阅读说明：本技术 基于PrP的单克隆抗体的肿瘤细胞检测试剂盒 (Tumor cell detection kit based on monoclonal antibody of PrP ) 是由 苑国忠 李莉 于 2019-03-07 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种肿瘤细胞检测试剂盒,其包括可与朊蛋白结构中的疾病特异性表位特异性结合的抗体,所述疾病特异性表位在PrPc中被包埋,在PrPsc中被暴露出来,所述疾病特异性表位的氨基酸序列为GYVLGSAMSRP。本发明利用肿瘤病变发生时,细胞表面PrPc发生构型变化,转化为PrPsc的特点,制备可和PrPsc的特性性表位相结合的抗体,通过抗体-抗原表位的特异性结合检测肿瘤细胞的存在。所制备的检测试剂盒操作方便,准确度高,且可用于泛癌检测。(The invention discloses a tumor cell detection kit, which comprises an antibody capable of being specifically combined with a disease-specific epitope in a prion structure, wherein the disease-specific epitope is embedded in PrPc and exposed in PrPsc, and the amino acid sequence of the disease-specific epitope is GYVLGSAMSRP. The invention utilizes the characteristic that when tumor lesion occurs, cell surface PrPc undergoes configuration change and is converted into PrPsc to prepare the antibody capable of being combined with the characteristic epitope of the PrPsc, and the existence of tumor cells is detected through the specific combination of the antibody-epitope. The prepared detection kit is convenient to operate and high in accuracy, and can be used for pan-cancer detection.)

基于PrP的单克隆抗体的肿瘤细胞检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种基于PrP的单克隆抗体的肿瘤细胞检测试剂盒以及该单克隆抗体在肿瘤细胞检测试剂盒中的应用。

背景技术

朊蛋白Prion protein即“蛋白性感染颗粒”，是正常蛋白错误折叠后形成的一种异常蛋白质。这一术语是在1982年由旧金山加利福尼亚大学的神经病学家StanleyB.Prusiner提出的，他提出：仅由蛋白质组成的新型病原体导致了被称作可传播性海绵状脑病(TSE)的一组致死性神经退行性疾病，包括例如羊类的羊瘙痒症(scrapie)、牛类的牛海绵状脑病(BSE或“疯牛病”)以及人类的库贾氏病(Creutzfeldt-Jakob(CJD))。

朊蛋白(PrP)包括细胞型朊蛋白(PrPc)和致病型朊蛋白(PrPsc)，二者具有相同的氨基酸序列和分子质量，但在空间结构和生化特性上显著不同。尽管已经在朊病毒疾病和朊蛋白(PrP)方面进行了大量的研究，但是正常的细胞型朊蛋白(PrPc)的作用尚未得到明确的认识。除在中枢神经系统细胞中之外，PrPc还在免疫系统、造血干细胞以及成熟淋巴区室和脊髓区室中广泛表达；有若干证据表明，PrP可保护人神经元免受各种内部压力或环境压力的作用；造血干细胞的自我更新可能需要PrP，并且PrP还可能在免疫系统中具有独特的作用；PrP的破坏会引起对细胞增殖、分化和存活非常重要的一组基因的调控异常；PrP在调节多层面的网络内的细胞生理功能方面发挥根本性的作用。

目前已经发现PrPc与乳腺癌、***癌、肝癌等多种肿瘤相关，但是PrPc在人类肿瘤中的具体生理功能尚不清楚，未见其对于肿瘤发生、发展作用机制的报道。

发明内容

本发明一个目的在于提供一种肿瘤检测的分子标记物，其为朊蛋白结构中的疾病特异性表位，所述疾病特异性表位在PrPc中被包埋，在PrPsc中被暴露。

根据本发明，所述疾病特异性表位的氨基酸序列为GYVLGSAMSRP。

本发明还提供一种肿瘤细胞检测试剂盒，所述试剂盒包括可与朊蛋白结构中的疾病特异性表位特异性结合的抗体，所述疾病特异性表位在PrPc中被包埋，在PrPsc中被暴露。

根据本发明的检测试剂盒，所述疾病特异性表位的序列为：GYVLGSAMSRP。

根据本发明的试剂盒，所述抗体为单克隆抗体。

根据本发明的试剂盒，所述肿瘤细胞来源于***癌，淋巴瘤，胰腺癌，结肠癌，直肠癌，胃癌，卵巢癌，黑色素瘤癌，肺癌、肝癌中的一种或两种以上。

根据本发明的试剂盒，可用于检测来源于受试者的器官组织、血清、脑脊液、唾液中的一种。

根据本发明的试剂盒，所述单克隆抗体可由本领域已知的单克隆抗体构建方法制备，例如杂交瘤抗体技术、基因工程抗体技术。

在本发明的一个实施方案中，所述单克隆抗体的构建方法包括：制备目标抗原、动物免疫、细胞融合和单抗筛选的步骤。

作为示例，所述目标抗原为含有序列GYVLGSAMSRP的多肽片段；可通过基因工程、化学合成等本领域已知的多肽合成方法制备，例如所述抗原可由固相合成法制备，J.M.Stewart and J.D.Young,Solid Phase Peptide Synthesis(Pierce Chemical Co.,Rockford,Ill.1984)和G.Barany and R.B.Merrifield,The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology,editors E.Gross and J.Meienhofer,Vol.2,(Academic Press,NewYork,1980),pp.3-254所记载固相合成法引入本专利；还可由M.Bodansky,Principles ofPeptide Synthesis,(Springer-Verlag,Berlin1984)和E.Gross and J.Meienhofer,Eds.,The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology,Vol.1所记载的经典溶液合成法制备所述抗原。

一种上述单克隆抗体与链霉亲和素修饰的纳米磁珠偶联得到的免疫磁珠。

本发明还提供上述单克隆抗体或免疫磁珠在制备肿瘤细胞检测试剂盒中的应用。

有益效果

(1)本发明利用朊蛋白在多种肿瘤细胞中的表达和调控特点，肿瘤病变发生时，细胞表面PrPc发生构型变化，转化为PrPsc，制备可和PrPsc的特异性表位相结合的抗体，通过抗体-抗原表位的特异性结合检测肿瘤细胞的存在。所制备构象型单克隆抗体特异性极强，可以特异性识别肿瘤病变发生时所引起的病变蛋白中结构异常位点，而不识别正常结构蛋白，从而可以实现检测肿瘤细胞的目的，可以作为肿瘤疾病早期诊断的辅助手段。

(2)本发明的特异性抗体用于肿瘤检测试剂盒时，其特异性和敏感性极高，假阳性率低，具有良好的应用前景。

术语定义与说明

1.在本文中使用以下氨基酸缩写：

丙氨酸：Ala(A) 精氨酸：Arg(R)

天冬酰胺：Asn(N) 天冬氨酸：Asp(D)

半胱氨酸：Cys(C) 谷氨酰胺：Gin(Q)

谷氨酸：Glu(E) 甘氨酸：Gly(G)

组氨酸：His(H) 异亮氨酸：He(I)

亮氨酸：Leu(L) 赖氨酸：Lys(K)

蛋氨酸：Met(M) 苯丙氨酸：Phe(F)

脯氨酸：Pro(P) 丝氨酸：Ser(S)

苏氨酸：Thr(T) 色氨酸：Trp(W)

酪氨酸：Tyr(Y) 缬氨酸：Val(V)

2.术语“朊蛋白”是指缺乏核酸的蛋白质性质的感染因子，通常以非致病性PrP_C形式存在形式存在，并且在适当的条件下折叠成致病性PrP_Sc形式。朊病毒蛋白的PrP_Sc构象通常包括至少一个能够适应β-螺旋构象的区域(称为“β-螺旋区”)。朊蛋白是在各种哺乳动物物种中自然产生的，包括人，绵羊，牛，老鼠，鹿，麋鹿等。

3.术语“肽”或“多肽”通常包括全长为至少约3-10个连续氨基酸残基的分子，或者至少约15-25个连续氨基酸残基，或至少约20-50个，或者保留引发所需生物反应能力的任何长度的更连续的氨基酸残基。

4.术语“抗体”是指识别或特异性结合抗原中存在的目标表位的分子；“特异性结合”是指抗体与抗原决定簇(抗原表位)通过“锁匙(lock and key)作用”形成抗原-抗体复合物的过程。本文所述“抗体”包括多克隆或单克隆抗体制剂以及杂合抗体分子，F(ab')2和F(ab)片段，Fv分子，单链Fv分子(sFv)，人源化抗体分子。在更广的意义上，本发明的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子(即，含有抗原结合部位的分子)的免疫活性片段，其中这些片段可以或可以不与另一个免疫球蛋白结构域(包括但不限于Fc区或其片段)融合。术语“单克隆抗体”是指具有同源抗体群的抗体组合物。该术语不限于抗体的种类或来源，也不受其制备方式的限制。该术语包括完整免疫球蛋白以及片段，例如Fab，F(ab')2，Fv和其他片段，以及嵌合和人源化同源抗体群，其显示亲本单克隆抗体分子的免疫结合特性。

附图说明

图1：朊蛋白结构变化示意图

图2：实施例2中ELISA检测抗体滴度结果

图3：实施例3免疫共沉淀法检测抗体特异性电泳图

图4：实施例1制备的1号抗体检测肿瘤细胞系样品的阳性细胞数(纵坐标为阳性细胞数对数值)

图5：实施例1制备的1号抗体检测肿瘤组织样品的阳性细胞数(纵坐标为阳性细胞数对数值)

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。此外，应理解，在阅读了本发明所公开的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的保护范围之内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1制备抗体

利用固相合成技术，合成目标多肽序列GYVLGSAMSRP，为增加免疫源性，利用Larson方法在多肽N端和C端反复叠加四次多肽序列，并将此多肽与具有强免疫刺激的免疫载体白细胞素偶联形成具有免疫活性的复合物。此免疫复合物呈现很强的免疫源性，并携带有特定结构特异性。将此免疫复合物克隆到白细胞毒素质粒中并转染大肠杆菌进行表达，利用得到的纯化重组蛋白免疫小鼠。取产生免疫反应的小鼠淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行杂交，培养出稳定的杂交瘤细胞系，取得单克隆抗体，记为1号抗体(No.1)。

实施例2ELISA检测抗体滴度

利用ELISA对免疫血清，载体和PrPc特异性抗体定量检测(参考Hedlin et al.，Vaccine(2010)28：981-988所记载的方法)。ELISA滴度表示为最高血清稀释度的倒数，读数超过阴性对照(免疫前)两个标准偏差。图2中，合成抗体序列的1号抗体，利用合成的抗体免疫小鼠10周，分别取0，3，4，7及10周的小鼠血清，ELISA检测抗体滴度。图2显示，1号抗体在第4周即达到峰值。

实施例3免疫共沉淀法检测

利用免疫共沉淀法来检测免疫血清样品与PrPsc特异性相互作用。在免疫沉淀之前，使用柱亲和纯化从血清中分离免疫球蛋白以减少背景。利用与磁珠相连的免疫球蛋白，与预先用蛋白酶K(Proteinase K)消化的(100ug/ml)小鼠脑匀浆进行免疫共沉淀；其中小鼠样本包括瘙痒病感染的小鼠组织(RML)、PrP敲除的小鼠组织(K/O)、过表达PrP小鼠组织(Tg20，含有少量PrPsc)、野生型小鼠组织(WT)、空白对照组(PrP_SC对照组)；采用westernblot分析。确定免疫血清中的抗体为目标抗体(只结合PrPSc)。MMP-2抗体(8B4)是小鼠单克隆抗体IgG1κ，作为阳性对照，可以结合PrPc和PrPsc；仅加入磁珠的样本是阴性对照。RML中使用1号抗体可以检测到PrPsc,在Tg20中，因为是过量表达PrP，所以有PrPsc的种子，因此1号抗体也可以检测到PrPsc。

根据图3可知，本发明所制备的1号抗体可以有效识别PrPsc，并不识别野生型小鼠组织中的PrPc。

实施例4用实施例1所制备的抗体检测肿瘤细胞

将所制备的1号抗体与磁珠偶联，在用流式荧光细胞检测技术，利用连有荧光剂的6D11检测阳性磁珠检测之前，先用终浓度为100ug/ml蛋白酶K消化，检测稳定的肿瘤细胞系和肿瘤组织细胞。

肿瘤细胞系：Mo3.13人胶质细胞系,SiHa子***细胞系,B16黑色素瘤细胞,,DU145人***癌细胞系,MOLT4人急性淋巴母细胞白血病细胞系,WiDr人大肠癌细胞系。

肿瘤组织细胞:来源于淋巴瘤，***，胰腺，结肠，卵巢，黑色素瘤，肺(每个组织3-7个测试样品)。

用1号抗体检测肿瘤细胞表面的PrPsc，结果显示本发明所述的抗体在稳定的肿瘤细胞系中可以检测到多种肿瘤细胞(图4)。

在肿瘤组织中，1号抗体对多种肿瘤检测阳性，说明1号抗体在肿瘤检测中具备特异性和稳定性(图5)。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。