阅读说明：本技术 一种新型的钠钾atp酶的检测方法 (Novel detection method of sodium-potassium ATP enzyme ) 是由 殷放宙 殷武 戴辉 李伟东 李林 于 2020-06-21 设计创作，主要内容包括：目前用于评估钠钾ATP酶活性较为常用的方法为放射性示踪法或比色法。但这两种方法均存在缺陷,前者需要使用放射性同位素,对实验环境要求高；后者则在检测准确度、灵敏度与重复性上相对较弱。本发明引入一种新方法进行细胞钠钾ATP酶活性的检测,通过电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)精确定量转运进细胞的铷离子,由此测得细胞内铷离子的转运率,进而评估钠钾ATP酶的活性。此方法具有无放射性、可靠、准确等优点。(The currently used method for evaluating the activity of sodium-potassium ATPase is a radioactive tracer method or a colorimetric method. However, both methods have defects, namely the former method needs to use radioactive isotopes, and has high requirements on experimental environment; the latter is relatively weak in detection accuracy, sensitivity and reproducibility. The invention introduces a new method to detect the activity of cell sodium potassium ATPase, and rubidium ions transferred into cells are accurately and quantitatively measured by inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS), so that the transfer rate of rubidium ions in cells is measured, and the activity of sodium potassium ATPase is further evaluated. The method has the advantages of no radioactivity, reliability, accuracy and the like.)

一种新型的钠钾ATP酶的检测方法

技术领域

本发明涉及检测ATP酶活性领域，具体涉及通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)的方法检测细胞钠钾ATP酶对铷离子(Rb⁺)跨膜转运量的方法来评估钠钾ATP酶的活性。

背景技术

钠钾ATP酶(Na，K-ATPase)，又名Na⁺-K⁺泵，于1957年由J.C.Skou所发现，由α、β两亚基组成。α亚基为分子量约为120kD的跨膜蛋白，既有Na+、K+结合位点，又具ATP酶活性。β亚基为小亚基，是分子量约为50kD的糖蛋白。钠钾ATP酶存在于所有真核细胞中，是一种金属离子转运蛋白，每消耗一个ATP分子，逆电化学梯度泵出3个钠离子和泵入2个钾离子，保持膜内高钾，膜外高钠的不均匀离子分布，由此维持细胞膜静息电位的稳定、离子、渗透压与pH平衡，发挥着非常重要的细胞功能。经科学研究发现钠钾ATP酶在人体的正常代谢中具有非常重要的作用，与一些疾病的发生也有着密切的关系，如脑水肿、白内障、囊纤维化、癫痫、偏头痛、高血压等。

目前，用于评估钠钾ATP酶活性较为精确的方法主要是检测该转运蛋白对放射性86Rb的转运效率，通常由放射性示踪法来确定，采用伽马计数仪检测86Rb，但这种方法需要使用放射性同位素，对实验操作环境要求高，限制钠钾ATP酶的快速检测。也有采用比色法对钠钾ATP酶活性进行检测，其原理在于在含Na⁺，K⁺、Mg²⁺的缓冲液中，加入ATP和酶，在37℃温育10min后，ATP被酶分解成ADP和无机磷(Pi)，在酸性环境中，定磷试剂中的钼酸铵以钼酸形式与样品中的磷酸反应生成磷钼酸，当有还原剂存在时磷钼酸立即转变蓝色的还原产物钼蓝，钼蓝在650-660nm波长处有最大的吸收。以每毫克蛋白每小时新产生的Pi量为酶的活性单位，所得结果为总ATP酶活性。缓冲液中加Na⁺，K⁺-ATP酶的特异性抑制剂哇巴因，所得结果为Mg²⁺-ATP活性，两者之差即为Na⁺，K⁺-ATP酶活性。比色法的对实验环境要求不高，但灵敏度较低。

发明内容

发明目的：提供一种基于电感耦合等离子体质谱(Inductively coupled plasmamass spectrometry，ICP-MS)检测方法，用于测定真核细胞膜钠钾ATP酶活性的方法。

技术方案：针对背景技术中的情况，本发明选用⁸⁶Rb的无放射性替代物氯化铷(RbCl)，采用电感耦合等离子体质谱法(Inductively coupled plasma massspectrometry，ICP-MS)测定Rb⁺跨膜转运量来评价钠钾ATP酶的活性。Rb⁺与K⁺为同系物，以同样方式经Na⁺，K⁺-ATP酶摄入细胞内，且Rb⁺是自然状态下细胞内不存在的离子，环境干扰小，易于检测。因此，通过仪器检测转运进细胞的Rb⁺，可以估钠钾ATP酶的活性。

ICP-MS是一种元素分析技术，具有很高的检测灵敏度与高效的样品分析能力。ICP-MS仪器使用等离子体(ICP)作为离子源，质谱(MS)分析器检测产生的离子，它可以同时测量周期表中大多数元素，现在的ICP-MS已经发展成为用于元素特异性检测和定量的最灵敏和多功能的工具。本专利利用ICP-MS建立了检测细胞钠钾ATP酶对Rb⁺离子跨膜转运量的方法来评估钠钾ATP酶的活性，即避免了放射性同位素测定方法的危险性，又保证了样品检测的灵敏度。

技术方案：

一种新型的钠钾ATP酶的检测方法，其包括以下步骤：

1.一种新型的钠钾ATP酶的检测方法，其包括以下步骤：

(1)将细胞按适宜的方法培养、加RbCl溶液、裂解、测蛋白、消化、赶酸、

制备供试品溶液。

(2)以铷(Rb)单元素标准溶液为标准品，以钇(Y)单元素标准溶液为内标，采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)检测Rb⁺的摄入量。

氯化铷(RbCl)用含钙、镁的Hank's溶液溶解稀释。将正常培养的细胞接种到孔板中，并至细胞覆盖约70－80％的板底时，对照组直接加入含RbCl的Hank's溶液，给药组加入药物处理细胞后再加入含RbCl的Hank's溶液。在培养箱中培养后，吸净含RbCl的Hank's溶液，用无RbCl的Hank's溶液洗涤细胞，裂解细胞，二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白质浓度。另加入浓硝酸和内标Y在室温下消化细胞，消化完成后再加入H₂O₂赶酸直至棕色气体消失，最后用超纯水将溶液定容到适宜的体积。

将正常培养的细胞调整为4×10⁵－5×10⁵个/mL，接种到孔板中。在细胞覆盖约70－80％的板底时，加入药物处理细胞24h后再加入含RbCl的Hank's溶液1mL。在培养箱中培养2h后，将含RbCl的Hank's溶液溶液吸净，用无RbCl的Hank's溶液洗涤细胞3次。随后，用裂解液裂解细胞，用BCA测定蛋白质浓度，另加入浓硝酸1mL和使终浓度达到20μg/L内标Y在室温下消化细胞2h。消化完成后，加入250μLH₂O₂在100℃下赶酸2h，直到棕色气体消失，最后用超纯水将溶液定容至40mL。

以铷(Rb)单元素标准溶液用2.5％HNO₃水溶液(v/v)溶解稀释至12.5－1000μg/L浓度作为标准品溶液；以钇(Y)单元素标准溶液用2.5％HNO₃水溶液(v/v)溶解稀释至8mg/L浓度作为内标母液。

电感耦合等离子体质谱法的参数为：射频功率、冷却气流量、辅助气流量、雾化器流量、采样深度、蠕动泵转速、扫描方式、扫描次数、重复采样次数。

RF射频功率1100W，冷却气流量15L/min，辅助气流量1.2L/min，雾化器流量0.99L/min，采样深度7.0mm，蠕动泵转速24r/min，扫描方式单点跳峰，扫描次数20次，重复采样3次。

采用ICP-MS法进行样品检测，根据标准曲线计算Rb⁺含量，并除以蛋白质浓度，得到每克蛋白质的Rb⁺转运浓度作为最终结果。

有益效果：本发明引入的ICP-MS方法可用于钠钾ATP酶活性的检测。通过ICP-MS方法测量无放射性的氯化铷(RbCl)来评价钠钾ATP酶活性，在以钠钾ATP酶抑制剂大黄酸抑制作用下的细胞上得到验证。此法较原有的具有放射性危险的放射性同位素示踪法及灵敏度不高的比色法的优势在于安全、稳定、快速、可靠，解决现有技术中实验环境要求高、灵敏度较低等技术问题。

附图说明

图1为比色法检测大黄酸抑制HCT116细胞钠钾ATP酶活性的结果图。左侧为60，80，120μM大黄酸和50nM哇巴因处理24h后检测结果，右侧为80μM大黄酸处理2，6，12，24h后检测结果。^*p<0.05,^NSp＞0.05，与空白对照组相比。

图2为比色法检测钠钾ATP酶活性独立实验结果图。HCT-116细胞用80μM大黄酸和50nM哇巴因处理24h，比色法检测细胞活性，同条件先后独立检测3次。^*p<0.05，^NSp＞0.05，与空白对照组相比。

图3为ICP-MS检测钠钾ATP酶活性的Rb标准曲线图。配置12.5，25，50，100，200，500，800，1000μg·L^-1铷离子标准液后绘制标准曲线，y＝0.024x-0.7336，r＝0.9990。

图4为ICP-MS检测大黄酸抑制的HCT116细胞钠钾ATP酶活性的结果图。HCT116细胞用60，80，120μM大黄酸和1μM哇巴因处理24h，ICP-MS检测细胞内转运铷离子量，除以各自样品蛋白浓度为最终钠钾ATP酶活性(n＝6)。^*p<0.05，^**p<0.01，^NSp＞0.05与空白对照组相比。

图5为ICP-MS检测大黄酸抑制HCT-116细胞钠钾ATP酶活性独立实验结果图。HCT-116细胞用80μM大黄酸处理24h，ICP-MS检测细胞内转运铷离子量，除以各自样品蛋白浓度为最终钠钾ATP酶活性。同条件先后独立检测3次。^**p<0.01,^***p<0.001，^NSp＞0.05，与空白对照组相比。

具体实施方式

下面的实施方案可详细地说明本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例一 比色法测定大黄酸抑制的HCT-116细胞的钠钾ATP酶活性

1.实验材料与仪器

HCT116细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(上海细胞库))，FBS胎牛血清(美国HyClone公司)，1640培养液(南京维森特生物技术有限公司)，二甲基亚砜DMSO(美国Sigma公司)，哇巴因(美国Sigma公司)，大黄酸(上海源叶生物科技公司)，BCA试剂盒(中国碧云天生物技术研究所)，超微量Na⁺,K⁺-ATPase定量试剂盒(南京建成生物工程研究所)。HERACELL-150i细胞培养箱(美国Thermo Fisher公司)，MiCROCL-17R低温离心机(美国Thermo Fisher公司)，BioMATE3S紫外分光光度计(美国Thermo Fisher公司)，JY96-ⅡN细胞超声破碎仪(浙江宁波新芝有限公司)，Milli-Q超纯水制备仪(美国Millipore公司)。

2.实验方法

2.1细胞培养及药物处理

正常培养的HCT116细胞为贴壁生长细胞，常规培养于含10％胎牛血清的1640培养基中，5％CO₂，37℃恒温培养箱中培养。待细胞长至70－80％融合时，弃培养液，PBS洗涤2次，0.25％胰酶消化。将细胞按4×10⁵－5×10⁵个/孔接种于6孔板中。待细胞贴壁生长完全后，在相应孔中加入不同浓度大黄酸(60、80、120μM)和哇巴因(50nM)处理24h，以及加入大黄酸(80μM)处理不同时间(2、6、12、24h)，待测。

2.2细胞破碎及蛋白定量

按照细胞培养方法中的消化步骤将各实验组细胞加适量PBS缓冲液洗涤2次后，进行消化，置于离心机1000rpm离心10min。加入适当介质，将装有细胞的EP管置于冰上破碎，相同模式下破碎3次，每次10s。每次破碎间隔30s，以防止过热。

应用BCA试剂盒进行蛋白定量。在562nm下，测定标准品及样品的OD值，根据已知浓度的标准蛋白OD值作标准曲线，根据标准曲线对待测蛋白样品溶液进行定量。

2.3钠钾ATP酶活性检测试剂盒测定细胞中的钠钾ATP酶活性

在已经裂解好的样品测试组中加入120μL双蒸水，对照管中加入160μL双蒸水。接着在样品测试管中加入含有蛋白质的100μL细胞破碎样品及40μl ATP-二钠溶液(最终ATP浓度：2.5mM)。每组再分别加入420μl反应基质液(100mM NaCl，20mM KCl，2mM MgCl₂，30mM组氨酸，1mM哇巴因，pH7.4)37℃处理10min，加入三氯乙酸(50％，100μl)终止反应。在对照管中加入含有蛋白质的100μl细胞样品并且在4℃以4000rpm离心10min。然后将1ml钼酸铵显色剂加入到300μl上清液中混匀，室温静置2min后加入1ml终止液，混匀，室温静止5min。采用分光光度计在636nm处读取吸光度，使用Na₂HPO₄作为标准，通过从总ATP酶活性中减去哇巴因不敏感的Mg²⁺-ATP酶活性来测量钠钾ATP酶活性。

2.4数据分析和处理

所有统计数据均用mean±SEM表示，采用t检验，p>0.05时无显著性差异，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001时有显著性差异，使用GraphPad Prism 5软件进行统计分析。

3实验结果

使用大黄酸作为HCT116细胞钠钾ATP酶的抑制剂，哇巴因作为阳性对照，采用比色法对钠钾ATP酶的活性进行检测。结果表明不同浓度大黄酸抑制HCT116细胞的钠钾ATP酶活性结果不明显(图1左)，同样对大黄酸作用时间梯度进行试验，结果发现同样没有明显效果(图1右)。使用相同浓度，严格控制试验条件进行独立的3次试验，结果发现其波动性较大(图2)。大黄酸作为钠钾ATP酶的抑制剂，其作用机理是十分明确的，由此可知，比色法检测钠钾ATP酶活性的灵敏度较差、波动性大、可靠性不高。

实施例二 ICP-MS检测被大黄酸抑制的HCT-116细胞钠钾ATP酶的活性

钠钾ATP酶转运是逆电化学梯度泵出3个钠离子和泵入2个钾离子。放射性⁸⁶Rb是K的同系物，可以相同方式被钠钾ATP酶摄入细胞内，目前较为准确的检测钠钾ATP酶活性的方法-放射性示踪法，即采用检测进入细胞内的Rb离子，计算出细胞对Rb离子的转运效率来评价其活性。通过研究发现，氯化铷(RbCl)可以替代⁸⁶Rb在细胞中转运，而Rb⁺等其他金属离子都可以通过ICP-MS进行精确定量。这里使用的氯化铷是一种没有放射性且可行的化合物。

1.实验材料与仪器

HCT116细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(上海细胞库))，1640培养液(南京维森特生物技术有限公司)，二甲基亚砜DMSO(美国Sigma公司)，哇巴因(美国Sigma公司)，大黄酸(上海源叶生物科技公司)，BCA试剂盒(碧云天生物技术研究所)，氯化铷(英国Alfa Aesar公司)，铷(Rb)、钇(Y)单元素标准溶液(国家有色金属及电子材料分析测试中心)，Hanks溶液(北京索莱宝科技有限公司)，浓硝酸及过氧化氢(南京化学股份有限公司)。NexION-350-Series电感耦合等离子体质谱仪(美国铂金埃尔默公司)，BioMATE3S紫外分光光度计(美国Thermo Fisher公司)，Milli-Q超纯水制备仪(美国Millipore公司)。

2.实验方法

2.1细胞培养及药物处理

正常培养的HCT116细胞为贴壁生长细胞，常规培养于含10％胎牛血清的1640培养基中，5％CO₂，37℃恒温培养箱中培养。待细胞长至80％融合时，弃培养液，PBS洗涤2次，0.25％胰酶消化。将细胞按4×10⁵－5×10⁵个/mL接种于12孔板中。待细胞贴壁生长完全后，在相应孔中加入不同浓度大黄酸(60、80、120μM)和哇巴因(1μM)处理24h。

2.2标准溶液的制备

Rb标准溶液的制备：取Rb单元素标准溶液(1g/L)适量用2.5％HNO₃稀释成1mg/L标准品母液，并进一步稀释成12.5，25，50，100，200，500，800，1000μg/L的Rb标准溶液。

Y内标母液的制备：取Y单元素标准溶液(1g/L)适量用2.5％HNO₃溶液稀释成8mg/L的内标母液。

Rb-Hank’s溶液的制备：取RbCl适量用Hank’s溶液溶解，配制成240μmoL/L的缓冲液。

2.3样品制备

各组细胞加入药物处理特定时间后，再加入含RbCl的Hank's溶液1mL，在培养箱中培养2h后，将含RbCl的Hank's溶液吸净，用Hank's溶液洗涤细胞3次。裂解液裂解细胞，BCA测定蛋白质浓度。加入浓硝酸1mL和内标Y0.1mL(终浓度20μg/L)在室温下消化细胞2h。消化完成后，加入250μLH₂O₂在100℃下赶酸2h，直到棕色气体消失，最后用超纯水将溶液定容至40mL。

2.4 ICP-MS参数

RF射频功率1100W，冷却气流量15L/min，碰撞气(氦气)流量3mL/min，辅助气流量1.2L/min，样品提升量为1.5mL/min，雾化器流量0.99L/min，采样锥孔径0.9mm，截取锥孔径1.1mm，超级截取锥孔径1.0mm，采样深度7.0mm，轴向磁场电压150V，模拟电压-1650V，蠕动泵转速24r/min，进样稳定时间20s，扫描方式单点跳峰，扫描次数20次，重复3次。

2.5方法学考察

以Y为内标，取上述各浓度Rb标准溶液用ICP-MS法测定Rb信号强度，并绘制工作曲线。以空白溶液连续测定10次，以测定结果的3倍标准偏差所对应的浓度值作为检出限。

取空白细胞15份，分3个剂量组，每组5份，分别加入25，160，800μg/L Rb标准溶液，处理方法同样品制备，平行测定5次，考察回收率。将25μg/L供试品连续进样5次考察方法精密度。取25μg/L供试品在12h内每隔1h进行检测，考察方法稳定性。分别取5组同浓度供试品组上机检测，考察方法重复性。

2.6样品检测

采用ICP-MS法进行样品检测，根据标准曲线计算Rb⁺含量。

2.7数据分析和处理

将测定的Rb⁺转运量除以蛋白质浓度，得到每克蛋白质的Rb转运浓度，将空白对照组的每克蛋白转运量归一化后，采用GraphPad Prism 6.0统计学软件进行数据的统计分析及作图，结果以平均值±标准误(mean±SEM)的方式表示，采用t检验，p>0.05时无显著性差异，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001时有显著性差异。

3.实验结果

3.1方法学考察

Rb⁺的浓度在12.5-1000μg/L之间与信号强度有良好的线性关系，其线性回归方程为：y＝0.024x-0.7336,r＝0.9990(图3)。Rb⁺的最低检测限是0.01μg/L。

精密度、稳定性及重复性考察结果分别为RSD为0.81％、0.70％和0.60％，表明该方法精密度、重复性及重复性均良好。回收率试验见表1，其回收率在97.2％～99.7％之间，RSD为0.60～0.83％。

表1回收率实验结果

因此，基于ICP-MS检测钠钾ATP酶活性的方法学考察结果整体较好，该方法可靠性、准确性。

3.2 ICP-MS法检测大黄酸抑制HCT116细胞钠钾ATP酶活性

根据上述最佳参数，通过ICP-MS方法测定了在大黄酸处理的HCT116细胞中的钠钾ATP酶活性。用三种不同浓度的大黄酸(60、80、120μM)和哇巴因(1μM)处理24h后，结果如图4所示，不同浓度的大黄酸和哇巴因对钠钾ATP酶的活性有明显的抑制作用。另外，为验证该方法的可靠性，进行的三次独立实验，结果如图5所示，三次独立实验均显示大黄酸对钠钾ATP酶的活性均有明显的抑制作用。因此，这种用于测量钠钾ATP酶活性的ICP-MS方法被认为是非常稳定和可靠的

由此可见，与放射性同位素法相比，该方法更安全简便，与比色法相比，该方法稳定可靠。因此，ICP-MS可用于精确检测细胞膜钠钾ATP酶离子转运活性。