阅读说明：本技术 表达非洲猪瘟病毒p54、p30、E248R蛋白的重组腺病毒及构建方法 (Recombinant adenovirus expressing African swine fever virus p54, p30 and E248R proteins and construction method ) 是由 周远成 邝声耀 阴文奇 于 2020-06-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种表达非洲猪瘟病毒p54、p30和E248R蛋白的重组腺病毒及构建方法,该重组腺病毒感染细胞后可以同步表达非洲猪瘟p54、p30和E248R蛋白,其中p54和p30蛋白融合表达,E248R通过自裂解2A信号肽与p54和p30串联表达。本发明构建了能同时表达p54、p30和E248R蛋白的重组腺病毒载体,使用该载体与腺病毒骨架系统共转染细胞后获得可表达非洲猪瘟病毒p54、p30和E248R蛋白的重组腺病毒,使用该重组腺病毒免疫试验动物后可以刺激试验动物产生特异性的抗体,为非洲猪瘟疫苗的开发提供了新的试验数据。(The invention discloses a recombinant adenovirus for expressing African swine fever virus p54, p30 and E248R proteins and a construction method thereof, the recombinant adenovirus can synchronously express African swine fever p54, p30 and E248R proteins after infecting cells, wherein the p54 and p30 proteins are fused and expressed, and the E248R is expressed in series with p54 and p30 through self-cleavage 2A signal peptide. The invention constructs a recombinant adenovirus vector capable of simultaneously expressing p54, p30 and E248R proteins, obtains the recombinant adenovirus capable of expressing the proteins of African swine fever virus p54, p30 and E248R after the vector and an adenovirus skeleton system are used for cotransfecting cells, can stimulate a test animal to generate a specific antibody after the test animal is immunized by the recombinant adenovirus, and provides new test data for the development of an African swine fever vaccine.)

表达非洲猪瘟病毒p54、p30、E248R蛋白的重组腺病毒及构建 方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种表达非洲猪瘟病毒p54、p30和E248R蛋白的重组腺病毒载体、重组腺病毒及构建方法。

背景技术

非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)是一种核质大DNA病毒，也是唯一虫媒DNA病毒，可感染家猪和野猪，具有较强的传染性和致病性。猪感染非洲猪瘟的临床症状与猪瘟和猪丹毒等疾病类似，其症状的严重程度与ASFV的毒力、感染计量和感染途径的不同而不同，根据临床症状的严重程度可以分为急性感染、亚急性感染和隐形感染等。急性感染表现为食欲减退、高热、白细胞减少、皮肤以及内脏器官的出血为主要特征，死亡几率较高，有的可达100％。亚急性感染表现为暂时性的血小板和包细胞减少，可观察到出血灶，同时可导致呼吸改变、流产和死亡，死亡率较急性感染低。到目前位置尚无针对非洲猪瘟的特效疫苗和治疗药物，因此国内外均采用强制捕杀的方式处理发病猪群。

非洲猪瘟于2018传入我国，截至目前在全国范围内报道的疫情超过150起。非洲猪瘟的爆发给我国生猪养殖业造成了巨大的经济损失。非洲猪瘟在我国出现的一年多时间内，我国能繁种猪存栏量由疫情出现前的约4000万头降低至最低峰的约1900万头，据不完全按统计，因非洲猪瘟导致的直接和间接经济损失可能超过1万亿元。非洲猪瘟爆发后，国内多个单位开展了非洲猪瘟疫苗研究，包括亚单位疫苗、多肽疫苗和基因缺失疫苗等，但截至目前尚无有效的疫苗问世。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种表达非洲猪瘟病毒p54、p30和E248R蛋白的重组腺病毒载体、重组腺病毒及构建方法。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种编码非洲猪瘟病毒p54、p30和E248R蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列如SEQID NO：1所示。

一种表达非洲猪瘟病毒p54、p30和E248R蛋白的重组腺病毒载体，包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

上述表达非洲猪瘟病毒p54、p30和E248R蛋白的重组腺病毒载体的构建方法，包括以下步骤：人工合成SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，并将其***到pDC316-mCMV-EGFP载体中，制得。

一种表达非洲猪瘟病毒p54、p30和E248R蛋白的重组腺病毒，包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或上述重组腺病毒载体。

上述表达非洲猪瘟病毒p54、p30和E248R蛋白的重组腺病毒的构建方法，包括以下步骤：

(1)人工合成SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，并将其***到pDC316-mCMV-EGFP载体中；

(2)将步骤(1)构建的载体与pBHGloxdelE13cre载体共转染293A细胞后进行培养，制得。

上述重组腺病毒可以用于制备非洲猪瘟疫苗。

本发明提供的表达非洲猪瘟病毒p54、p30和E248R蛋白的重组腺病毒载体、重组腺病毒及构建方法，具有以下有益效果：

本发明构建了能同时表达p54、p30和E248R蛋白的重组腺病毒载体，其中p54和p30蛋白融合表达，E248R通过自裂解2A信号肽与p54和p30串联表达。该载体与腺病毒骨架系统共转染细胞后获得可表达非洲猪瘟病毒p54、p30和E248R蛋白的重组腺病毒，使用该重组腺病毒免疫试验动物后可以刺激试验动物产生特异性的抗体，为非洲猪瘟疫苗的开发提供了新的试验数据。

附图说明

图1为构建的pDC316-54F30-2A-E248R载体的结构图。

图2为制备的重组腺病毒形成的荧光嗜斑结果图。

具体实施方式

实施例1重组腺病毒载体的构建

表达非洲猪瘟病毒p54和p30融合蛋白的氨基酸序列命名为54F30，具体序列见SEQID NO：2，E248R蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO：3，在54F30碳端添加组氨酸标签HHHHHH，在添加了组氨酸标签HHHHHH后的54F30和E248R中间添加T2A自切割信号肽，T2A的氨基酸序列见SEQ ID NO：4。

根据上述氨基酸序列，人工设计能够表达p54、p30和E248R蛋白的核酸序列，该核苷酸序列见SEQ ID NO：1，设计好的核苷酸序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，将合成的序列***到pDC316-mCMV-EGFP载体的NheⅠ和HindⅢ酶切位点之间，构建好的载体命名为pDC316-54F30-2A-E248R，其结构图见图1。

实施例2重组腺病毒的制备

按照常规方法传代293A细胞至12孔板，传代后第二天使用转染试剂(

HD，购于Promega公司)转染pDC316-54F30-2A-E248R质粒和pBHGloxdelE13cre质粒，转染试剂使用6ul，pDC316-54F30-2A-E248R质粒和pBHGloxdelE13cre质粒各1ug。转染后将细胞置37℃，5％二氧化碳培养箱中培养。每日观察细胞状态。转染后12小时可观察到绿色荧光蛋白的表达，转然后7天观察到绿色荧光嗜斑(结果图见图2)。出现荧光斑后继续培养48小时，将细胞置-80℃反复冻融三次，12000rpm离心，-80℃保存，计为ADV 54F30E2 P1代病毒。

按照常规方法传代293A细胞至96孔板中，取-80℃保存的ADV 54F30E2 P1代病毒使用无血清DMEM细胞培养液进行10倍梯度稀释，取10¹-10⁸稀释度的接种于加有293A细胞悬液的培养孔中，每个孔添加100ul病毒稀释液，每个稀释梯度24孔。加入病毒稀释液后置37℃，5％二氧化碳培养箱中培养每日观察。待出现绿色荧光斑后取最低稀释度单荧光斑孔病毒液接种293A进行扩大培养，培养至细胞病变至80％时收获病毒，-80℃反复冻融1次，12000rpm离心5min，取上清分装后-80℃保存，记为ADV 54F30E2 P3代病毒。取ADV 54F30E2P3代病毒按照常规方法接种293A细胞继续培养扩繁至ADV 54F30E2 P5代病毒，所有收获病毒均置于-80℃保存。

实施例3 ADV 54F30E2小量制备和纯化

按常规方法传代293A细胞至T175细胞瓶，待细胞生长成致密单层之后除去细胞培养液，接种0.5ml ADV 54F30E2 P3代病毒，37℃细胞培养箱吸附30分钟，然后往接种后的细胞瓶中加入30ml 2％小牛血清(购于GIBCO公司)的DMEM(购于GIBCO公司)培养液。37℃，5％二氧化碳培养箱中培养。待细胞90％以上细胞出现细胞病变后收获病毒液，12000rpm离心10分钟，取上清加入到100KD超滤离心管中(购于MERCK公司)，5000rpm离心至原来体积的1/10后加入0.1M磷酸盐缓冲液至原体积，5000rpm离心至原体积的1/100，最后按照5：1的比例添加甘油后分装并置于-80℃保存。

实施例4 ADV 54F30E2不同代次以及纯化病毒的病毒含量测定

按照常规方法传代293A细胞至96孔板，置37℃，5％二氧化碳培养箱中培养。取ADV54F30E2 P4、P5代病毒和纯化病毒使用2％血清DMEM进行10倍梯度稀释至10¹⁰，稀释后接种传代的293A细胞，每个稀释度接种8孔。接种后置37℃，5％二氧化碳培养箱中培养6天。将培养后的96孔板置于倒置荧光显微镜下观察各稀释度孔是否出现细胞病变和绿色荧光斑，记录各稀释度细胞绿色荧光斑和细胞病变孔数量，根据Reed-Muench方法计算ADV 54F30E2P4、ADV 54F30E2 P5代和ADV 54F30E2纯化病毒的TCID₅₀分别为10^7.6TCID₅₀/ml、10^8.2TCID₅₀/ml、10^10.5TCID₅₀/ml。

实施例5 ADV 54F30E2重组病毒在小鼠上的体液免疫效果测定

购买6-8周龄SPF级BALB/C小鼠24只(成都达硕生物科技有限公司)，24只小鼠随机分为4组，取纯化后的ADV 54F30E2纯化病毒使用无血清DMEM进行稀释，然后分别注射10⁶TCID₅₀、10⁷TCID₅₀、10⁸TCID₅₀的ADV 54F30E2 P5代病毒，腿部肌肉注射，注射体积均为100ul。免疫前、免疫后2周、免疫后4周采集血清参照北京金诺百泰生物技术有限公司非洲猪瘟抗体检测试剂盒说明书进行抗体检测，在检测时使用HRP-标记的兔抗小鼠二抗(购于生工生物工程(上海)股份有限公司)代替原试剂盒中的酶标抗体。测定结果显示免疫后2周所有免疫小鼠抗体均转为阳性，免疫后4周抗体均高于2周抗体水平，免疫剂量高的小鼠抗体较高(结果见表1所示)，该结果表明ADV 54F30E2可疑诱导针对非洲猪瘟p30蛋白特异性的体液免疫。

表1ADV 54F30E2重组病毒免疫小鼠后p30蛋白抗体测定结果

注：S/P≥0.4判定为阳性，0.4＞S/P＞0.3为可疑，S/P≤0.3判定为阴性。

实施例6 ADV 54F30E2重组病毒免疫仔猪后抗体测定结果

购买4周龄仔猪15头，随机分为3组。第1组肌肉注射10⁸TCID₅₀ ADV54F30E2重组病毒，第2组口服10⁸TCID₅₀ ADV 54F30E2重组病毒，第3组注射等剂量的DMEM培养液作为对照。免疫前、免疫后4周采集血清参照北京金诺百泰生物技术有限公司非洲猪瘟抗体检测试剂盒说明书进行抗体检测。测定结果显示免疫后4周所有免疫了ADV 54F30E2重组病毒p30抗体均为阳性，第1、2、3组抗体结果分别为0.758±0.123、0.665±0.109、0.133±0.089。该结果表明ADV 54F30E2重组病毒使用口服和肌肉注射均能够刺激仔猪产生特异性的体液免疫反应。

序列表

<110> 畜科生物工程有限公司

<120> 表达非洲猪瘟病毒p54、p30、E248R蛋白的重组腺病毒及构建方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2046

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggacttca ttctgaacat cagcatgaag atggaagtga tctttaagac cgacctgaga 60

tccagctccc aggtggtgtt ccacgccggg agcctgtata actggttcag cgtggagatc 120

atcaactccg gccgcatcgt gaccaccgcc atcaagaccc tgctgagcac cgtgaagtac 180

gacatcgtga agagcgcccg gatctacgcc gggcagggct acacagagca ccaggcccag 240

gaggagtgga acatgatcct gcacgtgctg ttcgaggagg agaccgagag cagcgcctcc 300

agcgagaaca tccacgagaa gaacgataac gagaccaatg agtgcaccag cagcttcgag 360

accctgttcg agcaggagcc cagcagcgag gtgcccaaag atagcaagct ctacatgctg 420

gcccagaaga ccgtccagca catcgagcag tacgggaagg cccccgactt caacaaggtc 480

atccgcgccc acaacttcat ccagaccatc tacggcaccc ccctgaagga ggaggagaag 540

gaggtcgtga ggctgatggt catcaagctg ctgaaaaaga aaggcggcag catggccgtg 600

ctgggcctgc tgttctgcct ggtgaccttc cctagctgcg tgctgagcgc ccccccccac 660

gccctgtctg aggccgccgc caaggatagc gagttcttcc agcccgtgta cccccgccac 720

tacggcgagt gcctgagccc cgtgaccacc cccagcttct tcagcaccca catgtatacc 780

atcctgatcg ccatcgtggt gctcgtgatc atcatcatcg tgctgatcta cctgttctcc 840

agccgcaaga agaaggccgc cgccatcgag gaggaggaca tccagttcat caacccctat 900

caggaccagc agtgggtgga ggtgaccccc cagcccggca ccagcaagcc cgccggcgcc 960

accaccgcct ccgtgggcaa gcccgtgacc gggcgccccg ccaccaacag gcctgccacc 1020

aacaagcccg tgaccgacaa cccggtgacc gacaggctcg tgatggccac cggcggccct 1080

gccgccgccg ccgccgcctc cgcccccgcc caccctgccg agccctacac caccgtgacc 1140

acccagaaca ccgcctccca gaccatgagc gccatcgaga acctgaggca gcggaacacc 1200

tacacccaca aagacctgga gaacagcctg caccatcacc accaccacga gggccggggg 1260

agcctgctga cctgcggcga cgtcgaggag aaccctgggc ccggcggcag caccagcaag 1320

aacagcttta agaacaccac caacatcatc agcaacagca tcttcaacca gatgcagagc 1380

tgcatctcca tgctggacgg caagaactac atcggcgtgt tcggcgacgg caacatcctg 1440

aaccacgtgt tccaggacct gaacctgagc ctgaacacca gctgcgtgca gaagcacgtg 1500

aacgaggaga acttcatcac caacctgagc aaccagatca cccagaacct gaaggaccag 1560

gaggtggccc tgacccagtg gatggatgcc ggcacccacg accagaagac cgatatcgag 1620

gagaacatca aggtgaacct gaccaccacc ctgatccaga actgcgtgag cagcctctcc 1680

ggcatgaacg tgctggtggt gaaggggaac ggcaacatcg tggagaacgc tacccagaag 1740

cagagccagc agatcatcag caactgcctg cagggctcca agcaggctat cgacaccacc 1800

accggcatca ccaacaccgt gaaccagtac tcccactaca cctccaagaa cttcttcgac 1860

ttcatcgccg atgccatctc cgccgtcttc aaaaacatca tggtggccgc cgtggtcatc 1920

gtgctgatta tcgtgggatt catcgccgtg ttctacttcc tgcatagccg gcaccgccac 1980

gaggaggagg aggaggccga gcccctgatc agcaacaagg tgctgaagaa cgccgccgtg 2040

agctaa 2046

<210> 2

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Asp Phe Ile Leu Asn Ile Ser Met Lys Met Glu Val Ile Phe Lys

1 5 10 15

Thr Asp Leu Arg Ser Ser Ser Gln Val Val Phe His Ala Gly Ser Leu

20 25 30

Tyr Asn Trp Phe Ser Val Glu Ile Ile Asn Ser Gly Arg Ile Val Thr

35 40 45

Thr Ala Ile Lys Thr Leu Leu Ser Thr Val Lys Tyr Asp Ile Val Lys

50 55 60

Ser Ala Arg Ile Tyr Ala Gly Gln Gly Tyr Thr Glu His Gln Ala Gln

65 70 75 80

Glu Glu Trp Asn Met Ile Leu His Val Leu Phe Glu Glu Glu Thr Glu

85 90 95

Ser Ser Ala Ser Ser Glu Asn Ile His Glu Lys Asn Asp Asn Glu Thr

100 105 110

Asn Glu Cys Thr Ser Ser Phe Glu Thr Leu Phe Glu Gln Glu Pro Ser

115 120 125

Ser Glu Val Pro Lys Asp Ser Lys Leu Tyr Met Leu Ala Gln Lys Thr

130 135 140

Val Gln His Ile Glu Gln Tyr Gly Lys Ala Pro Asp Phe Asn Lys Val

145 150 155 160

Ile Arg Ala His Asn Phe Ile Gln Thr Ile Tyr Gly Thr Pro Leu Lys

165 170 175

Glu Glu Glu Lys Glu Val Val Arg Leu Met Val Ile Lys Leu Leu Lys

180 185 190

Lys Lys Gly Gly Ser Met Ala Val Leu Gly Leu Leu Phe Cys Leu Val

195 200 205

Thr Phe Pro Ser Cys Val Leu Ser Ala Pro Pro His Ala Leu Ser Glu

210 215 220

Ala Ala Ala Lys Asp Ser Glu Phe Phe Gln Pro Val Tyr Pro Arg His

225 230 235 240

Tyr Gly Glu Cys Leu Ser Pro Val Thr Thr Pro Ser Phe Phe Ser Thr

245 250 255

His Met Tyr Thr Ile Leu Ile Ala Ile Val Val Leu Val Ile Ile Ile

260 265 270

Ile Val Leu Ile Tyr Leu Phe Ser Ser Arg Lys Lys Lys Ala Ala Ala

275 280 285

Ile Glu Glu Glu Asp Ile Gln Phe Ile Asn Pro Tyr Gln Asp Gln Gln

290 295 300

Trp Val Glu Val Thr Pro Gln Pro Gly Thr Ser Lys Pro Ala Gly Ala

305 310 315 320

Thr Thr Ala Ser Val Gly Lys Pro Val Thr Gly Arg Pro Ala Thr Asn

325 330 335

Arg Pro Ala Thr Asn Lys Pro Val Thr Asp Asn Pro Val Thr Asp Arg

340 345 350

Leu Val Met Ala Thr Gly Gly Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Ala

355 360 365

Pro Ala His Pro Ala Glu Pro Tyr Thr Thr Val Thr Thr Gln Asn Thr

370 375 380

Ala Ser Gln Thr Met Ser Ala Ile Glu Asn Leu Arg Gln Arg Asn Thr

385 390 395 400

Tyr Thr His Lys Asp Leu Glu Asn Ser Leu

405 410

<210> 3

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gly Gly Ser Thr Ser Lys Asn Ser Phe Lys Asn Thr Thr Asn Ile Ile

1 5 10 15

Ser Asn Ser Ile Phe Asn Gln Met Gln Ser Cys Ile Ser Met Leu Asp

20 25 30

Gly Lys Asn Tyr Ile Gly Val Phe Gly Asp Gly Asn Ile Leu Asn His

35 40 45

Val Phe Gln Asp Leu Asn Leu Ser Leu Asn Thr Ser Cys Val Gln Lys

50 55 60

His Val Asn Glu Glu Asn Phe Ile Thr Asn Leu Ser Asn Gln Ile Thr

65 70 75 80

Gln Asn Leu Lys Asp Gln Glu Val Ala Leu Thr Gln Trp Met Asp Ala

85 90 95

Gly Thr His Asp Gln Lys Thr Asp Ile Glu Glu Asn Ile Lys Val Asn

100 105 110

Leu Thr Thr Thr Leu Ile Gln Asn Cys Val Ser Ser Leu Ser Gly Met

115 120 125

Asn Val Leu Val Val Lys Gly Asn Gly Asn Ile Val Glu Asn Ala Thr

130 135 140

Gln Lys Gln Ser Gln Gln Ile Ile Ser Asn Cys Leu Gln Gly Ser Lys

145 150 155 160

Gln Ala Ile Asp Thr Thr Thr Gly Ile Thr Asn Thr Val Asn Gln Tyr

165 170 175

Ser His Tyr Thr Ser Lys Asn Phe Phe Asp Phe Ile Ala Asp Ala Ile

180 185 190

Ser Ala Val Phe Lys Asn Ile Met Val Ala Ala Val Val Ile Val Leu

195 200 205

Ile Ile Val Gly Phe Ile Ala Val Phe Tyr Phe Leu His Ser Arg His

210 215 220

Arg His Glu Glu Glu Glu Glu Ala Glu Pro Leu Ile Ser Asn Lys Val

225 230 235 240

Leu Lys Asn Ala Ala Val Ser

245

<210> 4

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

1 5 10 15

Gly Pro