禽流感病毒抗原表位筛选方法和应用
阅读说明：本技术 禽流感病毒抗原表位筛选方法和应用 (Avian influenza virus epitope screening method and application ) 是由 黄锐坤 房师松 于 2020-05-19 设计创作，主要内容包括：本申请涉及抗原筛选技术领域,提供了一种禽流感病毒抗原表位筛选方法,先判断所述目的禽流感病毒HA蛋白的具有遗传稳定性的保守性区域；再构建所述目的禽流感病毒的HA蛋白的三维结构,进一步的,对预测得到的CTL抗原表位、Th抗原表位、B细胞抗原表位进一步进行筛选,筛选位于所述保守性区域且所述三维结构的茎部区域的目的CTL抗原表位、目的Th抗原表位以及目的B细胞抗原表位。该筛选方法结合了病毒序列的保守性区域以及其三维结构,同时结合软件预测得到的抗原表位的信息,可以准确地、快速地筛选得到目的抗原表位,筛选得到的目的抗原表位位于HA蛋白的稳定区域,具有一定的稳定性和有效性；该筛选方法操作简单,可操作性强。(The application relates to the technical field of antigen screening, and provides a method for screening avian influenza virus epitope, which comprises the steps of firstly judging a conservative region with genetic stability of a target avian influenza virus HA protein; and then constructing a three-dimensional structure of the HA protein of the target avian influenza virus, further screening the predicted CTL epitope, Th epitope and B cell epitope, and screening the target CTL epitope, Th epitope and B cell epitope which are located in the conservative region and in the stem region of the three-dimensional structure. The screening method combines the conserved region and the three-dimensional structure of the virus sequence, and simultaneously combines the information of the epitope predicted by software, so that the target epitope can be accurately and quickly screened, is positioned in the stable region of the HA protein, and HAs certain stability and effectiveness; the screening method is simple to operate and high in operability.)
技术领域
本申请属于抗原筛选技术领域，尤其涉及一种禽流感病毒抗原表位筛选方法和应用。
背景技术
禽流感(AI)是一种重要的人、畜和禽共患的传染病，其致病原禽流感病毒(AIV)易于发生抗原漂移和抗原改变，从而快速产生新流行毒株并导致在人和禽中间大暴发流行。
禽流感病毒(AIV)属甲型流感病毒。流感病毒属于RNA病毒的正黏病毒科，分甲、乙、丙3个型。其中，甲型流感病毒呈多形性，球形直径80～120nm，有囊膜。基因组为分节段单股负链RNA。依据其外膜血凝素(H)/和神经氨酸酶(N)蛋白抗原性的不同，可分为16个H亚型(H1～H16)和9个N亚型(N1～N9)。感染人的禽流感病毒亚型主要为H5N1、H9N2、H7N7，其中感染H5N1的患者病情重，病死率高。
禽流感病毒(AIV)作为一种RNA病毒，其基因组具有较高突变几率和频繁重组的特性。血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)是禽流感病毒的主要表面抗原蛋白，目前大多数流感疫苗都以病毒的特征蛋白之一——血凝素HA蛋白的头部外露区域进行抗原设计，但是，其变异后会导致AIV抗原性、致病性和毒力发生改变，这导致了目前得到的抗原表位易由于血凝素HA蛋白的头部区域的高变异性而影响了稳定性和有效性，导致当季流感疫苗株与病毒流行株的差异，得到的抗原表位无法具有通用性和稳定性。
发明内容
本申请的目的在于提供一种禽流感病毒抗原表位筛选方法和应用，旨在解决现有技术中禽流感病毒抗原表位的筛选方法通用性差，筛选得到的抗原表位稳定性弱的问题。
为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：
第一方面，本申请提供一种禽流感病毒抗原表位筛选方法，包括如下步骤：
确定所述目的禽流感病毒的HA蛋白的氨基酸序列的保守性区域；
对所述目的禽流感病毒的HA蛋白的氨基酸序列进行三维结构模拟，得到目的禽流感病毒的HA蛋白的三维结构；
对所述目的禽流感病毒的HA蛋白的CTL抗原表位、Th抗原表位、B细胞抗原表位分别进行预测，得到预测CTL抗原表位、预测Th抗原表位、预测B细胞抗原表位；
将所述预测CTL抗原表位、所述预测Th抗原表位以及所述预测B细胞表位与所述目的禽流感病毒的HA蛋白的三维结构进行比对，确定所述预测CTL抗原表位、所述预测Th抗原表位以及所述预测B细胞抗原表位在所述目的禽流感病毒的HA蛋白的三维结构的位置，筛选位于所述保守性区域且所述三维结构的茎部区域的目的CTL抗原表位、目的Th抗原表位以及目的B细胞抗原表位。
第二方面，本申请提供一种禽流感病毒抗原表位筛选方法的应用，所述禽流感病毒抗原表位筛选方法用于禽流感疫苗的制备。
本申请第一方面提供的禽流感病毒抗原表位筛选方法，先判断目的禽流感病毒HA蛋白的具有遗传稳定性的保守性区域；再构建目的禽流感病毒的HA蛋白的三维结构，有利于对后续预测得到抗原表位的肽段在三维结构中进行精准定位，有利于对肽段进行筛选；进一步的，由于血凝素HA蛋白的头部区域的高变异性而影响了稳定性和有效性，对预测得到的CTL抗原表位、Th抗原表位、B细胞抗原表位进一步进行筛选，筛选位于保守性区域且三维结构的茎部区域的目的CTL抗原表位、目的Th抗原表位以及目的B细胞抗原表位。
该筛选方法结合了病毒序列的保守性区域以及其三维结构，同时结合软件预测得到的抗原表位的信息，可以准确地、快速地筛选得到目的抗原表位，筛选得到的目的抗原表位位于HA蛋白的稳定区域，具有一定的稳定性和有效性；同时该筛选方法操作简单，可操作性强，可广泛应用于各种禽流感病毒的抗原表位筛选。
本申请第二方面提供的一种禽流感病毒抗原表位筛选方法的应用，采用上述禽流感病毒抗原表位筛选方法，可准确地、快速地筛选得到目的抗原表位且筛选得到的目的抗原表位位于HA蛋白的稳定区域，具有一定的稳定性和有效性，可广泛用于禽流感疫苗的制备，应用范围广，效果佳。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本申请实施例提供的H9N2禽流感病毒的HA蛋白的氨基酸序列比对结果图。
图2是本申请实施例提供的H9N2禽流感病毒的HA蛋白的三维结构。
图3是本申请实施例提供的H9N2目的禽流感病毒的HA蛋白的二级结构的分析结果。
图4是本申请实施例提供的H9N2目的禽流感病毒的HA蛋白的抗原性的分析结果。
图5是本申请实施例提供的H9N2目的禽流感病毒的HA蛋白的亲水性的分析结果。
图6是本申请实施例提供的H9N2目的禽流感病毒的HA蛋白的延展性的分析结果。
图7是本申请实施例提供的H9N2蛋白T细胞表位Ifn-r检测结果。
图8是本申请实施例提供的小鼠脾脏CD4细胞流式结果。
图9是本申请实施例提供的小鼠脾脏CD8细胞流式结果。
图10是本申请实施例提供的小鼠血浆CD4细胞流式结果。
图11是本申请实施例提供的小鼠血浆CD8细胞流式结果。
图12是本申请实施例提供的H9N2病毒T细胞抗原表位(CTL)细胞增殖结果。
图13是本申请实施例提供的H9N2病毒T细胞抗原表位(Th)细胞增殖结果。
图14是本申请实施例提供的病毒的血清对流感病毒蛋白的中和能力的结果。
图15是本申请实施例提供的B1抗原表位的血清对流感病毒蛋白的中和能力的结果。
图16是本申请实施例提供的B2抗原表位的血清对流感病毒蛋白的中和能力的结果。
图17是本申请实施例提供的B3抗原表位的血清对流感病毒蛋白的中和能力的结果。
具体实施方式
为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。
本申请实施例第一方面提供一种禽流感病毒抗原表位筛选方法，包括如下步骤：
S01.确定目的禽流感病毒的HA蛋白的氨基酸序列的保守性区域；
S02.对目的禽流感病毒的HA蛋白的氨基酸序列进行三维结构模拟，得到目的禽流感病毒的HA蛋白的三维结构；
S03.对目的禽流感病毒的HA蛋白的CTL抗原表位、Th抗原表位、B细胞抗原表位分别进行预测，得到预测CTL抗原表位、预测Th抗原表位、预测B细胞抗原表位；
S04.将预测CTL抗原表位、预测Th抗原表位以及预测B细胞表位与目的禽流感病毒的HA蛋白的三维结构进行比对，确定预测CTL抗原表位、预测Th抗原表位以及预测B细胞抗原表位在目的禽流感病毒的HA蛋白的三维结构的位置，筛选位于保守性区域且三维结构的茎部区域的目的CTL抗原表位、目的Th抗原表位以及目的B细胞抗原表位。
本申请提供的禽流感病毒抗原表位筛选方法，先判断目的禽流感病毒HA蛋白的具有遗传稳定性的保守性区域和构建目的禽流感病毒的HA蛋白的三维结构；进一步，对预测得到的CTL抗原表位、Th抗原表位、B细胞抗原表位进一步进行筛选，筛选位于保守性区域且三维结构的茎部区域的目的CTL抗原表位、目的Th抗原表位以及目的B细胞抗原表位。
具体的，在上述步骤S01中，确定目的禽流感病毒的HA蛋白的氨基酸序列的保守性区域，优选的，确定所述目的禽流感病毒的HA蛋白的氨基酸序列的保守性区域的步骤中，提供目的禽流感病毒的HA蛋白的氨基酸序列，与所述目的禽流感病毒的相同亚型的禽流感病毒HA蛋白的氨基酸序列进行序列比对，其中，采用MEGA-X、Clustal-W、Clustal-X的任意一种软件进行序列比对。采用MEGA-X、Clustal-W、Clustal-X的任意一种软件进行序列比对，通过序列比对可以分析得到目的禽流感病毒的HA蛋白的氨基酸序列的保守性区域，其中，保守性区域的氨基酸指的是具有高度相似性或同一性的分子序列，在进化过程中基本保持不变，具有一定的遗传稳定性，在遗传过程中，不易出现变异，稳定性较高。
优选的，目的禽流感病毒的相同亚型的禽流感病毒HA蛋白的氨基酸序列可从从NCBI流感病毒数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/Database/nph-select.cgi？go＝database)下载得到。
具体的，在上述步骤S02中，对目的禽流感病毒的HA蛋白的氨基酸序列进行三维结构模拟，得到目的禽流感病毒的HA蛋白的三维结构，通过构建三维结构，有利于对后续预测得到抗原表位的肽段在三维结构中进行精准定位，对有利于对肽段进行筛选。
优选的，对目的禽流感病毒的HA蛋白的氨基酸序列进行三维结构模拟的步骤中，包括以下方法：提供目的禽流感病毒的HA蛋白的氨基酸序列，利用SWISS-MODEL网站(https://swissmodel.expasy.org/)在线分析得到目的禽流感病毒的HA蛋白的三维结构，SWISS-MODEL网站通过将目的序列与数据库中已知结构的蛋白进行比对进而分析得到目的禽流感病毒的HA蛋白的三维结构。
具体的，在上述步骤S03中，对目的禽流感病毒的HA蛋白的CTL抗原表位、Th抗原表位、B细胞抗原表位分别进行预测，得到预测CTL抗原表位、预测Th抗原表位、预测B细胞抗原表位。
优选的，对目的禽流感病毒的HA蛋白的CTL抗原表位、Th抗原表位进行预测的步骤中，采用SYFPEITHI软件预测CTL抗原表位以及Th抗原表位，利用SYFPEITHI软件预测，可分析得到目的禽流感病毒的HA蛋白中预测CTL抗原表位以及预测Th抗原表位。在一些实施例中，采用SYFPEITHI软件预测的过程中，进一步对某一种类的人群普遍携带T细胞位点
进行进一步限定，通过对普遍携带T细胞位点进一步进行限定，可提高抗原表位位点选择的准确性。
优选的，对目的禽流感病毒的HA蛋白的B细胞抗原表位进行预测的步骤中，采用Protean 3D软件预测目的禽流感病毒的HA蛋白的二级结构、抗原性、亲水性和延展性，当目的禽流感病毒的HA蛋白的某一肽段的抗原性、亲水性、延展性的评分均为0～3分时，肽段为预测B细胞抗原表位。由于B细胞抗原表位在蛋白中通常经过修饰，获取的氨基酸或基因序列没有明确修饰的位置和方法，B细胞的免疫应答是指受到抗原刺激之后，B细胞进行细胞分化阶段，形成浆细胞和记忆B细胞再起到免疫应答的作用，因此无法直接通过软件预测B细胞抗原表位，而是采用Protean 3D软件预测目的禽流感病毒的HA蛋白的二级结构、抗原性、亲水性和延展性，结合软件给出的评分，当目的禽流感病毒的HA蛋白的某一肽段的抗原性、亲水性、延展性的评分均为0～3分时，肽段为预测B细胞抗原表位。
具体的，在上述步骤S04中，将预测CTL抗原表位、预测Th抗原表位以及预测B细胞表位与目的禽流感病毒的HA蛋白的三维结构进行比对，确定预测CTL抗原表位、预测Th抗原表位以及预测B细胞抗原表位在目的禽流感病毒的HA蛋白的三维结构的位置，筛选位于保守性区域且三维结构的茎部区域的目的CTL抗原表位、目的Th抗原表位以及目的B细胞抗原表位。将各个预测得到的抗原表位，与目的禽流感病毒的HA蛋白的三维结构进行比对，确定预测CTL抗原表位、预测Th抗原表位以及预测B细胞抗原表位在目的禽流感病毒的HA蛋白的三维结构的位置，由于血凝素HA蛋白的头部区域的高变异性而影响了稳定性和有效性，因此，通过此方法，能够筛选得到为目的禽流感病毒的HA蛋白的氨基酸序列的保守性区域，且位于目的禽流感病毒的HA蛋白的三维结构的茎部区域的目的CTL抗原表位、目的Th抗原表位以及目的B细胞抗原表位。
优选的，禽流感病毒抗原表位筛选方法适用于H5N1亚型的禽流感病毒、H9N2亚型的禽流感病毒、H7N7亚型的禽流感病毒的任意一种。采用禽流感病毒抗原表位筛选方法，可分别分析不同亚型的禽流感病毒的抗原表位。该筛选方法结合了病毒序列的保守性区域以及其三维结构，同时结合软件预测得到的抗原表位的信息，可以准确地、快速地筛选得到目的抗原表位，筛选得到的目的抗原表位位于HA蛋白的稳定区域，具有一定的稳定性和有效性；同时该筛选方法操作简单，可操作性强，可广泛应用于各种禽流感病毒的抗原表位筛选。
优选的，以H9N2亚型的禽流感病毒为目的禽流感病毒进行抗原表位筛选，禽流感病毒抗原表位筛选方法包括如下步骤：
G01.提供H9N2禽流感病毒的HA蛋白的氨基酸序列，与H9N2禽流感病毒的相同亚型的禽流感病毒HA蛋白的氨基酸序列进行序列比对，确定H9N2禽流感病毒的HA蛋白的氨基酸序列的保守性区域；
G02.对H9N2禽流感病毒的HA蛋白的氨基酸序列进行三维结构模拟，得到H9N2禽流感病毒的HA蛋白的三维结构；
G03.对H9N2禽流感病毒的HA蛋白的CTL抗原表位、Th抗原表位、B细胞表位分别进行预测，得到预测CTL抗原表位、预测Th抗原表位、预测B细胞表位；
G04.将预测CTL抗原表位、预测Th抗原表位以及预测B细胞表位与目的禽流感病毒的HA蛋白的三维结构进行比对，确定预测CTL抗原表位、预测Th抗原表位以及预测B细胞表位在目的禽流感病毒的HA蛋白的三维结构的位置，筛选位于保守性区域且三维结构的茎部区域的目的CTL抗原表位、目的Th抗原表位以及目的B细胞抗原表位。
优选的，在上述步骤G01中，H9N2禽流感病毒的HA蛋白的氨基酸序列的编号为A/Guangdong/MZ058/2016.06.15/HA。进一步的，与H9N2禽流感病毒的相同亚型的禽流感病毒HA蛋白的氨基酸序列进行序列比对，其中，H9N2禽流感病毒的相同亚型的禽流感病毒HA蛋白的氨基酸序列包括A/Hunan/44557/2015.11.30/HA、A/Lengshuitan/11197/2013.11.20/HA和A/Zhongshan/201501/2015.02.07/HA。
优选的，使用MEGA-X将序列A/Guangdong/MZ058/2016.06.15/HA与序列A/Hunan/44557/2015.11.30/HA、序列A/Lengshuitan/11197/2013.11.20/HA和序列A/Zhongshan/201501/2015.02.07/HA进行蛋白序列比对，确定H9N2禽流感病毒的HA蛋白的氨基酸序列的保守性区域。
在上述步骤S02中，对H9N2禽流感病毒的HA蛋白的氨基酸序列A/Guangdong/MZ058/2016.06.15/HA进行三维结构模拟，通过构建三维结构，有利于对后续预测得到抗原表位的肽段在三维结构中进行精准定位，对有利于对肽段进行筛选。
优选的，对H9N2禽流感病毒的HA蛋白的氨基酸序列A/Guangdong/MZ058/2016.06.15/HA进行三维结构模拟的步骤中，包括以下方法：提供A/Guangdong/MZ058/2016.06.15/HA序列，利用SWISS-MODEL网站(https://swissmodel.expasy.org/)在线分析得到H9N2禽流感病毒的HA蛋白的三维结构。
具体的，在上述步骤G03中，对H9N2禽流感病毒的HA蛋白的CTL抗原表位、Th抗原表位、B细胞表位分别进行预测，得到预测CTL抗原表位、预测Th抗原表位、预测B细胞表位。
优选的，对目的禽流感病毒的HA蛋白的CTL抗原表位、Th抗原表位进行预测的步骤中，采用SYFPEITHI软件预测CTL抗原表位以及Th抗原表位，利用SYFPEITHI软件预测，可分析得到目的禽流感病毒的HA蛋白中预测CTL抗原表位以及预测Th抗原表位。
进一步优选的，由于涉及的禽流感病毒的序列均为中国人提供的序列，采用SYFPEITHI软件预测的过程中，对中国人普遍携带T细胞位点进一步进行限定，通过对普遍携带T细胞位点进一步进行限定，可提高抗原表位位点选择的准确性。在本发明优选实施例中，中国人普遍携带T细胞位点包括HLA-A*02:01、HLA-A*11:01、HLA-DRB1*07:01、HLA-DRB1*08:01、HLA-DRB 1*11:01和HLA-DRB1*13:01。
优选的，对目的禽流感病毒的HA蛋白的B细胞抗原表位进行预测的步骤中，采用Protean 3D软件预测目的禽流感病毒的HA蛋白的二级结构、抗原性、亲水性和延展性，当目的禽流感病毒的HA蛋白的某一肽段的抗原性、亲水性、延展性的评分均为0～3分时，肽段为预测B细胞抗原表位。由于B细胞抗原表位在蛋白中通常经过修饰，获取的氨基酸或基因序列没有明确修饰的位置和方法，B细胞的免疫应答是指受到抗原刺激之后，B细胞进行细胞分化阶段，形成浆细胞和记忆B细胞再起到免疫应答的作用，因此无法直接通过软件预测B细胞抗原表位，而是采用Protean 3D软件预测目的禽流感病毒的HA蛋白的二级结构、抗原性、亲水性和延展性，结合软件给出的评分，当目的禽流感病毒的HA蛋白的某一肽段的抗原性、亲水性、延展性的评分均为0～3分时，肽段为预测B细胞抗原表位。
具体的，在上述步骤G04中，将所述预测CTL抗原表位、所述预测Th抗原表位以及所述预测B细胞表位与所述目的禽流感病毒的HA蛋白的三维结构进行比对，确定所述预测CTL抗原表位、所述预测Th抗原表位以及所述预测B细胞表位在所述目的禽流感病毒的HA蛋白的三维结构的位置，筛选位于所述保守性区域且所述三维结构的茎部区域的目的CTL抗原表位、目的Th抗原表位以及目的B细胞抗原表位。
优选的，H9N2的目的CTL抗原表位包括肽段SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3以及SEQ ID No.4。其中，SEQ ID No.1的序列为TLTENNVPV；SEQ ID No.2的序列为KLAVGLRNV；SEQ ID No.3的序列为KAIDKITSK；SEQ ID No.4的序列为GSNAVEDGK。
优选的，H9N2的目的Th抗原表位包括肽段SEQ ID No.5、SEQ ID No.6以及SEQ IDNo.7。其中，SEQ ID No.5的序列为CSKYIGIKSLKLAVG；SEQ ID No.6的序列为NKQYEIIDHEFSEVE；SEQ ID No.7的序列为YKILTIYSTVASSLV。
优选的，H9N2的目的B细胞抗原表位包括肽段SEQ ID No.8、SEQ ID No.9以及SEQID No.10。其中，SEQ ID No.8的序列为QSTNSTETVDTLTENNVPVT；SEQ ID No.9的序列为CQTEKGGLN；SEQ ID No.10的序列为GQTLRIKSDGNLI。
该筛选方法结合了H9N2病毒序列的保守性区域以及其三维结构，同时结合软件预测得到的抗原表位的信息，可以准确地、快速地筛选得到目的抗原表位，筛选得到的目的抗原表位位于HA蛋白的稳定区域，具有一定的稳定性和有效性；同时该筛选方法操作简单，可操作性强，可广泛应用于各种禽流感病毒的抗原表位筛选。
第二方面，本申请提供一种禽流感病毒抗原表位筛选方法的应用，禽流感病毒抗原表位筛选方法用于禽流感疫苗的制备。
本申请第二方面提供的一种禽流感病毒抗原表位筛选方法的应用，采用上述禽流感病毒抗原表位筛选方法，可准确地、快速地筛选得到目的抗原表位且筛选得到的目的抗原表位位于HA蛋白的稳定区域，具有一定的稳定性和有效性，可广泛用于禽流感疫苗的制备，应用范围广，效果佳。
下面结合具体实施例进行说明。
实施例1
以H9N2亚型的禽流感病毒为目的禽流感病毒进行抗原表位筛选，禽流感病毒抗原表位筛选方法包括如下步骤：
提供H9N2禽流感病毒的HA蛋白的氨基酸序列为A/Guangdong/MZ058/2016.06.15/HA，与H9N2禽流感病毒的相同亚型的禽流感病毒HA蛋白的氨基酸序列(A/Hunan/44557/2015.11.30/HA、A/Lengshuitan/11197/2013.11.20/HA和A/Zhongshan/201501/2015.02.07/HA)采用MEGA-X进行序列比对，确定H9N2禽流感病毒的HA蛋白的氨基酸序列的保守性区域；
利用SWISS-MODEL网站(https://swissmodel.expasy.org/)对H9N2禽流感病毒的HA蛋白的氨基酸序列进行三维结构模拟，得到H9N2禽流感病毒的HA蛋白的三维结构；
采用SYFPEITHI软件对中国人普遍携带T细胞位点HLA-A*02:01、HLA-A*11:01、HLA-DRB1*07:01、HLA-DRB1*08:01、HLA-DRB 1*11:01和HLA-DRB1*13:01进行预测，预测CTL抗原表位以及Th抗原表位得到预测H9N2-CTL抗原表位、预测H9N2-Th抗原表位；
采用Protean 3D软件预测H9N2目的禽流感病毒的HA蛋白的二级结构、抗原性、亲水性和延展性，当H9N2目的禽流感病毒的HA蛋白的某一肽段的抗原性、亲水性、延展性的评分均为0～3分时，肽段为预测B细胞抗原表位；
将预测H9N2-CTL抗原表位、预测H9N2-Th抗原表位以及预测H9N2-B细胞表位与目的禽流感病毒的HA蛋白的三维结构进行比对，确定预测H9N2-CTL抗原表位、预测H9N2-Th抗原表位以及预测H9N2-B细胞表位在目的禽流感病毒的HA蛋白的三维结构的位置，筛选得到为目的禽流感病毒的HA蛋白的氨基酸序列的保守性区域，且位于目的禽流感病毒的HA蛋白的三维结构的茎部区域的目的H9N2-CTL抗原表位、目的H9N2-Th抗原表位以及目的H9N2-B细胞抗原表位。
结果分析
(1)H9N2禽流感病毒的HA蛋白的氨基酸序列的保守性区域的结果
如附图1所示，将H9N2禽流感病毒的HA蛋白的氨基酸序列A/Guangdong/MZ058/2016.06.15/H与H9N2禽流感病毒的相同亚型的禽流感病毒HA蛋白的氨基酸序列(A/Hunan/44557/2015.11.30/HA、A/Lengshuitan/11197/2013.11.20/HA和A/Zhongshan/201501/2015.02.07/HA)采用MEGA-X进行序列比对；通过对以上各病毒样株的HA蛋白进行序列比对，发现所有病毒样株HA蛋白的同源性基本一致。除了个别氨基酸肽链区域进行了同义突变外，蛋白的肽链长度没有发生变化。
(2)H9N2禽流感病毒的HA蛋白的三维结构
如附图2所示，为H9N2禽流感病毒的HA蛋白的三维结构，提供了H9N2禽流感病毒的HA蛋白的三维结构，有利于逐一对后续筛选出的抗原表位序列进行比对，来确定预测表位在蛋白实际结构中的位置，筛选出所需的抗原位点。
(3)预测得到的H9N2-CTL抗原表位以及预测得到的H9N2-Th抗原表位
采用SYFPEITHI软件对中国人普遍携带T细胞位点HLA-A*02:01、HLA-A*11:01、HLA-DRB1*07:01、HLA-DRB1*08:01、HLA-DRB 1*11:01和HLA-DRB1*13:01进行预测，得到的预测H9N2-CTL抗原表位如下表1所示，一共有26个预测H9N2-CTL抗原表位，但仍需要通过下一步对抗原表位的位置进行确定，再进一步筛选得到目的H9N2-CTL抗原表位；得到的预测H9N2-Th抗原表位如下表2所示，共有10个预测H9N2-Th抗原表位，但仍需要通过下一步对抗原表位的位置进行确定，再进一步筛选得到目的H9N2-Th抗原表位。
表1
表2
(4)预测得到的B细胞抗原表位
采用Protean 3D软件预测H9N2目的禽流感病毒的HA蛋白的二级结构、抗原性、亲水性和延展性，其中，如附图3所示，为H9N2目的禽流感病毒的HA蛋白的二级结构的分析结果；如附图4所示，为H9N2目的禽流感病毒的HA蛋白的抗原性的分析结果；如附图5所示，为H9N2目的禽流感病毒的HA蛋白的亲水性的分析结果；如附图6所示，为H9N2目的禽流感病毒的HA蛋白的延展性的分析结果；由于B细胞表位通常具有以下特征：拥有α-螺旋、较高的亲水性、对受体分子有一定的构象改变能力(即无序性)和较高的抗原性，根据软件分析的结果，统计H9N2目的禽流感病毒的HA蛋白的某一肽段的抗原性、亲水性、延展性的评分均为0～3分时，肽段为预测B细胞抗原表位；得到的预测H9N2-B抗原表位如下表3所示，共有9个预测H9N2-B抗原表位，但仍需要通过下一步对抗原表位的位置进行确定，再进一步筛选得到目的H9N2-B抗原表位。
表3
(5)进一步筛选得到目的H9N2-CTL抗原表位、目的H9N2-Th抗原表位以及目的H9N2-B细胞抗原表位
将预测H9N2-CTL抗原表位、预测H9N2-Th抗原表位以及预测H9N2-B细胞表位与目的禽流感病毒的HA蛋白的三维结构进行比对，确定预测H9N2-CTL抗原表位、预测H9N2-Th抗原表位以及预测H9N2-B细胞表位在目的禽流感病毒的HA蛋白的三维结构的位置，筛选得到为目的禽流感病毒的HA蛋白的氨基酸序列的保守性区域，且位于目的禽流感病毒的HA蛋白的三维结构的茎部区域的目的H9N2-CTL抗原表位、目的H9N2-Th抗原表位以及目的H9N2-B细胞抗原表位。
其中，如下表4所示，目的H9N2-CTL抗原表位包括肽段SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3以及SEQ ID No.4；其中，SEQ ID No.1的序列为TLTENNVPV；SEQ ID No.2的序列为KLAVGLRNV；SEQ ID No.3的序列为KAIDKITSK；SEQ ID No.4的序列为GSNAVEDGK。
表4
如下表5所示，目的H9N2-Th抗原表位包括肽段SEQ ID No.5、SEQ ID No.6以及SEQID No.7；其中，SEQ ID No.5的序列为CSKYIGIKSLKLAVG；SEQ ID No.6的序列为NKQYEIIDHEFSEVE；SEQ ID No.7的序列为YKILTIYSTVASSLV。
如下表6所示，目的H9N2-B细胞抗原表位包括肽段SEQ ID No.8、SEQ ID No.9以及SEQ ID No.10；其中，SEQ ID No.8的序列为QSTNSTETVDTLTENNVPVT；SEQ ID No.9的序列为CQTEKGGLN；SEQ ID No.10的序列为GQTLRIKSDGNLI。
表6
实施例2
对实施例1得到的目的H9N2-CTL抗原表位(SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3以及SEQ ID No.4)、目的H9N2-Th抗原表位(SEQ ID No.5、SEQ ID No.6以及SEQ IDNo.7)以及目的H9N2-B细胞抗原表位(SEQ ID No.8、SEQ ID No.9以及SEQ ID No.10)进行抗原表位的验证试验，分别包括如下验证试验：
(1)病毒TCID50检测试验
试验步骤如下：
①病毒样株为深圳市疾病预防与控制中心(CDC)保存的毒株，：A/Guangdong/MZ058/2016.06.15/HA。取出病毒原液并且释成4个滴度的接种液之后，往培养了10天鸡胚中，分别注射250ul到羊膜腔和尿囊腔中。用通明胶带封上被破开的鸡蛋气室，37℃鸡胚培养箱培养48h；
②取出鸡蛋，用灭菌的玻璃移液管吸取鸡蛋尿囊腔及羊膜腔中的液体，转机至不带滤膜的T75细胞培养瓶中。TCID50检测种植后的病毒滴度；
③加入0.15％(v/v)β-丙内脂，4℃摇床混匀16h；
④PBS稀释成4滴度，再次鸡胚扩增48h后，TCID50验证病毒灭活是否完全。
(2)前处理试验：T细胞培养
设计的T细胞表位由于无法直接诱导T细胞的激活和增殖等免疫反应，因此本课题的T细胞表位验证试验为体外验证，通过体外培养T细胞，使用表位进行二次免疫，来验证合成T表位的效果。
试验步骤如下：
①16周龄的BALB/c小鼠，分成对照组，实验组，每组15只。于第0天皮下注射灭活病毒200ul(100ul弗氏完全佐剂+100ul灭活病毒原液)。SPF动物房饲养7天。在超净台无菌环境下解剖取出脾脏，研磨过滤，备用。
②往制备的脾细胞悬液中加入3倍体积红细胞裂解液，转移至15ml离心管中，离心(250g，10min)，弃上清。
③加入10ml PBS，重悬细胞，离心(250g，10min)，弃上清。
④再次加入10ml PBS，重悬细胞，离心(250g，10min)，弃上清。
⑤用脾细胞培养基(90％RPMI1640，10％FBS)重悬细胞并转移至培养基，37℃培养。
(3)细胞因子的酶联免疫吸附测定试验
试验步骤如下：
①将(2)前处理培养得到的T细胞取出，计数，按照2×106/500uL的浓度稀释细胞；
②加入PBS溶解的T抗原表位(1mg/mL)至T细胞培养基中，使培养基抗原表位浓度为400ug/mL，每种合成抗原表位配置500uL；其中，加入的目的H9N2-CTL抗原表位包括SEQID No.1(C1)、SEQ ID No.2(C2)、SEQ ID No.3(C3)以及SEQ ID No.4(C4)以及目的H9N2-Th抗原表位包括SEQ ID No.5(T1)、SEQ ID No.6(T2)以及SEQ ID No.7(T3)；
③在6孔板中加入250ul配好的抗原表位和250ul稀释后细胞培养液，混匀。
④37℃细胞培养箱培养48h；
⑤取出培养的细胞，吸取每个细胞培养板孔内液体，转移至洁净的ep管中；
⑥取出elisa试剂盒，按照说明的步骤对每个ep管内的培养液进行检测。
(4)流式细胞验证试验
试验步骤如下：
①将(2)前处理培养得到的T细胞取出，离心，弃上清。
②加入1ml上样缓冲液，重悬，转移至EP管，450g离心10分钟。
③重复步骤2。
④弃上清，加入500ul上样缓冲液，加入CD3+荧光染料2.5ul，CD4+荧光染料5ul，CD8+荧光染料5ul，避光4℃孵育30min。
⑤450g离心10min，弃上清，加入500ul上样缓冲液，重悬，450g离心10分钟。
⑥弃上清，加入400ul上样缓冲液重悬，冰上保存，上机检测。
(5)细胞增殖试验
试验步骤如下：
①将(2)前处理培养得到的T细胞取出，，计数，按照1×105/ml细胞，使用RPMI1640稀释；
②取出冻干的抗原表位粉末，PBS溶解成1g/ml终浓度备用其中，其中，加入的目的H9N2-CTL抗原表位包括SEQ ID No.1(C1)、SEQ ID No.2(C2)、SEQ ID No.3(C3)以及SEQ IDNo.4(C4)以及目的H9N2-Th抗原表位包括SEQ ID No.5(T1)、SEQ ID No.6(T2)以及SEQ IDNo.7(T3)；
③分别取出以下3种体积量的抗原表位溶液至96孔板：20ul、10ul、5ul，补充RPMI1640至50ul：然后再加入50ul上述准备好的细胞悬液，混匀，使每种抗原表位获得3个不同浓度：200mg/ml，100mg/ml，50mg/ml，重复4孔；将铺好的96孔板放入37℃细胞培养箱中培养72h；
④取出，在避光生物安全柜中每孔加入10ul alamarblue，避光37℃培养4h；
⑤酶标仪选择560nm激发光，读取590nm的吸收值。
(6)血清IgG抗体特异性试验
获取抗原表位IgG血清方法：将16周龄的BALB/c小鼠，于第0天皮下注射合成B抗原表位200ul(100ul弗氏完全佐剂+100ul PBS溶解合成表位)；饲养14天后，第二次注射相同体积的抗原表位混合物；在第28天处死，眼球全血至洁净的EP管中，静置2小时后，10000g离心10min，将上清转移至新的洁净EP管，-80℃冻存。
血清IgG抗体特异性试验步骤如下：
①从溶解好的合成表位(浓度1mg/ml)中取10ul加至10ml包被液中，使包被液中表位浓度为1ug/ml；其中，采用的目的H9N2-B细胞抗原表位包括肽段SEQ ID No.8(B1)、SEQID No.9(B2)以及SEQ ID No.10(B3)；
②取出空的Elisa酶标板，每孔中加入100ul配好的表位包被液(1ug/ml)，封口，4℃孵育包被16h。
③取出包被好的Elisa酶标板，甩干孔内液体，以200ul每孔的量加入Wash Buffer清洗酶标板1min，重复5次。
④每孔加入200ul配好的Elisa封闭液，封口，37℃孵育封闭2h。
⑤取出冻存的对应血清，取出1ul，用elisa稀释液稀释1000倍至1ml，备用。
⑥取出甩干孔内液体，重复步骤3。
⑦加入步骤5准备好的血清稀释样品，每孔加入样品100ul，2个复孔。封口，37℃孵育2h。
⑧取出甩干孔内液体，重复步骤3。
⑨将IgG Anti mouse以1/5000稀释，以每孔100ul加入，封口，30℃孵育45min。
⑩取出甩干孔内液体，重复步骤3；在避光环境中，每孔加入elisa发光液100ul，封口，避光孵育30min；加入Elisa终止液100ul，酶标仪450nm吸收亮度数。
结果分析
(1)病毒TCID50检测试验结果分析
半数组织培养感染剂量，即破坏半数细胞所需最小感染量，是一种用于检测流感病毒滴度的方法。流感病毒的HA蛋白在接触到人、豚鼠和火鸡的血红细胞时，可以将细胞裂解并释放血红蛋白使细胞浑浊。可以用这个特性来检测病毒的滴度。
如下表7所示，为鸡胚接种H9N2滴度检测结果，如下表8所示，为鸡胚接种灭活H9N2滴度检测结果，可知对H9N2病毒进行鸡胚扩增之后，病毒的滴度为256；而使用β-丙内脂与病毒反应16h后，病毒被完全灭活。
表7
表8
(2)细胞因子的酶联免疫吸附测定试验结果分析
由于T细胞在初次接受病原体诱导分化后，会产生各种各样的细胞因子。如白细胞介素促进细胞的增殖修复，干扰素降低病毒的复制和侵染速度[3]。而不同T细胞分泌的细胞因子种类和数量都有明显的差异。因此在免疫之后测定不同类型细胞因子的水平，来反应不同类型的免疫细胞增殖水平。
如图7所示，为H9N2蛋白T细胞表位Ifn-r检测结果，结果显示，所有的T抗原表位都成功激活了T细胞的免疫反应。但Th组干扰素产生水平较CTL组高，这是由于Th刺激的CD4分泌的γ-干扰素水平比CD8高，因此Th抗原表位的刺激水平相较CTL抗原表位高。
(3)流式细胞验证试验结果分析
不同免疫细胞通过基因选择性表达来合成不同的蛋白，从而执行不同的免疫功能。如CD4+T细胞接受抗原分子后的免疫因子释放及CD8+T细胞对细胞内免疫原的清除。因此当使用带有不同信号的抗体标记细胞蛋白后，使用流式细胞技术就可以对细胞种类型和数量进行统计。流式实验中各实验组中样品细胞取样量均为1万，各组内细胞比例变化均可换算成对应细胞数量。
如图8所示，为小鼠脾脏CD4细胞流式结果；如图9所示，为脾脏CD8细胞流式结果；可以发现，在注射佐剂强化免疫的灭活病毒之后，实验组的脾脏中T淋巴细胞对应对照组数量均为增加，CD4+/CD8+T淋巴细胞的数量也有相对应的增加。这说明了注射灭活病毒的佐剂混合物能有效的刺激小鼠脾脏免疫细胞的分化和T细胞的增殖。并且灭活全病毒蛋白外壳的抗原仍然具有不错的效果。
如图10所示，为小鼠血浆CD4细胞流式结果；如图11所示，为血浆CD8细胞流式结果；可以发现，在注射佐剂强化免疫的灭活病毒之后，实验组小鼠血浆中的各种T细胞数量对比空白组有较大提高，但小鼠的CD4/CD8比值不变。这说明灭活病毒对小鼠免疫系统的刺激是全面的，没有偏向特定的免疫途径。
(4)细胞增殖试验结果分析
已经进行一次免疫的T细胞，当再次接触相同的抗原时，免疫细胞会迅速增殖分化形成效应T细胞，从而高效快速的清楚外来病原体。由于人工合成的T细胞抗原表位没有免疫原性，无法形成新的免疫刺激，因此只有抗原性与一次免疫相同的抗原表位才能再次激活T细胞的增殖和分化。通过检测T细胞增殖速率，可以反映该抗原表位的抗原性强弱。
如图12所示，为H9N2病毒T细胞抗原表位(CTL)细胞增殖结果；如图13所示，为H9N2病毒T细胞抗原表位(Th)细胞增殖结果；和阴性对照比，所有的T细胞抗原表位组中T细胞均出现了明显的增加，对于CTL表位来说，高浓度的刺激作用更明显，而Th表位则是低浓度的刺激比较明显，高浓度反而差距不大。而不同浓度的CoA蛋白对T细胞的增殖刺激效果相当。
(5)血清IgG抗体特异性试验
B细胞的抗原表位能直接与B细胞接触，刺激B细胞分化成浆细胞和记忆B细胞。通过浆细胞产生特异性IgG，来吸附病原体，降低病原体的侵染能力。因此可以通过Elisa的抗原抗体结合程度来判断血清中IgG抗体浓度。使用Control组血清作为阴性对照，H9N2灭活病毒组作为各自表位的阳性对照，分别检测B1、B2和B3组的血清对流感病毒蛋白的中和能力，其中，如图14所示，是病毒的血清对流感病毒蛋白的中和能力的结果，如图15所示，是B1抗原表位的血清对流感病毒蛋白的中和能力的结果，如图16所示，是B2抗原表位的血清对流感病毒蛋白的中和能力的结果，如图17所示，是B3抗原表位的血清对流感病毒蛋白的中和能力的结果，实验组中小鼠产生的血清IgG抗体相对Control组小鼠血清，对包被在孔内的病毒外壳蛋白有显着的特异性结合。但是结合的水平不如注射病毒的阳性对照组。而每组实验组对于自身注射的抗原肽段均有着不错的结合能力。在反交实验中，H9N2B2对于其他两种抗原的结合能力较弱，但仍然比病毒组血清中抗体的结合能力要强。
以上仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市疾控中心
<120> 禽流感病毒抗原表位筛选方法和应用
<130> 2020/5/15
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Thr Leu Thr Glu Asn Asn Val Pro Val
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 2
Lys Leu Ala Val Gly Leu Arg Asn Val
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 3
Lys Ala Ile Asp Lys Ile Thr Ser Lys
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 4
Gly Ser Asn Ala Val Glu Asp Gly Lys
1 5
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 5
Cys Ser Lys Tyr Ile Gly Ile Lys Ser Leu Lys Leu Ala Val Gly
1 5 10 15
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 6
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1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 7
Tyr Lys Ile Leu Thr Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val
1 5 10 15
<210> 8
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 8
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1 5 10 15
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20
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 9
Cys Gln Thr Glu Lys Gly Gly Leu Asn
1 5
<210> 10
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 10
Gly Gln Thr Leu Arg Ile Lys Ser Asp Gly Asn Leu Ile
1 5 10