CvBV3-3基因在降低昆虫体液免疫反应中的应用

文档序号：1638985 发布日期：2020-01-17 浏览：18次 >En<

阅读说明：本技术 CvBV3-3基因在降低昆虫体液免疫反应中的应用 (Application of CvBV3-3 gene in reducing humoral immune response of insect ) 是由陈学新王泽华黄健华时敏王知知于 2019-10-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了CvBV3-3基因在降低果蝇体液免疫反应中的应用,该CvBV3-3基因是菜蛾盘绒茧蜂多分DNA病毒的35个基因组片段中的第3个环上的第3个基因,碱基序列如SEQ ID NO.1所示。本发明利用转基因技术,将菜蛾盘绒茧蜂多分DNA病毒基因CvBV3-3转入果蝇基因组,获得了稳定遗传、纯合体的转基因果蝇品系；利用UAS/GAL4系统,纯合体的CvBV3-3转基因果蝇与BS8700果蝇品系进行杂交,得到的品系表达多分DNA病毒基因后,发现能够抑制昆虫血淋巴的黑化活力以及降低果蝇幼虫体内对寄生蜂幼虫的包囊作用,在受到病原物侵染时,具有明显的免疫力低的性状,在对研究昆虫免疫相关机制、增强人类免疫类药剂的筛选等方面有重要意义。(The invention discloses an application of a CvBV3-3 gene in reducing the humoral immune response of drosophila melanogaster, wherein the CvBV3-3 gene is the 3 rd gene on the 3 rd ring in 35 genome segments of plutella xylostella coilia multi-component DNA virus, and the base sequence is shown as SEQ ID NO. 1. The invention uses the transgenic technology to transfer plutella xylostella cotesia xylostella multi-DNA virus gene CvBV3-3 into the drosophila melanogaster genome, so as to obtain a transgenic drosophila melanogaster strain with stable heredity and homozygote; by utilizing a UAS/GAL4 system, the homozygous CvBV3-3 transgenic drosophila melanogaster is hybridized with the BS8700 drosophila melanogaster strain, and after the obtained strain expresses multi-component DNA virus genes, the blackening activity of insect hemolymph can be inhibited, the encapsulation effect of the drosophila melanogaster larva in vivo on parasitic wasp larva is reduced, and the drosophila melanogaster has the obvious character of low immunity when being infected by pathogens, and has important significance in the aspects of researching insect immunity related mechanisms, enhancing the screening of human immunity medicaments and the like.)

技术领域

本发明涉及分子生物学和基因工程技术领域，尤其涉及CvBV3-3基因在降低昆虫体液免疫反应中的应用。

背景技术

昆虫属于无脊椎动物中的节肢动物，是地球上数量最多的动物群体。目前，已知的昆虫有100余万种，它们形态各异，数量巨大，与农业生产和人类健康息息相关。对昆虫的研究，不仅能丰富人类对自然界的认识，还有助于解决实际生产和人类疾病防控中所面临的重大问题。尤其是对昆虫免疫的基础研究和应用研究一直都是热点，通过实验来研究与昆虫免疫相关的机制、信号等问题，对害虫防治、益虫防病、药物开发、研究人类免疫机制等有着非常重要的现实意义。

昆虫在长期进化过程中形成一套独特的天然免疫系统，包括细胞免疫(cellularimmunity)和体液免疫(humoral immunity)，两者既有区别、又相互联系(Lavine,M.D.andM.R.Strand(2002)."Insect hemocytes and their role in immunity."InsectBiochemistry and Molecular Biology 32(10):1295-1309；Tsakas,S.and V.J.Marmaras(2010)."Insect immunity and its signalling:An overview."Invertebrate SurvivalJournal7(2):228-238；Grizanova,E.V.,I.M.Dubovskiy,M.M.A.Whitten and V.V.Glupov(2014)."Contributions of cellular and humoral immunity of Galleria mellonellalarvae in defence against oral infection by Bacillus thuringiensis."Journalof Invertebrate Pathology119:40-46)。昆虫的细胞免疫是由昆虫血细胞介导完成的，主要包括吞噬、包囊和结节作用(Schmidt,O.,U.Theopold and M.Strand(2001)."Innateimmunity and its evasion and suppression by hymenopteran endoparasitoids."BioEssays 23(4):344-351；Wu,S.and E.J.Ling(2009)."Phagocytosis,nodulation andencapsulation in cellular immune responses in insects."Acta EntomologicaSinica 52(7):791-798)。昆虫的体液免疫和细胞免疫常常是伴随发生的。昆虫的体液免疫是从病原物的识别到抗菌肽(antimicrobial peptides,AMP)和黑色素(melanin)的产生，最终通过产生的抗菌肽或黑化反应破坏外来的病原物或异物(Lowenberger,C.(2001)."Innate immune response of Aedes aegypti."Insect Biochemistry and MolecularBiology 31(3):219-229,Blandin,S.and E.A.Levashina(2004)."Thioester-containingproteins and insect immunity."Molecular Immunology 40(12):903-908,Imler,J.L.and P.Bulet(2005).Antimicrobial peptides in Drosophila:Structures,activities and gene regulation.Chemical Immunology Allergy.D.Kabelitz andJ.M.Schroder.86:1-21)。

目前，对昆虫免疫的研究主要集中在昆虫抗药性的发生和天敌对昆虫的免疫抑制。昆虫抗药性是指在昆虫群体中发展起来的、能够耐受杀死正常种群大多数个体的药量的能力。长期以来，由于杀虫剂的选择作用，许多昆虫对杀虫剂产生了不同程度的抗药性。而自然界中的天敌生物，尤其是寄生蜂能有效控制害虫，通过抑制寄主昆虫的免疫系统，完成寄生。对天敌抑制寄主免疫的深入研究，不仅能开发昆虫防治的有效措施和途径，优化害虫生物防治，大幅度减少化学农药的使用，对于确保我国可持续农业稳健发展有着深远的现实意义。

多分DNA病毒(polydnavirus，PDV)分为茧蜂病毒(bracovirus，BV)和姬蜂(Ichnovirus，IV)病毒(Turnbull,M.and B.Webb(2002).Perspectives on polydnavirusorigins and evolution.Advances in Virus Research,Academic Press.58:203-254)。PDV是寄生蜂专性共生的特殊病毒，在寄生蜂产卵时被注射到鳞翅目寄主幼虫体内，是帮助寄生蜂成功寄生的重要寄生因子(Bai,S.,X.Chen,J.Cheng,W.Fu and J.He(2005)."Effects of wasp-associated factors of Cotesia plutellae on growth anddevelopment of Plutella xylostella larvae."Acta Phytophylacica Sinica 32(3):235-240)。其主要生理功能是抑制寄主的免疫(Dupuy,C.,E.Huguet and J.M.Drezen(2006)."Unfolding the evolutionary story of polydnaviruses."Virus Research117(1):81-89；Strand,M.R.and G.R.Burke(2012)."Polydnaviruses as symbionts andgene delivery systems."PLoS Pathogens 8(7))。菜蛾盘绒茧蜂多分DNA病毒(CvBV)是国内研究较多的一种多分DNA病毒，共有35个环状DNA组成，编码157个毒性基因(Chen,Y.F.,F.Gao,X.Q.Ye,S.J.Wei,M.Shi,H.J.Zheng and X.X.Chen(2011)."Deep sequencing ofCotesia vestalis bracovirus reveals the complexity of a polydnavirus genome."Virology 414(1):42-50.)。CvBV进入寄主小菜蛾后，CvBV基因迅速表达毒性蛋白抑制小菜蛾的免疫反应。因此，有必要对CvBV基因做更进一步地深入研究。

发明内容

本发明发现了CvBV3-3基因在降低昆虫体液免疫反应和制备免疫低下型果蝇中的新用途。

具体技术方案如下：

CvBV3-3基因是菜蛾盘绒茧蜂多分DNA病毒的35个基因组片段中的第3个环上的第3个基因，碱基序列如SEQ ID NO.1所示；其能够编码95个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明提供了CvBV3-3基因在降低昆虫体液免疫反应中的应用，所述CvBV3-3基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示；所述昆虫为果蝇或小菜蛾。

经实验发现，CvBV3-3基因能够抑制昆虫血淋巴的黑化活力，所述CvBV3-3基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示；所述昆虫为果蝇或小菜蛾。

经实验发现，CvBV3-3基因能够降低果蝇幼虫对寄生蜂幼虫的包囊作用，所述CvBV3-3基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了CvBV3-3基因在制备免疫低下型果蝇模型中的应用，所述CvBV3-3基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了一种免疫低下型果蝇模型的制备方法，包括：

(1)制备包含有CvBV3-3基因的重组质粒，将重组质粒注入白眼野生型果蝇胚胎中，胚胎发育至成虫后，获得红眼转基因果蝇；所述CvBV3-3基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)将红眼转基因果蝇与平衡系进行两轮杂交，依据后代表型，挑选纯合体转基因果蝇；

(3)利用UAS/GAL4系统，将步骤(2)制得的纯合体转基因果蝇与BS8700果蝇品系进行杂交，使得CvBV3-3基因在后代果蝇血细胞中特异性表达，从而获得免疫低下型果蝇。

其中，所述白眼野生型果蝇为W1118；平衡系的基因型为w-/w-；Sp/Cyo；TM2/TM6B。

所述纯合体转基因果蝇的基因型为w-/w-；CvBV3-3/CvBV3-3；TM2/TM6B。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明利用转基因技术，将菜蛾盘绒茧蜂多分DNA病毒基因CvBV3-3转入果蝇基因组，获得了稳定遗传、纯合体的转基因果蝇品系；利用UAS/GAL4系统，纯合体的CvBV3-3转基因果蝇与BS8700果蝇品系进行杂交，得到的品系表达多分DNA病毒基因后，发现能够抑制昆虫血淋巴的黑化活力以及降低果蝇幼虫体内对寄生蜂幼虫的包囊作用，在受到病原物侵染时，具有明显的免疫力低的性状，在对研究昆虫免疫相关机制、增强人类免疫类药剂的筛选等方面有重要意义。

(2)本发明当向小菜蛾体内注射重组CvBV3-3病毒粒子后，小菜蛾血淋巴的黑化活力显著受到抑制，表明CvBV3-3基因能够抑制小菜蛾血淋巴的黑化活力。

附图说明

图1为实施例1中构建CvBV3-3转基因果蝇的PCR检测结果。

图2为实施例1中半定量PCR检测CvBV3-3在转基因果蝇中的表达结果。

图3为实施例1中CvBV3-3基因影响果蝇免疫的检测结果。

图4为实施例1中果蝇幼虫对寄生蜂幼虫的包囊作用。

图5为实施例1中CvBV3-3基因影响果蝇幼虫对寄生蜂幼虫包囊作用的检测结果；

其中，N表示不产生黑块，S表示产生小黑块，L表示产生大黑块。

图6为实施例1中CvBV3-3基因影响果蝇幼虫黑化活力的检测结果。

图7为实施例2中CvBV3-3基因影响小菜蛾幼虫黑化活力的检测结果；

其中，CK表示未处理的小菜蛾；Bac-GFP表示注射重组杆状病毒(GFP基因)的小菜蛾；Bac-CvBV3-3表示注射重组杆状病毒(CvBV3-3基因)的小菜蛾。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。

实施例1

1、转基因果蝇的构建

根据CvBV3-3基因开放阅读框(ORF,SEQ ID NO.1所示)基因两端序列以及pUASttb载体上多克隆位点序列，结合同源重组酶(ClonExpress II One Step Cloning Kit，诺唯赞)的作用方式，设计特异性引物，引物序列如下：

3-3-P：5’-TTCGTTAACAGATCTGCGGCCGCATGATTTTTGTCATGCATTCGAT-3’

3-3-AP：5’-TCCTCTAGAGGTACCCTCGAGCTAATACCTATTTGGCATATTAG-3’；

采用Trizol(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)提取寄生后小菜蛾总RNA，并利用试剂盒构建cDNA文库。利用特异性引物3-3-P、3-3-AP从构建的cDNA文库中PCR扩增出带有载体同源序列的CvBV3-3基因片段，利用同源重组酶将片段重组克隆到pUASttb载体上。重组载体转化到大肠杆菌TG1进行扩繁，并对重组质粒进行测序以验证序列的正确性。

将验证正确的重组质粒显微注射入白眼野生型黑腹果蝇W1118的胚胎中，胚胎发育至成虫即为G0代，G0代果蝇中红眼果蝇即为成功的转基因品系，以此为依据进行筛选。

利用PCR检测，提取CvBV3-3转基因果蝇和野生型W1118黑腹果蝇的基因组DNA，分别用特异性引物3-3-P、3-3-AP对这些基因组DNA进行PCR检测。从CvBV3-3转基因果蝇扩增出与CvBV3-3大小一致的片段，而在野生型W1118黑腹果蝇的基因组DNA中没有扩增出片段。证明菜蛾盘绒茧蜂多分DNA病毒CvBV3-3基因成功***到转基因果蝇的基因组中，转基因果蝇品系构建成功(如图1)。

2、CvBV3-3转基因果蝇纯合体品系的构建

本实施例中CvBV3-3***到二号染色体上，故将上述步骤1构建成功的转基因品系与平衡品系(w-/w-；Sp/Cyo；TM2/TM6B)进行杂交，依据后代表现型，挑选出子代具有卷翅、大平衡棒的处女果蝇(w-/w-；CvBV3-3/Cyo；TM2/+)以及具有卷翅、肩部多毛的雄果蝇(w-/w-；CvBV3-3/Cyo；TM6B/+)，并将挑选出的果蝇进行杂交；或者挑选出子代具有卷翅、大平衡棒的雄果蝇(w-/w-；CvBV3-3/Cyo；TM2/+)以及具有卷翅、肩部多毛的处女果蝇(w-/w-；CvBV3-3/Cyo；TM6B/+)，并将挑选出的果蝇进行杂交；杂交后代挑选直翅、大平衡棒、肩部多毛的纯合体的转CvBV3-3基因的果蝇(w-/w-；CvBV3-3/CvBV3-3；TM2/TM6B)进行保种。

3、CvBV3-3基因在果蝇血细胞中表达

利用UAS/GAL4系统，将步骤2中纯合体的CvBV3-3转基因果蝇与BS8700(FlyBaseID:FBti0064641)果蝇品系进行杂交，使得CvBV3-3在果蝇血细胞中特异表达，并以CvBV3-3转基因品系与野生型W1118杂交作为对照。

提取子代血细胞总RNA反转录为cDNA(具体方法同本实施例步骤1部分)，以管家基因Actin做内参，用定量特异性引物进行半定量检测。

定量特异性引物如下：

CvBV3-3-qPCR-F：5’-AGCAGCTTGTGCATTTTGATG-3’

CvBV3-3-qPCR-F：5’-GCATGCATAATCTGTATCGGTTG-3’

Dro-actin-qPCR–F：5’-GCTGAGCGTGAAATCGTCCG-3’

Dro-actin-qPCR-R：5’-GGAGTTGTAGGTGGTCTCGTGGA-3’

图2结果表明，在mRNA水平上，CvBV3-3转基因品系和W1118的杂交后代无CvBV3-3的表达，而CvBV3-3转基因品系和BS8700的杂交后代表达量很高。因此，说明得到了在血细胞中特异表达CvBV3-3的转基因果蝇。

4、CvBV3-3基因在果蝇血细胞中特异表达对果蝇的影响

a)CvBV3-3影响果蝇免疫的检测结果

利用CvBV3-3转基因品系与野生型W1118和BS8700的处女果蝇分别杂交，向后代果蝇雄成虫(约60头)体内注射33nl PBS和金黄色葡萄球菌(OD＝0.4)。注射后每隔12h，统计果蝇生存情况，绘制生存曲线。

图3结果表明，注射PBS不影响果蝇的生存率；而注射金黄色葡萄球菌(S.aureus)后，CvBV3-3转基因品系与BS8700的杂交后代的存活率显著(p＝0.00324)低于对照组(CvBV3-3转基因品系与野生型W1118的杂交后代)，表明CvBV3-3能降低果蝇的免疫。

b)CvBV3-3影响果蝇对布拉迪小环腹瘿蜂幼蜂的包囊作用

果蝇幼虫在被布拉迪小环腹瘿蜂寄生后，由于体液免疫反应，寄生后的幼虫常常会在腹内马氏管附近产生黑色组织包块(实际是果蝇幼虫对幼蜂的包囊块，黑块的大小反应体液免疫反应的强弱)，寄生后的幼虫分为三种，即不产生黑块，产生小黑块和产生大黑块(图4)。

利用CvBV3-3转基因品系与野生型W1118和BS8700的处女果蝇分别杂交，产卵后统计卵的数量。待卵孵化至2龄时，按照卵数和寄生蜂20:1的比例放入交配充分的雌性寄生蜂，寄生2-3h后取出寄生蜂，48h后统计果蝇幼虫黑色包块的情况。

图5结果表明，与对照组(CvBV3-3转基因品系与野生型W1118的杂交后代)相比，CvBV3-3转基因品系与BS8700的杂交后代产生的大黑块的数量显著下降(其中n代表统计数量)。这进一步说明在果蝇血细胞中过表达CvBV3-3能抑制果蝇的体液免疫反应。

c)CvBV3-3影响果蝇黑化活力的检测结果

利用CvBV3-3转基因品系与野生型W1118和BS8700的处女果蝇分别杂交。抽取30头后代果蝇幼虫血淋巴，加入到200μl PBS中，涡旋混匀后取出20μl用于蛋白浓度的测定。血淋巴总蛋白浓度的测定采用PierceTM Coomassie(Bradfold)Protein Assay Kit试剂盒。

黑化活力测定时，向剩余的约180μl的血淋巴中加入20μl热灭活的大肠杆菌悬液(悬浮于PBS、OD＝0.5、沸水煮10min)，室温反应20min。取60μl反应液加入140μl的多巴溶液(3g/L)，每隔5min测定OD490值，共测定60min，做三次机械重复。以多巴溶液作为空白对照，每个处理三个生物学重复。一个酶活力单位定义为每分钟每毫克蛋白OD490的变化值。

图6结果表明，与对照组(CvBV3-3转基因品系与野生型W1118的杂交后代)相比，CvBV3-3转基因品系与BS8700的杂交后代的血淋巴的黑化活力显著受到抑制。

实施例2

1、重组载体的构建

根据CvBV3-3基因开放阅读框(ORF,SEQ ID NO.1所示)和GFP基因两端序列以及pFastBac-HTB载体上多克隆位点序列，结合同源重组酶(ClonExpress II One StepCloning Kit，诺唯赞)的作用方式，设计特异性引物，引物序列如下：

3-3-F：5’-ACGAGCTCACTAGTCGCGGCCGCTATGATTTTTGTCATGCATTCGAT-3’；

3-3-R：5’-CTTGGTACCGCATGCCTCGAGCTAATACCTATTTGGCATATTAG-3’；

GFP-F：5’-ACGAGCTCACTAGTCGCGGCCGCTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’；

GFP-R：5’-CTTGGTACCGCATGCCTCGAGTTACTAGAGGTACCCTCGAG-3’；

采用Trizol(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)提取寄生后小菜蛾总RNA，并利用试剂盒构建cDNA文库。利用特异性引物3-3-F、3-3-R从构建的cDNA文库中PCR扩增出带有载体同源序列的CvBV3-3基因片段，利用同源重组酶将片段重组克隆到pFastBac-HTB载体上。以带有GFP标签的质粒为模版，利用特异性引物GFP-F、GFP-R扩增出带有载体同源序列的GFP基因片段，利用同源重组酶将片段重组克隆到pFastBac-HTB载体上。重组载体转化到大肠杆菌TG1进行扩繁，并对重组质粒进行测序以验证序列的正确性。

将验证正确的重组质粒转入到DH10 Bac^TMEcoli中，与常规转化不同的是加入无抗的培养基以后37℃225rpm震荡培养4小时涂板。LB平板包含50μg/ml Kan，7μg/mlGentamicin，10μg/ml tetracycline，100μg/ml Biuo-gal，40μg/ml IPTG。37℃培养两天后选择白斑进行菌液检测。

2、重组杆状病毒的获取

转接200μl上一步中检测正确的DH10 Bac^TMEcoli的菌液到20ml的抗性培养基中(包含50μg/ml Kan，7μg/ml Gentamicin，10μg/ml tetracycline)，37℃250rpm培养过夜。利用PureLink^TM HiPure Plasmid Miniprep Kit试剂盒提取重组杆状病毒DNA。利用CellfectinⅡ将重组杆状病毒DNA转染至Sf9细胞系中，72h后将细胞吹打至悬浮状态，将细胞悬液转移至离心管中，500g离心5min，吸取上清液即为P1代病毒粒子。病毒粒子应避光保存在4℃冰箱中。将收集的P1代病毒加入到新的Sf9细胞系中，72h后收集得到P2代病毒粒子，以此类推。

收集P5代的病毒粒子，先2000-3000rpm离心20-30min，取上清；随后10000rpm离心30min，取上清；满速离心2h，留少量(约20μl)培养基，低速涡旋将病毒粒子重悬浮。以重悬浮的病毒粒子为模版，利用绝对定量的方式检测病毒粒子的滴度，随后将病毒粒子的滴度稀释成2×10⁵个/μl。

3、小菜蛾黑化活力的测定

向生长正常的3龄中期的小菜蛾幼虫体内注射0.05μl的病毒粒子悬浮液(即10⁴拷贝数的重组病毒)，24h后抽取20头小菜蛾血淋巴测定其黑化活力。

将20头小菜蛾血淋巴加入到200μl PBS中，涡旋混匀后取出20μl用于蛋白浓度的测定。血淋巴总蛋白浓度的测定采用PierceTM Coomassie(Bradfold)Protein Assay Kit试剂盒。

图7结果表明，与注射重组GFP基因病毒粒子相比，当向小菜蛾体内注射重组CvBV3-3病毒粒子后，小菜蛾血淋巴的黑化活力显著受到抑制。

序列表

<110> 浙江大学

<120> CvBV3-3基因在降低昆虫体液免疫反应中的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 288

<212> DNA

<213> 菜蛾盘绒茧蜂多分DNA病毒(Cotesia vestalis polydnavirus)

<400> 1

atgatttttg tcatgcattc gatggctgaa ggagactctg cagagtcgtg cattcctgtg 60

tataaatatt gtggaaattt tggcgaatgt tgtccgaccg ctaaagaagt taatggagaa 120

ttgaaaagag ttgaaacgat ttgtgacata acccaaacca accgatacag attatgcatg 180

ccagtggatg aagttgagag cctgctgaaa gttattgagc ataatgaaag aatcttaagg 240

gataatcctc gcatctcctt gggatctaat atgccaaata ggtattag 288

<210> 2

<211> 95

<212> PRT

<213> 菜蛾盘绒茧蜂多分DNA病毒(Cotesia vestalis polydnavirus)

<400> 2

Met Ile Phe Val Met His Ser Met Ala Glu Gly Asp Ser Ala Glu Ser

1 5 10 15

Cys Ile Pro Val Tyr Lys Tyr Cys Gly Asn Phe Gly Glu Cys Cys Pro

20 25 30

Thr Ala Lys Glu Val Asn Gly Glu Leu Lys Arg Val Glu Thr Ile Cys

35 40 45

Asp Ile Thr Gln Thr Asn Arg Tyr Arg Leu Cys Met Pro Val Asp Glu

50 55 60

Val Glu Ser Leu Leu Lys Val Ile Glu His Asn Glu Arg Ile Leu Arg

65 70 75 80

Asp Asn Pro Arg Ile Ser Leu Gly Ser Asn Met Pro Asn Arg Tyr

85 90 95

<210> 3

<211> 46

<212> DNA