一种抗菌活性敷料及其制备方法
阅读说明：本技术 一种抗菌活性敷料及其制备方法 (Antibacterial active dressing and preparation method thereof ) 是由 蓝咏 刘玉 何灼华 冯龙宝 于 2020-05-07 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种抗菌活性敷料,所述敷料包括如下质量百分比的组分：羧甲基纤维素钠1％～4％、丝胶蛋白0.2％～2％、含克林霉素的羧甲基纤维素微球0.01％～0.2％、余量为去离子水。本发明将克林霉素负载到羧甲基纤维素微球(CMs)上得到粒径均匀的羧甲基纤维素微球(CMs@CLDM),以开发协同有效的抗菌微球,从而在不降低抗菌性能的情况下使抗生素的加入量减少,同时增加了材料的生物相容性；而且基于丝胶蛋白/羧甲基纤维素敷料,能提高单纯羧甲基纤维素敷料易降解的性能,丝胶蛋白的加入提高了CMC敷料的水稳定性和细胞粘附性能。(The invention relates to an antibacterial active dressing which comprises the following components in percentage by mass: 1 to 4 percent of sodium carboxymethylcellulose, 0.2 to 2 percent of sericin, 0.01 to 0.2 percent of carboxymethyl cellulose microsphere containing clindamycin and the balance of deionized water. According to the invention, clindamycin is loaded on carboxymethyl Cellulose Microspheres (CMs) to obtain carboxymethyl cellulose microspheres (CMs @ CLDM) with uniform particle size, so as to develop synergistically effective antibacterial microspheres, thereby reducing the addition of antibiotics without reducing antibacterial performance and simultaneously increasing the biocompatibility of the material; and based on the sericin/carboxymethyl cellulose dressing, the easy-degradation performance of the single carboxymethyl cellulose dressing can be improved, and the water stability and the cell adhesion performance of the CMC dressing are improved by adding the sericin.)
技术领域
本发明涉及一种抗菌活性敷料及其制备方法，属于医用生物材料技术领域。
背景技术
皮肤在保护身体免受外来入侵方面起着关键作用。皮肤作为与周围环境接触的第一层，也是最大的一层，更容易受伤。因此，使用有效的伤口敷料已被认为是加速愈合过程的有效途径。合适的伤口敷料应该能够提供伤口周围的最佳条件，这最好地模拟皮肤的细胞外基质(ECM)，以帮助允许上皮细胞运动，适当地传递氧气，允许潮湿的环境，排出伤口分泌物，并在很大程度上防止伤口感染。
在这方面，羧甲基纤维素钠(CMC)基敷料因其丰富性、透明度和低成本而受到特别关注。CMC的高亲水性导致伤口渗出物的高度吸收；它还提供了伤口周围的潮湿环境，并防止组织失水，这在烧伤和糖尿病伤口中非常重要。尽管有这些改进，但CMC敷料的细胞粘附性相对较差，在以前的研究中已有报道。此外，较低的抗菌活性和水稳定性限制了它们作为伤口敷料的实际适用性。为了弥补这一缺陷，CMC与其他聚合物的混合是一种可行的方案。在制备敷料时，除了选择CMC之外，选择一种基于自然的蛋白质可以更接近于制造类似于自然ECM的结构。
丝胶是一种来源于丝绸的天然生物材料，具有优异的生物相容性、低免疫原性、天然细胞黏附性、促增殖作用和可调节的机械性能。以前的研究已经证明丝胶或丝胶衍生物在体外和活体中不刺激炎症反应。此外，丝胶的制备简单，成本低，存储方便，保质期长。丝胶涂层底物与胶原涂层基质相比，L929成纤维细胞具有更好的附着和生长，从蚕茧中提取的丝胶蛋白在愈合伤口方面更有效，因为上皮细胞几乎完全再生。
壳聚糖微球是一种应用广泛的药物载体材料。然而，壳聚糖的水溶性差，溶解时需加入盐酸或乙酸来增加溶解度，这些酸在清洗时很难完全去除，对细胞有一定的刺激性。相比于壳聚糖，羧甲基纤维素钠水溶性大大提高，这扩展了壳聚糖的应用范围，同时保持了其生物相容性等特质。
克林霉素是一种有效的抗生素，用于治疗严重的皮肤和软组织感染，特别是由金黄色葡萄球菌(S.aureus)引起的感染，如烧伤伤口感染。
针对传统抗生素敷料剂量大会产生耐药性，本发明将克林霉素负载到羧甲基纤维素微球(CMs)上从而能提高抗菌性能和生物相容性，使其适合皮肤创面的愈合。而且在制备敷料时，除了选择纯羧甲基纤维素钠之外，选择一种基于自然的蛋白质(丝胶蛋白)可以更接近于制造类似于自然细胞质基质的结构。该系统完全可扩展到任何其他可溶性药物，从而达到在敷料中缓慢释放药物的效果。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种抗菌活性敷料及其制备方法，本发明的敷料具有很高的杀菌性能。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种抗菌活性敷料，所述敷料包括如下质量百分比的组分：羧甲基纤维素钠1％～4％、丝胶蛋白0.2％～2％、含克林霉素的羧甲基纤维素微球0.01％～0.2％、余量为去离子水。
作为本发明所述敷料的优选实施方式，所述敷料包括如下质量百分比的组分：羧甲基纤维素钠2％、丝胶蛋白1％、含克林霉素的羧甲基纤维素微球0.1％、余量为去离子水。
作为本发明所述敷料的优选实施方式，所述含克林霉素的羧甲基纤维素微球的制备方法为：
(1)将羧甲基纤维素钠和克林霉素加入去离子水中，然后加入液体石蜡、司班80，水浴加热，并滴加明胶溶液，形成混合溶液，加入交联剂，搅拌反应；
(2)反应结束后，将反应液离心取得沉淀，洗涤、冷冻干燥沉淀，即得含克林霉素的羧甲基纤维素微球。
作为本发明所述敷料的优选实施方式，所述羧甲基纤维素钠和克林霉素的质量比为(10～30)：1。优选为20:1。
作为本发明所述敷料的优选实施方式，所述搅拌反应的转速为400～1000rmp，所述搅拌反应的时间为2h，所述离心时间为1～10min，所述交联剂为戊二醛。优选地，搅拌反应的转速为600rmp，离心时间为3min。
作为本发明所述敷料的优选实施方式，所述含克林霉素的羧甲基纤维素微球([email protected])的制备方法为：
(1)称取0.3g羧甲基纤维素钠和0.03g克林霉素溶于10mL去离子水中，然后加入10mL液体石蜡，加入磁子搅拌后，再加入2mL司班80作为乳化剂，40℃水浴加热；
(2)将配好的10mL 3％的明胶溶液转移到滴液漏斗中，然后在400rmp转速下，缓慢将明胶溶液滴加进上述反应液中，直至滴加完毕(约4h)，得到混合溶液；
(3)然后加入交联剂0.2mL 5wt％的戊二醛(每次取20uL，每20分钟加一次)，保持400rmp的转速，继续搅拌反应2h；
(4)反应液用4000rmp的转速离心3min取沉淀物，将沉淀物用异丙醇和无水乙醇交替洗涤3次，将洗涤后的沉淀物冷冻干燥，得到含克林霉素的羧甲基纤维素微球([email protected])。
作为本发明所述敷料的优选实施方式，所述丝胶蛋白的制备方法为：将蚕茧切成片并用去离子水洗涤，浸入Na2CO3溶液中煮沸，离心、过滤去除不溶性残留物，然后用去离子水透析，冻干，即得丝胶蛋白。
作为本发明所述敷料的优选实施方式，所述煮沸时间为0.5～2h，所述离心的转速为1000～5000rpm，所述离心的时间为5～15min。优选地，煮沸时间为1h，离心的转速为3500rpm，离心的时间为10min。
作为本发明所述敷料的优选实施方式，所述丝胶蛋白(Ser)的制备方法为：采用热和碱脱胶方法从蚕茧中提取丝胶，将5.0g蚕茧切成片并用去离子水洗涤，浸入200mL 0.02MNa2CO3溶液中煮沸1小时，随后通过离心(3500rpm，10分钟)和过滤去除不溶性残留物，用去离子水透析反应液(MWCO 3.5kDa)以除去Na2CO3，透析2天，冻干即得丝胶蛋白。
第二方面，本发明提供了上述敷料的制备方法，包括以下步骤：将羧甲基纤维素钠和丝胶蛋白加入去离子水中，搅拌直到完全溶解，然后加入含克林霉素的羧甲基纤维素微球，搅拌使微球均匀分散，然后将反应液倒入模具中，冷冻过夜，干燥后交联，即得抗菌活性敷料。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述搅拌直到完全溶解的时间为3h，所述搅拌使微球均匀分散的时间为15min，所述冷冻过夜的温度为-70℃。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述交联的温度为70℃，所述交联的时间为72h。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明以丝胶蛋白、羧甲基纤维素钠和克林霉素负载的羧甲基纤维素微球为原料，通过冷冻干燥制备具有明显相互连接的多孔结构的三维抗菌伤口敷料，模拟细胞外基质结构，具有良好的机械性能和生物相容性。
(2)本发明将克林霉素负载到羧甲基纤维素微球(CMs)上得到粒径均匀的羧甲基纤维素微球([email protected])，以开发协同有效的抗菌微球，从而在不降低抗菌性能的情况下使抗生素的加入量减少，同时增加了材料的生物相容性；而且基于丝胶蛋白/羧甲基纤维素敷料，能提高单纯羧甲基纤维素敷料易降解的性能，丝胶蛋白的加入提高了CMC敷料的水稳定性和细胞粘附性能。
(3)针对传统抗生素敷料剂量大会产生耐药性，将克林霉素负载到羧甲基纤维素微球(CMs)上，从而能提高抗菌性能和生物相容性，使其适合皮肤创面的愈合。本发明复合敷料的克林霉素释放能长达14天，同时对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有较好的抗菌效果。与之前传统含抗生素的敷料相比，本研究的负载克林霉素的羧甲基纤维素微球敷料具有很高的杀菌性能。
附图说明
图1为实施例5和对比例2制备的敷料的外观图；其中，左边为对比例2制备的敷料的外观图，右边为实施例5制备的敷料的外观图。
图2为实施例5和对比例2制备的敷料的扫描电镜图；其中，A为对比例2制备的敷料的扫描电镜图，B为实施例5制备的敷料的扫描电镜图。
图3为实施例5和对比例2制备的敷料的克林霉素的释放性能曲线图。
图4为实施例4～6和对比例1～2制备的敷料的细胞存活率统计图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种羧甲基纤维素/丝胶蛋白敷料(CMC/Ser)，其制备方法为：将羧甲基纤维素钠粉末(2g)和丝胶蛋白(0.2g)逐渐加入100mL去离子水中，然后轻轻搅拌直到完全溶解，加入作为交联剂的0.1g 5wt.％柠檬酸(聚合物重量)和作为交联扩充剂的0.06g 3wt.％甘油(聚合物重量)，然后将混合物倒入聚四氟乙烯模具中；随后，将模具存放在-70℃过夜，冷冻干燥；然后，将样品在70℃下交联72h，即得羧甲基纤维素/丝胶蛋白敷料(CMC/Ser)。
其中，丝胶蛋白的制备方法为：采用热和碱脱胶方法从蚕茧中提取丝胶，将5.0g蚕茧切成片并用去离子水洗涤，浸入200mL 0.02M Na2CO3溶液中煮沸1小时，随后通过离心(3500rpm，10分钟)和过滤去除不溶性残留物，用去离子水透析反应液(MWCO 3.5kDa)以除去Na2CO3，透析2天，冻干即得丝胶蛋白。
实施例2
一种羧甲基纤维素/丝胶蛋白敷料(CMC/Ser)，其制备方法为：将羧甲基纤维素钠粉末(2g)和丝胶蛋白(1g)逐渐加入100mL去离子水中，然后轻轻搅拌直到完全溶解，加入作为交联剂的0.1g 5wt.％柠檬酸(聚合物重量)和作为交联扩充剂的0.06g 3wt.％甘油(聚合物重量)，然后将混合物倒入聚四氟乙烯模具中；随后，将模具存放在-70℃过夜，冷冻干燥；然后，将样品在70℃下交联72h，即得羧甲基纤维素/丝胶蛋白敷料(CMC/Ser)。
丝胶蛋白的制备方法同实施例1。
实施例3
一种羧甲基纤维素/丝胶蛋白敷料(CMC/Ser)，其制备方法为：将羧甲基纤维素钠粉末(2g)和丝胶蛋白(2g)逐渐加入100mL去离子水中，然后轻轻搅拌直到完全溶解，加入作为交联剂的0.1g 5wt.％柠檬酸(聚合物重量)和作为交联扩充剂的0.06g 3wt.％甘油(聚合物重量)，然后将混合物倒入聚四氟乙烯模具中；随后，将模具存放在-70℃过夜，冷冻干燥；然后，将样品在70℃下交联72h，即得羧甲基纤维素/丝胶蛋白敷料(CMC/Ser)。
丝胶蛋白的制备方法同实施例1。
实施例4
一种羧甲基纤维素/丝胶蛋白/克林霉素微球敷料(CMC/Ser/[email protected])，包括如下质量百分比的组分：羧甲基纤维素钠2％、丝胶蛋白1％、含克林霉素的羧甲基纤维素微球0.01％、余量为去离子水。
其制备方法为：将羧甲基纤维素钠粉末(2g)和丝胶蛋白(1g)逐渐加入100mL去离子水中，然后轻轻搅拌直到完全溶解；搅拌约3h后，加入50mg含克林霉素的羧甲基纤维素微球，搅拌15min，使微球均匀分散在其上；然后将混合物倒入聚四氟乙烯模具中，将模具存放在-70℃过夜，冷冻干燥；然后，将样品在70℃下交联72h，即得羧甲基纤维素/丝胶蛋白/克林霉素微球敷料(CMC/Ser/[email protected])。
其中，含克林霉素的羧甲基纤维素微球([email protected])的制备方法为：
(1)称取0.3g羧甲基纤维素钠和0.03g克林霉素溶于10mL去离子水中，然后加入10mL液体石蜡，加入磁子搅拌后，再加入2mL司班80作为乳化剂，40℃水浴加热；
(2)将配好的10mL 3％的明胶溶液转移到滴液漏斗中，然后在400rmp转速下，缓慢将明胶溶液滴加进上述反应液中，直至滴加完毕(约4h)，得到混合溶液；
(3)然后加入交联剂0.2mL 5wt％的戊二醛(每次取20uL，每20分钟加一次)，保持400rmp的转速，继续搅拌反应2h；
(4)反应液用4000rmp的转速离心3min取沉淀物，将沉淀物用异丙醇和无水乙醇交替洗涤3次，将洗涤后的沉淀物冷冻干燥，得到含克林霉素的羧甲基纤维素微球([email protected])。
实施例5
一种羧甲基纤维素/丝胶蛋白/克林霉素微球敷料(CMC/Ser/[email protected])，包括如下质量百分比的组分：羧甲基纤维素钠2％、丝胶蛋白1％、含克林霉素的羧甲基纤维素微球0.1％、余量为去离子水。
其制备方法为：将羧甲基纤维素钠粉末(2g)和丝胶蛋白(1g)逐渐加入100mL去离子水中，然后轻轻搅拌直到完全溶解；搅拌约3h后，加入50mg含克林霉素的羧甲基纤维素微球，搅拌15min，使微球均匀分散在其上；然后将混合物倒入聚四氟乙烯模具中，将模具存放在-70℃过夜，冷冻干燥；然后，将样品在70℃下交联72h，即得羧甲基纤维素/丝胶蛋白/克林霉素微球敷料(CMC/Ser/[email protected])。
含克林霉素的羧甲基纤维素微球([email protected])的制备方法同实施例4。
实施例6
一种羧甲基纤维素/丝胶蛋白/克林霉素微球敷料(CMC/Ser/[email protected])，包括如下质量百分比的组分：羧甲基纤维素钠2％、丝胶蛋白1％、含克林霉素的羧甲基纤维素微球0.2％、余量为去离子水。
其制备方法为：将羧甲基纤维素钠粉末(2g)和丝胶蛋白(1g)逐渐加入100mL去离子水中，然后轻轻搅拌直到完全溶解；搅拌约3h后，加入50mg含克林霉素的羧甲基纤维素微球，搅拌15min，使微球均匀分散在其上；然后将混合物倒入聚四氟乙烯模具中，将模具存放在-70℃过夜，冷冻干燥；然后，将样品在70℃下交联72h，即得羧甲基纤维素/丝胶蛋白/克林霉素微球敷料(CMC/Ser/[email protected])。
含克林霉素的羧甲基纤维素微球([email protected])的制备方法同实施例4。
实施例7
一种羧甲基纤维素/丝胶蛋白/克林霉素微球敷料(CMC/Ser/[email protected])，包括如下质量百分比的组分：羧甲基纤维素钠1％、丝胶蛋白0.2％、含克林霉素的羧甲基纤维素微球0.01％、余量为去离子水。
其制备方法为：将羧甲基纤维素钠粉末(1g)和丝胶蛋白(0.2g)逐渐加入100mL去离子水中，然后轻轻搅拌直到完全溶解；搅拌约3h后，加入10mg含克林霉素的羧甲基纤维素微球，搅拌15min，使微球均匀分散在其上；然后将混合物倒入聚四氟乙烯模具中，将模具存放在-70℃过夜，冷冻干燥；然后，将样品在70℃下交联72h，即得羧甲基纤维素/丝胶蛋白/克林霉素微球敷料(CMC/Ser/[email protected])。
含克林霉素的羧甲基纤维素微球([email protected])的制备方法同实施例4。
实施例8
一种羧甲基纤维素/丝胶蛋白/克林霉素微球敷料(CMC/Ser/[email protected])，包括如下质量百分比的组分：羧甲基纤维素钠4％、丝胶蛋白2％、含克林霉素的羧甲基纤维素微球0.2％、余量为去离子水。
其制备方法为：将羧甲基纤维素钠粉末(4g)和丝胶蛋白(2g)逐渐加入100mL去离子水中，然后轻轻搅拌直到完全溶解；搅拌约3h后，加入200mg含克林霉素的羧甲基纤维素微球，搅拌15min，使微球均匀分散在其上；然后将混合物倒入聚四氟乙烯模具中，将模具存放在-70℃过夜，冷冻干燥；然后，将样品在70℃下交联72h，即得羧甲基纤维素/丝胶蛋白/克林霉素微球敷料(CMC/Ser/[email protected])。
含克林霉素的羧甲基纤维素微球([email protected])的制备方法同实施例4。
对比例1
一种羧甲基纤维素敷料(CMC)，其制备方法为：将CMC粉末(2g)逐渐加入100mL去离子水中，然后轻轻搅拌直到完全溶解，加入作为交联剂的0.1g5wt.％(聚合物重量)柠檬酸和作为交联扩充剂的0.06g 3wt.％甘油(聚合物重量)，将混合物倒入聚四氟乙烯模具中；随后，将模具存放在-70℃过夜，冷冻干燥；然后，将样品在70℃下交联72h，即得羧甲基纤维素敷料(CMC)。
对比例2
一种羧甲基纤维素/丝胶蛋白/克林霉素(CMC/Ser/CLDM)敷料，其制备方法为：将CMC(2g)和丝胶蛋白(1g)逐渐加入100mL去离子水中，然后轻轻搅拌直到完全溶解；搅拌约3h后，加入50mg克林霉素，搅拌约15分钟，使溶液均匀，然后将混合物倒入聚四氟乙烯模具中；随后，将模具存放在-70℃过夜，冷冻干燥；然后，将样品在70℃下交联72小时，即得羧甲基纤维素/丝胶蛋白/克林霉素(CMC/Ser/CLDM)敷料。
效果例
(1)敷料外观
实施例5和对比例2制备的敷料的外观图如图1所示，可以看出，实施例5和对比例2制备的敷料均呈现呈白色，表面光滑的外观。
(2)扫描电镜图
将制备的敷料喷金后，置于扫描电子显微镜下观察。测试条件为：5kV electronbeam。实施例5和对比例2制备的敷料的扫描电镜图如图2所示，其中，A为对比例2制备的敷料的扫描电镜图，B为实施例5制备的敷料的扫描电镜图。由图2可知，对比例2制备的敷料呈多孔的网状结构，直径为50～60μm。而且实施例5制备的敷料电镜图中可以看到[email protected]微球的嵌在敷料内部。
(3)吸水率、水蒸气透过率、孔隙率、拉伸强度
吸水率：吸水是生物材料的另一个特点，当用作伤口敷料时尤其应该考虑。为了获得样品的初始重量(Wo)，在去离子水中浸泡之前称量敷料。浸泡并在37℃下孵育约24小时后，再次称重膨胀的敷料(Ws)，同时用滤纸轻轻擦去多余的水分。吸水率由下列方程获得：
吸水率(％)＝(Ws-W0)/W0
水蒸气透过率：水蒸气透过率(WVTR)是评价所制备的复合材料控制水分损失的能力。简单地说，将样品固定在装满去离子水的玻璃瓶(直径13mm)的顶部。边缘用胶带完全密封，称重后放入相对湿度为37％，温度为32±1℃的恒温恒湿培养箱中。24小时后，测量组件的重量损失并绘制随时间变化的曲线。水蒸气透过率(WVTR)根据以下公式计算：
WVTR＝(△m/△t)/A
其中，△m/△t为24小时的水分损失重量(g/day)，A为瓶口的表面积(mm2)。
孔隙率：将比重瓶装满乙醇，称量其质量W1，把质量为Ws的样品浸入乙醇中，为了使乙醇充盈于多孔敷料的孔中，对其进行脱气,然后再加满乙醇，称其质量为W2，把浸满乙醇的样品取出后，称量剩余的乙醇与比重瓶的质量W3。每个样品重复测定3,次，取平均值。孔隙率p的计算公式为：
P＝(W2-W3-Ws)/(W1-W3)
拉伸强度：复合敷料的机械强度参照医药行业标准YY/T 0471.4-2004的测试方法进行，采用电子拉力试验机测试敷料的拉伸强度和断裂伸长率，其承载能力为500N，效率在±1％以内。具体步骤如下：将样品裁剪成长为90mm，宽为25mm的长条形样品。用游标卡尺测量其厚度并记录。在恒温恒湿条件(温度为25℃，相对湿度为70％)下进行拉伸，测试时试样的夹持距离为50mm，拉伸速率为300mm/min。按照试验方法规定设置程序，进行检测，记录敷料的拉伸强度(TS)，每个试验测试5组有效数据。
表1
实施例1～8、对比例1～2制备的敷料的吸水率、孔隙率、水蒸气透过率、拉伸强度如表1所示。从表1可知，所制备的敷料在PBS缓冲液中的吸水率为2000％～3200％。这种高的吸水率主要是由于羧甲基纤维素的高亲水性和敷料的多孔结构所致。从敷料在伤口上的应用角度出发，其吸水率越大，越有利于快速吸收伤口渗出液，并保持适当的湿润的愈合环境。可以看出，在CMC羧甲基纤维素(2g)和丝胶蛋白(1g)时，敷料具有最大的吸水率。
水蒸气透过率(WVTR)是评价伤口敷料效果的关键参数。从表1可知，空白对照组的水蒸气透过率为13391.52g/m2·24h，敷料的水蒸气透过率值在1800～2800g/m2·24h。与不加敷料的空白对照组相比，复合敷料均能有效减少水蒸气的损失。研究表明，WVTR在2000～2500g/m2·24h左右的敷料能够保持较好的水分含量，从而促进表皮细胞和成纤维细胞的增殖。可以看出，在CMC羧甲基纤维素(2g)和丝胶蛋白(1g)时，敷料具有合适的水蒸气透过率。
由表1可知，敷料的孔隙率范围为70％～90％。一般情况下，拥有80％～90％的孔隙率的敷料被认为是具有较好功能性的敷料。可以看出，在CMC羧甲基纤维素(2g)和丝胶蛋白(1g)时，材料的孔隙率最佳。
由表1可知，敷料拉伸强度均在0.21～0.33MPa范围内。可知，CMC羧甲基纤维素(2g)和丝胶蛋白(1g)时，拉伸强度达到最大值，适合皮肤伤口的应用。
(4)药物释放
剪裁2×2cm敷料放入50mL的离心管中，每份样品加入20mL PBS(pH＝7.4)，随后将离心管置于37℃水浴，分别在所设置时间点取样，取出1mL上清液，收集于无菌的离心管中，-80℃待测。将各个时间点收集的缓释液用紫外分光光度计进行检查，测定各时间点缓释液在最大吸收波长210nm处的吸光度(A),根据标准曲线，计算相对应的缓释液所含的克林霉素的浓度，从而推算出各时间点的药物释放量。
实施例5和对比例2制备的敷料体系药物释放曲线如图3所示。由图3可知，对比例2所制备的敷料在第2天药物基本完全释放。而实施例5所制备的敷料呈缓慢释放的趋势，到第11天抗菌肽总释放率约为87.21％，未释放完全，猜测是还有部分药物被CMs微球包裹所致。说明本方法制备的敷料具有持续输送药物的功能。
(5)抗菌实验
抑菌圈实验采取美国临床和实验室标准协会(CLSI)制定的标准，详细步骤：首先将实验室超净工作台进行灭菌处理，操作前开紫外照射30min。然后用打孔器裁剪出1C×1cm大小的敷料，滴取100μL上述细菌悬浮液到固体LB培养基，用涂布棒在上面涂布均匀，然后将上述裁剪好的样品依次贴在培养基上面，等15min后将培养皿放回37℃生化培养箱倒置培养，培养时间为24h。取出培养基观察上面抑菌圈的大小和细菌的生长情况，每组做三个平行试样。
表2
实施例4～8和对比例2所制备的敷料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果如表2所示。由表2可知，实施例4～8制备的敷料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑菌圈。其中实施例6和实施例8制备的敷料抗菌性能最大，实施例5、实施例6～8和对比例2制备的敷料抑菌圈无明显差异，考虑到高的克林霉素浓度会产生一定的细胞毒性，因此选择实施例5制备的敷料作为最优组。体外抗菌实验表明，该敷料对表皮葡萄球菌(革兰氏阳性)和大肠杆菌(革兰氏阴性)均具有良好的抗菌性。
(6)细胞毒性
按照国标GB/T 16886.12对医疗器械的浸提液浸提标准，按照表面积1.25cm2/mL比例浸提浸提液。按国标加入浸提液后，在37℃摇床中培养24±2h，即用，剩余可放4℃冰箱待用。将含100uL小鼠成纤维细胞3T3(1×104个/mL)的培养基接种于96孔板中。接种12h后取出原培养液，并分别在每孔皿中加入100μL实验材料浸提液。每组至少设5孔。培养液2天换一次。细胞在培养1天、2天、3天后，培养液被移除，细胞PBS洗涤2次。每孔加入培养基量50ul的CCK8溶液，并设定阴性对照(空白培养基)，在细胞培养箱中培养1h-2h。根据颜色变化判断，将培养板取出，将对应孔内液体吸至96孔板中。并在酶标仪450nm波长下检测吸光度值(OD值)，记录并计算数据。对实施例4～6和对比例1～2所制备的敷料进行生物相容性测试，测试结果如图4所示。
由图4可知，对比例1所制备的CMC敷料组(约96％)的细胞相对存活率与对照组相当，表明CMC敷料组没有细胞毒性。对比例2所制备的CMC/Ser/CLDM敷料组细胞存活率只有70％左右，细胞毒性为2级，显示为轻度细胞毒性。
当CLDM负荷在羧甲基壳聚糖微球中时，实施例4制备的CMC/Ser/[email protected]敷料、实施例4制备的CMC/Ser/[email protected]敷料细胞存活率均大于90％，显示微球负载克林霉素的敷料组基本没有细胞毒性。而CMC/Ser/[email protected]敷料细胞存活率有所降低，约85％左右。结果表明，通过微球负载克林霉素的技术，所设计的敷料具有零级的细胞毒性，可应用于植入材料。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。