阅读说明：本技术 一种橄榄源酪氨酸酶抑制肽的制备方法 (Preparation method of olive-derived tyrosinase inhibitory peptide ) 是由 陈徉 闵琪 李丽娟 刘春慧 王姣 周倩 赵海坤 周国玲 程泽龙 秦静 于 2019-03-28 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物活性肽的制备领域,特别涉及一种橄榄源酪氨酸酶抑制肽的制备方法。本发明中使用中性蛋白酶、酸性蛋白酶,配比1:1,蛋白酶总用量0.5~2.0%,辅助气体为氮气,氮气流速为0.2~0.5 L/min,操作温度为30~50℃时,酶解反应时间60~90 min,橄榄蛋白水解度可达80%,酪氨酸酶活性抑制率可达70%。本发明制备的酪氨酸酶抑制肽,天然安全活性高,适合在美容化妆品中使用。(The invention belongs to the field of preparation of bioactive peptides, and particularly relates to a preparation method of olive-derived tyrosinase inhibitory peptide. According to the invention, neutral protease and acid protease are used according to a ratio of 1:1, the total protease consumption is 0.5-2.0%, the auxiliary gas is nitrogen, the nitrogen flow rate is 0.2-0.5L/min, the enzymolysis reaction time is 60-90 min at an operation temperature of 30-50 ℃, the olive protein hydrolysis degree can reach 80%, and the tyrosinase activity inhibition rate can reach 70%. The tyrosinase inhibitory peptide prepared by the invention is natural, safe and high in activity, and is suitable for being used in beauty cosmetics.)

一种橄榄源酪氨酸酶抑制肽的制备方法

技术领域

本发明属于生物活性成分的制备领域，特别涉及一种橄榄源酪氨酸酶抑制肽的制备方法。

背景技术

酪氨酸酶具有独特的双重催化功能，是生物体内黑色素合成的关键酶，与人的衰老有密切关系。其异常过量表达可导致人体的色素沉着性疾病。酪氨酸酶抑制剂可以治疗目前常见的色素沉着性皮肤病如雀斑、黄褐斑、老年斑。多肽具有抗氧化、抗衰老、防癌等功能的一类化合物，是公认安全高效的天然食品。而橄榄、橄榄油及其相关产品在世界范围内广受欢迎，研究橄榄源酪氨酸酶抑制肽的制备方法具有重要意义。

本发明中涉及的橄榄源酪氨酸酶抑制肽，目前鲜有文献报道，尚未应用于化妆品领域。

发明内容

本发明提供的一种橄榄源酪氨酸酶抑制肽的制备方法，包括以下步骤：

取橄榄蛋白100 g，放入破壁料理机中，放入800~1000 mL水，10000 rpm处理2~3 min，制备橄榄蛋白液。将所得蛋白液，放入酶解反应器，升温至30~37℃，通入氮气，氮气流速为0.2~0.5 L/min，加入5~10 g中性蛋白酶，反应30~50 min，而后调节pH至5.0~6.5，升温至40~50℃，加入5~10 g酸性蛋白酶，反应30~50 min。反应结束后，升温至90℃，灭酶，冷却后所得为橄榄多肽液。本发明制备的酪氨酸酶抑制肽，天然安全活性高，适合在美容化妆品中应用。

附图说明

图1橄榄多肽与曲酸对酪氨酸酶的抑制率。

具体实施方式

现在结合具体实施例对本发明作进一步说明以及选取其中一种实例为本专利提供数据支持，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。

实施例一：橄榄源酪氨酸酶抑制肽的制备

（1） 取橄榄蛋白100 g，放入破壁料理机中，放入800 mL水，10000 rpm处理3 min，制备橄榄蛋白液。将所得蛋白液，放入酶解反应器，升温至37℃，通入氮气，氮气流速为0.2 L/min，加入5 g中性蛋白酶，反应30 min，而后调节pH至5.5，升温至40℃，加入5 g酸性蛋白酶，反应30 min。反应结束后，升温至90℃，灭酶，冷却后所得为橄榄多肽液。按如下方法测定蛋白水解度与酪氨酸酶的抑制率，此案例中蛋白水解度为72.3%，酪氨酸酶的抑制率为70.6%。

（2） 蛋白水解度的测定

采取甲醛滴定法测定氨基氮含量：取5mL蒸馏水加入2mL样品或者蒸馏水（空白），添加中性甲醛溶液2mL，滴入酚酞指示剂5滴，用0.02 mol/L的NaOH标准溶液滴定至微红，记录每次消耗的标准NaOH溶液的量。平行测定两次，求平均值。

计算公式：

V样品为样品所消耗的NaOH标准溶液的体积/mL；V空白为空白实验所消耗的NaOH标准溶液 的体积/mL。

α为甲醛滴定法测定的酶解液中氨基氮含量（g/L）；β为蛋白的浓度（g/L）。

（3） 酪氨酸酶的抑制率的测定

mL，微热完全溶解后，用氢氧化钠溶液调pH至7，加去离子水定容至200 mL，得到底物溶液。③精确称取0.1 g曲酸粉末，溶于20mL的去离子水中，得到5 mg/mL的阳性对照母液。 ①准确称取920 U/mg酪氨酸酶（蘑菇来源），用PBS配成 200 U/mg的酶液。②精确称取L_酪氨酸0.272 g，先加入数滴浓盐酸，加去离子水约50

实验时，向试管中依次加入磷酸盐缓冲液、不同浓度梯度的受试液(包括阳性对照)、酶液，于30℃水浴10 min。然后加入底物L-酪氨酸，立即开始计时。测定反应20 min时475 nm波长下的吸光值。测定时，以相应的阴性对照为参比。

 抑制率=[(A-B)/A]×l00％

其中，A为标准对照的吸光值， B为受试液(或阳性对照)的吸光值。每个实验做3个平行。抑制率高表明其对酪氨酸酶活性的抑制强度高。

实施例二：橄榄源酪氨酸酶抑制肽的制备

取橄榄蛋白100 g，放入破壁料理机中，放入800 mL水，10000 rpm处理3 min，制备橄榄蛋白液。将所得蛋白液，放入酶解反应器，升温至37℃，通入氮气，氮气流速为0.3 L/min，加入8 g中性蛋白酶，反应30 min，而后调节pH至5.0，升温至45℃，加入8 g酸性蛋白酶，反应30 min。反应结束后，升温至90℃，灭酶，冷却后所得为橄榄多肽液。此案例中蛋白水解度为76.5%，酪氨酸酶的抑制率为75.6%。

实施例三：橄榄源酪氨酸酶抑制肽的制备

取橄榄蛋白100 g，放入破壁料理机中，放入1000 mL水，10000 rpm处理3 min，制备橄榄蛋白液。将所得蛋白液，放入酶解反应器，升温至37℃，通入氮气，氮气流速为0.3 L/min，加入10 g中性蛋白酶，反应40 min，而后调节pH至5.0，升温至45℃，加入10 g酸性蛋白酶，反应40 min。反应结束后，升温至90℃，灭酶，冷却后所得为橄榄多肽液。此案例中蛋白水解度为82.5%，酪氨酸酶的抑制率为80.6%。