一种调控目的基因表达和cca效应的元件
阅读说明：本技术 一种调控目的基因表达和cca效应的元件 (Element for regulating and controlling target gene expression and CCA effect ) 是由 石贵阳 李由然 肖丰旭 张梁 丁重阳 徐沙 顾正华 张玉鹏 王瀚容 于 2020-06-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种调控目的基因表达和CCA效应的元件,属于生物工程技术领域。所述元件包括载体、启动子和靶基因结合序列,所述靶基因结合序列为AGCTTT-Y-AAAGCT或AAAGCT-Y-AGCTTT(Y代表长度为0-14bp的核苷酸序列)。含有AGCTTT-Y-AAAGCT的元件,响应葡萄糖存在时的CCA效应,甘油存在时的CCR效应；含AAAGCT-Y-AGCTTT的元件,响应葡萄糖存在时的CCR效应,甘油存在时的CCA效应。本发明为后续地衣芽孢杆菌表达原件的开发提供了高效的、靶向的分子手段。(The invention discloses an element for regulating and controlling target gene expression and CCA effect, belonging to the technical field of biological engineering. The element comprises a carrier, a promoter and a target gene binding sequence, wherein the target gene binding sequence is AGCTTT-Y-AAAGCT or AAAGCT-Y-AGCTTT (Y represents a nucleotide sequence with the length of 0-14 bp). An element comprising AGCTTT-Y-AAAGCT, responsive to the CCA effect in the presence of glucose, the CCR effect in the presence of glycerol; an AAAGCT-Y-AGCTTT containing element is responsive to the CCR effect in the presence of glucose and the CCA effect in the presence of glycerol. The invention provides an efficient and targeted molecular means for the subsequent development of a bacillus licheniformis expression element.)
技术领域
本发明涉及一种调控目的基因表达和CCA效应的元件，属于生物工程技术领域。
背景技术
1942年，Jacques Monod发现大肠杆菌在葡萄糖和半乳糖的混合碳源下优先利用葡萄糖，在葡萄糖消耗完时才利用半乳糖，存在着明显的二次生长现象。之后，人们相继在不同微生物以及不同的碳水化合物之间发现类似的效应，这表明这种分级代谢现象在细菌中广泛发生，是细菌应对复杂环境的生长策略。尽管在革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌中都存在这种分级代谢现象，但是主要负责调控的转录因子却大不相同。在革兰氏阳性菌中，负责分级代谢的主要转录因子为CcpA蛋白，而在革兰氏阴性菌中，负责分级代谢的主要转录因子为CRP蛋白。
CcpA蛋白作为LacI-GalR蛋白家族的成员，结构中包含N-末端螺旋-转-螺旋(HTH)基序和结合效应物的羧基末端结构域。作为负责调控革兰氏阳性菌中碳水化合物代谢的主要调控因子，不仅在复杂碳水化合物的分级代谢中发挥着重要的作用，还负责调控氮代谢、孢子生成以及一些重要的生理过程如产溶剂、毒性基因的表达。
研究表明，CcpA蛋白通过结合在特定的位点(cre位点)从而行使激活或者抑制过程，并且大部分效应为抑制，而实现激活或者抑制效应的前提是结合到特定的CcpA蛋白识别位点。经典的cre位点为一个14-bp的伪对称回文序列，其序列为TGWNANCGNTNWCA(W代表碱基A或T，N代表任意碱基)。经典的cre位点揭示了CcpA蛋白在革兰氏阳性菌中发挥功能的分子基础，是CcpA蛋白调控的一种共性。然而，越来越多的非共性特点在不同菌株种被发现，例如，在艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)中发现了CcpA蛋白的识别位点RGAAAANGTTTTCWW(R代表A或G，N代表任意核苷酸，W代表A或T)；在产溶剂梭菌中发现了CcpA蛋白的识别位点TGTAAAYTTTACA(Y代表长度可变的核苷酸序列)。这些现象均表明CcpA蛋白在不同菌株的调控存在共性与独特性，解析共性与独特性之间的联系是揭示CcpA蛋白全局调控的分子基础。
因此，以工业上具有优势的细菌(即地衣芽孢杆菌)为例，明确CcpA蛋白在地衣芽孢杆菌中的靶位点结合基序，从而揭示CcpA蛋白在地衣芽孢杆菌中调控中的独特性。
发明内容
针对现有阶段CcpA蛋白研究的不足，本发明提供了基于CcpA蛋白的靶基因结合序列得到的一种调控目的基因表达和CCA效应的元件，为今后开发高效表达平台提供高效的、靶向性的分子手段。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种调控目的基因表达和/或CCA效应的元件，所述元件包括启动子、靶基因结合序列和载体；所述靶基因结合序列位于启动子转录起始位点上游，所述启动子和靶基因结合序列位于载体的多克隆位点区，所述靶基因结合序列是AGCTTT-Y-AAAGCT或AAAGCT-Y-AGCTTT，其中，Y表示长度为0-14bp的核苷酸序列。
进一步地，所述载体为pHY-PLK300。
进一步地，所述启动子为核苷酸如SEQ ID NO.5所示的海藻糖启动子。
进一步地，所述AGCTTT-Y-AAAGCT的核苷酸序列如SEQ ID NO.1(AGCTTTATAAAGCT)、SEQ ID NO.2(AGCTTTAAGGTTCAGAAAAGCT)任一所示。
进一步地，所述AAAGCT-Y-AGCTTT的核苷酸序列SEQ ID NO.3(AAAGCTATAGCTTT)、SEQ ID NO.4(AAAGCTAAGGTTCAGAAGCTTT)任一所示。
本发明还提供了含上述元件的重组质粒及表达该质粒的菌株。
进一步地，所述菌株以地衣芽孢杆菌ATCC 14580为宿主。
本发明还提供了上述元件或重组质粒或菌株在调控目的基因表达和/或CCA效应中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种调控目的基因表达和CCA效应的元件，所述元件包括载体、启动子和靶基因结合序列，所述靶基因结合序列为AGCTTT-Y-AAAGCT或AAAGCT-Y-AGCTTT(Y代表长度为0-14bp的核苷酸序列)。含有AGCTTT-Y-AAAGCT的元件，响应葡萄糖存在时的CCA效应，甘油存在时的CCR效应；含AAAGCT-Y-AGCTTT的元件，响应葡萄糖存在时的CCR效应，甘油存在时的CCA效应。
附图说明
图1：纯化后的CcpA蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图。
图2：EMSA凝胶迁移电泳图。
图3：EMSA凝胶迁移电泳图。
图4：绿色荧光蛋白荧光强度检测。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步的说明，用于本发明的核苷酸序列可以通过合成的方法生产，分子片段的纯化、重组质粒的构建、转化子的挑选等过程中用到的仪器设备与试剂均为市售商品。
下述实施例中涉及到的引物如表1所示。
表1引物
注：划线处为突变位点。
实施例1构建pHY-promoter-cre-T/TR-eGFP质粒，并转化至地衣芽孢杆菌
(1)Promoter-cre-T/TR的制备
采用重叠延伸PCR方法将cre-T、cre-TR(cre-T：AGCTTTATAAAGCT，即SEQ ID NO.1；cre-TR：AAAGCTATAGCTTT，即SEQ ID NO.3)分别***到启动子的转录起始位点上游，以地衣芽孢杆菌中的海藻糖启动子(核苷酸序列为：
ATCTCAGCCGGTTGTTCCCGGCGTATAAATCGGAGGAAGCCTTGCTGTCCTTCGTTTTATGAAGGGAACGGCCGGGCTTTTTTTATTTTTGAAAGCGCTATAAAAATATGTTGACTACTTGTATATACAAGAATACAATATAGGTATAACATGTATATACAAGTTATAAGAGGAGAAGGAGGGATTGGAA，即SEQ ID NO.5)为例，叙述如何将cre-T/TR***到启动子中。
Promoter-cre-T的制备：
以地衣芽孢杆菌基因组为模板，采用引物对P-F1/P-R1、P-F2/P-R2，进行PCR扩增，并对PCR扩增产物通过DNA纯化试剂盒纯化，获得片段P1与P2。
以P1与P2为模板，采用引物对P-F1/P-R2，进行PCR扩增，并利用DNA纯化试剂盒对PCR扩增产物纯化，获得***cre-T的启动子片段Promoter-cre-T。
Promoter-cre-TR的制备：
以地衣芽孢杆菌基因组为模板，采用引物对P-F1/P-R1-1、P-F2-1/P-R2，进行PCR扩增，并利用DNA纯化试剂盒对PCR扩增产物纯化，获得片段P1与P2。
以P1与P2为模板，采用引物对P-F1/P-R2，进行PCR扩增，并对PCR扩增产物通过DNA纯化试剂盒纯化，获得***cre-TR的启动子片段Promoter-cre-TR。
(2)pHY-promoter-cre-T/TR质粒的制备
通过HindIII/XhoI两个酶分别酶切pHY-PLK300载体与Promoter-cre-T/TR，并对酶切产物分别用DNA纯化试剂盒纯化，获得携带粘性末端的pHY-PLK300载体与Promoter-cre-T/TR，纯化后将携带粘性末端的Promoter-cre-T/TR与pHY-PLK300采用摩尔比为5～10(Promoter-cre-T/TR：pHY-PLK300)的比例用DNA连接酶进行连接。
将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上挑选正确的转化子，并进行扩增培养，对培养后的转化子用质粒提取试剂盒进行提取质粒，并对提取的质粒用HindIII/XhoI双酶切验证，并进行测序验证，验证正确的质粒即为pHY-promoter-cre-T/TR质粒。
(3)pHY-promoter-cre-T/TR-eGFP质粒的制备
以携带eGFP片段的载体pUC19-EGFP(购于丰晖生物，货号：FH2162)为模板，以eGFP-F/eGFP-R为引物对通过常规PCR扩增，并对扩增产物通过DNA纯化试剂盒纯化，得到eGFP片段。
通过XhoI/SmaI两个酶分别酶切pHY-promoter-cre-T/TR质粒与纯化后的eGFP片段，并对酶切产物进行纯化，纯化后将eGFP片段与pHY-promoter-cre-T/TR质粒并采用摩尔比为5～10(eGFP片段：pHY-promoter-cre-T/TR质粒)的比例进行连接。
将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上挑选正确的转化子，并进行扩增培养，对培养后的转化子用质粒提取试剂盒进行提取质粒，并对提取的质粒用XhoI/SmaI双酶切验证，并进行测序验证。
(4)将pHY-promoter-cre-T/TR-eGFP质粒转化至地衣芽孢杆菌
取8μg-10μgpHY-promoter-cre-T/TR-eGFP质粒加入至地衣芽孢杆菌ATCC 14580(市售商品)感受态细胞中，并抽吸混匀，将混合液加入至预冷的0.1cm电转杯中，冰上静止3-5min，将电转杯放置电转仪中，电压设定1700V-2100V，设定后，迅速加入900μL复苏培养基(LB培养基+0.5M山梨醇+0.38M甘露醇)，并在37℃，100rpm下后培养3h，得到重组菌；涂布菌体至含有四环素的LB平板上，获得转化子。
对转化子进行菌落PCR验证，挑选正确的转化子，进行扩增培养，对培养后的转化子用质粒试剂盒进行提取质粒，并对提取的质粒进行XhoI/SmaI酶切验证，并进行测序验证。
实施例2 pHY-promoter-cre-T/TR-eGFP的在不同碳环境下的荧光强度测定
将实施例1中验证正确的质粒所对应的重组菌培养10h活化，并以3％(V/V)的接种量转接到发酵培养基中(TB培养基)，在培养8h后，按单位为g/100mL计，分别向培养基中添加1.5％海藻糖、1.5％海藻糖和1.5％葡萄糖、1.5％海藻糖和1.5％甘油，并继续培养16h后结束发酵，进行菌体量与发酵荧光强度的测定。
采用pH 7.0，0.2M PBS洗涤菌体两次，并将洗涤后的菌体液OD600控制在0.5，取200μL加入到96孔微量滴定板中，并置于TECAN-SparK多功能酶标仪中，并设置程序如下：选择样品孔，摇板时间为30s，吸收波长为485nm，激发波长为535nm，增益值为100，以获得最终值。
荧光强度(FI)的计算公式如下：FI(AU/OD)＝2×(FVt-FVr),其中，FVt代表目标菌株的荧光值，而FVr代表的是地衣芽孢杆菌原始荧光值。
结果表明，由图2，对于携带pHY-promoter-cre-T的菌株，按单位为g/100mL计，在发酵培养基中加入1.5％海藻糖做诱导剂，可检测到的最高荧光强度为1832.21AU/OD；而在添加1.5％海藻糖同时添加1.5％葡萄糖，可检测到的最高荧光强度为2424.24AU/OD；在添加1.5％海藻糖同时添加1.5％甘油，可检测到的最高荧光强度为336.69AU/OD，而在CcpA蛋白缺失菌株中，由添加碳源所造成的荧光强度差异较小。结果表明，在存在葡萄糖时，CcpA蛋白与cre-T结合，实现CCA效应；而存在甘油时，CcpA蛋白与cre-T结合，实现CCR效应。对于携带pHY-promoter-cre-TR的菌株，在发酵培养基中加入1.5％海藻糖做诱导剂，可检测到的最高荧光强度为2329.57AU/OD；而在添加1.5％海藻糖同时添加1.5％葡萄糖，可检测到的最高荧光强度为325.41AU/OD；在添加1.5％海藻糖同时添加1.5％甘油，可检测到的最高荧光强度为3838.62AU/OD，而在CcpA蛋白缺失菌株中，由添加碳源所造成的荧光强度差异较小。结果表明，在存在葡萄糖时，CcpA蛋白与cre-TR结合，实现CCR效应；而在存在甘油时，CcpA蛋白与cre-TR结合，实现CCA效应。
实施例3 promoter-cre-T/TR回文区突变片段构建
(1)CcpA蛋白的表达与纯化
以地衣芽孢杆菌基因组为模板，以ccpA-F/ccpA-R为引物对进行PCR扩增，并对PCR扩增产物采用DNA纯化试剂盒进行纯化，用HindIII/EcoRI两个酶分别酶切pET-28a与扩增后的ccpA片段，对酶切后产物采用DNA纯化试剂盒进行纯化，纯化后将ccpA片段与pET-28a按照摩尔比为5～10(ccpA片段：pET-28a)的比例进行连接，得到pET-28a-ccpA质粒。
将连接产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，在含有卡那霉素的LB平板上挑选正确的转化子，并进行扩增培养，对培养后的转化子用质粒提取试剂盒进行提取质粒，对质粒用HindIII/EcoRI两个酶进行双酶切验证，并进行测序验证。
将测序正确的菌株培养10h，并以3％的接种量转接到发酵培养基(即TB培养基)中，并于37℃，200rpm下培养，培养1.5h-2h后加入终浓度1mM IPTG进行诱导表达，并于8h后结束发酵，12000rpm离心5min去上清，并用0.2M PBS溶液洗涤菌体两次后用超声波破碎仪破碎菌体，直至呈现透明状，并且没有明显固状物存在，对破碎后溶液在12000rpm下离心5min，取上清至无菌的50mL的管中保存。
进行蛋白纯化，并对纯化后的样品通过SDS-PAGE电泳实验验证纯化蛋白的纯度(图1)，对纯化后蛋白采用冷冻干燥法进行冷冻干燥处理，最终获得的粉末状样品在4℃保存。
(2)promoter-cre-T/TR回文区突变片段的构建
对回文区的单碱基突变采用反向PCR法，以上述构建的pHY-promoter-cre-T/TR-eGFP质粒为模板，分别以T1-F/T1-R、T2-F/T2-R、T3-F/T3-R、T4-F/T4-R、T5-F/T5-R、T6-F/T6-R、T7-F/T7-R、T8-F/T8-R、T9-F/T9-R、T10-F/T10-R、T11-F/T11-R、T12-F/T12-R、TR1-F/TR1-R、TR2-F/TR2-R、TR3-F/TR3-R、TR4-F/TR4-R、TR5-F/TR5-R、TR6-F/TR6-R、TR7-F/TR7-R、TR8-F/TR8-R、TR9-F/TR9-R、TR10-F/TR10-R、TR11-F/TR11-R、TR12-F/TR12-R为引物对，进行PCR扩增，并对扩增后的产物用DNA纯化试剂盒进行纯化，并将纯化后产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中，挑选正确的转化子进行扩增培养，对扩增后的转化子提取质粒，并进行测序验证，得到突变质粒promoter-cre-T1-12、promoter-cre-TR1-12。
在构建成功回文区单碱基突变的质粒后，以P-F(5’-biotin)/P-R(5’-biotin)为引物对通过PCR扩增，并对PCR扩增产物用DNA纯化试剂盒进行纯化，对纯化后的生物素标记的片段进行定量。
实施例4：CcpA蛋白与promoter-cre-T/TR突变体间亲和力的比较
采用EMSA凝胶迁移电泳实验，采用市售化学发光法生物素标记核酸检测试剂盒(购于碧云天，货号：D3308)中的步骤，反应体系为10nM promoter-cre-T/TR突变体与1.2μM以下的CcpA，并比较相同条件下，不同突变体间阻滞条带在泳道中的占比，进而来表征与CcpA蛋白间亲和力的差异(图3与图4)。
对于promoter-cre-T，十二组突变体promoter-cre-T1-12中阻滞条带的比例分别为：25.53％、30.07％、44.40％、90.27％、72.70％、70.63％、10.87％、42.03％、88.43％、50.87％、0.00％、0.00％。结果表明，promoter-cre-T4、promoter-cre-T5、promoter-cre-T6、promoter-cre-T9、promoter-cre-T10与CcpA蛋白之间的亲和力高，表明这五个突变位点保守性较低，而promoter-cre-T1、promoter-cre-T2、promoter-cre-T3、promoter-cre-T7、promoter-cre-T8、promoter-cre-T11、promoter-cre-T12对CcpA的亲和力低，表明这七个突变位点的保守性较高。
对于promoter-cre-TR，十二组突变体promoter-cre-TR1-12中阻滞条带的比例分别为：3.67％、33.13％、17.63％、68.87％、30.03％、53.07％、21.10％、50.23％、74.00％、57.40％、18.57％、50.10％。promoter-cre-TR4、promoter-cre-TR6、promoter-cre-TR8、promoter-cre-TR9、promoter-cre-TR10、promoter-cre-TR12显示出对CcpA的高亲和力，这表明在此六个突变位点保守性较低，而promoter-cre-TR1、promoter-cre-TR2、promoter-cre-TR3、promoter-cre-TR5、promoter-cre-TR7、promoter-cre-TR11显示出对CcpA低亲和力，这表明在此六个突变位点的保守度较高。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种调控目的基因表达和CCA效应的元件及质粒
<160> 63
<170> PatentIn version 3.3
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agctttaagg ttcagaaaag ct 22
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aaagctatag cttt 14
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aaagctaagg ttcagaagct tt 22
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<213> Bacillus licheniformis
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atctcagccg gttgttcccg gcgtataaat cggaggaagc cttgctgtcc ttcgttttat 60
gaagggaacg gccgggcttt ttttattttt gaaagcgcta taaaaatatg ttgactactt 120
gtatatacaa gaatacaata taggtataac atgtatatac aagttataag aggagaagga 180
gggattggaa 190
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<213> 人工序列
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aagtagtcaa catatttggc tttataaagc taaaa 35
<210> 38
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
ggcttttttt attttcaagc tatagcttta a 31
<210> 39
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
ttaaagctat agcttgaaaa taaaaaaagc c 31
<210> 40
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
gcttttttta ttttacagct atagctttaa a 31
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
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tttaaagcta tagctgtaaa ataaaaaaag c 31
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
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ctttttttat tttaacgcta tagctttaaa t 31
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<213> 人工序列
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atttaaagct atagcgttaa aataaaaaaa g 31
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<213> 人工序列
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tttttttatt ttaaatctat agctttaaat a 31
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<213> 人工序列
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tatttaaagc tatagattta aaataaaaaa a 31
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ttttttattt taaagttata gctttaaata t 31
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atatttaaag ctataacttt aaaataaaaa a 31
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gtagtcaaca tatttgaagc tatagcttta a 31
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<400> 63
ccgctcgagt tccaatccct ccttctcc 28