阅读说明：本技术 流感病毒pb1蛋白抗原表位多肽及其用途 (Influenza virus PB1 protein epitope polypeptide and application thereof ) 是由 李呈军 陈化兰 姜丽 曾显营 施建忠 梁立滨 田国彬 于 2020-11-24 设计创作，主要内容包括：本发明涉及流感病毒PB1蛋白抗原表位多肽。本发明还涉及与上述抗原表位多肽特异性相互作用的针对流感病毒PB1蛋白的单克隆抗体,所述单克隆抗体具有广谱性和高敏感性,其与H1-H11等亚型的流感病毒均具有良好的反应性。本发明还涉及使用所述单克隆抗体制备的胶体金免疫层析试纸条。所述试纸条用20nm的胶体金颗粒对单克隆抗体7H11进行标记,将单克隆抗体1B7和羊抗鼠二抗分别喷涂于检测线T和质控线C,利用免疫层析技术原理实现了对广谱流感病毒的快速检测。(The invention relates to an influenza virus PB1 protein epitope polypeptide. The invention also relates to a monoclonal antibody which specifically interacts with the epitope polypeptide and is aimed at the PB1 protein of the influenza virus, wherein the monoclonal antibody has broad spectrum and high sensitivity, and has good reactivity with influenza viruses of subtypes H1-H11 and the like. The invention also relates to a colloidal gold immunochromatographic test strip prepared by using the monoclonal antibody. The test strip is characterized in that the monoclonal antibody 7H11 is marked by 20nm colloidal gold particles, the monoclonal antibody 1B7 and the goat anti-mouse secondary antibody are respectively sprayed on a detection line T and a quality control line C, and the rapid detection of the broad-spectrum influenza virus is realized by utilizing the principle of immunochromatography technology.)

流感病毒PB1蛋白抗原表位多肽及其用途

技术领域

本发明属于医学生物技术领域，尤其涉及流感病毒PB1蛋白抗原表位多肽以及其表位包含上述抗原表位多肽的广谱性单克隆抗体。另外地，本发明还涉及使用所述针对流感病毒PB1蛋白的单克隆抗体制备的胶体金免疫层析试纸条。

背景技术

流感病毒是一种能在禽类和多种动物中引起病毒性疾病的病原，并可能对动物和人类健康产生严重影响，其已成为公众日益关注的问题。由于流感病毒的快速变异和能够对动物和人类具有较高的致病性，因此一直以来均迫切需要高效的诊断方法，以便在无症状阶段检测出所有流感病毒亚型，从而实现终止流感病毒循环及其在鸟类、哺乳动物种群中的进化。

目前常用的流感病毒实验室诊断方法包括病毒的分离鉴定、血清学检测和分子生物学检测等方法，但是大多数方法都具有不足之处。例如，病毒的分离鉴定方法耗时长，一般需要3-4天；血凝与血凝抑制试验具有易于操作、结果快速准确等特点，但是每次仅能鉴定单一亚型；逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法具有特异性高、敏感性强特点，但其具有影响因素多，需要专业人员操作以及成本较高等缺陷。单克隆抗体的出现和应用为流感病毒的诊断和防控带来了新的技术方法，单克隆抗体具有高度均一、单一生物活性、仅结合某一特定抗原表位、可以长期传代及无限繁殖等特性。现在大多数检测方法中均涉及单克隆抗体的应用，如ELISA法和胶体金免疫层析方法等。

胶体金试纸条检测技术成熟且操作简单，但由于流感病毒亚型众多、毒株复杂，而市场流行的检测方法仅是针对个别亚型的检测方式，难以对其他亚型的流感病毒进行检测而造成潜在的流感病毒存在，形成流感病毒周期性的流行。

因而，本发明旨在获得针对流感病毒PB1蛋白的高效、广谱性单克隆抗体，以及确定所述单克隆抗体特异性针对的新表位多肽，并使用上述单克隆抗体建立广谱性胶体金免疫层析试纸条，为流感病毒相关蛋白的结构和生物学功能的研究以及流感的防治和诊断方法提供新思路。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供了流感病毒PB1蛋白抗原表位多肽以及其表位包含上述抗原表位多肽的广谱性单克隆抗体。另外地，本发明还提供了使用所述针对流感病毒PB1蛋白的单克隆抗体制备的胶体金免疫层析试纸条。

为达到本发明的目的，本发明采用了如下技术方案：

在第一个方面中，本发明涉及一种流感病毒PB1蛋白抗原表位多肽，所述流感病毒PB1蛋白抗原表位多肽是氨基酸序列为SEQ ID NO:1或2所示的多肽。

进一步地，本发明还涉及一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码如上所述的抗原表位多肽。

更进一步地，所述多核苷酸的序列为SEQ ID NO:3或4。

在第二个方面中，本发明涉及针对流感病毒PB1蛋白的广谱性单克隆抗体，所述单克隆抗体是由杂交瘤7H11产生的单克隆抗体7H11，所述单克隆抗体的表位包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或者所述单克隆抗体是由杂交瘤1B7产生的单克隆抗体1B7，所述单克隆抗体的表位包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

进一步地，所述广谱性单克隆抗体对H1-H11亚型的一种或多种具有反应性。

更进一步地，单克隆抗体7H11为IgG2a亚型，和单克隆抗体1B7为IgG1亚型。

在第三个方面中，本发明涉及一种用于检测流感病毒的胶体金免疫层析试纸条，所述试纸条对H1-H11亚型的一种或多种具有反应性，所述试纸条包括支持板和放置在其上的样品垫、灌注有金标抗体的偶联垫、含有检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜和吸水垫，所述金标抗体为胶体金标记的如上文所述的单克隆抗体7H11。

进一步地，所述胶体金颗粒直径为18-25nm。

优选地，所述胶体金颗粒直径为20nm。

更进一步地，所述检测线T由如上文所述的单克隆抗体1B7形成，和/或所述质控线C为羊抗鼠IgG。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明制备的针对流感病毒PB1蛋白的单克隆抗体具有广谱性和高敏感性，其与H1-H11等亚型的流感病毒均具有良好的反应性。

(2)本发明通过氨基酸定点突变技术和肽扫描等实验鉴定了单克隆抗体7H11和1B7的表位关键区域分别为₂₂FPYTGDPPYSHGTGT₃₆和₆₈₇QMYQKCCNLFEKF₆₉₉，为进一步建立高效检测流感病毒的方法提供了依据，同时也为研究PB1蛋白的结构和功能奠定了基础。

(3)将本发明使用针对流感病毒PB1蛋白的单克隆抗体采用本领域常规方法利用免疫层析技术原理制备胶体金免疫层析试纸条以实现对广谱流感病毒的快速检测。

附图说明

图1：针对PB1-1蛋白的单克隆抗体的Western Blot检测。其中，M：Marker，1：1E5，2：7F11，3：7H11，4：8G3，5：阳性对照，6：阴性对照。

图2：针对PB1-2蛋白的单克隆抗体的Western Blot检测。其中，M：Marker，1：1B7，2：5E9，3：6B9，4：10B10，5：10E10，6：10H5，7：阳性对照，8：阴性对照。

图3：7H11、1B7单克隆抗体的广谱性检测。其中，1：HEK293T细胞对照，2-6：HEK293T细胞中转染分别来自A/WSN/33、A/Sichuan/01/2009、A/Anhui/2/2005、A/Anhui/1/2013、A/Chicken/Shanghai/1/97的PB1质粒，7：A549细胞对照，8-9：WSN感染A549细胞4h、8h的样品。

图4：PB1-1截短质粒的表达。其中，1、4：空载体pCAGGS-GST质粒，2、3、5-9：截短质粒PB1(1-181)、PB1(182-360)、PB1(1-36)、PB1(37-72)、PB1(73-108)、PB1(109-144)、PB1(145-181)。

图5：PB1-2截短质粒的表达。其中，1、4：空载体pCAGGS-GST质粒，2、3、5-9：截短质粒PB1(405-568)、PB1(569-731)、PB1(569-600)、PB1(601-633)、PB1(634-666)、PB1(667-699)、PB1(700-731)。

图6：7H11单克隆抗体识别的抗原表位。其中，1、4：pCAGGS-PB1质粒，2、3、5-9：截短质粒PB1(1-181)、PB1(182-360)、PB1(1-36)、PB1(37-72)、PB1(73-108)、PB1(109-144)、PB1(145-181)，10：多肽序列DVNPTLLFLKVPAQNAISTT，11：多肽序列AISTTFPYTGDPPYSHGTGT。

图7：1B7单克隆抗体识别的抗原表位。其中，1、4：pCAGGS-PB1质粒，2、3、5-9：截短质粒PB1(405-568)、PB1(569-731)、PB1(569-600)、PB1(601-633)、PB1(634-666)、PB1(667-699)、PB1(700-731)，10：多肽序列IPKRNRSILNTSQRGILEDE，11：多肽序列RGILEDEQMYQKCCNLFEKF。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。

实施例1：针对流感病毒PB1蛋白的单克隆抗体的制备和鉴定

1.主要实验材料

1.1载体、菌种、病毒、细胞和实验动物

pET-30a表达载体，A/WSN/33(H1N1)、A/Sichuan/01/2009、A/Anhui/2/2005、A/Anhui/1/2013、A/Chicken/Shanghai/1/97等流感病毒，人肺泡腺癌A549细胞系、人胚胎肾细胞HEK293T和骨髓瘤细胞SP2/0细胞系均由发明人实验室保存，BL21大肠杆菌感受态细胞购自天根生化科技有限公司，BABL/c小鼠购于北京维通利华实验动物有限公司。

1.2主要试剂

PrimerSTAR Max DNA聚合酶购自宝生物公司，反转录酶M-MLV购自(美国)普洛麦格公司，T4 DNA连接酶和限制性内切酶购于NEB公司，Lipofectamine^TM LTX&PLUS转染试剂、质粒小量和中量抽提试剂盒购自赛默飞公司，DNA凝胶回收试剂盒购自(上海)凯杰公司，病毒总基因组(RNA)提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，HA培养基、HAT培养基、PEG(MW1500)、DMSO、弗氏佐剂、新生牛血清、胎牛血清、牛血清白蛋白(BSA)、羊抗鼠IgG-HRP抗体均购于西格玛奥德里奇公司，IMDM培养基购自HyClone公司，0.25％EDTA-胰酶和双抗购自Gibco公司，免疫球蛋白亚型鉴定试剂盒购自SBA公司，DAB显色试剂盒、TMB单组份显色液和4×蛋白上样缓冲液购自Solabio公司，Protein G亲和层析柱购自GE公司。

1.3主要仪器

PCR基因扩增仪、微量可调移液枪和高速离心机购自艾本德公司，凝胶电泳仪和湿电转膜仪购于Bio-Rad公司，恒温水浴锅、超净台购于购自赛默飞公司，酶标板购自(美国)康宁公司，电子天平购自赛多利斯公司，摇床购自江苏海门麒麟贝尔仪器制造公司，显微镜购自蔡司公司，二氧化碳细胞培养箱购于纽艾公司，4℃冷柜、-20℃和-80℃冰箱购自海尔公司。

2.主要实验方法

2.1引物设计

根据GenBank中流感病毒的PB1(GenBank:LC333186.1)基因序列，用软件Oligo7设计四对引物(含酶切位点)，由哈尔滨擎科生物技术公司合成，如表1所示。

表1：构建重组质粒的引物表

2.2重组质粒的构建和鉴定

采用常规分子生物学方法提取病毒总RNA和合成cDNA，并且对PB1-1和PB1-2基因进行扩增和鉴定。

2.3重组蛋白PB1-1和PB1-2的表达与纯化

2.4抗流感病毒PB1蛋白单克隆抗体的制备

具体制备步骤包括免疫BABL/c小鼠，将骨髓瘤细胞SP2/0与小鼠脾细胞融合，筛选阳性杂交瘤细胞株，冻存阳性杂交瘤细胞株，制备腹水，单克隆抗体的纯化，单克隆抗体的亚类鉴定步骤等。

2.5单克隆抗体的Western Blot检测

将重组蛋白经处理后进行SDS-SPGE电泳，通过湿转方法将重组蛋白转移至0.45μm的NC膜，300mA恒流转印60min。使用5％脱脂乳室温封闭1h，单克隆抗体(1:1000)为一抗，DyLight 800羊抗鼠IgG(1:10000)为二抗，进行Western Blot检测，同时阳性血清和SP2/0细胞上清分别作为阳性和阴性对照。

2.6单克隆抗体的广谱性检测

将HEK293T细胞铺于12孔板，待其生长至汇合度80％-90％，转染分别来自H1(A/WSN/33)、H1(A/Sichuan/01/2009)、H5(A/Anhui/2/2005)、H7(A/Anhui/1/2013)、H9(A/Chicken/Shanghai/1/97)等流感病毒的PB1质粒，转染量为1μg，转染时间为24h。将A549细胞铺于12孔板，待其生长至汇合度80％-90％左右，H1(A/WSN/33)病毒以MOI＝5感染A549细胞，分别在感染4h、8h后裂解细胞。将转染和感染细胞的样品处理后进行Western Blot试验，检测单克隆抗体的广谱性，一抗为制备的单克隆抗体，二抗为DyLight 800羊抗鼠IgG。

3.实验结果

3.1针对流感病毒PB1蛋白的单克隆抗体的筛选结果

通过建立的间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，SP2/0细胞上清为一抗，HRP标记的IgG山羊抗鼠为二抗，同时设立阳性和阴性对照(小鼠的阳性血清和阴性血清)。筛选到PB1的阳性杂交瘤细胞共有10株，命名为1E5、7F11、7H11、8G3、1B7、5E9、6B9、10B10、10E10、10H5。

3.2单克隆抗体的Western Blot检测

将重组蛋白用Loading buffer处理后进行Western Blot试验，一抗为制备的单克隆抗体，二抗为DyLight 800羊抗鼠IgG。

结果表明，制备的针对流感病毒PB1蛋白的单克隆抗体1E5、7F11、7H11、8G3、1B7、5E9、6B9、10B10、10E10、10H5均能和重组蛋白之间产生特异性反应，如图1和图2所示。其中，1E5、7F11、7H11、8G3为针对PB1-1的单克隆抗体，1B7、5E9、6B9、10B10、10E10、10H5为针对PB1-2的单克隆抗体。

3.3单克隆抗体的广谱性检测

将转染和感染细胞的样品用Loading buffer处理后进行Western Blot试验，检测单克隆抗体的广谱性，一抗为制备的单克隆抗体，二抗为DyLight 800羊抗鼠IgG。

实验结果表明，如图3所示，在上述针对流感病毒PB1蛋白的单克隆抗体中，7H11和1B7单克隆抗体具有更好的广谱性。单克隆抗体7H11为IgG2a亚型，和单克隆抗体1B7为IgG1亚型。因此，选择将这两种单克隆抗体用于进一步的研究。

实施例2：单克隆抗体7H11和1B7的表位关键区域的鉴定

1.主要实验材料

pCAGGS-GST、pMD18T表达载体由发明人实验室保存，其他实验材料见实施例1。

2.主要实验方法

2.1引物设计

根据GenBank中PB1(GenBank:LC333183.1)的基因序列，用软件Oligo7设计(部分含有酶切位点)引物，由哈尔滨擎科生物技术公司合成，见表2。

表2：构建重组质粒的引物表

2.2多肽合成

根据多次截短试验后，在南京金斯瑞生物科技有限公司合成PB1蛋白的重叠多肽，见表3。

表3：多肽的合成表

2.3pCAGGS-GST截短质粒的构建与表达和瞬时转染实验

具体的操作步骤按照本领域常规的分子生物学实验方法进行。

2.4免疫印迹试验检测截短质粒和删除质粒的表达

将12孔板中的细胞培养基弃掉，用PBS轻轻的洗两遍，弃PBS。加入1×的Loadingbuffer裂解5min，收集裂解液，95℃变性10min，进行SDS-PAGE电泳。封闭液是5％的脱脂乳，室温封闭1h。一抗为GST-M抗体，二抗为DyLight 800羊抗鼠IgG。

2.5免疫印迹试验检测单克隆抗体识别的抗原表位

细胞样品处理方法如上所示，其中合成的多肽处理方法如下：先4℃，12000rpm离心5min，再加入200μL的超纯水将多肽完全溶解，最后分别吸取2μL、4μL、6μL、8μL的多肽溶液点于0.22μm的NC膜上，在37℃温箱烘干后进行免疫印迹试验。以单克隆抗体为一抗，DyLight 800羊抗鼠IgG为二抗。

3实验结果

3.1免疫印迹试验检测截短质粒和删除质粒的表达

将转染质粒的HEK293T细胞裂解后进行免疫印迹试验，一抗为GST-M抗体，二抗为DyLight 800羊抗鼠IgG。结果表明构建的截短质粒和删除质粒均能正常表达。见图4和图5。

3.2免疫印迹试验检测单克隆抗体识别的抗原表位

将瞬时转染后的细胞和合成的多肽处理后进行免疫印迹试验，一抗为待检测的各单克隆抗体，二抗为DyLight800羊抗鼠IgG。结果表明，7H11单克隆抗体的抗原表位关键区域在₂₂FPYTGDPPYSHGTGT₃₆；1B7单克隆抗体的抗原表位关键区域在₆₈₇QMYQKCCNLFEKF₆₉₉。

综上所述，实验结果表明本发明制备的针对流感病毒PB1蛋白的单克隆抗体具有广谱性和高敏感性，其与H1-H11等亚型的流感病毒均具有良好的反应性。本发明还通过氨基酸定点突变技术和肽扫描等实验鉴定了单克隆抗体7H11和1B7的表位关键区域分别为₂₂FPYTGDPPYSHGTGT₃₆和₆₈₇QMYQKCCNLFEKF₆₉₉，为进一步建立高效检测流感病毒的方法提供了依据，同时也为研究PB1蛋白的结构和功能奠定了基础。

此外，将本发明使用针对流感病毒PB1蛋白的单克隆抗体采用本领域常规方法利用免疫层析技术原理制备胶体金免疫层析试纸条以实现对广谱流感病毒的快速检测。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心）

<120> 基因序列

<130> XH2020P0036

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 15

<212> 氨基酸序列

<213> 人工序列()

<400> 1

<210> 2

<211> 13

<212> 氨基酸序列

<213> 人工序列()

<400> 2

<210> 3

<211> 45

<212> 核苷酸序列

<213> 人工序列()

<400> 3

<210> 4

<211> 39

<212> 核苷酸序列

<213> 人工序列()

<400> 4