H5、h7亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 H5、h7亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法与应用 (H5 and H7 subtype avian influenza virus genetic engineering subunit vaccine and preparation method and application thereof ) 是由 李海鹰 丁向东 王增福 岳建新 李吉轩 张秀美 袁野 孙灵睿 史张艳 赵成全 李 于 2020-12-28 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种H5、H7亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法与应用。本发明通过截取H5、H7亚型禽流感病毒HA蛋白的胞外区,构建含有HA胞外区基因的穿梭载体,转染sf9昆虫细胞,拯救重组病毒,并通过hi5细胞进行分泌表达,通过亲和层析进行纯化,获得HA蛋白抗原,加入佐剂,乳化,制备得到H5、H7亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗。本发明制备方法简单,克服了以鸡胚生产疫苗的缺点,耗时短,表达量高,可在反应器中实现细胞悬浮培养,有利于大规模生产,所制备的基因工程亚单位疫苗免疫效果良好,能有效预防H5、H7亚型禽流感病毒的感染,具有广阔的应用前景。(The invention provides a H5 and H7 subtype avian influenza virus genetic engineering subunit vaccine and a preparation method and application thereof. The H5 and H7 subtype avian influenza virus genetic engineering subunit vaccine is prepared by intercepting extracellular regions of HA proteins of H5 and H7 subtypes of avian influenza viruses, constructing a shuttle vector containing HA extracellular region genes, transfecting sf9 insect cells, rescuing recombinant viruses, carrying out secretory expression by hi5 cells, purifying by affinity chromatography to obtain HA protein antigens, adding an adjuvant, and emulsifying. The preparation method is simple, overcomes the defects of vaccine production by chicken embryos, is short in time consumption and high in expression quantity, can realize cell suspension culture in a reactor, is beneficial to large-scale production, has a good immune effect of the prepared genetic engineering subunit vaccine, can effectively prevent infection of H5 and H7 subtype avian influenza viruses, and has a wide application prospect.)
技术领域
本发明属于兽用生物制品领域，具体地说，涉及一种H5、H7亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法与应用。
背景技术
禽流感是由禽流感病毒所引起的一种急性、热性、高度传染性的疾病，给我国养殖业造成巨大损失。其表面的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)是两种主要的病毒囊膜糖蛋白，根据抗原属性的不同，A型流感病毒可分为18种HA亚型和11种NA亚型，其中H1-H16和N1-N9存在于野生水禽中。自1996年首次报道H5N1亚型禽流感以来，H5亚型禽流感病毒已传播至全世界，迄今为止，H7N9亚型禽流感也造成多波感染。
流感病毒会经常发生变异，1996年从家禽中分离到H5N1亚型病毒A/Goose/Guangdong/1/1996株，自2008年开始，含有GS/GD96骨架的HPAIV 2.3.4分支的病毒陆续出现，随后进化出2.3.4.4分支，已成为目前流行的最主要分支，同时流行2.3.2.1分支病毒。至2012年末，2.3.4.4分支及2.3.2.1分支的H5亚型AIV进化成为四个不同的分支，分别是a，b，c，d，当前我国流行的主要为2.3.4.4d和2.3.2.1d两个分支的病毒，但以2.3.4.4d分支为主。
H7N9亚型禽流感病毒在世界范围内广泛流行，不仅给养禽业造成了巨大的经济损失，而且威胁到人类健康。流行病学分析发现H7N9发生了抗原变异，部分分离株具有感染哺乳动物的能力。
国内目前H5、H7亚型禽流感疫苗主要用鸡胚生产，由于鸡胚本身的特殊性容易受到孵化等周期的影响，并且生产过程中操作活毒，人工成本高，并且生产后的鸡胚需要昂贵的处理费用。杆状病毒表达系统具有高效表达、安全、易操作等特点，昆虫细胞可以完全无血清悬浮培养，生产易放大，非常适合做基因工程亚单位疫苗开发。
因此研制一种生产成本低、生产效率高以及免疫效果好的H5、H7亚型禽流感基因工程亚单位疫苗具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种H5、H7亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法与应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种分离的多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1-3任一所示，它分别来自H5、H7亚型禽流感病毒HA蛋白的胞外区。
第二方面，本发明提供编码所述多肽的核酸分子，其核苷酸序列分别如SEQ IDNO:4-6所示。
第三方面，本发明提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。
第四方面，本发明提供所述多肽、编码所述多肽的核酸分子或含有所述核酸分子的生物材料在制备H5、H7亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗中的应用。
第五方面，本发明提供一种免疫原性组合物，其包含所述多肽和药学上可接受的载体。
第六方面，本发明提供一种疫苗组合物，其包含所述免疫原性组合物。
第七方面，本发明提供一种重组杆状病毒，所述重组杆状病毒包含编码所述多肽的核酸分子。
第八方面，本发明提供所述重组杆状病毒在H5、H7亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗生产中的应用。
第九方面，本发明提供一种H5、H7亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗，所述疫苗包含所述多肽和疫苗佐剂。
第十方面，本发明提供H5、H7亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗的制备方法，包括：采用所述重组杆状病毒感染sf9或hi5昆虫细胞后，培养细胞并收集上清，从上清中分离纯化获得抗原蛋白，与疫苗佐剂混合，即得。
具体方法如下：
(1)人工合成如SEQ ID NO:4-6所示的基因序列，将改基因序列构建到pFastBac1载体中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性穿梭载体；然后将穿梭载体转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，筛选(蓝白斑筛选)阳性重组Bacmid；接种白斑到含有卡那霉素、庆大霉素和四环素的LB液体培养基中过夜培养；收集菌液，提取重组穿梭质粒Bacmid DNA并对重组Bacmid进行测序鉴定；
(2)取无血清悬浮培养的sf9细胞，待细胞密度为2.0×106～3.0×106cells/mL(优选2.5×106cells/mL)，用重组Bacmid进行转染，培养转染后的细胞，当细胞活率降至20％～40％(优选20％)时收获培养上清，即为P0代病毒重组杆状病毒；
(3)取无血清悬浮培养的sf9细胞，待细胞密度为2.0×106～3.0×106cells/mL(优选2.5×106cells/mL)，按1％-1‰体积比接种重组杆状病毒，培养72-96h收获上清，即为P1代病毒重组杆状病毒；
(4)按照(3)同样的方法连续传5-6代。取无血清悬浮培养的hi5细胞，待细胞密度为2.0×106～3.0×106cells/mL(优选2.5×106cells/mL)，按1％-1‰体积比接种重组杆状病毒，培养72-96h收获上清；
(5)将(4)收获的上清过His亲和层析柱，用洗脱液洗脱，收集洗脱液，即为抗原蛋白溶液，并检测抗原蛋白溶液中蛋白的纯度和浓度；
(6)取抗原蛋白溶液94～96份，加入吐温-80 4份搅拌溶解，作为水相，另取白油94～96份，司本-80 4～6份混匀，作为油相；取油相2～3份，加入水相1～1.5份，乳化20～40min(优选取抗原蛋白溶液96份，加入吐温-80 4份搅拌溶解，作为水相，另取白油94份，司本-80 6份混匀，作为油相；取油相2份，加入水相1份，乳化30min)，即得H5、H7亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗。
本发明中，所述份为重量份。
第十一方面，本发明提供所述疫苗或按照上述方法制备的疫苗在制备治疗或预防H5、H7亚型禽流感病毒感染的药物中的应用。
本发明通过截取H5、H7亚型禽流感病毒保护性抗原HA蛋白的胞外区，构建含有HA胞外区基因的穿梭载体，转染sf9昆虫细胞，拯救重组病毒，并通过hi5细胞进行分泌表达，通过亲和层析进行纯化，获得HA蛋白抗原，加入佐剂，乳化，制备得到H5、H7亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗。本发明制备方法简单，克服了以鸡胚生产疫苗的缺点，耗时短，表达量高，可在反应器中实现细胞悬浮培养，有利于大规模生产，所制备的基因工程亚单位疫苗免疫效果良好，能有效预防H5、H7亚型禽流感病毒的感染，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中健康细胞(左)和病变细胞(右)对比。
图2为本发明较佳实施例中H5 Clade2.3.4.4(A)、H5 Clade2.3.2.1(B)和H7 HA重组蛋白(C)的Western Blot检测结果。
图3为本发明较佳实施例中H5 Clade2.3.4.4(A)、H5 Clade2.3.2.1(B)和H7 HA重组蛋白(C)的SDS-PAGE检测结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1穿梭载体的设计与构建
根据NCBI数据库公布的H5 Clade2.3.4.4d(GenBank:QOJ99767.1)、Clade2.3.2.1d(GenBank:QBF65380.1)，H7高致病性分支流行毒株HA蛋白序列(GenBank:ASB31508.1)，分别截取各HA蛋白第1-400位氨基酸残基，设计编码基因序列，其N端加入起始密码子ATG，末端加入6×His标签CATCATCATCATCACCAC及终止密码子TAA序列，进行昆虫细胞密码子优化(优化后的HA蛋白截短体的编码基因序列分别如SEQ ID NO:4-6所示)，送至生物公司进行合成，并通过同源重组的方式连接到pFastBac1载体(购自Invitrogen公司)中，分别获得pFastBac1-54HA、pFastBac1-52HA和pFastBac1-7HA。
实施例2阳性重组Bacmid的筛选及重组杆状病毒获得
1、取穿梭载体pFastBac1-54HA，pFastBac1-52HA，pFastBac1-7HA各5μg，分别转化DH10Bac感受态，冰上孵育30min，42℃热激90s，冰上孵育5min，加入无抗LB培养基，37℃摇床190rpm培养4h，取10μl菌液涂布三抗平板，37℃恒温培养箱培养48h，待蓝白斑明显后，挑取白斑加入三抗(含有卡那霉素、庆大霉素和四环素)LB培养基进行过夜培养。
2、收集菌液，12000rpm离心收集菌体，采用异丙醇沉淀法提取重组Bacmid，用分光光度计检测Bacmid浓度，重组Bacmid浓度为3000ng/μl。
3、取无血清悬浮培养的sf9细胞，待细胞密度为2.5×106cells/mL，铺6孔板，每孔细胞个数为1×106个，取重组Bacmid 2.5μg和5μg两个浓度，用Lipo3000进行转染，转染后的细胞置于27℃恒温培养箱培养72-96h，待细胞膨大，折光率降低，收获上清作为P0代重组病毒，细胞病变结果如图1所示(三种重组病毒病变情况相似)。
实施例3重组杆状病毒的扩繁及蛋白的表达
1、取无血清悬浮培养的sf9细胞，待细胞密度为2.5×106cells/mL，按0.1％体积比接种P0代重组病毒，置于27℃，120rpm悬浮培养，72-96h后待细胞膨大，折光率降低，收获上清作为P1代重组病毒，并按此方法连续传至5-6代，将P5或P6代重组病毒作为蛋白表达用种毒。
2、准取无血清悬浮培养的hi5细胞，待细胞密度为2.5×106cells/mL，按0.1％体积比接种P5或P6代病毒，置于27℃，120rpm悬浮培养，72-96h后待细胞膨大，折光率降低，收获上清，用抗His标签抗体进行Western Blot检测蛋白表达情况，结果显示重组HA蛋白已正确分泌表达，大小在72KD左右(图2)。
实施例4重组HA蛋白的纯化
1、hi5细胞接种重组杆状病毒72-96h，待细胞膨大，折光率降低，收获培养物，8000rpm离心30min，收集细胞上清，用0.45μm水性滤膜过滤，除去小的细胞碎片，备用。
2、用超纯水清洗His预装柱，清洗5个柱体积，然后用结合缓冲液(20mM Tris、50mMNaCl和20mM咪唑)处理预装柱，5个柱体积，处理完毕后，将抽滤的细胞上清结合His亲和层析柱(购自GE公司，商品型号Histrap HP)，直至结合完毕，然后用洗脱缓冲液(20mM Tris、50mM NaCl和300mM咪唑)进行洗脱，洗脱完毕的重组蛋白制样，进行SDS-PAGE电泳鉴定，结果显示蛋白正确表达(图3)，经分光光度计检测，其表达水平为200mg/L。
实施例5H5、H7亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗的制备及免疫原性鉴定1、将重组蛋白稀释至相应浓度，作为水相，每羽份剂量分别为20μg、30μg、40μg、50μg，取96份上清，加入4份吐温-80，搅拌溶解，作为水相，取白油94份，司本-80 6份，混合均匀，作为油相，取油相2份，缓缓加入1份水相，3000rpm乳化30分钟，制备H5、H7亚型禽流感病毒基因工程疫苗，4℃保存。
2、取60只21日龄SPF鸡，肌肉注射疫苗，平均分成6组，每组10只，第一组为空白对照组(注射无菌PBS，0.5ml/只)，第二组免疫常规H5、H7亚型胚苗(配制方法为：将制备好的血凝价为28的H5 Re-11、H5 Re-12、H7 Re-2尿囊液，加入终浓度为0.2％的甲醛溶液37℃灭活24h，经灭活检验、无菌检验合格后4℃无菌保存，将三种灭活尿囊液分别做3倍浓缩，然后按1:1:1混合，取96份混合后的灭活尿囊液，加入4份吐温-80，搅拌溶解，作为水相，取白油94份，司本-80 6份，混合均匀，作为油相，取油相2份，缓缓加入1份水相，3000rpm乳化30分钟，即得H5、H7亚型全病毒灭活疫苗)，免疫剂量为0.5ml/只)，第三组至第六组免疫上述制备的基因工程亚单位疫苗，免疫剂量分别为每只20μg、30μg、40μg、50μg，免疫21天后采集血清进行抗体检测，结果显示40μg抗原剂量免疫后抗体平均水平分别为8.6log2、8.3log2和8.5log2，50μg抗原剂量免疫后抗体平均水平分别为9.9log2、10.2log2和9.9log2，优于全病毒胚苗8.4log2、8.0log2和8.4log2(表1)。
表1免疫后21天抗体效价(Log2)
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
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ctgaagcacc tgctgtcccg catcaaccac ttcgagaaga tccagatcat ccccaaggac 360
tcctggtccg accacgaggc ctccctgggc gtgtccgccg cctgctccta ccagggcaac 420
tcctccttct tccgcaacgt ggtgtggctg atcaagaaga acaacgccta ccccaccatc 480
aagaagtcct acaacaacac caaccgcgag gacctgctga tcctgtgggg catccaccac 540
cccaacgacg aggccgagca gaccaagctg taccagaacc ccaccaccta catctccatc 600
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ggccagtccg gccgcatcga cttcttctgg accatcctga agcccaacga cgccatccac 720
ttcgagtcca acggcaactt catcgccccc gagtacgcct acaagatcgt gaagaagggc 780
gactccacca tcatgcgctc cgaggtggag tacggcaact gcaacacccg ctgccagacc 840
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<210> 6
<211> 1200
<212> DNA
<213> 禽流感病毒(Avian influenza virus)
<400> 6
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