阅读说明：本技术 一种表达腈水合酶突变体的重组菌及其制备方法和应用 (Recombinant bacterium for expressing nitrile hydratase mutant and preparation method and application thereof ) 是由 董亢 濮梦华 李文兵 夏华跃 夏斌 李习红 于 2019-08-01 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种表达腈水合酶突变体的重组菌及其制备方法和应用,制备方法包括易错PCR法构建基因随机突变质粒文库,转化阳性克隆的筛选,经过酶活、蛋白电泳检测,水合小试验证筛选等步骤最终成功获得了表达腈水合酶突变体蛋白的重组大肠杆菌。本发明以高产腈水合酶大肠杆菌的基因组为模板,采用易错PCR技术重组构建随机突变质粒文库,从库中筛选腈水合酶突变体基因,该重组基因转化进入工程菌中后可高效诱导表达腈水合酶突变体蛋白。以高表达腈水合酶突变体编码基因的重组工程菌在经诱导表达后获得的菌体为酶源,在适合条件下进行水合反应生产烟酰胺,副产物烟酸低90％以上。(The invention discloses a recombinant bacterium for expressing nitrile hydratase mutant and a preparation method and application thereof. The invention uses the genome of Escherichia coli with high nitrile hydratase yield as a template, adopts error-prone PCR technology to recombine and construct a random mutant plasmid library, screens nitrile hydratase mutant genes from the library, and can efficiently induce and express nitrile hydratase mutant proteins after the recombinant genes are transformed into engineering bacteria. The recombinant engineering bacteria of the high expression nitrile hydratase mutant coding gene are induced and expressed to obtain thallus which is used as an enzyme source, hydration reaction is carried out under a proper condition to produce nicotinamide, and the byproduct nicotinic acid is over 90 percent lower.)

一种表达腈水合酶突变体的重组菌及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物基因重组技术领域，特别涉及一种表达腈水合酶突变体的重组菌及其制备方法和应用。

背景技术

定向进化属于非理性设计，是指通过在实验室中模拟达尔文自然进化过程，针对某一蛋白质酶的编码基因，通过易错PCR、DNA重组等技术来改造酶的基因，然后根据特定的改造目的，筛选有价值的突变酶。近10年来，定向进化技术已经在酶的相关性质改造领域取得了很多成功的案例，主要集中在提高催化活性，改进底物特异性，提高热稳定性等方面。

目前，烟酰胺的生产常用表达腈水合酶蛋白的重组工程菌进行生物催化生产，以水合3-氰基吡啶为原料，通过含腈水合酶的微生物催化制得烟酰胺，工艺路线先进、合理可行，具有工艺流程短、能耗低、污染少、转化率高等优点，但现有的烟酰胺生产技术副产烟酸含量高，难以与烟酰胺分离，导致主产物烟酰胺纯度难以提高，影响了烟酰胺的高纯度生产和使用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题：针对目前烟酰胺微生物催化生产过程中副产物含量高的缺点，本发明构建了腈水合酶突变体编码基因，重组工程菌在经诱导表达后获得的菌体为酶源，应用于烟酰胺生产，降低副产物烟酸的生成。

为解决上述技术问题，本发明提供以下的技术方案：

一种表达腈水合酶突变体的重组菌的制备方法，由如下具体步骤：

(1)以高产腈水合酶的大肠杆菌的pET28-NHase质粒为模板，采用易错PCR法构建基因随机突变质粒文库，具体方法如下：

上述扩增片段通过琼脂糖凝聚电泳回收DNA产物；

将pET-28(a)空载体用BamHI和HindIII双酶酶切，上述回收的DNA产物用同样方法酶切将酶切后的DNA片段和pET-28(a)载体用T4DNA ligase连接，16℃反应过夜；

将连接产物用电转化仪转化至DH10B感受态细胞，涂布于50mg/mL硫酸卡那霉素的LB平板，过夜培养后收集菌体并提取质粒即得基因随机突变质粒文库；

(2)以热激转化法将质粒文库转入BL21感受态细胞中，涂布于含终浓度50mg/ml的卡纳霉素的LB平板上，挑选单克隆进行菌检，目标条带1.9kb，菌检体系如下：(筛选结果图)

(3)随机挑选菌检阳性单克隆接种到48孔板中，每孔含终浓度50mg/ml的卡纳霉素的1ml液体LB培养基，37℃，220rpm摇床培养16h，取培养液以3％体积比接种到含有50mg/ml的卡纳霉素的50ml液体LB培养基中，37℃，220rpm摇床培养至OD₆₀₀＝0.4～0.6时，加入终浓度为100umol/L的IPTG和终浓度为40mg/L的氯化钴，18℃，220rpm摇床诱导培养24h得发酵液，发酵液中直接加入终浓度为10％的3-氰基吡啶，20℃反应30min后立即放置在冰上30min。淘汰掉有晶体析出的菌落；

(4)按照上述方法将筛选获得菌种再重新摇菌，并加大3-氰基吡啶的浓度至20％或30％，获得高活力菌种。

一种表达腈水合酶突变体的重组菌，由上述的一种表达腈水合酶突变体的重组菌的制备方法制备获得。

优选地，重组菌含有腈水合酶野生型或突变体基因，所述腈水合酶野生型或突变体基因序列包括但不限于SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3、SEQ NO.4、SEQ NO.5中的一种。

优选地，所述腈水合酶野生型或突变体基因表达合成腈水合酶野生型或突变体，所述水合酶野生型或突变体的氨基酸序列包括但不限于SEQ NO.6、SEQ NO.7、SEQ NO.8、SEQ NO.9、SEQ NO.10中的一种。

一种烟酰胺制备方法，以上述的表达腈水合酶突变体的重组菌为酶源生产烟酰胺，具体步骤如下：

将菌体加入纯水中重悬，20℃保温，以70wt％浓度的3-氰基吡啶水溶液为反应底物，初始流速40g/min流加，反应过程中根据反应液中3-氰基吡啶的含量降低流速，20±2℃持续反应得烟酰胺，副产物烟酸降低90％以上。

优选地，所述反应液中的腈水合酶突变体的酶活终浓度70U/mL，所述纯水采用液碱调至pH 8.0±0.2，所述反应底物由双蒸水配置，50℃水浴保温，3-氰基吡啶终浓度为反应底物的30wt％。

本发明获得的有益效果：

1、本发明以高产腈水合酶大肠杆菌的基因组为模板，采用易错PCR技术重组构建随机突变质粒文库，从库中筛选腈水合酶突变体基因，该重组基因转化进入工程菌中后可高效诱导表达腈水合酶突变体蛋白。

2、腈水合酶突变体蛋白作为催化酶，可高效催化底物3-氰基吡啶合成烟酰胺，并显著降低副产物烟酸的生成。

3、以高表达腈水合酶突变体编码基因的重组工程菌在经诱导表达后获得的菌体为酶源，在适合条件下进行水合反应生产烟酰胺，副产物烟酸低90％以上。

附图说明

图1为突变株与野生型菌株的氨基酸序列对比图；

图2为野生型菌株的腈水合酶突变体酶活测定结果；

图3为高活力突变菌株1的腈水合酶突变体酶活测定结果；

图4为高活力突变菌株2的腈水合酶突变体酶活测定结果；

图5为高活力突变菌株3的腈水合酶突变体酶活测定结果；

图6为高活力突变菌株4的腈水合酶突变体酶活测定结果；

其中，5.5～6min出峰为反应液中的烟酰胺，11min出峰为副产物烟酸。

具体实施方式

下面通过对实施例的描述，对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，以帮助本领域的技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。

实施例1：按如下方法构建高表达腈水合酶突变体编码基因的重组工程菌：

(1)以高产腈水合酶的大肠杆菌的pET28-NHase质粒为模板，采用易错PCR法构建基因随机突变质粒文库，方法如下：

上述扩增片段通过琼脂糖凝聚电泳回收DNA产物；

将pET-28(a)空载体用BamHI和HindIII双酶酶切，上述回收的DNA产物用同样方法酶切将酶切后的DNA片段和pET-28(a)载体用T4DNA ligase连接，16℃反应过夜；

将连接产物用电转化仪(Bio-rad MicroPulser)转化至DH10B感受态细胞，涂布于50mg/mL硫酸卡那霉素的LB平板，过夜培养后收集菌体并提取质粒即得基因随机突变质粒文库；

(2)以热激转化法将质粒文库转入BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含终浓度50mg/ml的卡纳霉素的LB平板上，挑选单克隆进行菌检，目标条带1.9kb，菌检体系如下：

(3)随机挑选菌检阳性单克隆接种到48孔板中，每孔含终浓度50mg/ml的卡纳霉素的1ml液体LB培养基，37℃，220rpm摇床培养16h，取培养液以3％体积比接种到含有50mg/ml的卡纳霉素的50ml液体LB培养基中，37℃，220rpm摇床培养至OD₆₀₀＝0.4～0.6时，加入终浓度为100umol/L的IPTG和终浓度为40mg/L的氯化钴，18℃，220rpm摇床诱导培养24h得发酵液，发酵液中直接加入终浓度为10％的3-氰基吡啶，20℃反应30min后立即放置在冰上30min。淘汰掉有晶体析出的菌落，如有晶体析出即为3-氰基吡啶未反应完全；

(4)按照上述方法将筛选获得菌种再重新摇菌，并加大3-氰基吡啶的浓度至20％或30％，获得高活力菌种。

本实施例获得了4株高活力突变菌株，将高活力突变菌株的菌体样品经过酶活筛选出部分菌株，进行水合小试验证，具体操作如下：

以收集的菌体为酶源，测定酶活性，检测具体方法如下：

1.反应体系为0.5mL，50mM氯化铵-氨水缓冲液(pH8.0)，含100mM 3-氰基吡啶。

2.添加适量的菌体。25℃振荡反应60min，立即添加0.5mL无水乙腈终止反应。12000rpm离心1min。

3.HPLC法采用安捷伦高效液相色谱(Agilent 1100,USA)，色谱柱为Varianpursuit C18反向色谱柱(4.6mm*250mm)，流动相为15mM磷酸钾缓冲液(pH2.8):乙腈92:8(v/v)，流速设定为0.5mL/min，UV检测器，检测波长为265mm。

4.腈水合酶酶活定义：1单位(U)为在25℃条件下1min催化形成1μmol烟酰胺所需要的酶量，单位为U/mL，结果见表1，HPLC检测图见图2～6：

表1菌体酶源的酶活测定结果

菌株	酶活(U/mL)
		野生型(SEQ NO.1)	70
突变株1(SEQ NO.2)	119
		突变株2(SEQ NO.3)	125
突变株3(SEQ NO.4)	107
		突变株4(SEQ NO.5)	143

分别以上述1株野生型和4株高活力突变菌株的菌体作为酶源，取适量菌体加入3.5ml纯水中(液碱调pH8.0±0.2)，酶活终浓度为70U/ml，20℃保温，分批次投加1.5ml的3-氰基吡啶(终浓度30％，50℃水浴保温)：150ul/次/15min，投加结束后反应1.5h，将反应液经过20℃后处理，检测副产烟酸含量，筛选出重组工程菌(烟酸降低90％以上)，然后将发酵液在4℃，6000rpm离心10min，收集菌体，数据如下：

表2不同菌种催化反应液中副产物烟酸的含量

菌种	温度/℃	烟酸ppm
			野生型(SEQ NO.1)	20	109.5
突变株1(SEQ NO.2)	20	9.3
			突变株2(SEQ NO.3)	20	10.2
突变株3(SEQ NO.4)	20	9.8
			突变株4(SEQ NO.5)	20	7.1

40L反应体系：以收集的菌体为酶源(酶活终浓度70U/ml)，加入20.5kg纯水中(液碱调pH8.0±0.2)，20℃保温，以70wt％的3-氰基吡啶水溶液19.5kg为反应底物(纯水配置，，50℃水浴保温)，初始流速40g/min流加，最终反应液3-氰基吡啶浓度为30wt％，20±2℃反应，反应结束将反应液经过20、30、40、50℃后处理，最终烟酰胺产物中降低副产烟酸90％以上。

表3不同后处理温度对烟酸含量的影响

(5)将筛选得出的重组菌株，进行腈水合酶基因的测序，野生型和突变基因序列测序结果见SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3、SEQ NO.4、SEQ NO5；野生型和突变基因序列对应的氨基酸序列见SEQ NO.6、SEQ NO.7、SEQ NO.8、SEQ NO.9、SEQ NO10；将突变体菌株与野生型菌株中的腈水合酶氨基酸序列进行对比，可见突变菌株的氨基酸残基突变位点主要为L49F，65位G缺失，N108I，L131Q，E155V，V180L，P181T(蛋白一级序列比对结果见图1)，对比酶活性测定结果(具体结果见图2～6)，当上述这些位点的氨基酸残基突变后腈水合酶的活性仍保持在高位，并显著降低副产物烟酸的生成。

综上所述，本发明以高产腈水合酶大肠杆菌的基因组为模板，采用易错PCR技术重组构建随机突变质粒文库，从库中筛选腈水合酶突变体基因，该重组基因转化进入工程菌中后可高效诱导表达腈水合酶突变体蛋白。腈水合酶突变体蛋白作为催化酶，可高效催化底物3-氰基吡啶合成烟酰胺，并显著降低副产物烟酸的生成。以高表达腈水合酶突变体编码基因的重组工程菌在经诱导表达后获得的菌体为酶源，在适合条件下进行水合反应生产烟酰胺，副产物烟酸低90％以上。

以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽瑞邦生物科技有限公司

<120> 一种表达腈水合酶突变体的重组菌及其制备方法和应用

<130> 11201

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 221

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Thr Gly Ser His Gly Arg Asp Gly Asp His His Gly His His His

1 5 10 15

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<210> 2

<211> 221

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

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<211> 221

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

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<210> 4

<211> 221

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

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1 5 10 15

Asp Arg Asp His Asp Asn His Leu Asp Pro Met Thr Ala Arg Val Met

20 25 30

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<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

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