阅读说明：本技术 一种含有反式双键的二芳基嘧啶类hiv-1逆转录酶抑制剂及其制备方法和应用 (Diaryl pyrimidine HIV-1 reverse transcriptase inhibitor containing trans double bond and preparation method and application thereof ) 是由 展鹏 左晓芳 刘新泳 霍志鹏 康东伟 于 2020-06-28 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种含有反式双键的二芳基嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂及其制备方法和应用。所述化合物具有式I所示的结构。本发明还涉及含有式I结构化合物的药物组合物。本发明还提供上述化合物以及含有一个或多个此类化合物的组合物在制备治疗和预防人免疫缺陷病毒(HIV)药物中的应用。<Image he="491" wi="466" file="DDA0002556972360000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The invention relates to a diaryl pyrimidine HIV-1 reverse transcriptase inhibitor containing trans double bonds, a preparation method and application thereof. The compound has a structure shown in formula I. The invention also relates to a pharmaceutical composition containing the compound with the structure shown in the formula I. The invention also provides the above compounds and compositions containing one or more of theseThe application of the compound composition in preparing medicaments for treating and preventing Human Immunodeficiency Virus (HIV).)

一种含有反式双键的二芳基嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂及 其制备方法和应用

技术领域

本发明属于有机化合物合成与医药应用技术领域，具体涉及一种含有反式双键的二芳基嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂及其制备方法和应用。

背景技术

艾滋病，全称获得性免疫缺陷综合征(Acquired Immunodeficiency Syndrome,AIDS)，是由人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)引起的极具危害性的传染性疾病，HIV-1是主要病原体。在HIV-1病毒复制过程中，逆转录酶(Reversetranscriptase,RT)的作用至关重要，因此是抗艾滋病药物设计的重要靶标。特别是，非核苷类逆转录酶抑制剂(Nonnucleoside RT inhibitors,NNRTIs)具有高效、高特异性和低毒性等优点，在当前高效抗逆转录疗法(Highly active antiretroviral therapy,HAART)中占有重要地位。然而，由于临床上耐药株的迅速出现、毒副作用和差的药代动力学性质导致NNRTIs的抗病毒效力降低。因此，开发高效广谱抗耐药且药代动力学性质优良的NNRTIs依旧是当前抗艾滋病药物研发领域的重要任务。

二芳基嘧啶(Diarylpyrimidine,DAPY)类化合物是第二代HIV-1NNRTIs，相比于第一代NNRTIs，其对HIV-1野生型和耐药突变毒株均有很好的抑制作用，代表性化合物依曲韦林(Etravirine)和利匹韦林(Rilpivirne)分别与2008年和2011年被美国FDA批准上市。但由于其自身刚性结构引起的水溶性差和透膜性差的缺点导致了其生物利用度低、口服剂量加大，进而引起毒副作用和交叉耐药等问题。因此，研发高效低毒、广谱抗耐药以及具有良好药代动力学性质的NNRTIs是目前抗艾滋病药物研究的重要领域之一。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种含有反式双键的二芳基嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂及其制备方法，本发明还提供了上述化合物的抗HIV-1活性筛选结果及其应用。

本发明的技术方案如下：

1.含有反式双键的二芳基嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂

一种含有反式双键的二芳基嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂，或其药学上可接受的盐、酯或前药，具有通式I所示的结构：

其中，

R₁、R₂、R₃各自独立的为：H、卤素、氰基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、三氟甲基、氨基、羟基、氰基乙烯基、氰基乙基或环丙基；

R₄为：OCH₂CH₃、NH₂、脂肪胺、各种取代的六元杂环或者各种取代的五元杂环。所述的取代基选自带有磺酰基或酰基的基团。

根据本发明优选的，

R₄为OCH₂CH₃、NH₂、环丙胺、炔丙胺、吗啉环、2-甲氧基乙胺、色胺、二甘醇胺、具有通式(a)的哌啶环、具有通式(b)的吡咯环和具有通式(c)的哌嗪环。

其中，R₅为SO₂CH₃、SO₂CF₃、COCF₃；R₆为SO₂CH₃、SO₂CF₃、COCF₃、COCH₃、CHO；n为0或1。

根据本发明进一步优选的，二芳基嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂为如下化合物之一：

本发明中所述的“药学上可接受的盐”是指在可靠的医药评价范围内，化合物的盐类适于与人或较低等动物的组织相接触而无不适当的毒性、刺激及过敏反应等，具有相当合理的收益与风险比例，通常是水或油可溶的或可分散的，并可有效地用于其预期的用途。包括药学上可接受的酸加成盐和药学上可接受的碱加成盐，在这里是可做预期的用途并与式I化合物的化学性质相容的。适宜的盐的列表参见S.M.Birge等，J.Pharm.Sci.,1977,66,1-19页。

本发明中所述的“前药”是指药学上可接受的衍生物，以便这些衍生物所得的生物转换产物是如式I化合物所定义的活性药物。

2.含有反式双键的二芳基嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂的制备方法

含有反式双键的二芳基嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂的制备方法，步骤包括：以2,4-二氯嘧啶为起始原料，在碱性条件下与取代苯酚反应得到中间体I-2；在1,4-二氧六环中，I-2与对氨基苯腈发生布赫瓦尔德-哈特维希(Buchwald-Hartwig)偶联反应生成I-3，然后该中间体与N-碘代丁二酰亚胺反应生成I-4；中间体I-4在催化剂的作用下与丙烯酸乙酯反应得到Z1，并水解生成关键中间体I-5，随后与不同的胺缩合得到目标产物或带Boc的中间体，带Boc的中间体与三氟乙酸反应脱去Boc，并与甲磺酰氯和相应的酸酐反应得到目标产物。合成路线如下：

试剂及条件：(i)取代苯酚，碳酸钾，N,N-二甲基甲酰胺，室温；对氨基苯腈，4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽，醋酸钯，碳酸铯，1,4-二氧六环，氮气保护回流，80℃；(iii)N-碘代丁二酰亚胺，三氟乙酸，乙腈，室温；(iv)丙烯酸乙酯，醋酸钯，三苯基膦，醋酸钠，氮气保护，回流，110℃；(v)四氢呋喃:水＝1:1(v/v)，氢氧化锂，室温；(vi)氨基中间体，2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，N,N-二异丙基乙胺，0℃～室温；(vii)草酰氯，氨水，45℃；(viii)三氟乙酸，二氯甲烷，常温；(ix)甲磺酰氯或酸酐，三乙胺，二氯甲烷，0℃～室温。

其中，R₁、R₂、R₃、R₄同上述通式I所示。

所述的酸酐为三氟甲磺酸酐和三氟乙酸酐。

所述的取代苯酚为：均三甲基苯酚、2,6-二甲基-4-氰基苯酚、2,6-二甲基-4-(E)-氰基乙烯基苯酚。

本发明所述的室温为20-30℃。

3.含有反式双键的二芳基嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂的抗HIV-1野生株及突变株活性及应用

本发明对按照上述方法合成的部分含有反式双键的二芳基嘧啶类衍生物进行了细胞水平的抗HIV-1(NL_4-3和III_B)，单耐药突变株L100I、K103N、Y181C、Y188L、E138K、以及双耐药突变株F227L/V106A、RES056(K103N/Y181C)的活性筛选，以奈韦拉平(NVP)、依法韦伦(EFV)、依曲韦林(ETV)和齐多夫定(AZT)为阳性对照。它们的抗HIV-1活性和毒性数据分别列于表1、表2和表3中。

由表1、表2和表3可以看出，本发明的含有反式双键的二芳基嘧啶衍生物是一系列结构新颖的非核苷类HIV-1抑制剂，绝大部分化合物表现出了较好的抑制野生株和突变株的活性。其中，化合物Z4活性较为突出，其在TZM-bl细胞中抑制NL_4-3病毒株的活性(EC₅₀＝2.45nM，SI>91)与ETR相当(EC₅₀＝1.45nM，SI>158)。在MT-4细胞中，Z4(EC₅₀＝5.2nM)对HIV-1III_B毒株的抑制活性与ETR(EC₅₀＝3.0nM)活性相当。同时，Z4(CC₅₀＝140μM，SI＝26934)的细胞毒性较低，选择性指数很高。在抗耐药株活性测试中，Z4(EC₅₀＝10.6nM)抑制单突变株E138K的活性与ETR(EC₅₀＝9.8nM)活性相当。因此该类二芳基嘧啶类化合物具有进一步研发的价值，可作为抗HIV-1的先导化合物加以利用。

本发明的含有反式双键的二芳基嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂可作为非核苷类HIV-1抑制剂应用。具体地说，作为HIV-1抑制剂用于制备抗艾滋病药物。

一种抗HIV-1药物组合物，包括本发明的含有反式双键的二芳基嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂和一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。

本发明提供了结构全新的含有反式双键的二芳基嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂及其制备方法，本发明还提供了化合物抗HIV-1活性筛选结果及其在抗病毒领域中的首次应用。经过试验证明，本发明的含有反式双键的二芳基嘧啶类衍生物可作为HIV-1抑制剂应用并具有很高的应用价值。具体地说，作为HIV-1抑制剂用于制备抗艾滋病药物。

具体实施方式

通过下述实施例有助于理解本发明，但是不能限制本发明的内容。

实施例中所涉及的合成路线如下：

合成路线一：

实施例1：乙基(E)-3-(4-(4-氰基-2,6-二甲基苯氧基)-2-((4-氰基苯基)氨基)嘧啶-5-基)丙烯酸乙酯(Z1)的制备

将2,4-二氯嘧啶(0.10g,0.67mmol)与4-羟基-3,5-二甲基苯腈(0.12g,0.8mmol)溶于30mL DMF中，加入K₂CO₃(0.11g,0.8mmol)，室温搅拌6h，TLC检测反应。反应结束后，二氯甲烷萃取(10mL×3)，合并有几层，饱和食盐水(30mL)洗一次，无水Na₂SO₄干燥5h，过滤，拌样。柱分离，乙酸乙酯/石油醚重结晶后得到白色固体I-2。产率：80％；熔点126-128℃。

将醋酸钯(0.004g,0.0019mmmol)和4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽(0.009g,0.0019mmol)溶于二氧六环(15mL)中，室温搅拌活化15min后，加入化合物I-2(0.1g,0.38mmol)和碳酸铯(4.89g,0.49mmol)搅拌15min。最后加入对氨基苯腈(0.16g,0.29mmol)，N₂保护下80℃反应6h，TLC检测反应。反应结束后，冷却加硅藻土过滤后浓缩，二氯甲烷萃取(10mL×3)，合并有几层，饱和食盐水(30mL)洗一次，无水Na₂SO₄干燥5h，过滤，拌样。柱分离，乙酸乙酯/石油醚重结晶后得到白色固体I-3。产率：50％；熔点：126-128℃。

将化合物I-3(0.1g,0.29mmol)和N-碘代丁二酰亚胺(0.086g,0.38mmol)溶于乙腈(16mL)中，加入三氟乙酸(88μL,0.087mmol)，室温搅拌6h，TLC检测反应。反应结束后，加入过量的10％Na₂CO₃溶液至pH 8，过滤得滤渣。干燥，将滤渣溶于10mL二氯甲烷，拌样。柱分离，乙酸乙酯/石油醚重结晶后得到白色固体I-4。产率：80％；熔点：130-132℃。

将化合物I-4(0.1g,0.21mmol)、醋酸钯(0.002g,0.007mmol)、三苯基磷(0.005g,0.019mmol)和乙酸钠(0.06g,0.44mmol)溶于DMF(30mL)中，N₂保护下活化15min，加入丙烯酸乙酯(19μL，0.175mmol)，110℃反应12h，冷却后，加硅藻土过滤后浓缩，二氯甲烷萃取(20mL×3)，合并有几层，饱和食盐水(30mL)洗一次，无水Na₂SO₄干燥5h，过滤，拌样。柱分离，乙酸乙酯/石油醚重结晶后得到乙基(E)-3-(4-(4-氰基-2,6-二甲基苯氧基)-2-((4-氰基苯基)氨基)嘧啶-5-基)丙烯酸乙酯。

产物为白色固体，产率：50％，熔点148-150℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ10.52(s,1H,NH),8.96(s,1H,C₆-pyrimidine-H),7.82(s,2H),7.77(d,J＝16.1Hz,1H,alkene-H),7.48(m,4H),6.76(d,J＝16.1Hz,1H,alkene-H),4.20(q,J＝7.1Hz,2H,CH₂),2.12(s,6H,2CH₃),1.26(t,J＝7.1Hz,3H,CH₃).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ166.82,165.81,161.89,159.05,153.83,144.15,135.80,133.24,133.07,133.05,119.65,119.12,118.99,118.61,109.31,107.31,103.94,60.57,16.20,14.69.HRMS m/zC₂₅H₂₁N₅O₃:calcd 439.16,found 438.26[M-H]^-.

实施例2：(E)-3-(4-(4-氰基-2,6-二甲基苯氧基)-2-((4-氰基苯基)氨基)嘧啶-5-基)丙烯酰胺(Z2)的制备

取I-6(0.15g,0.36mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，加入草酰氯(100μL,1.16mmol)，再加一滴DMF做催化剂，室温搅拌过夜，减压蒸干，加入30mL氨水，50℃加热回流6h，TLC检测反应。反应结束后，过滤得滤渣，烘干。将干燥品(0.2g)溶于10mL二氯甲烷，加入10mL氨水，45℃回流6h，拌样，柱分离，乙酸乙酯/石油醚重结晶后得到终产物(E)-3-(4-(4-氰基-2,6-二甲基苯氧基)-2-((4-氰基苯基)氨基)嘧啶-5-基)丙烯酰胺。

产物为白色固体，产率50.1％，熔点：226-228℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ10.40(s,1H,NH),8.76(s,1H,C₆-pyrimidine-H),7.83(s,2H,C₃,C₅-Ph”-H),7.59–7.53(m,2H),7.49–7.48(m,4H),7.11(s,1H),6.89(d,J＝15.9Hz,1H,alkene-H),2.14(s,6H,2CH₃).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ167.30,165.64,161.57,158.43,154.07,144.39,133.21,133.10,133.04,131.07,123.85,119.72,119.04,118.90,118.69,109.22,108.23,103.61,16.23.HRMS m/z C₂₃H₁₈N₆O₂:calcd 410.15,found409.26[M-H]^-.

实施例3：目标化合物(Z3～Z10，Z20，Z21)的制备

将I-5(0.1g，0.24mmol)和2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(0.11g，0.288mmol)溶于DMF(10mL)中，冰浴活化15min，加入N,N-二异丙基乙胺(121μL，0.72mmol)和环丙胺(20μL，0.288mmol)继续活化15min，室温搅拌6h，TLC检测反应。反应完全后浓缩蒸干。加入40mL水，二氯甲烷萃取(20mL×3)，合并有几层，饱和食盐水(30mL)洗一次，无水Na₂SO₄干燥5h，过滤，浓缩，拌样。柱分离，乙酸乙酯/石油醚重结晶后得到目标化合物Z3。

产物为白色固体，产率78.6％，熔点：254-255℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ10.41(s,1H,NH),8.75(s,1H,C₆-pyrimidine-H),8.23(d,J＝4.4Hz,1H,NHCO),7.84(s,2H)7.62–7.35(m,5H),6.85(d,J＝15.9Hz,1H,alkene-H),2.84–2.69(m,1H,cyclopropane-H),2.13(s,6H,2CH₃),0.67(q,J＝6.6Hz,2H,cyclopropane-2H),0.50–0.38(m,2H,cyclopropane-2H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ166.73,165.62,161.93,158.32,154.05,144.39,133.21,133.07,133.05,130.39,123.82,119.73,119.04,118.88,109.22,108.32,103.59,23.04,16.23,6.30.HRMS m/z C₂₆H₂₂N₆O₂:calcd 450.18,found 451.5[M+H]⁺,468.4[M+NH₄]⁺.

操作步骤同Z3，所不同的是使用氨基原料是丙炔胺。

产物为白色固体，产率76.6％，熔点：209-211℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ10.43(s,1H,NH),8.77(s,1H,C₆-pyrimidine-H),8.65–8.57(m,1H,NHCO),7.84(s,2H),7.58–7.38(m,5H),6.95(d,J＝15.9Hz,1H,alkene-H),4.00(dd,J＝5.3,2.3Hz,2H),3.17(t,J＝2.4Hz,1H,alkyne-H),2.14(s,6H,2CH₃).¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆):δ173.14,165.68,165.44,161.93,160.56,159.88,158.45,154.04,144.36,133.20,133.09,133.04,131.31,123.22,119.71,119.03,118.94,117.47,109.24,108.20,103.66,81.48,73.67,28.53,16.23,14.18.HRMS m/z C₂₆H₂₀N₆O₂:calcd 448.16,found 449.4[M+H]⁺,466.4[M+NH₄]⁺.

操作步骤同Z3，所不同的是使用氨基原料是N-(2-氨基乙基)吗啉。

产物为白色固体，产率80.4％，熔点：138-140℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ10.41(s,1H,NH),8.76(s,1H,C₆-pyrimidine-H),8.14(t,J＝5.6Hz,1H,NHCO),7.84(s,2H),7.52(s,1H),7.48(m,4H),6.94(d,J＝15.9Hz,1H,alkene-H),3.64–3.51(m,4H,morpholine-4H),3.31–3.29(m,2H),2.38–2.41(m,6H),2.13(s,6H,2CH₃).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ165.62,161.65,158.37,154.08,144.40,133.21,133.11,133,04,130.42,123.95,119.03,118.89,109.23,108.32,103.61,66.61,58.04,53.77,36.48,16.25.HRMS m/z C₂₉H₂₉N₇O₃:calcd 523.23,found 524.5[M+H]⁺.

操作步骤同Z3，所不同的是使用氨基原料是N-(3-氨丙基)吗啉。

产物为白色固体，产率81.3％，熔点：195-197℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ10.41(s,1H,NH),8.76(s,1H,C₆-pyrimidine-H),8.18(t,J＝5.5Hz,1H,NHCO),7.84(s,2H),7.65–7.32(m,5H),6.91(d,J＝15.9Hz,1H,alkene-H),3.67–3.47(m,4H,morpholine-4H),3.21(dd,J＝12.6,6.6Hz,2H),2.48–2.21(m,6H),2.13(s,6H,2CH₃),1.71–1.51(m,2H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ165.60,165.56,161.61,158.35,154.06,144.39,133.19,133.09,133.02,130.29,124.05,119.70,119.01,118.90,109.23(s),108.35,103.62,66.68,56.40,55.36,53.80,26.55,16.23.HRMS m/zC₃₀H₃₁N₇O₃:calcd 537.25,found538.5[M+H]⁺.

操作步骤同Z3，所不同的是使用氨基原料是2-甲氧基乙胺。

产物为白色固体，产率82.6％，熔点：274-276℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ10.34(s,1H,NH),8.68(s,1H,C₆-pyrimidine-H),8.20(t,J＝5.3Hz,1H,NHCO),7.77(s,2H),7.45(s,1H),7.41(m,4H),6.92(d,J＝15.9Hz,1H,alkene-H),3.34–3.32(m,4H),3.19(s,3H,CH₃),2.07(s,6H,2CH₃).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ165.75,165.62,161.72,158.35,154.09,144.41,133.19,133.11,133.04,130.49,124.05,119.05,118.89,109.19,108.36,103.58,99.99,71.16,58.33,39.03,16.24.HRMSm/zC₂₆H₂₄N₆O₃:calcd 468.19,found 469.4[M+H]⁺.

操作步骤同Z3，所不同的是使用氨基原料是色胺。

产物为白色固体，产率78.4％，熔点：225-228℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ10.83(s,1H),10.41(s,1H,NH),8.77(s,1H,C₆-pyrimidine-H),8.31(t,J＝5.6Hz,1H,NHCO),7.84(s,2H),7.57–7.55(m,2H),7.51–7.48(m,4H),7.34(d,J＝8.1Hz,1H),7.18(d,J＝1.9Hz,1H),7.07(t,J＝7.5Hz,1H),6.99–6.92(m,2H),3.49(dd,J＝13.4,6.9Hz,2H),2.89(t,J＝7.4Hz,2H),2.14(s,6H,2CH₃).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ165.60,161.65,158.34,154.08,144.40,136.71,133.19,133.09,133.04,130.33,127.70,124.15,123.08,121.38,119.72,119.04,119.03,118.74,118.68,112.31,111.83,109.21,103.59,99.98,25.72,16.24.HRMS m/z C₃₃H₂₇N₇O₂:calcd 553.22,found 554.4[M+H]⁺.

操作步骤同Z3，所不同的是使用氨基原料是二甘醇胺。

产物为白色固体，产率79.6％，熔点：234-236℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ10.41(s,1H,NH),8.76(s,1H,C₆-pyrimidine-H),8.25(t,J＝5.5Hz,1H,NHCO),7.84(s,2H),7.53–7.49(m,1H),7.49-7.48(m,4H),6.97(d,J＝15.9Hz,1H,alkene-H),4.60(t,J＝5.5Hz,1H,OH),3.55–3.46(m,4H),3.44(t,J＝5.1Hz,2H),2.14(s,6H,2CH₃).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ165.75,165.61,161.70,158.35,154.07,144.38,133.18,133.10,133.03,130.53,123.94,119.71,118.89,109.20,108.33,103.60,72.59,69.59,60.65,16.24.HRMS m/z C₂₇H₂₆N₆O₄:calcd 498.20,found 499.4[M+H]⁺.

操作步骤同Z3，所不同的是使用氨基原料是吗啉。

产物为白色固体，产率77.1％，熔点：283-285℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ10.48(s,1H,NH),9.05(s,1H,C₆-pyrimidine-H),7.83(s,2H),7.72(d,J＝15.5Hz,1H,alkene-H),7.47(d,J＝7.2Hz,4H),7.38(d,J＝15.5Hz,1H,alkene-H),3.70–3.45(m,8H),2.13(s,6H,2CH₃).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ165.46,164.98,160.37,158.78,154.05,144.33,133.18,133.14,133.01,132.34,119.68,119.01,118.86,118.00,109.20,108.08,103.65,66.67,46.01,42.66,16.23.HRMS m/z C₂₇H₂₄N₆O₃:calcd 480.19,found 479.25[M-H]^-.

操作步骤同Z3，所不同的是使用氨基原料是1-乙酰哌嗪。

产物为白色固体，产率79.2％，熔点：277-279℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ10.48(s,1H,NH),9.05(s,1H,C₆-pyrimidine-H),7.82(s,2H),7.71(d,J＝15.5Hz,1H,alkene-H),7.49–7.46(m,4H),7.40(d,J＝15.6Hz,1H,alkene-H),3.80–3.60(m,4H,piperazine-4H),3.56–3.49(m,4H,piperazine-4H),2.12(s,6H,2CH₃),2.04(s,3H,CH₃).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ168.95,165.47,165.05,158.79,154.05,144.33,133.19,133.15,133.01,119.69,119.01,118.88,109.20,108.07,103.66,55.37,21.74,16.24.HRMS m/z C₂₉H₂₇N₇O₃:calcd 521.22,found 520.33[M-H]^-.

操作步骤同Z3，所不同的是使用氨基原料是1-甲醛哌嗪。

产物为白色固体，产率78.3％，熔点：256-258℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ10.49(s,1H,NH),9.07(s,1H,C₆-pyrimidine-H),8.10(s,1H,aldehyde-H),7.83(s,2H),7.74(d,J＝15.5Hz,1H,alkene-H),7.58–7.36(m,5H),3.66(dd,J＝42.6,22.9Hz,4H,piperazine-4H),3.45(s,4H,piperazine-4H),2.13(s,6H,2CH₃).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ165.45,165.06,161.60,160.25,158.83,154.05,144.32,133.19,133.15,133.02,132.46,119.69,119.02,118.87,117.98,109.19,108.01,103.66,55.38,45.13,16.24.HRMS m/z C₂₈H₂₅N₇O₃:calcd 507.20,found 506.38[M-H]^-.

合成路线二：

实施例4：目标化合物(Z11～Z19,Z22)的制备

将I-5(0.1g，0.24mmol)和2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(0.11g，0.288mmol)溶于DMF(10mL)中，冰浴活化15min，加入N,N-二异丙基乙胺(121μL，0.72mmol)和哌嗪(0.025g，0.288mmol)继续活化15min，室温搅拌6h，TLC检测反应。反应完全后浓缩蒸干。加入40mL水，二氯甲烷萃取(20mL×3)，合并有几层，饱和食盐水(30mL)洗一次，无水Na₂SO₄干燥5h，过滤，浓缩，拌样。柱分离，乙酸乙酯/石油醚重结晶后得到中间体I-6。产率83.4％，熔点：261-263℃。

将I-6(0.3g，0.52mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，加入三氟乙酸(193μL，2.6mmol)，室温搅拌4h，TLC检测反应。反应完全后，向反应中加入饱和NaHCO₃溶液调pH至8-9，之后二氯甲烷萃取(10mL×3)，合并有机层，饱和氯化钠溶液洗(40mL)，无水Na₂SO₄干燥5h，过滤，浓缩，得粗品烘箱干燥。取粗品(0.1g，0.21mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，加入三乙胺(88μL，0.63mmol)，冰浴活化10min，将甲磺酰氯(48.3μL，0.624mmol)溶于1mL中，逐滴加入反应液中，继续活化10min，移至室温，反应6h，TLC检测反应。反应结束后，直接拌样，柱分离，乙酸乙酯/石油醚重结晶后得到终产物Z17。

产物为白色固体，产率75.4％，熔点：200-202℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ10.49(s,1H,NH),9.07(s,1H,C₆-pyrimidine-H),7.83(s,2H),7.74(d,J＝15.5Hz,1H,alkene-H),7.48–7.47(m,4H),7.42(d,J＝15.5Hz,1H,alkene-H),3.77(d,J＝45.2Hz,1H,piperazine-4H),3.17(s,4H,piperazine-4H),2.91(s,3H,CH₃),2.13(s,6H,2CH₃).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ166.32,165.49,165.00,164.76,160.41,158.84,158.42,154.06,144.32,133.22,133.17,133.04,132.71,118.88,118.77,117.83,109.20,103.67,45.70,34.55,16.25.HRMS m/z C₂₈H₂₇N₇O₄S:calcd 557.18,found556.13[M-H]^-.

操作步骤同Z17，所不同的是使用氨基原料是1-Boc-4-氨基哌啶。

产物为白色固体，产率82.6％，熔点：260-262℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ10.41(s,1H,NH),8.76(s,1H,C₆-pyrimidine-H),8.22(d,J＝7.5Hz,1H,NHCO),7.84(s,2H),7.54(s,1H),7.50–7.48(m,4H),6.92(d,J＝15.9Hz,1H,alkene-H),3.82–3.81(m,1H),3.52(d,J＝12.0Hz,2H),2.97–2.78(m,5H),2.14(s,6H,2CH₃),1.92(d,J＝12.9Hz,1H,piperidine-2H),1.46(td,J＝14.7,3.8Hz,2H,piperidine-2H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ165.65,165.03,161.96,158.36,154.07,144.37,133.21,133.09,133.05,130.87,123.85,119.73,119.05,118.91,118.70,109.23,108.28,103.62,103.34,45.76,44.94,44.86,34.68,31.40,31.23,16.25.HRMS m/z C₂₉H₂₉N₇O₄S:calcd571.20,found 570.22[M-H]^-.

操作步骤同Z17，所不同的是使用氨基原料是1-叔丁氧羰基-4-氨甲基哌啶。

产物为白色固体，产率80.9％，熔点：175-177℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ10.40(s,1H,NH),8.76(s,1H,C₆-pyrimidine-H),8.22(t,J＝5.5Hz,1H,NHCO),7.84(s,2H),7.53–7.49(m,5H),6.96(d,J＝15.9Hz,1H,alkene-H),3.56(d,J＝11.0Hz,2H,piperidine-2H),3.13(t,J＝5.8Hz,2H,piperidine-2H),2.84(s,3H,CH₃),2.67(t,J＝11.6Hz,2H,CH₂),2.14(s,6H,2CH₃),1.76(d,J＝12.9Hz,2H,piperidine-2H),1.58(s,1H,piperidine-H),1.20(dd,J＝21.5,10.6Hz,2H,piperidine-2H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ165.78,165.59,161.64,158.35,154.09,144.39,133.19,133.11,133.02,130.45,123.93,119.72,119.03,118.89,118.69,109.21,108.32,103.58,99.98,45.76,44.32,35.55,34.50,29.51,16.26.HRMS m/z C₃₀H₃₁N₇O₄S:calcd 585.22,found 587.32[M+H]⁺.

操作步骤同Z11，所不同的是使用三氟甲磺酸酐代替甲磺酰氯。

产物为白色固体，产率70.6％，熔点：294-296℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ10.42(s,1H,NH),8.77(s,1H,C₆-pyrimidine-H),8.25(d,J＝7.6Hz,1H,NHCO),7.84(s,2H),7.54(s,1H),7.50–7.48(m,4H),6.90(d,J＝15.9Hz,1H,alkene-H),4.08–3.91(m,1H),3.77(d,J＝13.1Hz,2H),3.40(m,2H),2.13–1.94(m,2H,piperazine-4H),1.45(td,J＝14.5,4.1Hz,2H,piperazine-2H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ165.76,165.65,165.12,163.51(d,¹J_CF＝303Hz),158.37,154.04,144.36,133.21,133.08,133.03,131.01,123.73,119.70,119.01,118.92,118.53,109.25,108.25,103.64,45.77,44.91,31.64,16.25.HRMS m/z C₂₉H₂₆F₃N₇O₄S:calcd 625.17,found 626.4[M+H]⁺,643.4[M+NH₄]⁺.

操作步骤同Z11，所不同的是使用三氟乙酸酐代替甲磺酰氯。

产物为白色固体，产率76.2％，熔点：141-143℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ10.41(s,1H,NH),8.76(s,1H,C₆-pyrimidine-H),8.21(d,J＝7.5Hz,1H,NHCO),7.84(s,2H),7.54(s,1H),7.51–7.48(m,4H),6.91(d,J＝15.9Hz,1H,alkene-H),4.19–4.16(m,1H),4.12–3.97(m,1H),3.85–3.81(m,1H),3.41(t,J＝11.9Hz,1H),3.14(t,J＝11.4Hz,1H),2.05–1.85(m,2H),1.44–1.34(m,2H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ167.87,167.22,164.19,160.58,156.71(d,²J_CF＝35.3Hz),156.26,146.79,146.58,135.42,135.39,135.30,135.25,133.17,126.02,121.93,121.24,121.13,120.92,119.11(d,¹J_CF＝289.9Hz),111.46,110.49,105.85,47.88,46.69,44.67,34.49,33.56,18.45,18.43.HRMS m/zC₃₀H₂₆F₃N₇O₃:calcd 589.20,found 590.4[M+H]⁺,607.4[M+NH₄]⁺.

操作步骤同Z17，所不同的是使用氨基原料是1-Boc-3-氨基吡咯烷。

产物为白色固体，产率77.3％，熔点：158-160℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ10.43(s,1H,NH),8.77(s,1H,C₆-pyrimidine-H),8.46(d,J＝6.5Hz,1H,NHCO),7.85(s,2H),7.55(s,1H),7.51–7.48(m,4H),6.94(d,J＝15.8Hz,1H,alkene-H),4.39(dd,J＝11.2,5.7Hz,1H),3.51(dd,J＝10.2,6.4Hz,1H),3.41–3.32(m,4H),3.09(dd,J＝10.2,4.3Hz,1H),2.91(s,3H,CH₃),2.23–2.07(m,7H,2CH₃,pyrrolidine-H),1.85(td,J＝12.6,6.1Hz,1H,pyrrolidine-H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ165.68,162.11,158.39,154.05,144.34,133.21,133.08,133.03,131.22,123.40,119.70,119.01,118.93,109.25,108.22,103.66,53.21,49.59,46.47,33.86,31.36,16.24.HRMS m/zC₂₈H₂₇N₇O₄S:calcd 557.18,found 556.39[M-H]^-.

操作步骤同Z17，所不同的是使用氨基原料是1-叔丁氧羰基-3-(氨基甲基)吡咯烷。

产物为白色固体，产率76.8％，熔点：264-266℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ10.42(s,1H,NH),8.77(s,1H,C₆-pyrimidine-H),8.31(t,J＝5.7Hz,1H,NHCO),7.85(s,2H),7.55(s,1H),7.51–7.48(m,4H),6.93(d,J＝15.9Hz,1H,alkene-H),3.33–3.16(m,5H),2.99–2.95(m,1H),2.90(s,3H,CH₃),2.39(dt,J＝14.3,7.3Hz,1H,pyrrolidine-H),2.14(s,6H,2CH₃),1.98(dt,J＝12.5,6.7Hz,1H,pyrrolidine-H),1.64(dt,J＝18.0,6.6Hz,1H,pyrrolidine-H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ165.86,165.63,161.83,158.37,154.06,144.37,133.20,133.09,133.03,130.82,123.66,119.71,119.02,118.91,109.24,108.27,103.63,55.37,51.36,47.39,41.33,33.60,29.38,16.25.HRMS m/z C₂₉H₂₉N₇O₄S:calcd571.20,found 571.89[M+H]⁺.

操作步骤同Z17，所不同的是使用三氟甲磺酸酐代替甲磺酰氯。

产物为白色固体，产率79.6％，熔点：292-294℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ10.49(s,1H,NH),9.03(s,1H,C₆-pyrimidine-H),7.83(s,2H),7.72(d,J＝15.5Hz,1H,alkene-H),7.48–7.40(m,4H),7.38(d,J＝15.5Hz,1H,alkene-H),3.85–3.82(m,4H,piperazine-4H),3.55(s,4H,piperazine-4H),2.12(s,6H,2CH₃).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ166.53,165.51,164.68,161.12(d,¹J_CF＝185.84Hz),158.44,153.91,144.49,144.29,133.17,133.03,126.54,124.68,119.73,118.97,118.89,118.78,109.20,108.39,103.46,55.37,46.68,46.47,45.90,16.20.HRMS m/zC₂₈H₂₄F₃N₇O₄S:calcd 611.16,found 610.31[M-H]^-.

操作步骤同Z17，所不同的是使用三氟乙酸酐代替甲磺酰氯。

产物为白色固体，产率73.5％，熔点：285-287℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ10.29(s,1H,NH),8.58(s,1H,C₆-pyrimidine-H),7.80(s,2H),7.48(s,4H),6.90(d,J＝12.5Hz,1H,alkene-H),6.47–6.43(m,1H),3.69–3.47(m,8H),2.12(s,6H,2CH₃).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ166.45,164.86,159.83,158.46,154.83(d,²J_CF＝32.32Hz),153.98,144.52,133.16,133.03,126.14,124.52,119.74,119.01,117.00(d,¹J_CF＝358.5Hz),109.14,108.36,103.43,45.78,45.15,43.55,41.04,16.21,16.19.HRMS m/z C₂₉H₂₄F₃N₇O₃:calcd 575.19,found 576.3[M+H]⁺.

操作步骤同Z17，所不同的是使用氨基原料是4-N-(2-胺乙基)-1-N-Boc-哌啶。

产物为白色固体，产率76.4％，熔点：277-279℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ10.42(s,1H,NH),8.77(s,1H,C₆-pyrimidine-H),8.15(t,J＝5.4Hz,1H,NHCO),7.85(s,2H),7.53(s,1H),7.49(s,4H),6.93(d,J＝15.8Hz,1H,alkene-H),3.34–3.29(m,4H),3.10(s,4H),2.87(s,3H,CH₃),2.48–2.45(m,4H,piperazine-4H),2.14(s,6H,2CH₃).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ165.63,165.60,161.61,158.38,154.06,144.38,133.19,133.09,133.02,130.45,123.89,119.70,119.01,118.91,109.23,108.30,103.63,57.09,52.38,45.84,36.75,34.21,16.24.HRMS m/z C₃₀H₃₂N₈O₄S:calcd 600.23,found 601.4[M+H]⁺.

实施例5：目标化合物的体外抗HIV-1NL_4-3病毒株活性测试实验

实验原理：通过检测病毒感染后TZM-bl细胞萤光素酶基因表达的减少来测定化合物对nef基因缺失的HIV-1NL_4-3病毒株的抑制。

实验材料：nef基因缺失的HIV-1NL_4-3病毒株、TZM-bl细胞、待测化合物、对照药ETR。

细胞活性(EC₅₀)测试方法：向接种有TZM-bl细胞(1×10⁵cells/mL)的细胞培养板上(96孔)，向每孔加入不同浓度的待测化合物和阳性对照药ETR。在HIV-1NL_4-3病毒株(50TCID₅₀/孔)感染TZM-bl细胞三天后，收集上清液，通过萤光素酶报告基因检测系统来检测其萤光活性。荧光素酶活性降到一半时所需的浓度为抑制HIV-1药物有效浓度，即EC₅₀。

细胞毒性(CC₅₀)测试方法：使用2,3-双-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲酰苯胺(XTT)比色法测定待测化合物对TZM-bl细胞的体外毒性。向具有等体积细胞(5×10⁵/mL)的96孔板中加入不同浓度梯度的化合物。37℃孵育4天后，加入50μL含有0.02μM吩嗪硫酸甲酯(PMS)的XTT溶液(1mg/mL)。4小时后，测定450nm波长下的吸光度。细胞存活率降到50％时化合物的浓度即为CC₅₀值。选择性系数SI＝CC₅₀/EC₅₀。

按照上述实验方法对合成的部分含有反式双键的二芳基嘧啶类化合物进行了细胞水平的抗HIV-1(NL_4-3)的活性筛选，活性结果如表1所示。

表1.部分含有反式双键的二芳基嘧啶类化合物的抗HIV-1NL_4-3病毒株活性测试结果

^a荧光素酶活性降到一半时所需的浓度为抑制HIV-1药物有效浓度。

^b细胞存活率降到50％时化合物的浓度。

实施例6：代表化合物的体外抗HIV-1IIIB及常见突变株活性实验

测试原理：

化合物体外抗HIV活性筛选采用MTT法。MTT全称为溴化-3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四唑氮(商品名：噻唑蓝),可用于检测细胞的存活和生长。检测原理为：MTT可以与活的细胞内琥珀酸脱氢酶结合还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒沉积在细胞中，而死细胞并无此功能。二甲基亚砜可以溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪检测其在590nm下的吸光度(A)值可以间接的反映活细胞的数量。在一定的细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

由于HIV感染的MT-4细胞在一定时间内(5-7天)会发生病变，因此向HIV感染的MT-4细胞悬浊液中加入适当浓度的待检测化合物溶液，经过一段时间(5-7天)的培养后，用MTT分析法测定MT-4细胞活力，得到保护50％细胞免于细胞病变的药物浓度(EC₅₀)即可得出目标化合物的抗HIV的活性。同时得到目标化合物使50％未感染HIV的细胞发生病变的浓度(CC₅₀),计算出选择系数(selectivity index，SI＝CC₅₀/EC₅₀)。

测试材料和方法：

(1)HIV-1(III_B)、HIV-2(ROD)毒株、各种HIV-1耐药株：由比利时鲁汶大学医学院Rega研究所提供。

(2)MT-4细胞：由比利时鲁汶大学医学院Rega研究院提供。

(3)MTT：购自美国Sigma公司。

(4)样品处理：样品临用前溶于DMSO配成适当浓度，并用双蒸水作5倍稀释，各5个稀释度。

(5)阳性对照药：奈韦拉平(NVP)、依法韦仑(EFV)、依曲韦林(ETV)、齐多夫定(AZT)。

(6)测试方法：样品稀释后加入到HIV感染MT-4细胞悬浊液中，经过一段时间后用MTT比色法测定细胞活力，用酶标仪中记录在590nm下的吸光度(A)值,计算出EC₅₀，CC₅₀以及SI。

(7)MTT比色法：加入样品溶液培养一段时间后，向每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL，继续培养若干小时后，弃染色液，并向每孔加入150μL DMSO，充分混合，用酶标仪中测定590nm下的吸光度(A)值。

实验方法：

在96孔细胞培养板上，加入50μL含1×10⁴MT-4细胞培养液，再分别加入20μL感染HIV-1(III_B或者RES056)或HIV-2(ROD)的MT-4细胞混悬液(每毫升含100倍CCID₅₀)或者空白(毒性测定)，然后加入不同浓度的待测化合物溶液或者阳性对照药物，每个浓度设计3个复孔。接着细胞在5％CO₂氛围，37℃下培养5天，向每个孔中加入20μL(5mg/mL)MTT溶液，继续培养2h，然后加入DMSO，使用酶标仪测定反应溶液在540nm处的吸收度，计算化合物不同浓度下的细胞增值率P％。同时设空白和药物对照组和阳性药物对照组，由此计算化合物保护50％的细胞免于HIV诱导的细胞病变所需浓度(EC₅₀)。选择指数的计算：SI＝CC₅₀/EC₅₀。

按照上述实验方法对合成的代表化合物进行了细胞水平的抗HIV-1(III_B)，单突变株K103N、Y181C、Y188L以及双突变株RES056(K103N/Y181C)的活性筛选，活性结果如表2和表3所示。

表2.代表化合物抗HIV活性结果

^cEC₅₀:抑制50％的病毒诱导的致细胞突变效应的化合物浓度或保护50％感染病毒的细胞免于细胞病变的化合物浓度。

^dCC₅₀：使50％未感染HIV的细胞发生病变的浓度。

表3.代表化合物抗HIV-1突变株活性

4.结论

由表1、表2和表3可以看出，本发明的含有反式双键的二芳基嘧啶衍生物是一系列结构新颖的非核苷类HIV-1抑制剂，绝大部分化合物表现出了较好的抑制野生株和突变株的活性。其中，化合物Z4活性较为突出，其在TZM-bl细胞中抑制NL_4-3病毒株的活性(EC₅₀＝2.45nM，SI>91)与ETR相当(EC₅₀＝1.45nM，SI>158)。在MT-4细胞中，Z4(EC₅₀＝5.2nM)对HIV-1III_B毒株的抑制活性与ETR(EC₅₀＝3.0nM)活性相当。同时，Z4(CC₅₀＝140μM，SI＝26934)的细胞毒性较低，并表现出了极高的选择性指数。在抗耐药株活性测试中，Z4(EC₅₀＝10.6nM)抑制单突变株E138K的活性与ETR(EC₅₀＝9.8nM)活性相当。因此该类二芳基嘧啶类化合物具有进一步研发的价值，可作为抗HIV-1的先导化合物加以利用。