阅读说明：本技术 一种基于质谱分析技术快速鉴定大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的方法 (Method for rapidly identifying Atlantic salmon and rainbow trout based on mass spectrometry technology ) 是由 毕红燕 王成玉 于 2020-07-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于质谱分析技术快速鉴定大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的方法,包括如下步骤：步骤(1)准备大西洋鲑鱼样本和虹鳟鱼样本；步骤(2)向两种鱼肉样本冷却后制得样本；步骤(3)得到滤液样本；步骤(4)取步骤(3)待干后进入质谱仪分析；步骤(5)对步骤(4)质谱分析后的两种质谱数据采集；步骤(6)在市场上购买大西洋鲑鱼,并按照上述步骤(1)-(4)的方法处理,然后进行质谱数据采集；步骤(8)比较步骤(6)中的购买大西洋鲑鱼和步骤(5)中的虹鳟鱼样本的质谱图的相似性得分。本发明用基质辅助激光解吸/电离质谱技术区分和鉴定大西洋鲑鱼和虹鳟鱼,达到高效率、省时、快速、灵敏和高通量的检测效果。(The invention discloses a method for rapidly identifying Atlantic salmon and rainbow trout based on a mass spectrometry technology, which comprises the following steps: preparing an Atlantic salmon sample and an oncorhynchus mykiss fish sample; cooling the two fish samples to obtain samples; obtaining a filtrate sample in the step (3); step (4), the dried product obtained in the step (3) is put into a mass spectrometer for analysis; step (5) collecting two kinds of mass spectrum data after the mass spectrum analysis in the step (4); step (6) purchasing Atlantic salmon in the market, processing according to the method of the steps (1) to (4), and then performing mass spectrum data acquisition; and (8) comparing the similarity scores of the mass spectrograms of the purchased atlantic salmon in the step (6) and the rainbow trout sample in the step (5). The invention uses the matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry technology to distinguish and identify the Atlantic salmon and the rainbow trout, and achieves the detection effects of high efficiency, time saving, rapidness, sensitivity and high flux.)

一种基于质谱分析技术快速鉴定大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的方法

技术领域

本发明涉及了质谱技术领域，提出了一种基于质谱分析技术快速鉴定大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的方法。

背景技术

水产养殖业是世界上重要且发展迅速的产业之一，作为一种快速发展的产业，水产品中因含有许多对人类健康有益的营养素和生理活性物质，所以人们对水产品尤其是海产品的需求不断增加。按照百度百科介绍，三文鱼(Oncorhynchus)具有商业价值的品种有30多个，目前最常见的是2种鳟鱼(三文鳟、金鳟)和4种鲑鱼(太平洋鲑、大西洋鲑、北极白点鲑、银鲑)。

我国常进口太平洋鲑和大西洋鲑。大西洋鲑鱼(Salmo salar)作为一种可生食的海鲜，因其味道鲜美、富含蛋白质，氨基酸，二十二碳六烯酸(DHA)，二十碳五烯酸(EPA)，维生素D和微量元素铁，铜，锌，锰等而被全世界人类食用。大西洋鲑食用价值高，市场需求量大。虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)的养殖成本较大西洋鲑低。在市场上，标签比较模糊，虹鳟鱼有时也被标为三文鱼售卖。市场上常常将虹鳟鱼标注为三文鱼以谋取利益。事实上，为谋取利益，对水产品进行错标，以次充好的现象在世界范围内存在。已有科学家建议在标签中标注鱼类的科学名称作为区分。对鱼的品种进行鉴定符合消费者的需求。虹鳟鱼和大西洋鲑同属鲑鱼科，两种鱼的肉质色泽和纹理相近，将价值较低的虹鳟鱼冒充大西洋鲑鱼售卖谋取暴利时，会损害了消费者的利益。当大西洋鲑鱼可以作为婴幼儿辅食，若因误标乱标等被购买食用，可能会因致病性微生物等因素对健康造成威胁。对大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的有效区分可以体现对鱼的品种进行鉴定的必要性。

传统的水产品鉴定方法主要基于形态特征的鉴定，通过观察标本解剖学和根据鱼的形态特征区分鱼种的方法实用、快速、成本低廉，但通常需要专业人员，常需产品保持完整状态。当被加工成成品或半成品时，鱼的形态特征会消失或部分消失，因此鉴定难度增加。现在，基于形态学特征分类鱼种的测定仍然存在。不同的鱼具有不同形状和大小的耳石，耳石形态也被用于鉴定鱼类。但是要求鉴别者具备鱼类解剖的技能和知识。分子生物学技术已被广泛用于鉴别鱼类。但是此技术涉及脱氧核糖核酸(DNA)的提取、聚合酶链式反应(PCR)扩增、序列分析等耗时繁琐的步骤。此外，某些物种的关系非常接近，序列中几乎没有核苷酸差异，增加了鉴别难度。

免疫学技术如酶联免疫吸附分析依据抗体对蛋白的识别来鉴定大西洋鲑鱼和虹鳟鱼，尽管这些检测方法能有效的识别大西洋鲑鱼和虹鳟鱼，但当需要大批量检测和鉴定时，不能满足高通量的需求。寻找简便、快速、高通量、省时的分析技术鉴别大西洋鲑鱼与虹鳟鱼，符合水产品市场、食品安全及人类健康的需求。质谱技术(MS)由于快速、灵敏、高通量的优点而被用于不同领域，如分析化学、核苷生物化学、寡核苷酸和核酸分析、有机金属化学、营养、食品残留和有机掺假分析。

传统的水产品鉴定方法主要基于形态特征的鉴定，通过观察标本解剖学和根据鱼的形态特征区分鱼种的方法实用、快速、成本低廉，但通常需要专业人员，常需产品保持完整状态。当被加工成成品或半成品时，鱼的形态特征会消失或部分消失，因此鉴定难度增加。现在，基于形态学特征分类鱼种的测定仍然存在。不同的鱼具有不同形状和大小的耳石，耳石形态也被用于鉴定鱼类。但是要求鉴别者具备鱼类解剖的技能和知识。分子生物学技术已被广泛用于鉴别鱼类。但是此技术涉及脱氧核糖核酸(DNA)的提取、聚合酶链式反应(PCR)扩增、序列分析等耗时繁琐的步骤。此外，某些物种的关系非常接近，序列中几乎没有核苷酸差异，增加了鉴别难度。免疫学技术如酶联免疫吸附分析依据抗体对蛋白的识别来鉴定大西洋鲑鱼和虹鳟鱼，尽管这些检测方法能有效的识别大西洋鲑鱼和虹鳟鱼，但当需要大批量检测和鉴定时，不能满足高通量的需求。寻找简便、快速、高通量、省时的分析技术鉴别大西洋鲑鱼与虹鳟鱼，符合水产品市场、食品安全及人类健康的需求。

借助多变量分析技术，通过对大量数据进行降维分析，例如可获得主成分分析得分图建立标准图库，通过比对实现未知样的鉴别。但目前所依赖的多变量分析技术对光谱数据的预处理涉及一阶导数、二阶导数、均值中心化、多元散射校正、标准正态变量变换和归一化等处理方法，步骤较为繁琐。本文所述的鉴别鱼的方法，只需对原始质谱数据进行基线、归一化后直接进行比对就可实现三文鱼的鉴别，具有快速和简便的特点。

国内已有专利(专利名称：一种大西洋鲑鱼与虹鳟鱼的快速鉴别方法，专利申请号：201910126179.8，公开号：CN109765196A)报道了关于大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的鉴定方法，该方法运用近红外光谱(NIR)技术进行数据采集，预处理，然后采用化学计量学方法建立大西洋鲑鱼与虹鳟鱼的快速鉴别模型。该研究与本项目涉及方法和技术存在本质差异。本发明基于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI TOF MS)技术，对获得的质谱数据直接分析，能在短时间内准确、快速区分大西洋鲑鱼和虹鳟鱼。

发明内容

本发明提供了一种基于质谱分析技术快速鉴定大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的方法，采用质谱技术，只需基于少量样本及简单的数据处理就可实现高通量、快速、灵敏和简便的鱼种的鉴别。

本申请是通过以下技术方案实现的：

一种基于质谱分析技术快速鉴定大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的方法，包括如下步骤：

步骤(1)准备大西洋鲑鱼样本和虹鳟鱼样本，每种样本称量5-10g，并分别放在两个容器内，大西洋鲑鱼和虹鳟鱼亲缘关系接近，鱼肉样本相似，鱼肉的颜色、纹理相似，但是价格有区别；

步骤(2)向两种鱼肉样本中分别加入三氟乙酸水溶液，然后在电热板上加热，并冷却后制得样本，用三氟乙酸水溶液的目的是溶解出鱼肉组织蛋白或肽段提取物，并且与质谱仪的离子源具有极好的相容性，电热板上加热的目的是为了更快的溶解出蛋白；

步骤(3)将冷却后的两种样本分别用去离子水稀释，再经过离心后，取上清液，并对上清液进行稀释，并经过滤后，得到滤液样本；

步骤(4)取步骤(3)中的两种滤液样本分别1-2微升滴于质谱靶板上，待干后进入质谱仪分析；

步骤(5)对步骤(4)质谱分析后的两种质谱数据采集；

步骤(6)在市场上购买大西洋鲑鱼，并按照上述步骤(1)-(4)的方法处理，然后进行质谱数据采集；

步骤(7)对步骤(5)、(6)采集的三种质谱数据进行基线、归一化处理；

步骤(8)比较步骤(6)中的购买大西洋鲑鱼和步骤(5)中的虹鳟鱼样本的质谱图的相似性得分，当相似性得分为零时，可判定购买大西洋鲑鱼不是虹鳟鱼；

步骤(9)比较步骤(6)中的购买大西洋鲑鱼和步骤(5)中的大西洋鲑鱼样本的质谱图的相似性得分，当相似性得分在95％以上时，可判定购买大西洋鲑鱼就是大西洋鲑鱼。

进一步，所述步骤(4)的用去离子水稀释的目的是，在质谱分析时，防止蛋白或肽段的质谱峰堆叠，更易获得良好的质谱峰。

进一步，所述步骤(4)的离心是采用型号为TGL-18C的离心机离心。

进一步，所述步骤(4)的过滤是用0.22μm的Millipore纤维素膜过滤。

进一步，所述步骤(4)中的质谱仪的型号为Micro Flex LRF。

有益效果：许多种属相近的鱼如大西洋鲑鱼和虹鳟鱼肉质颜色及纹理较相似，尤其是加工成鱼片、鱼排或鱼糜后增加了区分难度，因此建立一种快速、灵敏、可靠的质谱技术对二者进行区分和鉴定。本发明只需少量的样本就可以达到区分大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的目的。本发明只需对获得的原始质谱数据进行基处理后就可以通过直接比对质谱图区分和鉴定大西洋鲑鱼和虹鳟鱼。本发明用基质辅助激光解吸/电离(MALDI)质谱(MS)技术区分和鉴定大西洋鲑鱼和虹鳟鱼，达到高效率、省时、快速、灵敏和高通量的检测效果。

附图说明

图1为本申请中大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱相似性得分示意图。

图2为本申请中虹鳟鱼和盲样的质谱相似性得分示意图。

图3为本申请中大西洋鲑鱼和盲样的质谱相似性得分示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

一种基于质谱分析技术快速鉴定大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的方法，包括如下步骤：

步骤(1)准备大西洋鲑鱼样本和虹鳟鱼样本，每种样本称量5-10g，并分别放在两个容器内，大西洋鲑鱼和虹鳟鱼亲缘关系接近，鱼肉样本相似，鱼肉的颜色、纹理相似，但是价格有区别；

步骤(2)向两种鱼肉样本中分别加入三氟乙酸水溶液，然后在电热板上加热，并冷却后制得样本，用三氟乙酸水溶液的目的是溶解出鱼肉组织蛋白或肽段提取物，并且与质谱仪的离子源具有极好的相容性，电热板上加热的目的是为了更快的溶解出蛋白；

步骤(3)将冷却后的两种样本分别用去离子水稀释，再经过离心后，取上清液，并对上清液进行稀释，并经过滤后，得到滤液样本；

步骤(4)取步骤(3)中的两种滤液样本分别1-2微升滴于质谱靶板上，待干后进入质谱仪分析，所述步骤(4)的用去离子水稀释的目的是，在质谱分析时，防止蛋白或肽段的质谱峰堆叠，更易获得良好的质谱峰，所述步骤(4)的离心是采用型号为TGL-18C的离心机离心，所述步骤(4)的过滤是用0.22μm的Millipore纤维素膜过滤，所述步骤(4)中的质谱仪的型号为Micro Flex LRF；

步骤(5)对步骤(4)质谱分析后的两种质谱数据采集；

步骤(6)在市场上购买大西洋鲑鱼，并按照上述步骤(1)-(4)的方法处理，然后进行质谱数据采集；

步骤(7)对步骤(5)、(6)采集的三种质谱数据进行基线、归一化处理；

步骤(8)比较步骤(6)中的购买大西洋鲑鱼和步骤(5)中的虹鳟鱼样本的质谱图的相似性得分，当相似性得分为零时，可判定购买大西洋鲑鱼不是虹鳟鱼；

步骤(9)比较步骤(6)中的购买大西洋鲑鱼和步骤(5)中的大西洋鲑鱼样本的质谱图的相似性得分，当相似性得分在95％以上时，可判定购买大西洋鲑鱼就是大西洋鲑鱼。

为了验证本申请方法的正确性，试验后，申请人对大西洋鲑鱼进行了基因鉴定，发现鉴定的结果却是就是大西洋鲑鱼，这说明本申请这种鉴定鱼种类的方法是可行的。同样道理，本申请这种利用质谱图的相似性得分来判断鱼的种类的方法，同样也可以使用与其他鱼种，在判断时，同样也是选择亲缘关系相近的鱼来进行质谱图数据分析。

1)基于质谱相似性得分的大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的区分：

为了区分大西洋鲑鱼和虹鳟鱼，我们用软件直接对比了二者的质谱图，如图1所示，图中1,2分别表示虹鳟鱼和大西洋鲑鱼，我们肉眼看到大西洋鲑鱼和大西洋鲑鱼的质谱图较为相似，但是，通过软件比对二者的质谱相似性得分可知，数据结构显示二者实际上存在较大的差别，相似性得分为0。大量结果表明本发明的方法是可以实现大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的鉴别的。

2)市场上购买的鱼(盲样)的鉴定：

如图2-3所示，图中1,2,3分别表示虹鳟鱼、大西洋鲑鱼和盲样。图2我们展示了盲样与虹鳟鱼的质谱相似性得分图，可以看到，盲样(记为3)与虹鳟鱼(记为1)的质谱相似性得分为0，此外，图3展示了盲样与大西洋鲑鱼(记为2)的质谱相似性得分图，结果显示，盲样(记为3)与大西洋鲑鱼(记为2)的质谱图具有98.0％的相似性，我们认为，该盲样来自大西洋鲑鱼。综上可知，我们可以通过直接对比质谱数据图型来鉴别未知样本。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。