一种中和eb病毒的单克隆抗体及其应用

文档序号：1179835 发布日期：2020-09-22 浏览：14次 >En<

阅读说明：本技术 一种中和eb病毒的单克隆抗体及其应用 (Monoclonal antibody for neutralizing EB virus and application thereof ) 是由张林琦曾木圣单思思朱倩莹曹素梅于 2020-04-30 设计创作，主要内容包括：本发明首次公开了一种EB病毒的抗体,由轻链和重链组成,所述重链的重链可变区中具有3个互补区CDR1、CDR2和CDR3,其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-3所示,所述轻链的轻链可变区中具有3个互补区CDR1’、CDR2’和CDR3’,其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、AAS、SEQ ID NO.5所示。该抗体能够阻断EBV感染上皮细胞和B细胞,在上皮细胞中的IC50为120ng/ml,在B细胞中的IC50为211ng/ml,而对埃博拉病毒感染无中和效果,说明该抗体具有很高的特异中和EBV感染的能力。(The invention discloses an antibody of EB virus for the first time, which consists of a light chain and a heavy chain, wherein the heavy chain variable region of the heavy chain is provided with 3 complementary regions CDR1, CDR2 and CDR3, the amino acid sequences of the complementary regions are respectively shown as SEQ ID NO.1-3, and the light chain variable region of the light chain is provided with 3 complementary regions CDR1 ', CDR2 ' and CDR3 ', the amino acid sequences of the complementary regions are respectively shown as SEQ ID NO.4, AAS and SEQ ID NO. 5. The antibody can block EBV from infecting epithelial cells and B cells, has the IC50 of 120ng/ml in the epithelial cells and the IC50 of 211ng/ml in the B cells, has no neutralization effect on Ebola virus infection, and shows that the antibody has high capacity of specifically neutralizing EBV infection.)

一种中和EB病毒的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及抗体技术领域，更具体地，涉及一种中和EB病毒的IgG抗体及其应用。

背景技术

EB病毒最早于1964年由Epstein和Barr从Burkitt淋巴瘤细胞中成功培养并建株。EBV 属于γ亚型疱疹病毒，是首个被发现的人类致癌病毒。EBV在人群中的感染非常普遍，据报道全球约有95％以上的成年人携带有EBV。在儿童和青少年中，EBV感染多造成传染性单核细胞增多症。EBV的潜伏感染与人类多种淋巴肿瘤和上皮肿瘤发生有关，如霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤及NK/T细胞淋巴瘤等，上皮肿瘤包括鼻咽癌和大约10％的胃癌等。而对于器官移植病人以及艾滋病患者等免疫抑制病人来说，罹患EBV相关肿瘤的概率大大增加。据统计，全球每年新增约200000例EBV相关的肿瘤病例,美国NIH已于2016年正式将EBV列入第14版致癌物名录。

目前针对EB病毒尚无有效的疫苗，由EBV感染引起的疾病也缺乏特异的治疗手段。传染性单核细胞增多症的治疗大多应用抗病毒药物如阿昔洛韦等，虽然可一定程度上缓解症状，但并不能消除B淋巴细胞内及咽喉部上皮的EB病毒。EBV相关肿瘤的治疗主要为化疗和放疗，但对于复发或转移的患者来说，疗效较差。

单克隆抗体可大量生产，其与抗原结合的高亲和性和高特异性，大大减少了临床应用时的不良反应。同时可以对抗体分子进行改造以增加其抗病毒效力。抗体以其特异性和使用的灵活性成为感染性疾病治疗中非常有前景的手段。而至今仍未有针对EBV囊膜糖蛋白的人源单克隆抗体上市。因此开发抗EBV的人源单克隆抗体，将为EBV感染相关疾病提供更有效的预防和治疗手段。

发明内容

本发明第一个方面的目的，在于利用EB病毒(Epstein-Barr Virus，EBV)膜蛋白gH/gL(glycoprotein H，glycoprotein L,gH/gL)作为钓饵，筛选抗体生成的记忆B细胞，得到可同gH/gL蛋白特异结合的单克隆抗体。通过EB病毒感染细胞模型，筛选得到了具有中和活性的单克隆抗体。

本发明第二个方面的目的，在于提供编码本发明第一个方面所述抗体的核苷酸序列。

本发明第三个方面的目的，在于提供含有本发明第二个方面所述的核苷酸序列的转基因细胞系。

本发明第四个方面的目的，在于提供一种治疗与EB病毒相关疾病的药物，所述药物的活性成分为本发明第一个方面所述的抗体。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种中和EB病毒的抗体，由轻链和重链组成，所述重链的重链可变区中具有3个互补区CDR1、CDR2和CDR3，其中，CDR1的氨基酸序列为GFTFSYYP(SEQ ID NO.1)，CDR2的氨基酸序列为MSFDGTSD(SEQ ID NO.2)，CDR3的氨基酸序列为ARGGWKWPGGAFDV(SEQ ID NO.3)；所述轻链的轻链可变区中具有3个互补区CDR1’、 CDR2’和CDR3’，其中，CDR1’的氨基酸序列为QAIRNN(SEQ ID NO.4)，CDR2’的氨基酸序列为AAS，CDR3’的氨基酸序列为LQHSTYPWT(SEQ ID NO.5)。

根据本发明第一个方面所述的抗体，所述抗体的重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。

根据本发明第一个方面所述的抗体，所述抗体的轻链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。

根据本发明第一个方面所述的抗体，所述抗体的重链的氨基酸序列如SEQ IDNO.15所示。

根据本发明第一个方面所述的抗体，所述抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ IDNO.17所示。

本发明的第二个方面，提供一种编码本发明第一个方面所述抗体的核苷酸序列。

根据本发明第二个方面所述的核苷酸序列，编码重链可变区中3个互补区CDR1、CDR2 和CDR3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。

根据本发明第二个方面所述的核苷酸序列，编码轻链可变区中3个互补区CDR1’、CDR2’ 和CDR3’的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9、GCTGCTTCC、SEQ ID NO.10所示。

根据本发明第二个方面所述的核苷酸序列，编码所述抗体重链可变区的核苷酸序列如 SEQ ID NO.12所示。

根据本发明第二个方面所述的核苷酸序列，编码所述抗体轻链可变区的核苷酸序列如 SEQ ID NO.14所示。

根据本发明第二个方面所述的核苷酸序列，编码所述抗体重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。

根据本发明第二个方面所述的核苷酸序列，编码所述抗体轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。

本发明的第三个方面，提供含有本发明第二个方面所述核苷酸序列的转基因细胞系。

本发明的第四个方面，提供一种治疗与EB病毒相关疾病的药物，所述药物的活性成分为本发明第一个方面所述的抗体。

本发明的有益效果是：

本发明首次公开了一种中和EB病毒的抗体，通过利用流式细胞分选术，直接从具有抗病毒活性的感染者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中分离特异性单个B淋巴细胞，然后进行单克隆抗体基因的克隆和结构功能研究以及筛选。既避免了由于抗原免疫、杂交瘤融合和单克隆抗体筛选所需要的漫长过程，也可以大大降低动物来源抗体所引起的副作用。

本发明采用该方法，在从具有抗病毒活性的EBV感染者的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中，分选得到同gH-gL蛋白特异结合的memory B细胞，获得抗体可变区基因，然后将抗体可变区基因克隆到含有对应恒定区的真核细胞表达载体上并转染293T细胞，即可得到同gH-gL蛋白特异结合的单克隆抗体。然后通过EB病毒感染细胞模型，筛选得到了具有抗EBV中和活性的单克隆抗体。

本发明提供的该中和EB病毒的抗体能够阻断EBV感染上皮细胞和B细胞，在上皮细胞中的IC50为120ng/ml,在B细胞中的IC50为211ng/ml，而对埃博拉病毒的感染无中和效果，说明该抗体具有很高的特异中和EBV感染的能力。

附图说明

图1 实施例4中1D8抗体对EBV感染Raji细胞的中和效果。

图2 实施例4中1D8抗体对EBV感染HNE1细胞的中和效果。

图3 实施例5中1D8抗体对埃博拉假病毒感染Huh7细胞的中和效果。

具体实施方式

(1)EBV gH/gL重组蛋白的制备。

将编码EBV gH/gL蛋白的基因片段在哺乳动物细胞表达系统进行表达和纯化。重组抗原蛋白C端带有6×His tag，使用镍柱进行gH/gL蛋白的亲和纯化。

(2)利用流式细胞分选术，筛选获得同gH/gL蛋白特异结合的menory B细胞。

从具有抗EB病毒活性的感染者中分离出PBMC，并根据memory B细胞的标记进行染色，利用特异性抗原钓饵gH/gL蛋白，通过流式细胞仪分选得到与gH/gL蛋白反应的memoryB 细胞。裂解细胞，通过RT-PCR得到cDNA,再分别利用重链轻链特异性引物进行巢式PCR，测序得到抗体基因。

(3)单克隆抗体的表达纯化。

将筛选得到的抗体重链可变区上游与CMV片段、下游与人IgG1的恒定区以及ployA片段，进行overlapping PCR，得到可以表达完整重链的片段；将筛选得到的抗体轻链可变区上游与CMV片段、下游与轻链κ/λ的恒定区以及ploy A片段，进行overlapping PCR，得到可以表达完整轻链的片段。然后将这两个片段构建到PMD18T(Takara)载体中。将带有抗体重链和轻链全长序列的PMD18T质粒共转染293T细胞进行抗体的表达，用protein Abeads 进行抗体的纯化。

(4)抗体的中和活性检测。

EBV中和抗体的检测采用病毒感染细胞模型进行。将表达纯化的全长抗体按照一定的倍比稀释后同EB病毒共同孵育；将EBV相应的易感细胞铺至上述的共孵育体系中，培养细胞至48-72小时；感染后的细胞，用流式细胞仪检测GFP阳性的细胞比例；利用Prism 5软件计算单克隆抗体的IC50。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的阐述。所举实例只用于解释和理解本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1 EBV gH/gL重组蛋白的制备

gH/gL蛋白在EBV入侵上皮细胞和B细胞的过程中均发挥重要作用。因此，发明人的研究团队选择gH/gL作为诱饵蛋白来筛特异性记忆B细胞，以期获得能阻断EBV感染的中和性抗体。

然后选用EBV-M81毒株的基因组为模板，分别扩增gH和gL的序列，并通过linker将两者连接在一起，以提高纯化蛋白的效率。

未经改造前gH原始序列：

ATGCAGTTGCTCTGTGTTTTTTGCCTGGTGTTGCTATGGGAGGTGGGGGCTGCCAGCCTTAGCGA GGTTAAGCTGCACCTGGACATAGAGGGGCATGCTTCGCATTACACCATCCCATGGACCGAACTGATGG CAAAGGTCCCAGGCCTTAGCCCAGAGGCGCTGTGGAGAGAGGCAAATGTCACCGAAGATTTGGCGT CTATGCTTAACCGCTACAAGTTAATTTACAAGACGTCTGGTACCCTTGGTATTGCGCTGGCCGAGCCTG TCGATATCCCTGCTGTCTCTGAAGGATCCATGCAAGTGGATGCATCTAAGGTCCATCCCGGAGTCATTA GCGGCCTGAATTCCCCTGCCTGCATGCTTAGTGCCCCCCTTGAGAAGCAGCTCTTCTACTATATTGGCA CCATGCTGCCCAACACGCGGCCACACAGCTATGTCTTTTATCAGCTGCGCTGTCACTTGTCTTATGTGG CCCTGTCCATCAACGGGGACAAGTTTCAGTACACGGGGGCCATGACTTCTAAATTTCTGATGGGCACC TACAAGCGAGTGACCGAGAAGGGAGATGAGCATGTGTTGAGCCTGATCTTTGGCAAGACGAAGGAC CTGCCGGATCTGAGGGGGCCTTTTAGTTACCCATCCTTAACCAGTGCCCAAAGCGGGGACTATTCCCT GGTGATTGTTACAACCTTTGTGCATTATGCCAACTTTCACAACTACTTTGTACCCAACCTGAAGGATAT GTTTTCCCGAGCCGTCACCATGACAGCCGCCAGCTACGCTCGCTACGTTCTCCAGAAACTGGTCCTGC TGGAGATGAAGGGAGGCTGCCGGGAGCCAGAACTGGACACGGAAACGCTGACTACCATGTTTGAGG TTTCTGTGGCCTTCTTTAAGGTGGGTCATGCCGTGGGTGAGACTGGCAATGGCTGCGTGGACCTCCGC TGGTTGGCCAAGAGCTTCTTTGAGCTGACTGTCCTGAAAGACATCATCGGCATATGTTATGGGGCCAC GGTCAAGGGCATGCAATCCTACGGGCTGGAGCGCTTGGCCGCCATGCTGATGGCCACGGTCAAGATG GAGGAGCTTGGTCACCTGACGACTGAGAAACAGGAGTACGCGCTGAGGTTAGCCACCGTCGGCTAC CCCAAGGCCGGGGTTTACAGTGGCCTCATTGGAGGCGCCACATCTGTGCTTCTCTCGGCCTACAACCG CCACCCCCTTTTCCAGCCCCTGCATACCGTGATGAGAGAGACCCTGTTTATCGGCAGCCACGTGGTGC TACGCGAGTTGCGGCTGAACGTGACTACCCAGGGGCCCAACCTTGCCCTATACCAACTGCTGTCCACC GCCCTGTGCTCGGCCCTAGAGATTGGGGAGGTTTTGCGGGGGCTAGCCCTGGGGACGGAGAGCGGG CTCTTCTCACCGTGCTACCTCAGCCTACGATTTGACCTCACACGAGACAAGCTGCTGAGCATGGCCCC CCAGGAGGCAATGCTGGACCAGGCGGCCGTTTCAAATGCTGTGGATGGGTTTCTTGGGCGTCTCTCTT TGGAGCGAGAAGACAGGGATGCGTGGCATCTCCCCGCCTACAAATGCGTGGACAGGCTCGACAAAG TTCTGATGATTATCCCGCTCATCAACGTGACATTCATAATCTCTAGTGACCGTGAGGTCCGAGGCTCGG CGCTATACGAGGCCAGCACCACCTATCTCAGCAGCTCTCTCTTTCTCTCCCCCGTTATAATGAATAAAT GTTCGCAGGGTGCTGTGGCTGGGGAGCCCCGCCAGATTCCAAAGATCCAGAATTTTACCAGGACGCA GAAATCCTGCATTTTTTGTGGCTTTGCCCTGCTCAGTTATGATGAAAAGGAAGGCCTGGAAACTACAA CCTACATCACCTCCCAGGAAGTCCAAAACTCCATCTTGAGCTCCAACTACTTTGATTTTGACAACCTC CACGTTCACTATCTGCTGCTGACCACCAACGGGACTGTCATGGAAATTGCGGGCCTGTATGAAGAAA GAGCACACGTTGTTTTGGCAATAATCCTGTACTTTATTGCTTTTGCTCTGGGTATCTTTCTGGTTCACAA GATTGTTATGTTTTTCCTTTAG(SEQ ID NO.19)。

相对应的未经改造前gL原始序列：

ATGCGTGCTGTTGGTGTATTTCTGGCCACCTGTCTTGTCACCATTTTCGTCCTCCCAACATGGGGC AATTGGGCATACCCATGTTGTCACGTCACTCAGCTCCGCGCTCAACACCTTCTCGCGTTGGAAAACAT TAGCGACATTTACCTGGTGAGCAATCAGACATGCGACGGCTTTAGTCTGGCCTCCTTAAATTCACCTAA GAATGGGAGCAACCAGCTGGTCATCAGCCGCTGCGCAAACGGACTCAACGTGGTCTCCTTCTTTATCT CCATCCTGAAGCGAAGCAGCTCCGCCCTCACGAGCCATCTCCGTGAGTTGTTAACCACCCTGGAGTCT CTTTACGGTTCATTCTCAGTGGAAGACCTGTTTGGTGCCAACTTAAACAGATACGCATGGCATCGCGG GGGCTAG(SEQ ID NO.20)。

将gH与gL通过linker连接起来的序列：

ATGCCCATGGGGTCTCTGCAACCGCTGGCCACCTTGTACCTGCTGGGGATGCTGGTCGCTTCCTG CCTCGGATGGGCATACCCATGTTGTCACGTCACTCAGCTCCGCGCTCAACACCTTCTCGCGTTGGAAA ACATTAGCGACATTTACCTGGTGAGCAATCAGACATGCGACGGCTTTAGTCTGGCCTCCTTAAATTCAC CTAAGAATGGGAGCAACCAGCTGGTCATCAGCCGCTGCGCAAACGGACTCAACGTGGTCTCCTTCTT TATCTCCATCCTGAAGCGAAGCAGCTCCGCCCTCACGAGCCATCTCCGTGAGTTGTTAACCACCCTGG AGTCTCTTTACGGTTCATTCTCAGTGGAAGACCTGTTTGGTGCCAACTTAAACAGATACGCATGGCAT CGCGGGGGCGGAGGAGGAGGCTCCGGCGGAGGAGGCTCTGGCGGCGGCGGCAGCAGCCTTAGCGA GGTTAAGCTGCACCTGGACATAGAGGGGCATGCTTCGCATTACACCATCCCATGGACCGAACTGATGG CAAAGGTCCCAGGCCTTAGCCCAGAGGCGCTGTGGAGAGAGGCAAATGTCACCGAAGATTTGGCGT CTATGCTTAACCGCTACAAGTTAATTTACAAGACGTCTGGTACCCTTGGTATTGCGCTGGCCGAGCCTG TCGATATCCCTGCTGTCTCTGAAGGATCCATGCAAGTGGATGCATCTAAGGTCCATCCCGGAGTCATTAGCGGCCTGAATTCCCCTGCCTGCATGCTTAGTGCCCCCCTTGAGAAGCAGCTCTTCTACTATATTGGCA CCATGCTGCCCAACACGCGGCCACACAGCTATGTCTTTTATCAGCTGCGCTGTCACTTGTCTTATGTGG CCCTGTCCATCAACGGGGACAAGTTTCAGTACACGGGGGCCATGACTTCTAAATTTCTGATGGGCACC TACAAGCGAGTGACCGAGAAGGGAGATGAGCATGTGTTGAGCCTGATCTTTGGCAAGACGAAGGAC CTGCCGGATCTGAGGGGGCCTTTTAGTTACCCATCCTTAACCAGTGCCCAAAGCGGGGACTATTCCCT GGTGATTGTTACAACCTTTGTGCATTATGCCAACTTTCACAACTACTTTGTACCCAACCTGAAGGATAT GTTTTCCCGAGCCGTCACCATGACAGCCGCCAGCTACGCTCGCTACGTTCTCCAGAAACTGGTCCTGC TGGAGATGAAGGGAGGCTGCCGGGAGCCAGAACTGGACACGGAAACGCTGACTACCATGTTTGAGG TTTCTGTGGCCTTCTTTAAGGTGGGTCATGCCGTGGGTGAGACTGGCAATGGCTGCGTGGACCTCCGC TGGTTGGCCAAGAGCTTCTTTGAGCTGACTGTCCTGAAAGACATCATCGGCATATGTTATGGGGCCAC GGTCAAGGGCATGCAATCCTACGGGCTGGAGCGCTTGGCCGCCATGCTGATGGCCACGGTCAAGATG GAGGAGCTTGGTCACCTGACGACTGAGAAACAGGAGTACGCGCTGAGGTTAGCCACCGTCGGCTAC CCCAAGGCCGGGGTTTACAGTGGCCTCATTGGAGGCGCCACATCTGTGCTTCTCTCGGCCTACAACCG CCACCCCCTTTTCCAGCCCCTGCATACCGTGATGAGAGAGACCCTGTTTATCGGCAGCCACGTGGTGC TACGCGAGTTGCGGCTGAACGTGACTACCCAGGGGCCCAACCTTGCCCTATACCAACTGCTGTCCACC GCCCTGTGCTCGGCCCTAGAGATTGGGGAGGTTTTGCGGGGGCTAGCCCTGGGGACGGAGAGCGGG CTCTTCTCACCGTGCTACCTCAGCCTACGATTTGACCTCACACGAGACAAGCTGCTGAGCATGGCCCC CCAGGAGGCAATGCTGGACCAGGCGGCCGTTTCAAATGCTGTGGATGGGTTTCTTGGGCGTCTCTCTT TGGAGCGAGAAGACAGGGATGCGTGGCATCTCCCCGCCTACAAATGCGTGGACAGGCTCGACAAAG TTCTGATGATTATCCCGCTCATCAACGTGACATTCATAATCTCTAGTGACCGTGAGGTCCGAGGCTCGG CGCTATACGAGGCCAGCACCACCTATCTCAGCAGCTCTCTCTTTCTCTCCCCCGTTATAATGAATAAAT GTTCGCAGGGTGCTGTGGCTGGGGAGCCCCGCCAGATTCCAAAGATCCAGAATTTTACCAGGACGCA GAAATCCTGCATTTTTTGTGGCTTTGCCCTGCTCAGTTATGATGAAAAGGAAGGCCTGGAAACTACAA CCTACATCACCTCCCAGGAAGTCCAAAACTCCATCTTGAGCTCCAACTACTTTGATTTTGACAACCTC CACGTTCACTATCTGCTGCTGACCACCAACGGGACTGTCATGGAAATTGCGGGCCTGTATGAAGAAA GAGCACACCACCACCACCACCACTAA(SEQID NO.21)。

真核细胞表达载体的构建

将gH/gL基因片段连入哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1+，方法如下：

1)gH/gL蛋白基因的扩增

将gL蛋白本身的信号肽替换为CD5信号肽(signal peptide,SP)，并在信号肽前面加入 KOZAK序列，以增强蛋白的表达。蛋白在哺乳动物细胞表达并分泌的过程中信号肽将被切除。gH与gL基因片段通过(G4S)3linker连接起来，因此gH蛋白的信号肽也不包括在表达蛋白基因内。由于蛋白存在跨膜区将无法分泌表达出来，因此gH蛋白的跨膜区不包括在表达蛋白基因内。最后在蛋白末端加入6×His tag，用于后续的纯化操作。因此，重组蛋白的构建为SP-gL-(G4S)3-gH-his。

以EBV-M81-BAC DNA为模板，用下面的引物分别对gL和gH进行扩增：

gL正向引物：

TAGTCCAGTGTGGTGGAATTCGCCACCATGCCCATGGGGTCTCTGCAACCGCTGGC CACCTTGTACCTGCTGGGGATGCTGGTCGCTTCCTGCCTCGGATGGGCATACCCATGT (SEQ ID NO.22)；

gL反向引物：

GCTGCCGCCGCCGCCAGAGCCTCCTCCGCCGGAGCCTCCTCCTCCGCCCCCGCGAT GCCA(SEQ IDNO.23)；

gH正向引物：GGCGGCGGCGGCAGCAGCCTTAGCGAGGTT(SEQ ID NO.24)；

gH反向引物：GTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCTCTTTCTTCATA(SEQ ID NO.25)。

选用50μl的PCR反应体系：

扩增完成的目的片段通过琼脂糖凝胶电泳分析，在紫外灯下切割正确分子量的条带，按照试剂盒说明书操作回收PCR产物。

2)目的片段和载体的酶切与连接：

载体使用真核表达质粒pcDNA3.1+。目的片段和载体都采用EcoRI和NotI进行酶切，使用50μl的反应体系：

酶切在37℃进行，时间为3～5hr。片段使用DNA纯化试剂盒回收，载体酶切跑胶后进行胶回收。

使用20μl的体系进行连接反应，反应在37℃进行30min：

3)连接产物的转化

将连接产物加入刚刚融化的DH5α感受态细胞；冰上放置30min；42℃热激90s，放回冰上5min；加入200μl LB培养基于30℃慢摇复苏40min；吸取培养液涂布在氨苄抗性的LB平板上，37℃培养过夜。

4)阳性克隆的筛选

挑取单个菌落接种于5ml加有氨苄的培养基中培养约12hr；使用质粒小提试剂盒提取质粒；酶切鉴定获取阳性克隆；测序验证，获得完全正确的重组质粒。大量提取质粒。

将编码EBV gH/gL蛋白的基因片段在哺乳动物细胞表达系统进行表达和纯化。重组抗原蛋白C端带有6×His tag，使用镍柱进行gH/gL蛋白的亲和纯化。

重组蛋白的表达和提取

293F细胞培养至1L，细胞密度至1.5×10^6/ml时用PEI转染试剂转染。将100mlDMEM 培养基中加入1mg重组质粒与5ml 1mg/ml PEI充分震荡混匀，室温放置20min后，加入细胞中。培养5天后收细胞上清，4000rpm离心30min，弃去细胞沉淀，上清中含有目的蛋白。

gH/gL重组蛋白纯化

1)亲和层析

gH/gL重组蛋白C端带有6×His tag，可以使用镍柱进行亲和纯化。

在高速离心后的上清液中加入镍柱beads，4℃孵育过夜；低速离心除去上清；用含有 20mM咪唑的上样缓冲液共100mL淋洗beads；用5个柱体积的含有250mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白。

2)凝胶过滤层析

使用30kD浓缩管对镍柱洗脱的蛋白进行浓缩，至体积小于1ml；样品使用superdex200 柱纯化。

最终获得的氨基酸序列：

WAYPCCHVTQLRAQHLLALENISDIYLVSNQTCDGFSLASLNSPKNGSNQLVISRCANGLNVVSFFISILKRSSSALTSHLRELLTTLESLYGSFSVEDLFGANLNRYAWHRGGGGGGSGGGGSGGGGSSLSEVKLHLD IEGHASHYTIPWTELMAKVPGLSPEALWREANVTEDLASMLNRYKLIYKTSGTLGIALAEPVDIPAVSEGS MQVDASKVHPGVISGLNSPACMLSAPLEKQLFYYIGTMLPNTRPHSYVFYQLRCHLSYVALSINGDKFQY TGAMTSKFLMGTYKRVTEKGDEHVLSLIFGKTKDLPDLRGH/GLFSYPSLTSAQSGDYSLVIVTTFVHYAN FHNYFVPNLKDMFSRAVTMTAASYARYVLQKLVLLEMKGGCREPELDTETLTTMFEVSVAFFKVGHAVG ETGNGCVDLRWLAKSFFELTVLKDIIGICYGATVKGMQSYGLERLAAMLMATVKMEELGHLTTEKQEYA LRLATVGYPKAGVYSGLIGGATSVLLSAYNRHPLFQPLHTVMRETLFIGSHVVLRELRLNVTTQGH/GLNL ALYQLLSTALCSALEIGEVLRGLALGTESGLFSPCYLSLRFDLTRDKLLSMAPQEAMLDQAAVSNAVDGFL GRLSLEREDRDAWHLPAYKCVDRLDKVLMIIPLINVTFIISSDREVRGSALYEASTTYLSSSLFLSPVIMNK CSQGAVAGEPRQIPKIQNFTRTQKSCIFCGFALLSYDEKEGLETTTYITSQEVQNSILSSNYFDFDNLHVHYL LLTTNGTVMEIAGLYEERAHHHHHH(SEQ ID NO.26)。

实施例2 抗体的筛选及测序

利用流式细胞分选术，筛选获得同gH/gL蛋白特异结合的menory B细胞。

(1)材料与设备

EBV感染者的抗凝外周血；淋巴细胞分离液；pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS，Thermo公司)； PBS-1％(wt/vol)BSA溶液；荧光抗体CD3-PE-Cy5，CD16-PE-Cy5，CD235a-PE-Cy5，CD19-APC-Cy7，CD20-PE-Cy7,CD38-AF700，IgG-FITC(BD Biosciences公司)； CD27-PB(Biolegend公司)CD14-PE-Cy5(Thermo公司)；anti-his-PE荧光抗体(Miltenyi Biotec 公司)；His-tag标记的gH/gL蛋白(gH/gL-his蛋白)；96孔PCR板(美国Axygen公司)；FACSAriaII流式细胞分选仪(BD公司)。

(2)方法

1)利用Ficoll密度梯度离心法分离经EBV感染者外周血中(肝素抗凝)的单个核细胞 (PBMC)；

2)计数PMBC，取1×10^7细胞和100nMgH/gL-his蛋白4℃孵育30min；

3)用1ml PBS-1％(wt/vol)BSA溶液重悬PBMC，4℃335×g离心5min，小心弃去上清液，重复洗2次；

4)加入荧光标记抗体(CD3-PE-Cy5，CD16-PE-Cy5，CD235a-PE-Cy5，CD19-APC-Cy7，CD20-PE-Cy7,CD38-AF700，IgG-FITC，CD27-PB，CD14-PE-Cy5，anti-his-PE)，4℃孵育30min；

5)用1ml PBS-1％(wt/vol)BSA溶液重悬PBMC，4℃335×g离心5min，小心弃去上清液，重复洗2次；

6)最后用1ml PBS溶液重悬PBMC；

7)采用FACSAria流式细胞仪96孔微孔板单个细胞分选技术分选能够特异性识别EB病毒表面抗原gH/gL蛋白的B细胞，即表面表达gH/gL蛋白特异性BCR的记忆性B细胞(CD3-CD14-CD16-CD235a-CD20+CD19+CD27+CD38-IgG+gH/gLBCR+)。单个B细胞分选至预先加好缓冲液的96孔PCR板中，-80℃保存，待基因克隆。

实施例3 单克隆抗体的测序及表达纯化

将实施例2中筛选得到的单个B细胞裂解，通过RT-PCR得到cDNA,再分别利用重链轻链特异性引物进行巢式PCR，测序得到抗体基因。

单克隆抗体的表达纯化。

将筛选得到的抗体重链可变区上游与CMV片段、下游与人IgG1的恒定区以及ployA片段，进行overlapping PCR，得到可以表达完整重链的片段；将筛选得到的抗体轻链可变区上游与CMV片段、下游与轻链κ/λ的恒定区以及ploy A片段，进行overlapping PCR，得到可以表达完整轻链的片段。然后将这两个片段构建到PMD18T(Takara)载体中。将含有来自同一个B细胞扩增出来的抗体重链和轻链全长序列的PMD18T质粒共转染293T细胞进行抗体的表达，用protein A beads进行抗体的纯化。

1D8全长重链共470氨基酸，序列如下所示：

MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGRVVQPGGSLRLSCVTSGFTFSYYPIHWVRQGPGKGLEWVTMMSFDGTSDHCISSVKGRFVMSRDNSRNTLYLEMNKMRLEDTGVYYCARGGWKWPGGAFDVFGPGT VVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO.15)。

其中下划线部分为重链可变区的氨基酸序列；下划线且加粗部分为重链可变区中3个互补区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。

1D8全长重链的编码基因共2499个碱基，序列如下所示：

AGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCA TAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTG GCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCC TGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCG CTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGAT TTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCA AAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATAT AAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATA GAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTG CCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTATAGAGTCTATAGGCCCACCCCCTTGGCTTCGTTAGAACGCGGC TACAATTAATACATAACCTTATGTATCATACACATACGATTTAGGTGACACTATAGAATAACATCCACTTT GCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAACTGCACCTCGGTTCTATCGATTGAATTCCACCA TGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTGAGGTGCAGCTGG TGGAGTCTGGGGGACGCGTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGTAACGTCTGGATT CACCTTCAGTTACTATCCCATCCACTGGGTCCGCCAGGGTCCCGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGACA ATGATGTCTTTTGATGGAACAAGTGACCACTGCATAAGTTCCGTTAAGGGCCGGTTCGTCATGTCCAG AGACAATTCCAGGAACACACTATATCTGGAGATGAACAAAATGAGACTTGAAGATACAGGTGTCTATT ATTGTGCGAGAGGGGGTTGGAAGTGGCCGGGGGGTGCCTTTGACGTCTTTGGCCCCGGGACAGTGGT CACCGTCTCCTCAGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACC TCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCTGTGACGGTCTCGT GGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTA CTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTG AATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCAC ACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAAC CCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGA AGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCC GCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTG GCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAAC CATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGA GATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTG GAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGAC GGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCT CATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGT AAATGAGTGCGACGGCCGGCAAGCCCCCGCTCCCCGGGCTCTCGCGGTCGTACGAGGAAAGCTTGG CCGCCATGGCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTC ACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCAT (SEQ ID NO.16)。

其中下划线部分为重链可变区的核苷酸序列；下划线且加粗部分为重链可变区中3个互补区CDR1、CDR2和CDR3的核苷酸序列；下划线且斜体部分为启示、终止密码子。

1D8全长轻链共233氨基酸，序列如下所示：

MGWSCIILFLVATATGVHGDIVMTQTPPSLSASVGDRVTLTCRASQAIRNNLAWYQHKPGKAPKRLIYAASTLEDGVPSSFSGSGFGTDFTLTINSLQPEDFATYYCLQHSTYPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO.17)。

其中下划线部分为轻链可变区的氨基酸序列；下划线且加粗部分为轻链可变区中3个互补区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。

1D8全长轻链的编码基因共1738个碱基，序列如下所示：

其中下划线部分为轻链可变区的核苷酸序列；下划线且加粗部分为轻链可变区中3个互补区CDR1’、CDR2’和CDR3’的核苷酸序列；下划线且斜体部分为启示、终止密码子。

1D8的重链的重链可变区中具有3个互补区CDR1、CDR2和CDR3，重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3依次为序列表的SEQ ID NO.15自N末端第45-52位氨基酸残基、第 70-77位氨基酸残基和第116-129位氨基酸残基(对应SEQ ID NO.15加粗部分序列)；轻链的轻链可变区中具有3个互补区CDR1’、CDR2’和CDR3’，轻链可变区中的CDR1’、CDR2’ 和CDR3’依次为序列表SEQ ID NO.17自N末端第46-51位氨基酸残基、第69-71位氨基酸残基和第108-116位氨基酸残基(对应SEQ ID NO.17的加粗部分序列)。

CDR1的氨基酸序列为：GFTFSYYP(SEQ ID NO.1)；

CDR2的氨基酸序列为：MSFDGTSD(SEQ ID NO.2)；

CDR3的氨基酸序列为：ARGGWKWPGGAFDV(SEQ ID NO.3)；

CDR1’的氨基酸序列为：QAIRNN(SEQ ID NO.4)；

CDR2’的氨基酸序列为：AAS；

CDR3’的氨基酸序列为：LQHSTYPWT(SEQ ID NO.5)。

编码CDR1、CDR2、CDR3、CDR1’、CDR2’和CDR3’的核苷酸序列如下所示：

CDR1的核苷酸序列为：GGATTCACCTTCAGTTACTATCCC(SEQ ID NO.6)；

CDR2的核苷酸序列为：ATGTCTTTTGATGGAACAAGTGAC(SEQ ID NO.7)；

CDR3的核苷酸序列为：

GCGAGAGGGGGTTGGAAGTGGCCGGGGGGTGCCTTTGACGTC(SEQ ID NO.8)；

CDR1’的核苷酸序列为：CAGGCCATTAGAAATAAT(SEQ ID NO.9)；

CDR2’的核苷酸序列为：GCTGCTTCC；

CDR3’的核苷酸序列为：CTACAACATTCTACTTACCCGTGGACG(SEQ ID NO.10)。

1D8的重链可变区的氨基酸序列由序列表的SEQ ID NO.15自N末端第20至140位氨基酸残基组成，如下所示(对应SEQ ID NO.15中下划线部分序列)：

EVQLVESGGRVVQPGGSLRLSCVTSGFTFSYYPIHWVRQGPGKGLEWVTMMSFDGTSDHCISSVKG RFVMSRDNSRNTLYLEMNKMRLEDTGVYYCARGGWKWPGGAFDVFGPGTVVTVSS(SEQ ID NO.11)。

其核苷酸序列如下所示(对应SEQ ID NO.16中下划线部分序列)：

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGACGCGTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCT GTGTAACGTCTGGATTCACCTTCAGTTACTATCCCATCCACTGGGTCCGCCAGGGTCCCGGCAAGGGG CTGGAGTGGGTGACAATGATGTCTTTTGATGGAACAAGTGACCACTGCATAAGTTCCGTTAAGGGCCG GTTCGTCATGTCCAGAGACAATTCCAGGAACACACTATATCTGGAGATGAACAAAATGAGACTTGAA GATACAGGTGTCTATTATTGTGCGAGAGGGGGTTGGAAGTGGCCGGGGGGTGCCTTTGACGTCTTTGG CCCCGGGACAGTGGTCACCGTCTCCTCA(SEQID NO.12)。

1D8的轻链可变区由序列表的SEQ ID NO.19自N末端第20至126位氨基酸残基组成，如下所示(对应SEQ ID NO.17中下划线部分序列)：

DIVMTQTPPSLSASVGDRVTLTCRASQAIRNNLAWYQHKPGKAPKRLIYAASTLEDGVPSSFSGSGFGTDFTLTINSLQPEDFATYYCLQHSTYPWTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO.13)。

其核苷酸序列如下所示(对应SEQ ID NO.18中下划线部分序列)：

GATATTGTGATGACCCAGACTCCACCCTCCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACCCTCAC TTGCCGGGCAAGTCAGGCCATTAGAAATAATTTAGCCTGGTATCAGCACAAACCGGGGAAAGCCCCTA AGCGCCTGATCTATGCTGCTTCCACTTTAGAGGATGGGGTCCCATCCTCATTCAGCGGCAGTGGTTTTG GGACAGATTTCACTCTCACAATCAACAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCTACAA CATTCTACTTACCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA(SEQ ID NO.14)。

实施例4 抗体在EBV病毒感染细胞模型中的中和活性检测

1.EBV病毒的制备

(1)培养感染EBV-GFP的Akata细胞至密度为2*10^6/ml，在无血清的1640培养基中，加入终浓度为8ul/ml的羊抗人IgG，37℃，5％CO2环境中培养6h。

(2)6h后将细胞的培养基更换成含5％FBS的1640培养基，37℃，5％CO2环境中继续培养3天。

(3)3天后收取细胞上清，上清经过0.45um滤膜过滤后再用超高速离心机20000rpm，4℃ 离心2h。

(4)病毒沉淀用无血清的1640培养基重悬。

2.单克隆抗体的中和活性检测

单克隆抗体按照一定的倍比稀释后同EBV病毒在4℃共同孵育3h；

孵育后的病毒液加入到HNE1或Raji细胞中，培养细胞至48-72小时；

制备HNE1或Raji细胞悬液，用流式细胞仪检测GFP阳性细胞的百分比；利用Prism5 软件计算抗体的IC50。

3.中和实验检测结果

通过病毒中和能力验证，共筛选到2株对EBV具有中和活性的抗体，分别为1D8和2A6。两个抗体的IC50值如表1所示。，两者比较可以看出，1D8抗体对EBV的中和效果更好，1D8 抗体的基本信息见表2，中和实验结果见图1和2。

表1 1D8和2A6抗体的IC50值

表1中列出了1D8和2A6抗体在中和EBV感染上皮细胞和B细胞的IC50值。

表2 1D8抗体序列基本信息

表2中列出了1D8抗体的可变区序列信息，包括抗体家族分布、抗体胚系保守性及CDR3 氨基酸序列。

从附图1和2的中和实验结果中可以看出，1D8均能阻断EBV感染上皮细胞和B细胞，在上皮细胞中的IC50为120ng/ml,在B细胞中的IC50为211ng/ml，而阴性对照抗体2G4 均不能阻断EBV感染上皮细胞和B细胞。说明1D8抗体具有很高的中和EBV感染的能力。

实施例5 抗体在埃博拉假病毒感染细胞模型中的中和活性检测

1.埃博拉(Ebola-Zaire)假病毒的制备

(1)利用埃博拉全长膜蛋白的真核表达质粒(pcDNA3.1+,购自Invitrogen公司)和骨架质粒pNL4-3R-E-luciferase共转染293T细胞；

(2)48小时后收集细胞上清，利用p24定量检测的ELISA试剂盒进行病毒滴度的测定。

2.单克隆抗体的中和活性检测

(4)单克隆抗体按照一定的倍比稀释后同埃博拉假病毒在37℃共同孵育1h；

(5)孵育后的病毒液加入到Huh7细胞中，培养细胞至48-72小时；

(6)裂解细胞Huh7；检测裂解液中的荧光素酶活性，利用Prism 5软件计算抗体的IC50。

3.中和实验检测结果

通过病毒中和能力验证，抗体1D8对埃博拉假病毒没有中和能力，抗体2G4作为埃博拉假病毒中和的阳性对照。中和实验结果见图3。

从附图3中可以看出1D8不能阻断埃博拉假病毒感染Huh7细胞，而2G4抗体作为阳性对照则能高效阻断埃博拉假病毒的感染，IC50为330ng/ml。综上所述，说明1D8是一个对EBV具有高中和活性的特异性抗体。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 清华大学

中山大学肿瘤防治中心(中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究

所）

<120> 一种中和EB病毒的单克隆抗体1D8及其应用

<130>

<160> 26

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr Pro

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ser Phe Asp Gly Thr Ser Asp

1 5

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Ala Arg Gly Gly Trp Lys Trp Pro Gly Gly Ala Phe Asp Val

1 5 10

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Gln Ala Ile Arg Asn Asn

1 5

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Leu Gln His Ser Thr Tyr Pro Trp Thr

1 5

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggattcacct tcagttacta tccc 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atgtcttttg atggaacaag tgac 24

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gcgagagggg gttggaagtg gccggggggt gcctttgacg tc 42

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

caggccatta gaaataat 18

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ctacaacatt ctacttaccc gtggacg 27

<210> 11

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr

20 25 30

Pro Ile His Trp Val Arg Gln Gly Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Thr Met Met Ser Phe Asp Gly Thr Ser Asp His Cys Ile Ser Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Val Met Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Lys Met Arg Leu Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Trp Lys Trp Pro Gly Gly Ala Phe Asp Val Phe Gly

100 105 110

Pro Gly Thr Val Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 12

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggacgc gtggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgtaa cgtctggatt caccttcagt tactatccca tccactgggt ccgccagggt 120

cccggcaagg ggctggagtg ggtgacaatg atgtcttttg atggaacaag tgaccactgc 180

ataagttccg ttaagggccg gttcgtcatg tccagagaca attccaggaa cacactatat 240

ctggagatga acaaaatgag acttgaagat acaggtgtct attattgtgc gagagggggt 300

tggaagtggc cggggggtgc ctttgacgtc tttggccccg ggacagtggt caccgtctcc 360

tca 363

<210> 13

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Arg Asn Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Ser Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Ser Thr Tyr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 14

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gatattgtga tgacccagac tccaccctcc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcacc 60

ctcacttgcc gggcaagtca ggccattaga aataatttag cctggtatca gcacaaaccg 120

gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcttccactt tagaggatgg ggtcccatcc 180

tcattcagcg gcagtggttt tgggacagat ttcactctca caatcaacag cctgcagcct 240

gaagattttg caacttatta ctgtctacaa cattctactt acccgtggac gttcggccaa 300

gggaccaagg tggaaatcaa a 321

<210> 15

<211> 470

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 15

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Val Val Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Tyr Tyr Pro Ile His Trp Val Arg Gln Gly Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Thr Met Met Ser Phe Asp Gly Thr Ser Asp His Cys Ile

65 70 75 80

Ser Ser Val Lys Gly Arg Phe Val Met Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Glu Met Asn Lys Met Arg Leu Glu Asp Thr Gly Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Trp Lys Trp Pro Gly Gly Ala Phe Asp

115 120 125

Val Phe Gly Pro Gly Thr Val Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

130 135 140

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

145 150 155 160

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

165 170 175

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

180 185 190

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

195 200 205

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

210 215 220

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

225 230 235 240

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

245 250 255

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

260 265 270

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

275 280 285

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

290 295 300

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

305 310 315 320

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

325 330 335

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

340 345 350

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

355 360 365

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

370 375 380

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

385 390 395 400

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

405 410 415

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

420 425 430

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

435 440 445

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

450 455 460

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210> 16

<211> 2499

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac 60

ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 120

tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 180

atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 240

ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 300

gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc 360

ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc 420

tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa 480

aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg 540

tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct 600

gttttgacct ccatagaaga caccgggacc gatccagcct ccgcggccgg gaacggtgca 660

ttggaacgcg gattccccgt gccaagagtg acgtaagtac cgcctataga gtctataggc 720

ccaccccctt ggcttcgtta gaacgcggct acaattaata cataacctta tgtatcatac 780

acatacgatt taggtgacac tatagaataa catccacttt gcctttctct ccacaggtgt 840

ccactcccag gtccaactgc acctcggttc tatcgattga attccaccat gggatggtca 900

tgtatcatcc tttttctagt agcaactgca accggtgtac attctgaggt gcagctggtg 960

gagtctgggg gacgcgtggt ccagcctggg gggtccctga gactctcctg tgtaacgtct 1020

ggattcacct tcagttacta tcccatccac tgggtccgcc agggtcccgg caaggggctg 1080

gagtgggtga caatgatgtc ttttgatgga acaagtgacc actgcataag ttccgttaag 1140

ggccggttcg tcatgtccag agacaattcc aggaacacac tatatctgga gatgaacaaa 1200

atgagacttg aagatacagg tgtctattat tgtgcgagag ggggttggaa gtggccgggg 1260

ggtgcctttg acgtctttgg ccccgggaca gtggtcaccg tctcctcagc gtcgaccaag 1320

ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 1380

ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaacctgtga cggtctcgtg gaactcaggc 1440

gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 1500

ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 1560

gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac 1620

aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 1680

ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 1740

gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 1800

gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 1860

gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1920

aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1980

cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 2040

caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 2100

gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 2160

ggctccttct tcctctatag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 2220

gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 2280

tccctgtccc cgggtaaatg agtgcgacgg ccggcaagcc cccgctcccc gggctctcgc 2340

ggtcgtacga ggaaagcttg gccgccatgg cccaacttgt ttattgcagc ttataatggt 2400

tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct 2460

agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcat 2499

<210> 17

<211> 233

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 17

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Pro Ser Leu Ser Ala

20 25 30

Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile

35 40 45

Arg Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

50 55 60

Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Ser

65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser

85 90 95

Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Ser Thr

100 105 110

Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

115 120 125

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

130 135 140

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

145 150 155 160

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

165 170 175

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

180 185 190

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

195 200 205

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

210 215 220

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 18

<211> 1738

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18