一种可降解壳聚糖基复合止血薄膜
阅读说明：本技术 一种可降解壳聚糖基复合止血薄膜 (Degradable chitosan-based composite hemostatic film ) 是由 张正男 段书霞 潘红福 闫钧 付迎坤 常聪 周静 储旭 何孜翰 柳小军 田林奇 于 2020-12-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种可降解壳聚糖基复合止血薄膜,包括基材层和功能层,所述基材层为可降解纤维布；所述功能层为改性壳聚糖、聚乙二醇2000、明胶、黄原胶、Ag/Fe-2O-3磁性纳米粒子、锻制花蕊石、油酸酰胺制备得到的复合水凝胶,功能层通过聚多巴胺与基材层结合。本发明提供的可降解壳聚糖基复合止血薄膜具有柔软透气、安全性高、机械性能良好,吸水保水能力强,能够与伤口紧密贴合,容易剥离,止血、抗感染效果好,不会产生血管栓塞副作用。(The invention discloses a degradable chitosan-based composite hemostatic film, which comprises a substrate layer and a functional layer, wherein the substrate layer is degradable fiber cloth; the functional layer is modified chitosan, polyethylene glycol 2000, gelatin, xanthan gum, Ag/Fe 2 O 3 The functional layer of the composite hydrogel prepared from magnetic nanoparticles, forged ophicalcite and oleamide is polymerizedThe bamine is bonded to the substrate layer. The degradable chitosan-based composite hemostatic film provided by the invention has the advantages of softness, air permeability, high safety, good mechanical property, strong water absorption and retention capacity, capability of being tightly attached to a wound, easiness in stripping, good hemostatic and anti-infection effects and no side effect of vascular embolism.)
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，具体涉及一种可降解壳聚糖基复合止血薄膜。
背景技术
已有研究表明壳聚糖可黏附聚集红细胞和血小板，通过血小板的活化激活凝血途径，加速纤维蛋白胶的合成，刺激血管收缩，最终封合伤口。同时壳聚糖还具有一定的抗菌、止痛、促进伤口愈合及减少疤痕的作用，是一种理想的止血材料。然而单纯的壳聚糖材料，包括凝胶和纤维，其机械强度往往较弱。因此，研发性质稳定、安全无毒、具有良好的机械强度的壳聚糖基复合止血材料成为热点。现有技术在制备壳聚糖复合材料时为了提高材料的机械强度，大都需要用到交联剂，如对苯二甲醛、己二醛或戊二醛等，而残留的交联剂会对伤口造成刺激，不利于伤口愈合。而粉状矿物具有良好的止血、吸水性能，也是制备复合止血材料常用的组分，但是粉体容易聚集造成止血效果下降，还存在粉体脱落进入血管造成血管栓塞的风险，能够固载粉体使其发挥止血凝血功效，又能避免泄露是复合止血材料研发面临的难题。为改进复合止血材料贴合性、粘附性及避免粉状矿物泄露，研发人员通常采用增大材料黏度或提高材料致密性的方法，这又引发了止血材料难以与伤口分离，揭掉时造成二次伤害或材料舒适度变差的问题。
发明内容
本发明提供一种能直接用于创面、不会与伤口粘结，机械性能良好、安全无毒、抗感染的可降解壳聚糖基复合止血薄膜及其制备方法。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种可降解壳聚糖基复合止血薄膜，包括基材层和功能层；所述基材层为可降解纤维布；所述功能层为改性壳聚糖、聚乙二醇2000、明胶、黄原胶、Ag/Fe2O3磁性纳米粒子、锻制花蕊石、油酸酰胺制备得到的复合水凝胶，功能层通过聚多巴胺与基材层结合。
进一步地，所述可降解纤维布所用纤维为聚乳酸纤维、聚碳酸纤维、聚羟基乙酸、聚己内酯纤维、聚丁二酸丁二醇酯纤维、聚三亚甲基碳酸酯纤维中的一种或几种。
进一步地，所述改性壳聚糖的制备方法为：将壳聚糖粉末溶于1wt％醋酸配置成1wt％壳聚糖—醋酸溶液，加入烷基醛，室温搅拌12h，用NaOH溶液调节pH至5，缓慢加入硼氢化钠后继续搅拌2h，再次用NaOH溶液调节pH至7，待沉淀析出后，过滤洗涤至中性，再用乙醇反复洗涤，除去多余的醛，冷冻干燥研磨即得改性壳聚糖。
进一步地，所述烷基醛为己醛、十二醛、十八醛中的一种或几种。
进一步地，所述Ag/Fe2O3磁性纳米粒子的制备方法为：将Fe2O3磁性纳米粒子配制成悬浮液，加入浓度为0.1％的硝酸银溶液，振荡20～30min，加入柠檬酸三钠还原剂，反应5～15min后，再次加入浓度为1％的硝酸银溶液，振荡5～10min，被还原的纳米银包覆在Fe2O3磁性纳米粒子表面，磁性分离，去离子水反复洗涤即得Ag/Fe2O3磁性纳米粒子。
进一步地，所述锻制花蕊石的制备方法为：将产地为安徽亳州的花蕊石超微粉碎后过 100目筛，400℃煅烧4h，乙酸淬冷后研磨制得。
进一步地，所述功能层制备原料的重量份数配比为：改性壳聚糖90～150、聚乙二醇 2000 6～10份、明胶24～40份、黄原胶12～20份、Ag/Fe2O3磁性纳米粒子6～14份、锻制花蕊石12～25份、油酸酰胺0.1～0.2份。
进一步地，所述明胶、黄原胶的重量份数比为2:1。
进一步地，所述改性壳聚糖、聚乙烯醇2000、明胶、黄原胶的重量份数比为15:1:4:2。
一种所述可降解壳聚糖基复合止血薄膜的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、基材层表面改性：配制含透明质酸和多巴胺的Tris-HCl缓冲溶液，分别加入 EDC和NHS，将基材层浸没其中，室温下反应2h，取出用去离子水多次冲洗后再浸没于去离子水中6h，真空冷冻干燥，得到表面改性的基材层；
步骤二、功能层的制备：将改性壳聚糖溶解于3wt％醋酸配成溶液；分别取明胶、黄原胶溶解于40℃的去离子水中配置成溶液，放置溶胀8h得明胶溶液和黄原胶溶液；在明胶溶液中加入改性壳聚糖溶液和油酸酰胺，快速搅拌30s，再加入聚乙二醇2000、Ag/Fe2O3磁性纳米粒子、锻制花蕊石超声处理40～60s，然后将黄原胶溶液逐滴加入，滴加完毕后置于室温下静置反应12～24h，用去离子水充分洗涤后冷冻干燥，得复合水凝胶功能层；
步骤三、功能层与基材层的结合：将功能层与基材层叠置冷压，即得可降解壳聚糖基复合止血薄膜。
进一步地，步骤一中所述Tris-HCl缓冲溶液浓度为10mM，pH为8.5。
进一步地，步骤四中冷压采用的压力为2～4MPa，时间10～20min。
本发明基材层表面可以接枝透明质酸，一方面透明质酸分子间存在较强的氢键作用提高了基材层的力学性能，另一方面透明质酸具有非常优异的保持水分的作用，也进一步提高了基材层的吸水保水性能。此外，多巴胺分子能够在基材表面进行自组装，通过自身聚合和与透明质酸的氨基反应对基材表面进行改性，使得改性后的基材表面具有良好的粘附性和亲水保水性。基材层表面改性后无需使用粘合剂就能够在常温和较小压力条件下与功能层结合，且结合牢固，有效避免了粘合剂对伤口的刺激。
本发明功能层所用壳聚糖与明胶、黄原胶是天然的生物大分子，生物相容性好，无毒副作用，壳聚糖通过烷基化改性止血功能及抗菌性得到提高，其在酸性水溶液中带正电荷，能够与明胶发生交联作用，从而与聚乙二醇一起对Ag/Fe2O3磁性纳米粒子、锻制花蕊石进行初步交联固定，避免二者的聚集，当滴加入带负电荷的阴离子多糖黄原胶时，黄原胶通过与壳聚糖间发生聚电解质络合作用形成共凝胶，对Ag/Fe2O3磁性纳米粒子、锻制花蕊石进行二次固定，避免了可能由于二者泄露造成血管栓塞的副作用，同时由于明胶的三维螺旋结构具有一定的刚性，其能够贯穿凝胶体系，既能保证复合凝胶的多孔结构又能提高水凝胶的机械性能。
明胶具有良好的吸水性、黄原胶具有良好的剪切性，本发明首先在明胶溶液中加入壳聚糖溶液，使得明胶三维结构和壳聚糖骨架间发生交联形成第一网络结构，使得水凝胶具有良好的韧性，在外力作用下第一网络结构交联骨架能够在水凝胶内部发生滑移而不会导致止血薄膜整体的移位，能够始终与伤口接触；油酸酰胺无毒，性质稳定，生物相容性良好，本发明首先将油酸酰胺在体系中分散均匀，然后加入Ag/Fe2O3磁性纳米粒子、锻制花蕊石矿物组分，超声处理过程中油酸酰胺能够促进矿物组分在体系中的分散，避免发生聚集，从而实现对矿物组分的分散固载；本发明所用聚乙二醇2000能够提高复合水凝胶的延展性、抗撕裂性，使得复合水凝胶能够容纳较高含量的矿物成分，不会由于Ag/Fe2O3磁性纳米粒子、锻制花蕊石的加入而变得发硬、易碎。黄原胶通过滴加的方式与明胶及改性壳聚糖复合形成第二网络结构，制得的复合水凝胶一方面能够与伤口紧密贴合、持粘性高，可吸收渗液，促进伤口愈合，另一方面具有较小的剥离强度，能够轻松揭掉，从伤口剥离时不会对伤口造成二次伤害。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
(1)本发明提供的可降解壳聚糖基复合止血薄膜基材层采用可降解纤维材料，既能够满足止血薄膜对机械性能的要求，又具有柔软透气的性质，通过表面接枝透明质酸具有强大的吸水保水能力，能够将功能层的组织渗液吸收到基材层，使得功能层保持适宜的湿度，促进伤口愈合；基材层表面还具有通过自组装聚合及与透明质酸反应生成的聚多巴胺层，聚多巴胺具有粘附性，能够将功能层与基材层牢固结合在一起，也能进一步防止Ag/Fe2O3磁性纳米粒子、锻制花蕊石的泄露，避免造成血管栓塞。
(2)本发明所用Ag/Fe2O3磁性纳米粒子，纳米银负载在Fe2O3磁性纳米粒子表面，具有较大的比表面积，与常规纳米银粒子相比，杀菌效率更高，赋予复合止血薄膜优异的抗感染功能；Fe2O3磁性纳米粒子具有磁响应性和超顺磁性，在交变磁场作用下能够吸收电磁波产热，因而其能够在外加磁场作用下参与调控和调节细胞功能，促进伤口愈合。
(3)本发明提供的可降解壳聚糖基复合止血薄膜，不使用任何交联剂，不会对伤口产生刺激，通过明胶与壳聚糖的交联形成第一网络结构，黄原胶与壳聚糖的胶凝作用形成第二网络结构，制备得到双网络结构复合水凝胶，加入适量的聚乙烯醇2000提高了复合水凝胶的延展性和抗撕裂性，同时能够有效固定矿物组分，复合水凝胶的多孔结构能够保证矿物组分止血抗菌及促进伤口愈合功效的发挥，同时交联作用及聚乙烯醇2000的固定能够阻止矿物组分的泄露，避免副作用的发生。
附图说明
图1为细胞毒性测试结果。
图2为体外全血凝固测试结果。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合具体实施例进行详细描述。
实施例1
一种可降解壳聚糖基复合止血薄膜，包括基材层和功能层；所述基材层为聚碳酸纤维布；所述功能层为改性壳聚糖、聚乙二醇2000、明胶、黄原胶、Ag/Fe2O3磁性纳米粒子、锻制花蕊石、油酸酰胺制备得到的复合水凝胶，功能层通过聚多巴胺与基材层结合；所述功能层制备原料的重量份数配比为：改性壳聚糖150份、聚乙二醇2000 10份、明胶40份、黄原胶20份、Ag/Fe2O3磁性纳米粒子14份、锻制花蕊石25份、油酸酰胺0.2份。
所述改性壳聚糖的制备方法为：将壳聚糖粉末溶于1wt％醋酸配置成1wt％壳聚糖—醋酸溶液，加入己醛，室温搅拌12h，用NaOH溶液调节pH至5，缓慢加入硼氢化钠后继续搅拌2h，再次用NaOH溶液调节pH至7，待沉淀析出后，过滤洗涤至中性，再用乙醇反复洗涤，除去多余的醛，冷冻干燥研磨即得改性壳聚糖。
所述Ag/Fe2O3磁性纳米粒子的制备方法为：将Fe2O3磁性纳米粒子配制成悬浮液，加入浓度为0.1％的硝酸银溶液，振荡20min，加入柠檬酸三钠还原剂，反应5min后，再次加入浓度为1％的硝酸银溶液，振荡5min，被还原的纳米银包覆在Fe2O3磁性纳米粒子表面，磁性分离，去离子水反复洗涤即得Ag/Fe2O3磁性纳米粒子。
所述锻制花蕊石的制备方法为：将产地为安徽亳州的花蕊石超微粉碎后过100目筛， 400℃煅烧4h，乙酸淬冷后研磨制得。
一种所述可降解壳聚糖基复合止血薄膜的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、基材层表面改性：配制含透明质酸和多巴胺的Tris-HCl缓冲溶液(Tris-HCl缓冲溶液浓度为10mM，pH为8.5)，分别加入EDC和NHS，将基材层浸没其中，室温下反应2h，取出用去离子水多次冲洗后再浸没于去离子水中6h，真空冷冻干燥，得到表面改性的基材层；
步骤二、功能层的制备：将改性壳聚糖溶解于3wt％醋酸配成溶液；分别取明胶、黄原胶溶解于40℃的去离子水中配置成溶液，放置溶胀8h得明胶溶液和黄原胶溶液；在明胶溶液中加入改性壳聚糖溶液和油酸酰胺，快速搅拌30s，再加入聚乙二醇2000、Ag/Fe2O3磁性纳米粒子、锻制花蕊石超声处理60s，然后将黄原胶溶液逐滴加入，滴加完毕后置于室温下静置反应24h，用去离子水充分洗涤后冷冻干燥，得复合水凝胶功能层；
步骤三、功能层与基材层的结合：将一层功能层与一层基材层叠置冷压，冷压采用的压力为2MPa，时间10min，即得可降解壳聚糖基复合止血薄膜。
实施例2
一种可降解壳聚糖基复合止血薄膜，包括基材层和功能层；所述基材层为聚乳酸纤维布；所述功能层为改性壳聚糖、聚乙二醇2000、明胶、黄原胶、Ag/Fe2O3磁性纳米粒子、锻制花蕊石、油酸酰胺制备得到的复合水凝胶，功能层通过聚多巴胺与基材层结合；所述功能层制备原料的重量份数配比为：改性壳聚糖120份、聚乙二醇2000 8份、明胶32份、黄原胶16份、Ag/Fe2O3磁性纳米粒子10份、锻制花蕊石18份、油酸酰胺0.15份。
所述改性壳聚糖的制备方法为：将壳聚糖粉末溶于1wt％醋酸配置成1wt％壳聚糖—醋酸溶液，加入十二醛，室温搅拌12h，用NaOH溶液调节pH至5，缓慢加入硼氢化钠后继续搅拌2h，再次用NaOH溶液调节pH至7，待沉淀析出后，过滤洗涤至中性，再用乙醇反复洗涤，除去多余的醛，冷冻干燥研磨即得改性壳聚糖。
所述Ag/Fe2O3磁性纳米粒子的制备方法为：将Fe2O3磁性纳米粒子配制成悬浮液，加入浓度为0.1％的硝酸银溶液，振荡25min，加入柠檬酸三钠还原剂，反应10min后，再次加入浓度为1％的硝酸银溶液，振荡8min，被还原的纳米银包覆在Fe2O3磁性纳米粒子表面，磁性分离，去离子水反复洗涤即得Ag/Fe2O3磁性纳米粒子。
所述锻制花蕊石的制备方法为：将产地为安徽亳州的花蕊石超微粉碎后过100目筛， 400℃煅烧4h，乙酸淬冷后研磨制得。
一种所述可降解壳聚糖基复合止血薄膜的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、基材层表面改性：配制含透明质酸和多巴胺的Tris-HCl缓冲溶液(Tris-HCl缓冲溶液浓度为10mM，pH为8.5)，分别加入EDC和NHS，将基材层浸没其中，室温下反应2h，取出用去离子水多次冲洗后再浸没于去离子水中6h，真空冷冻干燥，得到表面改性的基材层；
步骤二、功能层的制备：将改性壳聚糖溶解于3wt％醋酸配成溶液；分别取明胶、黄原胶溶解于40℃的去离子水中配置成溶液，放置溶胀8h得明胶溶液和黄原胶溶液；在明胶溶液中加入改性壳聚糖溶液和油酸酰胺，快速搅拌30s，再加入聚乙二醇2000、Ag/Fe2O3磁性纳米粒子、锻制花蕊石超声处理50s，然后将黄原胶溶液逐滴加入，滴加完毕后置于室温下静置反应18h，用去离子水充分洗涤后冷冻干燥，得复合水凝胶功能层；
步骤三、功能层与基材层的结合：将一层功能层与一层基材层叠置冷压，冷压采用的压力为3MPa，时间15min，即得可降解壳聚糖基复合止血薄膜。
实施例3
一种可降解壳聚糖基复合止血薄膜，包括基材层和功能层；所述基材层为聚己内酯纤维布；所述功能层为改性壳聚糖、聚乙二醇2000、明胶、黄原胶、Ag/Fe2O3磁性纳米粒子、锻制花蕊石、油酸酰胺制备得到的复合水凝胶，功能层通过聚多巴胺与基材层结合；所述功能层制备原料的重量份数配比为：改性壳聚糖90份、聚乙二醇2000 6份、明胶24份、黄原胶12份、Ag/Fe2O3磁性纳米粒子6份、锻制花蕊石12份、油酸酰胺0.1份。
所述改性壳聚糖的制备方法为：将壳聚糖粉末溶于1wt％醋酸配置成1wt％壳聚糖—醋酸溶液，加入十八醛，室温搅拌12h，用NaOH溶液调节pH至5，缓慢加入硼氢化钠后继续搅拌2h，再次用NaOH溶液调节pH至7，待沉淀析出后，过滤洗涤至中性，再用乙醇反复洗涤，除去多余的醛，冷冻干燥研磨即得改性壳聚糖。
所述Ag/Fe2O3磁性纳米粒子的制备方法为：将Fe2O3磁性纳米粒子配制成悬浮液，加入浓度为0.1％的硝酸银溶液，振荡30min，加入柠檬酸三钠还原剂，反应15min后，再次加入浓度为1％的硝酸银溶液，振荡10min，被还原的纳米银包覆在Fe2O3磁性纳米粒子表面，磁性分离，去离子水反复洗涤即得Ag/Fe2O3磁性纳米粒子。
所述锻制花蕊石的制备方法为：将产地为安徽亳州的花蕊石超微粉碎后过100目筛， 400℃煅烧4h，乙酸淬冷后研磨制得。
一种所述可降解壳聚糖基复合止血薄膜的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、基材层表面改性：配制含透明质酸和多巴胺的Tris-HCl缓冲溶液(Tris-HCl缓冲溶液浓度为10mM，pH为8.5)，分别加入EDC和NHS，将基材层浸没其中，室温下反应2h，取出用去离子水多次冲洗后再浸没于去离子水中6h，真空冷冻干燥，得到表面改性的基材层；
步骤二、功能层的制备：将改性壳聚糖溶解于3wt％醋酸配成溶液；分别取明胶、黄原胶溶解于40℃的去离子水中配置成溶液，放置溶胀8h得明胶溶液和黄原胶溶液；在明胶溶液中加入改性壳聚糖溶液和油酸酰胺，快速搅拌30s，再加入聚乙二醇2000、Ag/Fe2O3磁性纳米粒子、锻制花蕊石超声处理60s，然后将黄原胶溶液逐滴加入，滴加完毕后置于室温下静置反应24h，用去离子水充分洗涤后冷冻干燥，得复合水凝胶功能层；
步骤三、功能层与基材层的结合：将一层功能层与一层基材层叠置冷压，冷压采用的压力为4MPa，时间20min，即得可降解壳聚糖基复合止血薄膜。
对实施例1～3制得的复合止血薄膜样品及单独调整明胶与黄原胶的重量份数比为1:2、 1:1、3:1、4:1，而其余操作均与实施例2相同条件下制得的样品A、B、C、D，进行剥离强度和持粘性测试，所得结果如下表1所示。
表1
从表1可以看到，明胶与黄原胶的配比对复合止血薄膜的剥离强度及持粘性有较大影响，实施例1～3制得的复合止血薄膜具有较小的剥离强度和较佳的持粘性，即当明胶与黄原胶的重量份数比为2:1时，复合止血薄膜一方面能够与伤口紧密贴合、避免移位，另一方面能够轻松揭掉，剥离时不会对伤口造成二次伤害。
对比例1
除功能层不含黄原胶外，其余同实施例2。
对比例2
除功能层不含明胶外，其余同实施例2。
对比例3
除功能层不含聚乙二醇2000外，其余同实施例2。
对比例4
除所述功能层制备原料的重量份数配比为：改性壳聚糖160份、聚乙二醇2000 8份、明胶32份、黄原胶16份、Ag/Fe2O3磁性纳米粒子10份、锻制花蕊石18份、油酸酰胺0.15 份外，其余同实施例2。
对比例5
除除所述功能层制备原料的重量份数配比为：改性壳聚糖120份、聚乙二醇2000 8份、明胶20份、黄原胶10份、Ag/Fe2O3磁性纳米粒子10份、锻制花蕊石18份、油酸酰胺0.15 份外，其余同实施例2。
拉伸性能测试
按照GB/T 1040.3-2006的方法，采用万能材料试验机对样品进行拉伸性能测试。测试分为干燥样品和溶胀样品(在0.05M，pH7.4的PBS缓冲溶液中溶胀1h)，每种样品做3次平行试验，记录拉伸强度与断裂伸长率。实施例1～3及对比例1～5制得的复合止血薄膜的力学性能测试结果如下表2所示：
表2
孔隙率测定
在量筒中加入一定体积的无水乙醇，体积记为V1，将样品投入其中，静置5min，使样品被无水乙醇完全浸透且表面无明显气泡，此时的总体积记为V2；取出样品，量筒中剩余的无水乙醇体积记为V3。样品的孔隙率P按下列公式计算：P＝(V1－V3)/(V2－V3)× 100％，每种样品平行测试3次，取平均值。
吸水性测试
将样本裁剪成相同尺寸大小，充分干燥，用电子天平分别称取各样品的起始重量记为 m0，然后分别将各样本放入培养皿中，向培养皿中加入重蒸水，在不同的时间用镊子夹出样品，用吸水纸擦去表面水分，电子天平称重，记录为mt。利用如下公式计算吸水率，吸水率
抑菌性测试
采用金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)和大肠杆菌(ATCC 25922)来测试样品的抑菌性能。两种菌株分别培养24h后，稀释至1×106CFU/mL。将同样重量的样品(试验组)及医用无菌纱布(对照组)各三份分别放置在48孔板中，然后每孔加入1mL菌液置于37℃下温育。用MTT细胞增殖检测试剂盒测定在6h，12h及24h的吸光值。以纱布对照组为参考基准，按照公式W抑菌率＝(A对照组－A试验组)/(A试验组－0.04)，其中0.04为无菌培养液在 OD＝600的吸光值。
对实施例1～3及对比例1～5制备得到的复合止血薄膜进行孔隙率、吸水率、抗菌性测试，结果如表3所示：
表3
从表3可以看出，本发明实施例1～3制得的复合止血薄膜样品具有较高的孔隙率和吸水率，抑菌性很强。对比例1和对比例2孔隙率较低，吸水率大幅降低，推测是由于对比例1 只有明胶与壳聚糖的交联形成的第一网络结构，对比例2只有黄原胶与壳聚糖的胶凝作用形成的第二网络结构，二者均为单网络结构，所得到的复合水凝胶孔数量少且孔直径较大导致的；对比例3不含聚乙二醇2000，抑菌性较差，这可能是由于矿物组分发生聚集，导致 Ag/Fe2O3磁性纳米粒子的抑菌功效不能充分发挥；对比例4改性壳聚糖的用量大于150份，其抑菌率反而不及实施例2，推断是由于改性壳聚糖的用量对复合水凝胶的双网络结构有重要影响，而双网络结构能够影响Ag/Fe2O3磁性纳米粒子和锻制花蕊石的分散及固定，表明本申请复合止血薄膜的杀菌性不仅与改性壳聚糖、Ag/Fe2O3磁性纳米粒子和锻制花蕊石的用量有关，也与其在复合水凝胶中的分布有关；对比例5明胶用量小于24份，复合止血薄膜的孔隙率增大，吸水性却下降，抑菌性也有一定程度下降，表明复合水凝胶的双网络结构具有特定的结构，各组分的用量对该结构的形成起到关键作用。
细胞毒性检测
用96孔板培养NIH3T3成纤维细胞，分为十组，每组5个复孔。实验组换液时用样品浸提液代替正常培养基，实施例1～3依次编号为T1、T2、T3，对比例1～5依次编号为D1、 D2、D3、D4、D5；阳性对照组用含0.64％苯酚的DMEM高糖完全培养基，记为PC；阴性对照为正常的DMEM高糖完全培养基，记为NC。在培养24h后分别检测3次，计算平均值。检测方法为：每孔加入5mg/mL的MTT溶液0.02mL，37℃培养4h，吸去液体，再在每孔中加入DMSO 0.1mL，混匀。测定吸光值(波长570nm)，按下式计算细胞存活率：
细胞存活率(％)＝(A样品-A空白1)/(A阴性-A空白2)×100％
式中，A样品：加入样品浸提液的孔的吸光度数值；
A空白1：只加浸提液而未接种细胞的孔中溶液吸光度数值；
A阴性：加入DMEM完全培养基的孔中溶液吸光度数值；
A空白2：只加入DMEM完全培养基而未接种细胞的孔中溶液吸光度数值。
试验结果如图1所示，从图1可以看出，本发明实施例及对比例制得的复合止血薄膜浸提液24h细胞存活率均在90％以上，均无细胞毒性。
体外全血凝固试验
取健康的新西兰大白耳兔，经心脏取血后，将血液和抗凝剂枸橼酸按9:1的比例均匀混合，制成抗凝全血。将实施例1～3及对比例1～5样品编号为A～H，对照组为空白(Blank)，将样品放入试管中，37℃预温5min，加入1mL抗凝兔血后37℃继续孵育3min，然后从加入500μL CaCl2溶液(浓度25mM)后开始计时，毎隔10s取出试管并倾斜，观察血液是否流动，直至血液完全凝固，倾斜90℃也无血流下时，记录血液凝固的时间，即为全血凝固时间BCT。
试验结果如图2所示。从图2可以看出，本发明实施例1～3制得的复合止血薄膜样品组血液凝固时间均小于100s，远远低于空白组。对比例1～2样品组血液凝固时间明显大于实施例1～3样品组，这可能是由于这两组样品吸水率变差导致的；对比例3聚乙二醇2000，血液凝固时间超过150s，这可能是由于矿物组分发生聚集，导致部分矿物组分无法止血功效；对比例4改性壳聚糖的用量大于150份，其血液凝固时间却大于实施例1～3，表明止血薄膜对血液凝固具有促进作用不仅与其所含的组分有关，还与复合水凝胶特定的双网络结构有关；对比例5明胶用量小于24份，血液凝固时间达到160s，也表明复合水凝胶特定的双网络结构能够与Ag/Fe2O3磁性纳米粒子和锻制花蕊石协同促进血液凝固。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
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