×107TCID50/mL，为PAM细胞扩繁后的第4代种毒，分装保存于-80℃备用。
pX330载体、peGFP-N1载体、pUC19载体均购买于兰州瑞博莱生物科技有限公司；无内毒素的质粒提取试剂盒，购于OMEGA公司。
实验中的操作如果没有特别说明均是本领域知晓的操作方法。
定义
术语“蛋白功能丧失”是指通过对编码蛋白的基因进行敲除、突变或在编码蛋白的基因片段中***部分基因，使得基因编码蛋白发生移码突变，导致基因编码蛋白的功能丧失。本发明通过对非洲猪瘟病毒中的MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因的全部或部分核苷酸序列进行敲除，导致MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码蛋白的功能丧失，进而构建了MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒，并用于非洲猪瘟疫苗的生产。由于MGF360-18R基因位于DP71L基因的一端，并与DP71L基因部分重叠(MGF360-18R基因CDS的部分序列及启动子序列)，DP96R基因与DP71L基因的另一端相邻，中间含有部分无基因功能的连接序列，因此可以通过分别缺失MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因的全部核苷酸序列导致其编码蛋白功能的丧失；为了简化操作步骤，也可以通过一次操作缺失MGF360-18R基因的部分序列(CDS的部分序列及启动子序列)、DP71L基因全部核苷酸序列、DP96R基因的部分序列及DP71L基因和DP96R基因之间的无基因功能序列的连接序列，使MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码的蛋白无法正常表达，导致其编码蛋白功能的丧失；根据本领域技术人员的公知常识，除了上述基因编辑手段，还可以采用其它基因编辑手段使MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码的蛋白功能同时丧失，例如：移码突变、点突变、缺失或***核苷酸序列等。
术语“基因缺失”是指缺失染色体上某一区段及其带有的基因一起丢失，从而引起变异的现象，本发明通过缺失MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因的部分或全部核苷酸序列获得了减毒非洲猪瘟重组病毒，降低了亲本毒株的毒性。由于MGF360-18R基因位于DP71L基因的一端，并与DP71L基因部分重叠(MGF360-18R基因CDS的部分序列及启动子序列)，DP96R基因与DP71L基因的另一端相邻，中间含有部分无基因功能的连接序列，因此可以通过分别缺失MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因的全部核苷酸序列导致其编码蛋白功能的丧失；为了简化操作步骤，也可以通过一次操作缺失MGF360-18R基因的部分序列(CDS的部分序列及启动子序列)、DP71L基因全部核苷酸序列、DP96R基因的部分序列及DP71L基因和DP96R基因之间的无基因功能序列的连接序列，使MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码的蛋白无法正常表达，导致其编码蛋白功能的丧失；根据本领域技术人员的公知常识，除了上述基因编辑手段，还可以采用其它基因编辑手段使MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码的蛋白功能同时丧失，例如：移码突变、点突变、缺失或***核苷酸序列等。
术语“基因突变”是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变，就是在一个位点上，突然出现了一个新基因，代替了原有基因，这个基因叫做突变基因，基因突变导致后代的表型中也就突然地出现从未有的新性状。在本发明中通过缺失DP71L基因全部核苷酸序列、并缺失DP96R基因和MGF360-18R基因的部分序列，使MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码的蛋白无法表达，导致其编码蛋白功能的丧失，获得了减毒非洲猪瘟重组病毒，降低亲本毒株的毒性的基础上，本领域技术人员通过将MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因进行全部或部分突变，也能使MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因基因编码的蛋白无法表达，导致其编码蛋白功能的丧失，实现减毒非洲猪瘟重组病毒的构建。
基因缺失的方法一般是指基因敲除，是用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。基因敲除的方法一般包括：同源重组技术、随机***突变技术以及RNA干扰技术；其中，同源重组技术又叫基因打靶，是指外源DNA与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生重组，并整合到预定的位置上，从而改变某些遗传特性的方法，重组的目的是为了敲除某个基因；随机***突变技术是指利用某些能随机***基因序列的病毒、细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机***突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞；RNA干扰技术是指由与生物体内源靶基因mRNA同源的双链RNA特异性引发的靶mRNA降解，导致目的基因表达沉默的一种反向遗传学技术。
本发明虽然仅通过同源重组技术对MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因的部分或全部核苷酸序列进行敲除，但是通过上述随机***突变技术以及RNA干扰技术也能够对MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因的部分或全部核苷酸序列进行敲除，使MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码的蛋白无法表达，导致MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码蛋白的功能丧失。
本发明以ASFV CN/GS/2018分离株为例，本发明所述的MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因为相邻基因，之间还包括间隔序列。其中所述的MGF360-18R基因位于ASFVCN/GS/2018分离株全基因组序列的183372-184085位，所述的DP71L基因位于ASFV CN/GS/2018分离株全基因组序列的184068-184280位，所述的DP96R基因位于ASFV CN/GS/2018分离株全基因组序列的184379-184669位。所述间隔序列不含有任何功能基因序列；本发明中所述缺失的MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因序列位于ASFV CN/GS/2018分离株全基因组序列的184062-184456位(如SEQ ID NO.7所示)，其中包括部分间隔序列。
术语“疫苗”是指能够在动物中提供保护性应答的生物制剂，其中所述疫苗已经被递送并且不能造成严重疾病。本发明的疫苗是遗传工程改造的基因缺失减毒病毒疫苗，其中所述缺失的基因为MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因的全部或部分核苷酸序列，应当理解的是所述缺失的基因还可以包括基因(例如CD2v基因、MGF360-12L基因、MGF360-13L基因、MGF360-14L基因、MGF360-505R基因等)中的任何一种或几种的全部或部分核苷酸序列；突变被理解为在亲本CN/GS/2018ASFV毒株中野生型或未修饰的MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因的遗传信息中的变化。应当理解的是，由MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因突变获得重组突变体也可以作为减毒病毒疫苗。
本发明的减毒非洲猪瘟病毒疫苗，进一步任选地包含一种或多种佐剂，赋形剂，载体和稀释剂。佐剂可以任何合适的佐剂，化学类免疫佐剂如氢氧化铝、弗氏佐剂、矿物油、司盘等；微生物类免疫佐剂如分枝杆菌、脂多糖、胞壁酰二肽、胞肽、脂溶性蜡质D、短小棒状杆菌；植物类免疫佐剂多为从植物或大真菌中提取的多糖类，如茯苓多糖、红花多糖、中草药类等。而生化类免疫佐剂如胸腺肽、转移因子、白细胞介素等。优选的佐剂可以是纳米佐剂生物佐剂，白介素、干扰素等。
本发明公开的疫苗也可被用于制备联合疫苗，如与猪的其他疫苗联合，但重点在减毒活疫苗上，尤其是病毒基因的整合，如双价苗，三价苗等。联合疫苗可以包含不同基因型的多种减毒非猪瘟病毒，如此可以诱导针对多种非猪瘟病毒基因型的交叉保护性免疫应答。
本发明的疫苗的施用可以采用方便的途径，例如肌内注射，鼻内，口服，皮下，透皮和***等途径。本发明的减毒疫苗优选采用肌肉注射。疫苗可以在初免-加强方案后施用。例如，在第一次接种后，受试者可以在一段时间(例如约7，14，21或28天)之后接受第二次加强施用。通常，加强施用的剂量相同或低于初免施用的剂量。此外，也可以进行第三次加强免疫，例如免疫后2-3个月、6个月或一年。
实施例1重组病毒Δ181/UK的构建及纯化鉴定
1.CRISPR/Cas9载体构建
(1)pX330载体优化：由于非洲猪瘟病毒主要在细胞质病毒工厂内复制，因此在构建pCRISPR/Cas9载体时，首先将pX330进行优化；通过ClonExpressⅡ一步法克隆法去除其Cas9酶两端的核定位信号(NLS)，命名为pX330ΔN。
(2)MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因为相邻基因，设计针对DP71L和DP96R基因的靶向gRNAs，其寡核苷酸名称和序列分别为：181/UK-gRNA-L：GCTCCTCCACGCTCGCGATCCGG(SEQ ID NO.8所示)；181/UK-gRNA-R：TTACAGGAAGAATAATGGGGAGG(SEQ ID NO.9所示)。
(3)参照文献(Ran FA,Hsu PD,Wright J,Agarwala V,Scott DA,ZhangF.Genomeengineering using the CRISPR-Cas9 system.Nat Protoc.2013；8(11):2281-2308)推荐的克隆方法，将寡核苷酸181/UK-gRNA-LF和181/UK-gRNA-RF分别***到pX330-ΔN载体中，提取质粒DNA，经测序正确后，分别将阳性克隆质粒命名为：pX330ΔN-181/UKL和pX330ΔN-181/UKR。用无内毒素的质粒提取试剂盒提取DNA，测定浓度，-20℃保存备用。
2.筛选表达盒构建
为了便于筛选，共构建一套筛选标记基因的表达盒，即增强型绿色荧光蛋白(Enhance Green fluorescent protein，eGFP)基因筛选表达盒构建：参照文献(O'DonnellV,Holinka L G,Krug PW,Gladue DP,Carlson J,Sanford B,Alfano M,Kramer E,Lu Z,Arzt J,Reese B,Carrillo C,Risatti GR,BorcaMV.African Swine Fever VirusGeorgia 2007with a Deletion of Virulence-Associated Gene 9GL(B119L),whenAdministered at Low Doses,Leads to Virus Attenuation in Swine and Induces anEffective Protection against Homologous Challenge.JVirol.2015；89(16):8556-66)，通过PCR扩增p72启动子(从p72基因上游的-196nt到+17之前序列)，备用；扩增引物为：正向引5’-TTATAAAACATATGTTCATAAAAAGGGTCGCCGGAGGAAAAGTC-3’(SEQ ID NO.10所示)和反向引物5’-CTCCTCGCCCTTGCTCACCATATATAATGTTATAAAAATAATT-3’(SEQ ID NO.11所示)；以peGFP-N1载体为模板，扩增eGFP基因，备用，扩增引物为：正向引物5’-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’(SEQ ID NO.12所示)和反向引物5’-ACCACAACTAGAATGCAGTG-3’(SEQ ID NO.13所示)；参照文献(Borca MV,Holinka LG,Berggren KA,GladueDP.CRISPR-Cas9,a tool to efficiently increase the development of recombinantAfrican swine fever viruses.Sci Rep.2018；8(1):3154.)，将上述步骤扩增获得的p72启动子和eGFP两个基因通过融合PCR的方法连接，获得eGFP筛选表达盒基因片段，命名为p72-eGFP-SV40polyA，该表达盒序列含SV40polyA终止序列。
3.同源重组转移载体的构建
利用pUC19载体作为骨架载体，构建MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因敲除用同源重组转移载体，所述MGF360-18R基因的核苷酸序如SEQ ID NO.1所示，所述的DP71L基因的核苷酸序如SEQ ID NO.3所示，所述DP96R基因的核苷酸序如SEQ ID NO.5所示，所述的MGF360-18R基因位于ASFV CN/GS/2018分离株全基因组序列的183372-184085位，所述DP71L基因位于ASFV CN/GS/2018分离株全基因组序列的184068-184280位，所述DP96R基因位于ASFV CN/GS/2018分离株全基因组序列的184379-184669位，所述缺失的基因序列位于ASFV CN/GS/2018分离株全基因组序列的184062-184456(如SEQ ID NO.7所示)，构建策略见图1。
具体步骤为：由于MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因为相邻基因，所以设计MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因组合片段(位于ASFV CN/GS/2018分离株全基因组序列的184062-184456)的上下游序列约1.0kb作为同源重组左臂(Left arm，序列如SEQ IDNO.14所示)和右臂(Right arm，序列如SEQ ID NO.15所示)，并分别克隆入pUC19载体中，获得三基因的重组转移载体；在重组转移载体左、右臂基因序列中间***eGFP筛选表达盒基因片段p72-eGFP-SV40poly；经测序正确后，将该同源重组转移载体命名为p181/UKLR-eGFP；用无内毒素的质粒提取试剂盒提取DNA，测定浓度，-20℃保存备用。
4.细胞转染和重组病毒筛选
选取状态良好的骨髓巨噬细胞(BMDM)，接种ASFV CN/GS/2018毒株(MOI＝1.0)，约3-4h更换为正常半量培养基，将同源重组转移载体p181/UKLR-eGFP(2μg)、pX330ΔN-181/UKL(1μg)、pX330ΔN-181/UKR(1μg)和JET PEI-Macrophage DNA转染试剂(12μL)充分混匀，共转染至BMDM细胞，4h后更换为正常量培养基，培养箱培养，24h后即可观察。结果如图2中A和B所示，在荧光显微镜下观察发现，低代次(F0)时，BMDM中只能观察到少量的eGFP信号，随后消化收集细胞，少量培养基重悬后滴加至新的培养皿中，待细胞沉降后，在荧光显微镜下挑取转染孔中单个荧光细胞至96孔板，-80℃反复冻融2次后，接至96孔板单层BMDM细胞中，24h后观察到荧光细胞，证明重组毒基本构建成功。接毒72h后，选择阳性孔按如上步骤挑取单细胞，将剩余的当代次阳性孔重组毒-80℃反复冻融2次后，一分为二接种至预先铺好的96孔板BMDM中，一孔提取病毒基因组DNA，进行检测，另一孔冻存待扩增。具体检测方法如下：利用p72-eGFP定点整合检测引物对进行PCR鉴定，检测p72-eGFP-SV40pA元件是否整合到了目的基因位点。纯净性检测的181/UK-check-F/R引物对为：AAACTACGCTCGCAGCGCAAAAAG(SEQ ID NO.16所示)和ATCCACGACAACTGATTTCTCAGA(SEQ IDNO.17所示)，同时选取病毒基因组中的p72为内参基因，确保所检测病毒基因组的质量合格，针对p72检测的引物分别为p72-F：CCGGGGTATTCGCAGTAGTA(SEQ ID NO.18所示)和p72-R：GCAGCTTCAAACGTTTCCTC(SEQ ID NO.19所示)。
经多次单细胞传代后，在高代次(F6)时荧光显微镜下观察结果如图2中C和D所示，部分孔中荧光细胞数量比例可达100％，为全阳性孔，这说明重组毒构建基本成功。纯净性检测结果如图3所示，其中以ASFV CN/GS/2018分离株为阳性对照，以水为阴性对照，Δ181/UK-#1-2代表Δ181/UK重组病毒，结果表明，这些重组病毒的基因组中均已经检测不到MGF360-18R、DP71L和DP96R基因组合片段，表明MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因组合片段敲除成功；即，本实施例通过缺失了DP71L基因全部核苷酸序列、DP96R基因的绝大部分核苷酸序列，并缺失了与DP71L基因的重叠的MGF360-18R基因的启动子序列，使MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因基因编码的蛋白无法表达，导致其编码蛋白功能的丧失，成功构建了MGF360-18R、DP71L和DP96R基因缺失的减毒重组病毒，并且已纯化，将减毒重组病毒命名为Δ181/UK。
由于MGF360-18R基因位于DP71L基因的一端，并与DP71L基因部分重叠(CDS的部分序列及启动子序列)，DP96R基因与DP71L基因的另一端相邻，中间含有部分无基因功能的连接序列，因此可以通过分别缺失MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因的全部核苷酸序列导致其编码蛋白功能的丧失；为了简化操作步骤，也可以通过一次操作缺失MGF360-18R基因的部分序列(CDS的部分序列及启动子序列)、DP71L基因全部核苷酸序列、DP96R基因的部分序列及DP71L基因和DP96R基因之间的无基因功能序列的连接序列，使MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码的蛋白无法正常表达，导致其编码蛋白功能的丧失；根据本领域技术人员的公知常识，除了上述基因编辑手段，还可以采用其它基因编辑手段使MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码的蛋白功能同时丧失，例如：移码突变、点突变、缺失或***核苷酸序列等。
实施例2病毒滴度的测定
非洲猪瘟病毒的滴度采用半数血细胞吸附量(50％haemadsorption,HAD50)表示，HAD50实验具体操作见文献(Borca MV,Ramirez-Medina E,Silva E,Vuono E,Rai A,Pruitt S,Holinka LG,Velazquez-Salinas L,Zhu J,GladueDP.Development of ahighly effective African swine fever virus vaccine by deletion of the I177Lgene results in sterile immunity against the current epidemic Eurasiastrain.JVirol.2020.pii:JVI.02017-19)，同时对其进行适当调整：在96孔板中按照约1x105/孔细胞接种原代PAM细胞，待检重组毒连续10倍梯度稀释，共7个稀释度，每个稀释度下8孔，按照100μL/孔将稀释毒加至96孔板PAM中，随即加入红细胞，共三次重复。病毒感染可根据红细胞在感染细胞周围聚集形成的花环进行判定，连续观察6天，统计阳性孔数，计算半数血细胞吸附量(HAD50)。滴度测定合格，进行致病性评价。
实施例3基因缺失毒株Δ181/UK的毒力评价
为了检测基因缺失毒株Δ181/UK的毒力，本实验用104HAD50剂量经肌肉注射猪对其毒力进行评价。
本实验用13头非洲猪瘟抗原抗体阴性的健康长白仔猪，共分为3组，其中攻亲本毒株ASFV CN/GS/2018分离株和基因缺失毒株Δ181/UK组各5头，另外3头实验猪为Δ181/UK接毒组的同居对照，攻毒后每天测量体温变化情况，采集外周血和唾液，参照文献(KingDP,Reid SM,Hutchings GH,Grierson SS,Wilkinson PJ,Dixon LK,Bastos AD,DrewTW.2003.Development of a TaqMan PCR assay with internal amplification controlfor the detection of African swine fever virus.J Virol Methods 107:53-61)，通过荧光定量PCR方法测定血液中的ASFV病毒含量，观察至19天终止。统计实验组和对照组动物的致死率和体温变化。存活率实验结果如图4(免疫部分)所示，和体温变化实验结果如图5(免疫部分)所示，亲本毒株经过肌肉注射后，实验猪出现ASFV典型症状，持续高温发热，第5天开始出现死亡，到第7天全部死亡；而基因缺失毒株Δ181/UK经过肌肉注射后，虽然有2头实验猪(总共5头)出现瞬时的高温反应，但最终都下降到正常体温，存活率为100％；并且Δ181/UK同居猪体温正常，并未出现死亡，存活率为100％。
血液中的ASFV病毒含量检测结果如图6(免疫部分)所示，注射亲本毒株ASFV CN/GS/2018分离株的实验猪在接毒后血液中ASFV病毒量急速上升(鉴于第5天已经有实验猪死亡，且其余实验猪出现了明显的非洲猪瘟临床症状，所以接毒第5天以后没有继续采血检测带毒情况)，而注射基因缺失毒株Δ181/UK的实验猪血液带毒量明显减少，并且血液中病毒增殖速度缓慢。此外，Δ181/UK的3头同居实验猪的血液中未检测到明显的带毒情况。
上述实验结果表明，使亲本ASFV CN/GS/2018分离株中MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码蛋白的功能丧失后，获得的基因缺失毒株Δ181/UK的毒力相较于亲本ASFV CN/GS/2018分离株的毒力显著致弱，并且实验动物之间不存在水平传播。
实施例4缺失病毒Δ181/UK的免疫保护效果评价
为了检测基因缺失毒株Δ181/UK的免疫保护效果，本实验用102HAD50剂量的亲本ASFV CN/GS/2018分离株对实施例3中经过基因重组毒株Δ181/UK免疫的5头实验猪和3头未免疫过的实验猪(对照组)进行攻毒。
攻毒后每天测量体温变化情况，采集外周血，观察至13天终止，野生ASFV攻毒后免疫组未出现发热的典型病症，而对照组中实验猪的体温明显升高，体温监测结果如图5(攻毒部分)所示，其中横坐标为攻毒时间，纵坐标为体温，Δ181/UK为重组毒株免疫注射组猪；对照组猪出现ASFV典型症状，持续高温发热，第7天开始出现死亡，到第9天全部死亡；而基因缺失毒株Δ181/UK免疫注射组猪的存活率为100％。这些结果初步说明，在亲本ASFV CN/GS/2018分离株攻毒后，相对于对照组，基因缺失毒株Δ181/UK免疫组中实验猪的体温显著降低，即基因缺失毒株Δ181/UK对亲本ASFV CN/GS/2018分离株具有完全的免疫保护效果。
本实验参照文献(King DP,Reid SM,Hutchings GH,Grierson SS,Wilkinson PJ,Dixon LK,Bastos AD,Drew TW.2003.Development of a TaqMan PCR assay withinternal amplification control for the detection of African swine fevervirus.J Virol Methods 107:53-61)，通过荧光定量PCR方法测定血液中的ASFV病毒含量，对免疫后攻毒阶段的实验动物血液带毒情况进行了检测。从图6(攻毒部分)可知，在免疫后攻毒阶段，未经免疫的对照组猪血液中病毒含量急速升高，而经过Δ181/UK减毒株免疫的猪血液中病毒含量非常低，并且随着时间的推移，有逐步降低的趋势。这些结果进一步说明，基因缺失毒株Δ181/UK对亲本ASFV CN/GS/2018分离株有完全的免疫保护效果。
综上所述，研究人员可以通过同时敲除MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因的部分或全部核苷酸序列以及已公开的一种或几种毒力基因(例如CD2v基因、MGF360-12L基因、MGF360-13L基因、MGF360-14L基因、MGF360-505R基因等)的部分或全部核苷酸序列，使上述基因编码蛋白的功能丧失，最终制备出安全有效的非洲猪瘟疫苗。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 非洲猪瘟基因缺失弱毒株的构建及其作为疫苗的应用
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 714
<212> DNA
<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)
<400> 1
atgttagaaa tagtattggc aacgctgcta ggcgacctgc agcggctccg ggttcttacc 60
cctcagcagc gggcagttgc cttctttcga gccaatacta aggagctaga ggacttctta 120
tgctcagatg ggcagtctga ggaggtactg tctggccccc ttcttaaccg tctactagaa 180
ccctcaggcc ctcttgatat tttaaccgga tatcacctat ttcgtcagaa tcccaaggca 240
ggtcagttgc gcggccttga ggtcaagatg cttgaacggt tatacgatgc taatatttac 300
aatatactgt ctcggctgcg gcctgaaaaa gttcgcaaca aggctattga gctatactgg 360
gttttccgag ctatccatat ttgtcatgct cctttagttt tagatattgt acgatatgag 420
gaaccggact ttgctgaact ggcctttatt tgtgctgctt actttggtga acctcaggta 480
atgtatttgc tctacaaata tatgcctctg acccgcgcag ttcttacgga tgccatccgg 540
ataagtcttg agagcaacaa ccaggtaggg atttgctatg cttacttgat gggaggcagc 600
ctcaagggac tagtctccgc cccactgcgt aaacgtctgc gcgccaaact acgctcgcag 660
cgcaaaaaga aggacgttct ttcaccccac gacttcttac tgctgctcca gtag 714
<210> 2
<211> 237
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)
<400> 2
Met Leu Glu Ile Val Leu Ala Thr Leu Leu Gly Asp Leu Gln Arg Leu
1 5 10 15
Arg Val Leu Thr Pro Gln Gln Arg Ala Val Ala Phe Phe Arg Ala Asn
20 25 30
Thr Lys Glu Leu Glu Asp Phe Leu Cys Ser Asp Gly Gln Ser Glu Glu
35 40 45
Val Leu Ser Gly Pro Leu Leu Asn Arg Leu Leu Glu Pro Ser Gly Pro
50 55 60
Leu Asp Ile Leu Thr Gly Tyr His Leu Phe Arg Gln Asn Pro Lys Ala
65 70 75 80
Gly Gln Leu Arg Gly Leu Glu Val Lys Met Leu Glu Arg Leu Tyr Asp
85 90 95
Ala Asn Ile Tyr Asn Ile Leu Ser Arg Leu Arg Pro Glu Lys Val Arg
100 105 110
Asn Lys Ala Ile Glu Leu Tyr Trp Val Phe Arg Ala Ile His Ile Cys
115 120 125
His Ala Pro Leu Val Leu Asp Ile Val Arg Tyr Glu Glu Pro Asp Phe
130 135 140
Ala Glu Leu Ala Phe Ile Cys Ala Ala Tyr Phe Gly Glu Pro Gln Val
145 150 155 160
Met Tyr Leu Leu Tyr Lys Tyr Met Pro Leu Thr Arg Ala Val Leu Thr
165 170 175
Asp Ala Ile Arg Ile Ser Leu Glu Ser Asn Asn Gln Val Gly Ile Cys
180 185 190
Tyr Ala Tyr Leu Met Gly Gly Ser Leu Lys Gly Leu Val Ser Ala Pro
195 200 205
Leu Arg Lys Arg Leu Arg Ala Lys Leu Arg Ser Gln Arg Lys Lys Lys
210 215 220
Asp Val Leu Ser Pro His Asp Phe Leu Leu Leu Leu Gln
225 230 235
<210> 3
<211> 213
<212> DNA
<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)
<400> 3
ttactgctgc tccagtagct ttttttgccg caggagcacc gcggatagga gctcctccac 60
gctcgcgatc cggcgctgga agcggaaccg atcgaccgcc acctgctccc agggaccctt 120
gcgctcgatg tcgtcggctt cccacacctc gacggctgtg gcaaaatgga catgcttcgc 180
gtcgttcgtc cgttttttgc gccgcctccc cat 213
<210> 4
<211> 70
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)
<400> 4
Met Gly Arg Arg Arg Lys Lys Arg Thr Asn Asp Ala Lys His Val His
1 5 10 15
Phe Ala Thr Ala Val Glu Val Trp Glu Ala Asp Asp Ile Glu Arg Lys
20 25 30
Gly Pro Trp Glu Gln Val Ala Val Asp Arg Phe Arg Phe Gln Arg Arg
35 40 45
Ile Ala Ser Val Glu Glu Leu Leu Ser Ala Val Leu Leu Arg Gln Lys
50 55 60
Lys Leu Leu Glu Gln Gln
65 70
<210> 5
<211> 291
<212> DNA
<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)
<400> 5
atgtctacac atgattgttc tctaaaagag aaaccggttg atatgaacga tatatctgag 60
aaatcagttg tcgtggataa tgcacccgag aaaccagctg gagcgaatca tatacctgag 120
aagtcggccc gcgaaatgac atcatcagaa tggattgctg aatattggaa aggtataaaa 180
cgtggaaatg acgtgccatg ttgttgtcca agaaaaatga ccagtgcaga caaaaagttt 240
tcagtatttg gtaagggatc cctaatgcgc tccatccaga agaataatta a 291
<210> 6
<211> 96
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)
<400> 6
Met Ser Thr His Asp Cys Ser Leu Lys Glu Lys Pro Val Asp Met Asn
1 5 10 15
Asp Ile Ser Glu Lys Ser Val Val Val Asp Asn Ala Pro Glu Lys Pro
20 25 30
Ala Gly Ala Asn His Ile Pro Glu Lys Ser Ala Arg Glu Met Thr Ser
35 40 45
Ser Glu Trp Ile Ala Glu Tyr Trp Lys Gly Ile Lys Arg Gly Asn Asp
50 55 60
Val Pro Cys Cys Cys Pro Arg Lys Met Thr Ser Ala Asp Lys Lys Phe
65 70 75 80
Ser Val Phe Gly Lys Gly Ser Leu Met Arg Ser Ile Gln Lys Asn Asn
85 90 95
<210> 7
<211> 395
<212> DNA
<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)
<400> 7
gacttcttac tgctgctcca gtagcttttt ttgccgcagg agcaccgcgg ataggagctc 60
ctccacgctc gcgatccggc gctggaagcg gaaccgatcg accgccacct gctcccaggg 120
acccttgcgc tcgatgtcgt cggcttccca cacctcgacg gctgtggcaa aatggacatg 180
cttcgcgtcg ttcgtccgtt ttttgcgccg cctccccatt attcttcctg taagattagt 240
gtttaatacc tataataaca taattttaag atttaatata ccaaaactta aactattttt 300
gtatagtaac tattagcatg tctacacatg attgttctct aaaagagaaa ccggttgata 360
tgaacgatat atctgagaaa tcagttgtcg tggat 395
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gctcctccac gctcgcgatc cgg 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttacaggaag aataatgggg agg 23
<210> 10
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttataaaaca tatgttcata aaaagggtcg ccggaggaaa agtc 44
<210> 11
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctcctcgccc ttgctcacca tatataatgt tataaaaata att 43
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atggtgagca agggcgagga g 21
<210> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
accacaacta gaatgcagtg 20
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<212> DNA
<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)
<400> 14
acaagaggaa taggggccat tactaacatt ggctccaaca tcctgttgtc tacaaaaaaa 60
aatatttttt ttagcaaaaa aaaatccatg gaaggatatt aatacacata attatttgac 120
atcacattag tgtacttacc aaatagtaat atacaaccat cctaatattc acctttatga 180
aatgatccca acctatacgg taaaatagta taggttttaa taaagaaaaa agatattctg 240
tggtttttat ttttgtatag tgtgtgaata caaaataaaa tcccaaattt taaccttttc 300
tttttttttc tatacaggat gttagaaata gtattggcaa cgctgctagg cgacctgcag 360
cggctccggg ttcttacccc tcagcagcgg gcagttgcct tctttcgagc caatactaag 420
gagctagagg acttcttatg ctcagatggg cagtctgagg aggtactgtc tggccccctt 480
cttaaccgtc tactagaacc ctcaggccct cttgatattt taaccggata tcacctattt 540
cgtcagaatc ccaaggcagg tcagttgcgc ggccttgagg tcaagatgct tgaacggtta 600
tacgatgcta atatttacaa tatactgtct cggctgcggc ctgaaaaagt tcgcaacaag 660
gctattgagc tatactgggt tttccgagct atccatattt gtcatgctcc tttagtttta 720
gatattgtac gatatgagga accggacttt gctgaactgg cctttatttg tgctgcttac 780
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cttacggatg ccatccggat aagtcttgag agcaacaacc aggtagggat ttgctatgct 900
tacttgatgg gaggcagcct caagggacta gtctccgccc cactgcgtaa acgtctgcgc 960
gccaaactac gctcgcagcg caaaaagaag gacgttcttt caccccac 1008
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<212> DNA
<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)
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acatcatcag aatggattgc tgaatattgg aaaggtataa aacgtggaaa tgacgtgcca 120
tgttgttgtc caagaaaaat gaccagtgca gacaaaaagt tttcagtatt tggtaaggga 180
tccctaatgc gctccatcca gaagaataat taaaaaaaat atttttttta gcaagttttt 240
aaactattta aataaatgtg gtaaaaaaat tcacataata attaaagtga acgtgttaga 300
attaatattt ttttataatc ggatataata tccattaaat caataaatga tagtgttgct 360
accacactaa acaataacaa acagaaacgc acgatacctt tcctcatgat ttataatagc 420
gtgttatcta aagatttttt tgaaaaaaat attaaatttt agttgattat ttttttcagt 480
tacaacattg ctttagaaaa aatacctaat tactacatag caaataaagc gagcgcattg 540
ttacaaacaa catttttttg cgcctggata ctcctatata tgagaactat aatacggtat 600
attaatccta ttaccaacat tgtcaataat agtatgtagg caatgacata ctttaaatac 660
caaatatcca tggttatttc taaaaatctt gaaaaaacgt taaattttag atcggtcacc 720
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<212> DNA
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<211> 24
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atccacgaca actgatttct caga 24
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
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