一种可溶性猪圆环病毒2型Cap蛋白及应用
阅读说明：本技术 一种可溶性猪圆环病毒2型Cap蛋白及应用 (Soluble porcine circovirus type 2 Cap protein and application thereof ) 是由 于江 吴家强 张玉玉 陈智 孙文博 韩红 杨杰 于 2020-03-13 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物技术中蛋白表达技术领域,特别涉及一种可溶性猪圆环病毒2型Cap蛋白。该可溶性猪圆环病毒2型Cap蛋白制成的铝胶佐剂疫苗比油佐剂疫苗安全效果好,免疫后猪体吸收快,应激小,比201佐剂免疫保护率高。(The invention relates to the technical field of protein expression in biotechnology, in particular to a soluble porcine circovirus type 2 Cap protein. The alumina gel adjuvant vaccine prepared from the soluble porcine circovirus type 2 Cap protein has better safety effect than an oil adjuvant vaccine, the absorption of a immunized pig body is fast, the stress is small, and the immune protection rate is higher than that of an adjuvant 201.)
技术领域
本发明涉及生物技术中蛋白表达技术领域，特别涉及一种可溶性猪圆环病毒2型Cap蛋白，还涉及可溶性猪圆环病毒2型Cap蛋白的应用。
背景技术
猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2，PCV2)是近年来新发现的、危害养猪业较严重的病毒之一，该病毒与猪的多种疾病综合征密切相关，包括猪断奶后多系统衰竭综合征(Post-weaning multi-systemic wasting syndrome，PMWS)和母猪的繁殖障碍(Sowabort ion and mortali ty syndrome，SAMS)等。自1991年加拿大首次报道PMWS以来，该病现已波及世界各地在2010年国际猪兽医大会(IPVS)上，猪圆环病毒感染成为关注度最高的疾病，是全球公认的危害养猪业的重要传染病之一。近年来，国内猪圆环病毒感染呈上升趋势，在我国猪群中流行十分严重，给我国养猪业造成了重大的经济损失。
PCV2基因组全长1767bp或1768bp，共包含11个开放阅读框(ORF)，其中ORF1、ORF2是两个最大的开放阅读框，分别编码复制相关蛋白(Rep蛋白)和衣壳蛋白(Cap蛋白)。Cap蛋白是主要的结构蛋白，研究表明其N端含有一个由41个氨基酸残基组成的核定位信号(NLS)，且含有大量的大肠埃希菌稀有密码子，这将严重影响外源蛋白的表达。相关研究证实，Cap 蛋白免疫动物可以产生病毒的中和抗体。ORF2基因已经作为研制基因工程疫苗的重点对象。但是，目前Cap蛋白在原核表达系统中的表达情况多以包涵体形式表达，对蛋白的纯化带来不便，其反应原性和免疫原性亦不如可溶性蛋白好，因此研制可溶性猪圆环病毒2型Cap蛋白是扩大其免疫应用的一个重要研究方向。
发明内容
为了解决以上现有技术中猪圆环病毒2型Cap蛋白包涵体的问题，本申请提供了一种可溶性猪圆环病毒2型Cap蛋白，表达此可溶性猪圆环病毒2型Cap蛋白的猪圆环病毒2型ORF2 基因。如果蛋白具有可溶性，即可增强活性蛋白的比例，不用再经过蛋白复性等繁琐的过程，而且适合生物制品企业大规模生产。
本发明还提供了可溶性猪圆环病毒2型Cap蛋白的应用。
本发明是通过以下步骤得到的：
一种猪圆环病毒2型ORF2基因，其核苷酸序列见序列表中序列1。
一种序列表中序列1表达得到的可溶性猪圆环病毒2型Cap蛋白。
优选所述的可溶性猪圆环病毒2型Cap蛋白，1L细菌培养液中可溶性猪圆环病毒2型 Cap蛋白表达量为36.75mg。
优选所述的可溶性猪圆环病毒2型Cap蛋白在制备免疫制剂中的应用。
优选所述免疫制剂为猪圆环病毒2型Cap蛋白灭活疫苗。
优选灭活疫苗中佐剂为油佐剂、201佐剂或铝胶佐剂。
优选灭活疫苗中可溶性猪圆环病毒2型Cap蛋白浓度为100ug/ml。
本发明的有益效果：
通过对ORF2基因进行剪接、修饰，将稀有密码子进行优化，得到优化后的猪圆环病毒2型 ORF2基因，其表达的猪圆环病毒2型Cap蛋白具有可溶性，增强了活性蛋白的比例，不用再经过蛋白复性等繁琐的过程，而且适合生物制品企业大规模生产。该可溶性猪圆环病毒2 型Cap蛋白制成的铝胶佐剂疫苗比油佐剂疫苗安全效果好，免疫后猪体吸收快，应激小，比 201佐剂免疫保护率高。
附图说明
图1为目的基因优化前后核苷酸序列对比图，上为优化前序列，下为优化后序列，
图2重组质粒酶切鉴定结果，M：DL2000 Marker；1：BL21(DE3)重组质粒；2：BL21Star (DE3)重组质粒；3：Rosetta重组质粒；
图3为重组质粒的PCR鉴定结果，M：DL2000 Marker；1：BL21(DE3)重组质粒；2：BL21Star(DE3)重组质粒；3：Rosetta重组质粒；
图4为SDS-PAGE分析Cap蛋白于BL21(DE3)、BL21 Star(DE3)和Rosetta中全菌表达情况，M：蛋白Marker；1：pET-30a载体；2：0.1mM IPTG，15℃，16小时，BL21(DE3)； 3：0.1mMIPTG，37℃，16小时，BL21(DE3)；4：0.25mM IPTG，37℃，16小时，BL21 (DE3)；5：0.25mMIPTG，37℃，4小时，BL21(DE3)；6：0.1mM IPTG，15℃，16小时，BL21 Star(DE3)；7：0.1mMIPTG，37℃，16小时，BL21 Star(DE3)；8：0.25mM IPTG， 37℃，16小时，BL21 Star(DE3)；9：0.25mM IPTG，37℃，4小时，BL21 Star(DE3)； 10：0.1mM IPTG，15℃，16小时，Rosetta；11：0.1mM IPTG，37℃，16小时，Rosetta；12： 0.25mM IPTG，37℃，16小时，Rosetta；13：0.25mMIPTG，37℃，4小时，Rosetta；
图5为SDS-PAGE分析Cap蛋白于BL21(DE3)、BL21 Star(DE3)和Rosetta中表达分析结果，A：上清表达情况；B：包涵体表达情况，M：蛋白Marker；1：pET-30a载体；2：0.1mM IPTG，15℃，16小时，BL21(DE3)；3：0.1mM IPTG，37℃，16小时，BL21(DE3)；4： 0.25mM IPTG，37℃，16小时，BL21(DE3)；5：0.25mM IPTG，37℃，4小时，BL21(DE3)； 6：0.1mM IPTG，15℃，16小时，BL21 Star(DE3)；7：0.1mM IPTG，37℃，16小时，BL21 Star(DE3)；8：0.25mM IPTG，37℃，16小时，BL21 Star(DE3)；9：0.25mM IPTG，37℃，4小时，BL21 Star(DE3)；10：0.1mM IPTG，15℃，16小时，Rosetta；11：0.1mM IPTG， 37℃，16小时，Rosetta；12：0.25mM IPTG，37℃，16小时，Rosetta；13：0.25mM IPTG， 37℃，4小时，Rosetta；
图6为SDS-PAGE分析Cap蛋白上清纯化结果，M：蛋白Marker；1：全菌破菌离心后上清； 2：上清同Ni-IDA孵育后流出液；3：50mM咪唑的洗脱组分；4：100mM咪唑的洗脱组分； 5：500mM咪唑的洗脱组分；
图7为重组蛋白鉴定结果，A：SDS-PAGE鉴定；B：Western-blot鉴定；M1：SDS-PAGEMarker； M2：Western-blot Marker；1：BSA(1.5μg)；2：目的蛋白(1.5μg)；
图8为平均相对日增重结果；
图9为免疫组化检测结果，A：攻毒组；B：空白对照组；C：油佐剂组；D：201佐剂组；E：铝胶佐剂组；
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：
实施例1
1.1目的基因的扩增
根据PCV2 SD毒株(GenBank:HM776450.1)的序列，对ORF2基因进行剪接、修饰，将稀有密码子进行优化，优化后的基因两端分别加上NdeI和HindIII酶切位点，序列由南京德泰生物科技有限公司合成。优化合成的ORF2基因如序列表中序列1所示，未优化的ORF2基因如序列表中序列2所示，两段基因对比如图1所示，其中，上为优化前序列，下为优化后序列。主要优化思路为将基因序列中的CCC、CCA或CCT优化为CCG，CGC或AGA优化为CGT， ACT、ACA或ACG优化为ACC，CTT、CTC或CTA优化为CTG，TCC或AGT优化为AGC等。
1.2目的基因的克隆
将合成的序列与pEASY-Blunt克隆载体连接，并转化DH5α感受态细胞，挑选转化长出的菌落进行单克隆培养，提取质粒进行PCR鉴定，并将阳性质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定，鉴定正确的质粒命名为pEAST-Cap。
1.3 Cap蛋白原核表达载体的构建
将上述鉴定正确的阳性质粒pEASY-Cap和原核表达载体pET-30a分别用限制性核酸内切酶NdeI和HindIII酶切，用凝胶回收试剂盒回收后，用T4连接酶16℃连接过夜，分别转化至BL21 (DE3)、BL21 Star(DE3)和Rosetta感受态细胞中，挑选转化长出的菌落进行单克隆培养，提取三种阳性质粒分别进行酶切鉴定。
三种重组质粒经NdeI和HindIII双酶切均可切下一条约为600bp的特异性条带(图2)，用引物对三种重组质粒进行PCR扩增，同样可得一条约600bp的目的条带(图3)。两者均与预期结果相符。说明三种阳性重组菌均构建成功。
1.4重组菌表达条件的优化
用无菌接种环蘸取三种阳性重组菌菌液，分别划线于LB固体培养基，37℃培养12～ 14小时，挑取单菌落转接至LB液体培养基中，于37℃恒温振荡摇床培养过夜。
1.4.1诱导温度的优化
将过夜培养的3种重组菌分别按2％的比例接种于LB液体培养基，于37℃恒温摇床培养。当OD600值达到0.6～0.8时，加入终浓度为0.1mM的IPTG后，每种重组菌用吸管吸取菌液分装至2支试管中，每支试管分装10mL，分别转移至15℃和37℃恒温振荡摇床，180r/min振荡培养16小时。取不同温度诱导后的菌液离心，弃上清液，菌体沉淀用1mL PBS(0.01mol/L， pH值为7.4)悬浮，加SDS-PAGE上样缓冲液混匀后，沸水煮10min，进行SDS-PAGE分析，确定诱导重组菌的最佳温度。
1.4.2诱导时间的优化
将过夜培养的3种重组菌分别按2％的比例接种于LB液体培养基，于37℃恒温摇床培养。当OD600值达到0.6～0.8时，加入终浓度为0.25mM的IPTG后，每种重组菌用吸管吸取菌液分装至2支试管中，每支试管分装10mL，分别转移至37℃恒温振荡摇床，180r/min振荡培养 16小时或4小时。取不同时间诱导后的菌液离心，弃上清液，菌体沉淀用1mL PBS(0.01mol /L，pH值7.4)悬浮，加SDS-PAGE上样缓冲液混匀后，沸水煮10min，进行SDS-PAGE分析，确定诱导重组菌的最佳温度。
1.4.3 IPTG浓度的优化
将过夜培养的3种重组菌分别按2％的比例接种于LB液体培养基，于37℃恒温摇床培养。当OD600值达到0.6～0.8时，每种重组菌用吸管吸取菌液分装至2支试管中，每支试管分装10 mL，分别加入终浓度为0.1mM和0.25mM的IPTG后，转移至37℃恒温振荡摇床，180r/min 振荡培养16小时。取不同IPTG浓度诱导后的菌液离心，弃上清液，菌体沉淀用1mL PBS(0.01 mol/L，pH值7.4)悬浮，加SDS-PAGE上样缓冲液混匀后，沸水煮10min，进行SDS-PAGE分析，确定诱导重组菌的最佳IPTG诱导浓度。
经SDS-PAGE分析表明，三种重组质粒经IPTG诱导后均可获得分子质量大约为29kDa的蛋白，而空pET-30a菌体在29kDa附近没有出现目的蛋白条带，与预计结果相符(图4)。最佳诱导温度为37℃，最佳诱导时间为16小时，最佳IPTG诱导浓度为0.1mM(图4)。
1.5重组蛋白的表达分析
将诱导表达的菌体，4℃6000r/min离心5min，去除上清液，收集菌体，称重，按照10mL/g 的菌体加入50mM Tris(pH值8.0)，150mM NaCl含1％Triton X-100，1μg/mLPepstin A，1μg/mL Leupeptin，混合均匀后超声波破碎。破碎后，将样品离心，分别向上清和沉淀中加入SDS-PAGE 上样缓冲液，混匀后，沸水煮10min，进行SDS-PAGE分析。
经SDS-PAGE分析表明，三种重组菌的Cap蛋白在上清和沉淀中均有表达，但采用BL21 Star(DE3)感受态，0.1mM IPTG，37℃诱导16小时的试验条件下，上清中Cap蛋白表达量相对较高(图5)，将该重组菌命名为pET-Cap。
1.6重组蛋白的纯化
将诱导表达效果好的重组菌菌体，4℃6000rpm离心5min，去除上清液，收集菌体，采用50mM Tris(pH值8.0)，150mM NaCl含1％Triton X-100，1μg/mL Pepstin A，1μg/mLLeupeptin 超声裂解，同时以50mM Tris(pH8.0)，150mM NaCl，20mM咪唑缓冲液平衡Ni-IDA亲和层析柱，之后分别用含50mM、100mM、500mM咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，收集上述目标蛋白将其透析到1×PBS，10％Glycerol，pH值8.0中，透析结束后用0.22μm膜过滤，样品进行SDS-PAGE分析检测。
经Ni-IDA亲和层析纯化BL21 Star(DE3)感受态表达的Cap蛋白，结果表明目的蛋白 Cap蛋白主要存在于含500mM咪唑的平衡缓冲液中(图6)。
1.7重组蛋白的定量
目的蛋白浓缩后用BCA蛋白定量试剂盒定量，通过Imagej软件确定目的蛋白占总蛋白的比例。
采用BCA蛋白定量试剂盒定量测定蛋白总浓度，换算出40mL培养液中表达于上清样品的总蛋白含量约为4.04mg。Imagej软件分析结果显示目的蛋白占总蛋白的比例为36.483％，即40mL细菌培养液中表达于上清样品的目的蛋白含量为1.47mg，可估算1L细菌培养液目的蛋白表达量为36.75mg。
1.8重组蛋白的鉴定
收集目的蛋白洗脱液，用SDA-PAGE检测蛋白纯度，同时通过Western blot方法鉴定目的蛋白是否单一，一抗采用PCV2单克隆抗体，二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG。
收集目的蛋白洗脱液，用SDA-PAGE检测蛋白纯度，结果发现纯化的蛋白目的条带单一 (图7中A)。以PCV2单克隆抗体作为一抗时，目的蛋白在约29kDa处均出现明显条带(图7中B)。结果表明，重组Cap蛋白表达成功，能与PCV2单克隆抗体发生特异性反应，具有良好的反应原性。蛋白氨基酸序列见序列表中序列3。
实施例2
本实施例将比较三种不同佐剂(油佐剂、201佐剂、铝胶佐剂)猪圆环病毒2型Cap蛋白灭活疫苗的免疫保护效果，以此选择一种免疫保护效果最佳的佐剂。
1、试验动物筛选
选取猪蓝耳病病毒抗原、抗体均阴性，猪圆环病毒2型抗原、抗体均阴性的10～14日龄易感仔猪65头，进行耳标标号。
2、安全性试验
将40头10～14日龄健康易感仔猪随机分为4组，油佐剂组10头(其中疫苗中Cap蛋白浓度为100ug/ml)、201佐剂组10头(其中疫苗中Cap蛋白浓度为100ug/m)、铝胶佐剂组10头(其中疫苗中Cap蛋白浓度为100ug/ml)，空白对照组10头。除空白对照组外，其他3组均在10～14 日龄颈部肌肉免疫疫苗1.0ml/头，空白对照组颈部肌肉注射1.0ml/头PBS作为对照，间隔14日以相同剂量相同途径重复免疫1次，接种后观察2周，记录试验猪临床症状、体温及注射局部变化等。观察结束后，每组随机抽1头仔猪进行剖检，观察器官病变。
分别对应用油佐剂、201佐剂、铝胶佐剂疫苗进行2次重复免疫的仔猪连续观察2周，试验猪的精神、呼吸、体温、食欲均正常，油佐剂组有2头仔猪注射部位未完全吸收，其余仔猪注射局部未出现肿胀和坏死，仔猪剖检内脏器官无明显病理变化。试验结果说明201佐剂和铝胶佐剂对仔猪单剂量重复接种安全。具体结果见表1。
表1单剂量重复接种不同疫苗对仔猪的安全试验
注：a表示仔猪出现食欲减退、精神沉郁、体温升高、咳嗽、呼吸困难和被毛粗乱等临床症状；
b表示注射局部出现肿胀和坏死。
3、效力试验
3.1免疫
10～14日龄健康易感仔猪25头，分为油佐剂组5头(其中疫苗中Cap蛋白浓度为100ug/ml)、201佐剂组5头(其中疫苗中Cap蛋白浓度为100ug/m)、铝胶佐剂组5头(其中疫苗中Cap蛋白浓度为100ug/ml)，攻毒组5头，空白对照组5头。除攻毒组和空白对照组外，其余3组猪只均在10～14日龄颈部肌肉免疫疫苗1.0ml/头，攻毒组和空白对照组颈部肌肉注射1.0ml/头PBS。首免后14天，相同剂量相同途径加强免疫1次。
表2试验动物分组情况
3.2攻毒
二免后第18日，对油佐剂组、201佐剂组、铝胶佐剂组各5头试验猪，分别在每头仔猪两侧腋下及两臀部肌肉注射弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白(KLH/ICFA，0.5mg/ml)， 4.0ml/头，腹腔注射巯基乙酸培养基，10ml/头。二免后第21日，对所有猪称重，用PCV2BZ 毒株病毒液(病毒含量为106.0TCID50/ml)对油佐剂组、201佐剂组、铝胶佐剂组和攻毒组的每头猪滴鼻2.0ml(每个鼻孔1ml)、肌肉注射2.0ml。攻毒后第4日，分别在每头攻毒猪的两侧腋下及两臀部肌肉注射弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白(KLH/ICFA，0.5mg/ml)，4.0ml/头，腹腔注射巯基乙酸培养基10.0ml/头；攻毒后第11、19日，对每头攻毒猪再次腹腔注射巯基乙酸培养基，10.0ml/头，每组隔离观察28日。攻毒后每日定时测体温，第28日逐头采血、称重后扑杀剖检，取腹股沟和肠系膜淋巴结进行免疫组化。根据体温变化、平均相对日增重比较、血清病毒血症检测及免疫组化检测结果进行发病判定(符合上述4项中的任意2项，即判为发病)。
3.3效力试验结果
3.3.1临床观察免疫前后，各组仔猪精神、食欲、体温均正常，无不良反应。攻毒后，油佐剂组第8日有1头表现食欲减退的症状，且连续2日超过40.0℃，发热猪体温恢复正常后采食量、精神状况也逐步恢复正常；201佐剂组仔猪第7日有1头表现食欲减退、精神不振等临床症状，且连续2日超过40.0℃，发热猪体温恢复正常后采食量、精神状况也逐步恢复正常；第8日有1头表现食欲减退、精神不振等临床症状，且体温超过40.0℃，但仅持续1日；非免疫攻毒组仔猪第6日有1头表现食欲减退、精神不振等临床症状，且连续3日超过40.0℃，第8日有2头表现食欲减退、精神不振等临床症状，且连续2日超过40.0℃，发热猪体温恢复正常后采食量、精神状况也逐步恢复正常；而铝胶佐剂组和空白对照组仔猪在整个试验期间临床表现和体温均正常。
3.3.2平均相对日增重免疫前与攻毒前各组仔猪平均初重无显著差异(P>0.05)。攻毒后 28日平均末重之间、平均相对日增重之间比较：油佐剂组、铝胶佐剂组和空白对照组之间差异不显著(P>0.05)，与非免疫攻毒组之间差异显著(P<0.05)；非免疫攻毒组与空白对照组之间差异显著(P<0.05)(表3、图8)。
表3免疫攻毒后仔猪相对日增重变化
注：同列不同字母之间表示差异显著(P＜0.05)。
平均初重：攻毒前各组猪平均体重；平均末重：攻毒后28日各组猪平均体重；平均相对日增重：攻毒前后各组猪相对日增重的平均数，每头猪相对日增重＝(攻毒后体重-攻毒前体重)÷(攻毒前体重×28)
3.3.3血清病毒血症检测免疫前、免疫后、攻毒前各组仔猪血清中均未检测到病毒。攻毒后第28日铝胶佐剂组未检出PCV2病毒，油佐剂组和201佐剂组仍有1头仔猪检测到PCV2病毒；而非免疫攻毒组在攻毒后整个过程中有4头持续存在病毒血症；空白对照组始终未检测到PCV2病毒。
3.3.4免疫组化检测如图9所示，免疫组仔猪淋巴结中均未见黄染颗粒物质，即无PCV2病毒感染；非免疫攻毒组有4头仔猪淋巴结中可见棕黄色着染，即有PCV2病毒感染；空白对照组5头仔猪淋巴结均未见棕黄色着染，即为PCV2阴性。
综合上述体温变化、相对日增重比较、血清病毒血症检测、免疫组化检测结果，表明将 PCV2 Cap蛋白油佐剂组、201佐剂组、铝胶佐剂疫苗(蛋白含量为100μg/ml)免疫仔猪，油佐剂组攻毒保护率为100％，201佐剂组攻毒保护率为80％，铝胶佐剂组攻毒保护率为100％ (表4)。上述结果表明用PCV2 Cap蛋白油佐剂组和铝胶佐剂组疫苗均有良好的免疫原性。
表4不同佐剂PCV2 Cap蛋白基因工程亚单位疫苗免疫原性试验结果
根据安全性试验结果和效力试验结果综合分析，铝胶佐剂组PCV2 Cap蛋白基因工程亚单位疫苗的效果比201佐剂组和油佐剂组好。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 山东省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 一种可溶性猪圆环病毒2型Cap蛋白及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 702
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 1
atgacctacc cgcgtcgtcg ttatcgtcgt cgtcgtcatc gtccgcgtag tcatctgggt 60
caaattctgc gtcgtcgtcc gtggctggtt catccgcgtc atcgttatcg ttggcgtcgc 120
aaaaacggca tcttcaatac ccgtctgagc cgtaccattg gctataccgt taaaaagacc 180
accgttcgta ccccgagttg gaacgtcgac atgatgcgct tcaacatcaa cgattttctg 240
ccgccgggcg gcggttctaa cccgctgacc gttccgtttg aatactaccg catccgcaaa 300
gtcaaagtcg aattctggcc gtgtagtccg attacccaag gcgatcgtgg cgttggtagt 360
accgcagtta ttctggacga caactttgtt accaaagcga acgcgctgac ctacgatccg 420
tacgttaact acagcagccg tcataccatt acccaaccgt ttagctacca cagccgttat 480
tttaccccga aaccggttct ggatcgcacc atcgattact tccagccgaa caacaaacgc 540
aaccaactgt ggctgcgtct gcaaaccacc ggtaacgttg atcacgttgg tctgggtacc 600
gcatttgaaa acagcatcta cgaccaggac tacaacatcc gcatcaccat gtacgtccag 660
ttccgcgagt tcaacctgaa agatccgccg ctgaatccgt aa 702
<210> 2
<211> 702
<212> DNA
<213> 猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2)
<400> 2
atgacgtatc caaggaggcg ttaccggaga agaagacacc gcccccgcag ccatcttggc 60
cagatcctcc gccgccgccc ctggctcgtc cacccccgcc accgttaccg ctggagaagg 120
aaaaatggca tcttcaacac ccgcctctcc cgcaccatcg gttatactgt caagaaaacc 180
acagtcagaa cgccctcctg gaatgtggac atgatgagat ttaatattaa tgattttctt 240
cccccaggag ggggctcaaa ccccctcact gtgccctttg aatactacag aataaggaag 300
gttaaggttg aattctggcc ctgctcccca atcacccagg gtgacagggg agtgggctcc 360
actgctgtta ttctagatga taactttgta acaaaggcca atgccctaac ctatgacccc 420
tatgtaaact actcctcccg ccataccata acccagccct tctcctacca ctcccggtac 480
tttaccccga aacctgtcct tgataggaca atcgattact tccaacccaa taacaaaaga 540
aatcaactct ggctgagact acaaactact ggaaatgtag accatgtagg cctcggcact 600
gcgttcgaaa acagtatata cgaccaggac tacaatatcc gtataaccat gtatgtacaa 660
ttcagagaat ttaatcttaa agacccccca cttaaccctt aa 702
<210> 3
<211> 233
<212> PRT
<213> 猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2)
<400> 3
Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg
1 5 10 15
Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro
20 25 30
Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg
35 40 45
Leu Ser Arg Thr Ile Gly Tyr Thr Val Lys Lys Thr Thr Val Arg Thr
50 55 60
Pro Ser Trp Asn Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu
65 70 75 80
Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Leu Thr Val Pro Phe Glu Tyr Tyr
85 90 95
Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr
100 105 110
Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn
115 120 125
Phe Val Thr Lys Ala Asn Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr
130 135 140
Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr
145 150 155 160
Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Arg Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro
165 170 175
Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Thr Gly Asn
180 185 190
Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp
195 200 205
Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Ile Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe
210 215 220
Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro
225 230