具体实施方式

I.定义

为了可以更容易地理解本发明，首先定义某些术语。

除非本文另有定义，否则与本发明有关的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应该是明确的，但是，在任何潜在歧义的情况下，此处提供的定义优先于任何词典或外部定义。

术语“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”以及在描述本发明的上下文中的类似指代(特别是在以下权利要求的上下文中)将被解释为涵盖单数和复数(即一个或更多)，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。除非另有说明，否则属于“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即，意为“包括但不限于”)。除非本文另有说明，否则本文对数值范围的引用仅旨在作为单独提及所引用或落入该范围内的每个单独值的便捷方式，并且将每个单独值并入说明书中，如同其被单独引用一样。

术语“约”或“大约”通常指在给定值或范围的5％以内，或更优选1％以内。

通常，术语“治疗”或“治疗”被定义为向患者应用或使用治疗剂，或向从患者分离的组织或细胞系应用或施用治疗剂，所述患者疾病、疾病症状或疾病倾向，目的是治愈、治疗、改善、缓解、改变、补救、改善、改进或影响疾病、疾病症状或疾病倾向。因此，治疗可以包括抑制、约束、预防、治疗或其组合。治疗尤其是指增加持续进展的时间、加快缓解、诱导缓解、增加缓解、加速恢复、增加替代疗法的功效或降低对替代疗法的抗性，或其组合。“抑制”或“约束”尤其是指延迟症状的发病、防止疾病复发、减少复发的次数和频率、增加症状发作之间的潜伏期、降低症状的严重程度、减少急性发作的严重性、减少症状的数量、减少疾病相关症状的发生率、减少症状的潜伏期、改善症状、减少继发症状、减少继发感染、延长患者存活或其组合。在一个实施方式中，症状是原发性，而在另一个实施方式中，症状是继发性。“原发性”是指由疾病直接导致的症状，例如糖尿病，而继发性是指源于或因主要原因而产生的症状。症状可以是疾病或病理状况的任何表现。

因此，如在本文中所使用的，术语“治疗”或“治疗”包括本文所述组合物的任何施用，并且包括：(i)预防疾病发生在可能易患该病但尚未经历或表现出该疾病的病理学或症状的受试者中；(ii)抑制正在经历或表现出该疾病的病理学或症状的受试者的疾病(即阻止病理学和/或症状的进一步发展)；或(iii)改善正在经历或表现出该疾病的病理学或症状的受试者的疾病(即逆转病理和/或症状)。

疾病或病症的“治疗”、“预防”或“改善”是指延迟或预防此类疾病或病症的发病、逆转、减轻、改善、抑制、减缓或停止进展、恶化或退化、与此类疾病或病症相关的病症的进展或严重程度。在一个实施方式中，疾病或病症的症状减轻至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％。

结合用于诊断病症的任何已知方法来测定治疗功效。该病症的一种或多种症状的缓解表明该组合物具有临床益处。上文描述的任何治疗方法可应用于任何合适的受试者，其包括例如哺乳动物如狗、猫、牛、马、兔子、猴子，并且最优选地是人。

如在本文中所使用的，术语“受试者”包括可受益于本发明的水凝胶或可植入药物递送装置的任何受试者。术语"受试者"包括动物，例如脊椎动物、两栖动物、鱼、哺乳动物、非人类动物，包括人和灵长类动物，例如黑猩猩、猴子等。在本发明的一个实施方式中，所述受试者是人。

术语“受试者”还包括农业生产的牲畜，例如牛、绵羊、山羊、马、猪、驴、骆驼、水牛、兔、鸡、火鸡、鸭、鹅和蜜蜂；和家养动物，例如狗、猫、笼养的鸟和观赏鱼，以及所谓的实验动物，例如仓鼠、豚鼠、大鼠和小鼠。

II.用于调节免疫系统的组合物

本发明的特征在于调节受试者中免疫系统的组合物和方法。本发明的组合物包含多孔支架；生长因子，其以有效诱导组织或器官在所述支架内形成并将细胞募集到所述支架中的量存在；和诱导募集细胞分化成T细胞祖细胞。

本发明的组合物和方法提供优于现有技术的优点。例如，本发明所述的组合物和方法增强了胸腺的T细胞祖细胞接种、T细胞新生和T细胞受体库的拓宽。此外，本发明所述的组合物和方法促进供体CD4+调节性T细胞产生并改善同种异体HSCT后的存活。与T细胞祖细胞的过继转移相比，本发明所述的组合物和方法增加了供体嵌合、T细胞产生并诱导更强大的抗体特异性T细胞对刺激的相应。本发明的组合物可以代表一种易于施用、现成的在HSCT中达到T细胞产生和GVHD减轻的方法。

在某些实施方式中，本发明所述的组合物和方法还降低了由于使用显著降低水平的生长因子而引起的毒性，例如与本领域所指导的相比，1ng至约1000μg生长因子或1ng至约1000ng生长因子。此外，本发明所述的组合物和方法表现出令人惊讶的增强的活性，从而允许在移植数量减少的细胞时具有相当的功效。

支架

本发明的组合物包含支架，例如聚合物支架。所述支架可以包含一种或多种生物材料。优选地，生物材料是无毒和/或非免疫原性的生物相容性材料。如在本文中所使用的，术语“生物相容性材料”指当植入或放置在受试者的生物组织附近时，不会随时间推移引起显著免疫反应或有害组织反应，例如独行发暗影或显著刺激的任何材料。

支架可包含不可生物降解或可生物降解的生物材料。在某些实施方式中，生物材料可以是不可生物降解的材料。示例性的不可生物降解材料包括但不限于金属、塑料聚合物或丝聚合物。在某些实施方式中，聚合物支架包含可生物降解的材料。可生物降解的材料可以通过物理或化学作用降解，例如谁合作用、加热、氧化或离子交换的水平，或通过细胞作用，例如附近或常驻细胞对酶、肽或其他化合物的加工。在某些实施方式中，聚合物支架包含不可降解材料和可降解材料两者。

在一些实施方式中，所述支架组合物可基于选自温度、pH、水合状态和孔隙率、交联密度、类型和化学或主链接头对降解的敏感性的预定速率降解。或者，所述支架组合物以基于化学聚合物比率的预定速率降解。例如，仅由丙交酯组成的高分子量聚合物在几年内降解，例如1-2年，而由丙交酯和乙交酯的50:50混合物组成的低分子量聚合物在几周内降解，例如1、2、3、4、6或10周。由高分子量、高古罗糖醛酸海藻酸盐组成的钙交联凝胶在体内经过几个月(1、2、4、6、8、10或12个月)到几年(1、2或5年)降解，而由低分子量海藻酸盐和/或已部分氧化的海藻酸盐组成的凝胶将在几周内降解。

在某些实施方式中，本文公开的一种或多种化合物或蛋白(例如生长因子、分化因子和归巢因子)共价地或非共价地连接或附着到支架组合物。在各种实施方式中，本文公开的一种或多种化合物或蛋白合并到支架组合物的结构或孔中，或存在于支架组合物的结构或孔中。

在一些实施方式中，所述支架包含被修饰的生物材料，例如被氧化或被还原。修饰例如氧化的程度可以在约1％至约100％变化。如在本文中所使用的，修饰程度指生物材料上被官能团修饰的位点的摩尔百分比。例如，修饰程度可以是约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。所列举值的中间值和范围旨在是本发明的一部分。示例性的修饰生物材料，例如水凝胶，包括但不限于还原海藻盐、氧化海藻酸盐、MA-海藻酸盐(甲基丙烯酸化海藻酸盐)或MA-明胶。

适用作本发明所述的支架的示例性生物材料包括糖胺聚糖、丝、纤维蛋白、聚乙二醇(PEG)、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚丙烯酰胺、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、(PGA)、聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚ε-己内酯(PCL)、聚氧化乙烯、聚富马酸丙二醇酯(PPF)、聚丙烯酸(PAA)、聚羟基丁酸、水解聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸、聚乙烯胺、海藻酸酯、果胶酯酸；和藻酸脂、完全或部分氧化的海藻酸盐、透明质酸、羧甲基纤维素、肝素、硫酸肝素、壳聚糖、羧甲基壳聚糖、几丁质、普鲁兰多糖、结冷胶、黄原胶、胶原、明胶、羧甲基淀粉、羧甲基葡聚糖、硫酸软骨素、阳离子瓜尔胶、阳离子淀粉及其组合。在某些实施方式中，生物材料选自海藻酸盐、完全或部分氧化分海藻酸盐及其组合。

本发明所述的支架可包括外表面。替代地或另外，所述支架可包括内表面。本发明所述的支架的外表面或内表面可以是实心的或多孔的。所述支架的孔径可以小于约10nm，约100nm至20μm，或大于20μm，例如直径高达并包括1000μm。例如，所述孔可以是纳米孔、微孔或大孔。例如，所述纳米孔的直径小于约10nm；微孔直径范围为约100nm至20μm；以及，所述大孔的直径大于约20μm，例如大于约50μm，例如大于约50μm，例如大于约100μm，例如大于约400μm，例如大于600μm或大于800μm。在一些实施方式中，孔径为约50μm至约80μm。

在一些实施方式中，本发明所述的支架组织成各种几何形状(例如圆盘、珠、丸)、壁龛、平面层(例如薄片)。例如，直径为约0.1-200毫米(例如5、10、20、40或50毫米)的盘可以皮下植入。盘可具有0.1至10毫米的厚度，例如1、2或5毫米。盘可以容易地被压缩或冻干以施用于患者。用于皮下给药的示例性盘具有以下尺寸：直径8毫米且厚度1毫米。

在一些实施方式中，所述支架可包括多个组件和/或隔室。在其他实施方式中，多隔室装置在体内通过将类似或不同掺杂的凝胶或其他支架材料的连续层施加到目标部位来组装。例如，装置是通过使用针将下一个内层依次注射到先前注射材料的中心从而形成同心球体来形成的。在某些实施方式中，非同心隔室通过将材料注入先前注入层中的不同位置来形成。多头注射装置并行且同时地挤出隔室。这些层由不同地掺杂有药物组合物的类似或不同生物材料制成。或者，隔室根据其亲水/疏水特性或每个隔室内的二次相互作用进行自组织。在其他实施方式中，多组分支架可选地构建在同心层中，每层具有不同的物理特性，例如聚合物的百分比、聚合物的交联百分比、水凝胶的化学组成、孔径、孔隙度和孔结构、刚度、韧性、延展性、黏弹性，掺入其中的生长因子、分化因子和/或归巢因子、和/或掺入其中的其他组合物。

水凝胶和冷冻凝胶支架

在某些实施方式中，本发明所述的支架包含一种或多种水凝胶。水凝胶是包含教练的局化合物链网络的聚合物凝胶。水凝胶通常是包含亲水聚合物链的组合物。水凝胶的网络结构使它们能够吸收大量的水。一些水凝胶是高度可拉伸和弹性的；其他的是粘弹性的。有时发现水凝胶是一种胶体凝胶，其中水是分散介质。在某些实施方式中，水凝胶是高吸收性的(它们可以含超过99％水(v/v))天然或合成聚合物，由于其显著水含量，其具有与天然组织非常相似的一定程度的灵活性。在某些实施方式中，水凝胶可具有这样的特性，即当施加适当的剪切应力时，可变形水凝胶被显著且可逆地压缩(高达其体积的95％)，从而产生可注射的大孔预成型支架。水凝胶已用于治疗应用，例如作为治疗剂(如小分子、细胞和生物制剂)体内递送的载体。水凝胶通常由多糖例如海藻酸盐制成。可以化学操作多糖以调节它们的性质和所得水凝胶的性质。

本发明的水凝胶可以是多孔的或无孔的。优选地，本发明所述的组合物由多孔水凝胶形成。例如，水凝胶可以是纳米多孔的，其中孔的直径小于约10nm；微孔，其中所述孔的直径优选地在约100nm至20μm的范围内；或大孔，其中孔的直径大于约20μm，更优选大于约100μm，甚至更优选大于约400μm。在某些实施方式中，水凝胶是大孔的，孔的直径为约50-80μm。在某些实施方式中，水凝胶是大孔的，具有直径为约400-500μm的对齐孔。制备多孔水凝胶的方法是本领域已知的。(参见例如美国专利号6,511,650，通过引用并入本文)。

水凝胶可由多种不同的刚性、半刚性、柔性、凝胶、自组装、液晶或流体组合物构成，例如肽聚合物、多糖、合唱聚合物、水凝胶材料、陶瓷(例如磷酸钙或羟磷灰石)、蛋白、糖蛋白、蛋白聚糖、金属和金属合金。使用本领域已知的方法将组合物组装成水凝胶，例如注射成型、预成型结构的冻干、打印、自组装、相转化、溶剂浇铸、熔融加工、发泡、纤维成型/加工、颗粒浸出或其组合。然后将组装好的装置植入或施用于待治疗个体的身体。

包含水凝胶的组合物可以以多种方式在体内组装。水凝胶由胶凝材料制成，以未凝胶的形式引入体内，在那里原位凝胶。将组合物的组分递送至发生组装的部位的示例性方法包括通过针或其他挤出工具注射、喷涂、打印或沉淀在组织部位的方法(例如使用通过套管插入的施用装置递送)。在一些实施方式中，未胶凝或未成形的水凝胶材料在引入体内之前或在其引入时与至少一种药物组合物混合。所得体内/原位组装装置例如水凝胶含有至少一种药物组合物的混合物。

水凝胶的原位组装可以作为聚合物的缔合或协同或化学催化聚合的结果而发生。协同或化学催化由组装位点处或附近的许多内源性因素或条件(例如体温、体内离子或pH值)引发，或操作员提供给组装位点的外源因素或条件(例如光子、热、电、声或在引入未胶凝材料后直接照射的其他辐射)引发。能量通过辐射束或通过热或光导体(例如电线或光缆或超声换能器)指向水凝胶材料。或者，使用剪切稀化材料例如两亲物，其在施加在其上的剪切力例如通过其通过针而被解除后重新交联。

在一些实施方式中，水凝胶可以离体组装。在一些实施方式中，水凝胶是可注射的。例如，水凝胶是在体外制成的大孔支架。注射到体内后，孔塌陷导致凝胶变得非常小并允许它穿过针头。参见例如WO2012/149358；和Bencherif等.,2012,Proc.Natl.Acad.Sci.USA109.48:19590-5，其内容通过引用并入本文)。

用于水凝胶装置的体内和离体组装的合适的水凝胶是本领域公知的，并且描述于例如Lee等.,2001,Chem.Rev.7:1869-1879。自组装组装的肽两亲方法描述于例如Hartgerink等.,2002,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:5133-5138。剪切稀化后可逆凝胶的方法在Lee等,2003,Adv.Mat.15:1828-1832中举例说明。

在某些实施方式中，示例性水凝胶由与包封材料相容的材料组成，所述材料包括聚合物、纳米颗粒、多肽和细胞。示例性水凝胶由海藻酸盐、聚乙二醇(PEG)、PEG-丙烯酸酯、琼脂糖、透明质酸或合成蛋白(例如胶原蛋白或工程化蛋白(即基于肽的自组装水凝胶))制成。例如，市售水凝胶包括BD^TM PuraMatrix^TM。BD^TM PuraMatrix^TM肽水凝胶是一种合成的基质，用于为细胞培养创造定义的三维(3D)微环境。

在一些实施方式中，水凝胶是生物相容聚合物基质，其整体或部分可生物降解。可形成水凝胶的材料的实施例包括海藻酸盐和海藻酸盐衍生物、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)聚合物、明胶、胶原蛋白、琼脂糖、透明质酸、透明质酸衍生物、天然和合成多糖、聚氨基酸例如多肽特别是聚(赖氨酸)、聚酯例如聚羟基丁酸酯和聚-ε-己内酯、聚酐；聚磷腈、聚乙烯醇、聚(环氧烷)特别是聚(环氧乙烷)、聚(烯丙胺)(PAM)、聚(丙烯酸酯)、改性苯乙烯聚合物例如聚(4-氨基甲基苯乙烯)、普朗尼克多元醇、聚氧杂、聚(糖醛酸)、聚(乙烯吡咯烷酮)及上述共聚物，包括接枝共聚物。也可以使用合成聚合物和天然存在的聚合物，例如但不限于胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸、琼脂糖和富含层粘连蛋白的凝胶。如在本文中所使用的，术语“衍生物”指通过化学反应从类似化合物衍生的化合物。例如，氧化海藻酸盐是海藻酸盐通过氧化反应而得的，是海藻酸盐的衍生物。

可植入组合物实际上可以具有任何规则或不规则形状，包括但不限于球体、立方体、多面体、棱柱体、圆柱体、杆、盘或其他几何形状。因此，在一些实施方式中，植入物为直径为约0.5至约10mm且长度约0.5至约10cm的圆柱形形式。优选地，其直径为约1至约5mm且其长度为约1至5cm。

在一些实施方式中，本发明所述的组合物是球形形式。当组合物是球形形式时，在一些实施方式中，其直径的范围为约0.5至约50mm。在一些实施方式中，球形植入物直径为约5至约30mm。在示例性实施方式中，直径为约10至约25mm。

在某些实施方式中，所述支架包含点击水凝胶或点击冷冻凝胶。点击水凝胶或冷冻凝胶是其中通过聚合物之间的点击反应促进水凝胶或冷冻凝胶聚合物之间的交联的凝胶。每个聚合物可包含一个或多个可用于点击反应的官能团。鉴于点击反应中官能团对的高度特异性，可以在通过点击化学形成水凝胶装置之前或同时将活性化合物添加到预制装置中。可用于形成点击水凝胶的点击反应的非限制性实施例包括铜I催化叠氮炔环加成反应、应变促进的同尺寸-炔环加成反应、硫醇烯光耦合、狄尔斯-阿尔德反应、反电子需求狄尔斯-阿尔德反应、四唑-烯烃光点击反应、肟反应、硫醇-迈克尔加成和醛-酰肼偶联。点击水凝胶的非限制性方面描述于Jiang等,2014,Biomaterials,35:4969-4985，其全部内容通过引用并入本文。

在各种实施方式中，利用点击海藻酸盐(参见例如2015年10月8日公开的PCT国际专利申请公开号WO 2015/154078，其全部内容通过引用并入本文)。

在某些实施方式中，水凝胶(例如冷冻凝胶)系统可以递送一种或多种药剂(例如生长因子例如BMP-2，和/或分化因子例如DLL-4，同时为细胞(例如，造血干细胞(HSC)浸润和运输等干细胞)创造空间。在一些实施方式中，根据本发明的水凝胶系统递送BMP-2，其充当造血干细胞(HSC)和/或造血祖细胞增强/募集因子，以及DLL-4作为分化因子，其促进造血干细胞和/或造血祖细胞的T细胞谱系专向分化。

在一些实施方式中，冷冻凝胶组合物(例如MA-海藻酸盐形成的冷冻凝胶组合物)可以通过创建局部壁龛(例如用于增强T谱系专向分化的特定壁龛)来充当递送平台。在一些实施方式中，冷冻凝胶创建局部壁龛，其中可以控制细胞(例如募集的干细胞或祖细胞)和本发明的各种示例性药剂(例如生长因子和/或分化因子)。在某些实施方式中，本发明的细胞和示例性药剂被定位在小体积中，并且可以在空间和时间上定量控制细胞和药剂的接触。

在某些实施方式中，水凝胶(例如冷冻凝胶)可以被设计为在空间和时间上协调生长因子和分化因子两者的递送，通过调整募集细胞(例如造血干细胞或祖细胞)的分化和/或专向分化，潜在地增强整体免疫调节性能。在某些实施方式中，所述细胞和生长因子/分化因子被定位在小体积中，并且可以定量控制因子在时间和空间上的递送。由于生长/分化因子是局部释放的，与全身递送药剂(例如生长因子)相比，预计很少有全身性影响。

制备冷冻凝胶或水凝胶的聚合物组合物的实施例在本公开全文中进行了描述，包括海藻酸盐、透明质酸、明胶、肝素、葡聚糖、角豆胶、PEG、PEG衍生物(包括PEG-co-PGA和PEG-肽缀合物)。该技术可用于任何生物相容性聚合物，例如胶原蛋白、壳聚糖、羧甲基纤维素、支链淀粉、聚乙烯醇(PVA)、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)(PHEMA)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)或聚(丙烯酸)(PAAc)。例如，在一个特定实施方式中，所述组合物包含基于海藻酸盐的水凝胶/冷冻凝胶。在另一个实施例中，所述支架包含基于明胶的水凝胶/冷冻凝胶。

冷冻凝胶是一类具有高度多孔互连结构的材料，其使用低温凝胶化(或冷冻凝胶化)技术生产。冷冻凝胶也具有高度多孔结构。通常，在冷冻凝胶的孔/璧结构冷冻形成之后，将活性化合物添加到冷冻凝胶装置中。冷冻凝胶的特征在于高孔隙率，例如至少约50、55、60、65、70、75、80、85、90或95％的孔，具有以高密度聚合物交联为特征的薄孔壁。如在本文中所使用的，术语“孔隙率”指孔体积与支架体积的百分比。所列举值的中间值和范围旨在是本发明的一部分。冷冻凝胶的璧通常致密且高度交联，使它们能够通过针头压缩到受试者体内，而不会产生永久性变形或显著结构损坏。

在各种实施方式中，孔壁包含至少约10、15、20、25、30、35或40％(w/v)聚合物。所列举值的中间值和范围旨在是本发明的一部分。在其他实施方式中，孔壁包含约10-40％聚合物。在一些实施方式中，使用约0.5-4％(w/v)的聚合物浓度(冷冻凝胶化之前)，并且该浓度在冷冻凝胶化完成后显著增加。冷冻凝胶凝胶化的非限制性方面和冷冻凝胶化后聚合物浓度的增加讨论于Beduer等,2015Advanced Healthcare Materials 4.2:301-312，其全部内容通过引用并入本文。

在某些实施方式中，冷冻凝胶化包括在拟冷冻反应溶液中进行聚合交联反应的技术。冷冻凝胶化技术的非限制性实施例描述于2014年8月14日公开的美国专利公开号20140227327，其全部内容通过引用并入本文。与通过相分离获得的常规大孔水凝胶相比，冷冻凝胶的一个优点是它们的高度可逆变形能力。冷冻凝胶可能非常柔软，但可以变形并重新形成形状。在某些实施方式中，冷冻凝胶可以非常坚韧，可以承受高度变形，例如伸长和扭转，还可以在机械力下挤压以排除其溶剂含量。所述海藻酸盐冷冻凝胶改善的变形性能源于反应系统未冷冻液体通道的高交联密度。

在冷冻凝胶化过程中，在大分子单体(例如甲基丙烯酸化海藻酸盐)溶液冷冻期间，大分子单体和引发剂系统(例如APS/TEMED)从冰晶之间的通道内的冰冻浓缩物中排出，因此反应仅在这些未冷冻的液体通道中发生。在聚合和冰融化后，产生一种多孔材料，其微观结构是形成的冰的负复型。冰晶充当致孔剂。所需的孔径部分是通过改变冷冻凝胶化过程的温度来实现的。例如，冷冻凝胶化过程通常在-20℃下快速冷冻溶液来进行。将温度降低至例如-80℃将导致更多的冰晶并导致更小的孔隙。在一些实施方式中，冷冻凝胶通过甲基丙烯酸化(MA-)-海藻酸盐和MA-PEG的低温聚合产生。在一些实施方式中，冷冻凝胶通过至少MA-海藻酸盐、生长因子、分化因子和MA-PEG的低温聚合产生。

在一些实施方式中，本发明的特征还在于明胶支架，例如明胶水凝胶，例如明胶冷冻凝胶，其是用于基于生物材料的治疗的细胞相应平台。明胶是通过部分水解从胶原蛋白中提取的多肽的混合物。这些明胶支架与其他类型的支架和水凝胶/冷冻凝胶相比具有明显的优势。例如，本发明的明胶支架支持细胞的附着、增殖和存活，并且被细胞降解，例如通过酶例如基质金属蛋白酶(MMPs)(例如重组基质金属蛋白酶-2和-9)的反应。

在某些实施方式中，当将预制明胶冷冻凝胶皮下注射到受试者(例如哺乳动物例如人、狗、猫、猪或马)时，会迅速恢复其大致原始形状(“形状记忆”)，并且在注射后几乎不会或不会引起有害的宿主免疫反应(例如免疫排斥)。

在一些实施方式中，水凝胶(例如冷冻凝胶)包含被改性的聚合物，例如聚合物分子上的位点被甲基丙烯酸基团(甲基丙烯酸酯(MA)或丙烯酸基团(丙烯酸酯)改性。示例性的改性水凝胶/冷冻凝胶是MA-海藻酸盐(甲基丙烯酸化海藻酸盐)或MA-明胶。在MA-海藻酸盐或MA-明胶的情况下，50％对应于海藻酸盐或明胶的甲基丙烯酸化程度。这意味着每隔一个重复单位包含一个甲基丙烯酸酯基团。甲基丙烯酸化的程度可以在约1％至约100％变化。优选地，甲基丙烯酸化的程度可以在约1％至约90％变化。

在某些实施方式中，聚合物也可以用丙烯酸酯基团而不是甲基丙烯酸酯基团进行改性。然后该产物被称为丙烯酸酯聚合物。大多数聚合物的甲基丙烯酸化(或丙烯酸化)程度可以不同。但是，一些聚合物(例如PEG)即使在100％化学改性下仍能保持其水溶性。交联后，聚合物通常达到接近完全甲基丙烯酸酯基团转化，表明交联率为约100％。如在本文中所使用的，术语“交联率”指与共价连接的大分子单体的百分比。例如，水凝胶中的聚合物是50-100％交联的(共价键)。交联程度与水凝胶的耐久性相关。因此，改性聚合物的高水平交联(90-100％)是期望的。

例如，高度交联的水凝胶/冷冻凝胶聚合物组合物的特征在于至少约50％聚合物交联(例如约75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％；旨在将所述值的中间值和范围作为本发明的一部分。)。高水平的交联赋予结构的机械稳健性。优选地，交联的百分比小于约100％。所述组合物是使用自由基聚合过程和冷冻凝胶化过程形成的。例如，冷冻凝胶是通过甲基丙烯酸化明胶、甲基丙烯酸化海藻酸盐或甲基丙烯酸化透明质酸的低温聚合形成的。在一些实施方式中，冷冻凝胶包含浓度约1.5％(w/v)或更低(例如约1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、1.1％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或更低；旨在将所述值的中间值和范围作为本发明的一部分。)的甲基丙烯酸化明胶大分子单体或甲基丙烯酸化海藻酸盐大分子单体。在一些实施方式中，甲基丙烯酸化明胶或海藻酸盐大分子单体浓度约1％(w/v)。

在某些实施方式中，冷冻凝胶包含至少约75％(v/v)孔，例如约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％(v/v)或更多的孔。所列举值的中间值和范围旨在是本发明的一部分。在一些实施方式中，孔是互联的。互联性对水凝胶和/或冷冻凝胶的功能很重要，因为没有互联性，水会被困在凝胶中。孔的互联性允许水(和其他组合物例如细胞和化合物)进出结构。在某些实施方式中，在完全水合状态下，水凝胶(例如冷冻凝胶)包含至少约90％水(水体积/支架体积)(例如，约90至99％，至少约92％、95％、97％、99％或更多)。例如，至少约90％(例如至少约92％、95％、97％、99％或更多)的冷冻凝胶体积由包含在孔中的液体(例如水)组成。所列举值的中间值和范围旨在是本发明的一部分。在某些实施方式中，在压缩或脱水的水凝胶中，不存在高达约50％、60％、70％的水，例如，冷冻凝胶包含小于约25％(例如约20％、15％、10％、5％或更少)水。

在某些实施方式中，本发明的冷冻凝胶包含大到足以让细胞通过的孔。例如，冷冻凝胶包含直径为约20-500μm的孔，例如约20-30μm，约30-150μm，约50-500μm，约50-450μm，约100-400μm，约200-500μm。在一些实施方式中，水合孔径为约1-500μm(例如约10-400μm，约20-300μm，约50-250μm)。在某些实施方式中，冷冻凝胶包含直径为约50-80μm的孔。

在一些实施方式中，可注射水凝胶或冷冻凝胶通过添加选自以下的官能团而进一步官能化：氨基、乙烯基、醛、硫醇、硅烷、羧基、叠氮化物或炔。或者或此外，冷冻凝胶通过添加另外的交联剂(例如多臂聚合物、盐、醛等)而进一步官能化。溶剂可以是水性的，特别是酸性或碱性的。水性溶剂可包括与水混溶的溶剂(例如甲醇、乙醇、DMF、DMSO、丙酮、二氧六环等)。

对于冷冻凝胶，低温交联可以在模具中发生并且冷冻凝胶(可注射)可以是可降解的。孔径可以通过使用的主要溶剂的选择、致孔剂的掺入、应用的冷冻温度和速率、交联条件(例如聚合物浓度)以及所用聚合物的类型和分子量来控制。冷冻凝胶的形状可以由模具决定，因此可以呈现制造商所需的任何形状，例如通过低温聚合制备各种尺寸和形状(圆盘、圆柱、正方形、线等)。

可以在微米级到厘米级制备可注射冷冻凝胶。示例性体积可以从几百μm³(例如约100-500μm³)至约10cm³不等。在某些实施方式中，示例性支架组合物尺寸为约100μm³至约100mm³。在各种实施方式中，所述支架尺寸为约10mm³至约100mm³。在某些实施方式中，所述支架的尺寸为约30mm³。

在一些实施方式中，冷冻凝胶被水合，装载有化合物并装载到注射器或其他递送装置中。例如，注射器被预填充并冷藏至使用。在另一个实施例中，冷冻凝胶被脱水，例如冻干，任选地用加载在凝胶中的化合物(例如生长因子或分化因子)并干燥或冷藏储存。施用之前，可以将装有冷冻凝胶的注射器或装置与含有待递送化合物的溶液接触。例如，冷冻凝胶预填充注射器的针筒填充有生理相容的溶液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)。或者，冷冻凝胶将施用至所需解剖部位，然后施用生理学相容的溶液，任选地含有其他成分，例如生长因子和/或分化因子或与一种或多种本文公开的化合物一起。然后将冷冻凝胶复水并在原位恢复其形状完整性。在某些实施方式中，冷冻凝胶放置后施用的PBS或其他生理溶液的体积通常是冷冻凝胶本身体积的10倍左右。

冷冻凝胶还具有以下优点：在压缩时，冷冻凝胶组合物保持结构完整性和形状记忆特性。例如，冷冻凝胶可通过中空针头注射。例如，冷冻凝胶在穿过针(例如16号(G)针)，例如具有1.65mm毫米内径)后恢复到其近似原始几何形状。其他示例性针尺寸是16号、18号、20号、22号、24号、26号、28号、30号、32号或34号针。可注射冷冻凝胶被设计为穿过中空结构，例如非常细的针，例如18-30号G针。在某些实施方式中，冷冻凝胶在通过针头的短时间内，例如小于约10秒、小于约5秒、小于约2秒或小于约1秒后恢复到期近似原始几何形状。

可以使用任何合适的注射装置将冷冻凝胶注射到受试者。例如，可以使用注射器通过针注射冷冻凝胶。注射器可以包括柱塞、针头和包含本发明的组合物。还可以使用导管、套管或支架将可注射冷冻凝胶注射到受试者。

可注射冷冻凝胶可模制成所需性质，呈棒状、方形、圆盘、球状、立方体、纤维状、泡沫。在一些情况下，冷冻凝胶呈圆盘、圆柱、正方形、矩形或线状。例如，冷冻凝胶组合物尺寸为约100μm³至10cm³，例如10mm³至约100mm³。例如，冷冻凝胶组合物直径为约1mm至约50mm(例如约5mm)。任选地，冷冻凝胶的厚度为约0.2mm至约50mm(例如约2mm)。

下面描述了三个示例性冷冻凝胶材料系统。

a)甲基丙烯酸化明胶冷冻凝胶(CryoGeIMA)-使用甲基丙烯酸化明胶的示例性冷冻凝胶，并且该结果描述于2014年8月14日公开的美国专利申请公开号2014-0227327，其全部内容通过引用并入本文)。

b)甲基丙烯酸化海藻酸盐冷冻凝胶(CryoMAAlginate)-使用甲基丙烯酸化海藻酸盐的示例性冷冻凝胶，并且该结果描述于2014年8月14日公开的美国专利申请公开号2014-0227327，其全部内容通过引用并入本文。

c)锂藻土纳米片的点击海藻酸盐冷冻凝胶(CryoClick)-基材为点击海藻酸盐(2015年10月8日公开的PCT国际专利申请号WO2015/154078，其全部内容通过引用并入本文)。在一些实施例中，基材包含锂藻土(用于许多消费品如化妆品的市售硅酸盐粘土)。锂藻土具有大表面积和高负电荷密度，这使其能够通过静电相互作用吸附各种蛋白和其他生物活性分子上的带正电荷部分，从而实现药物装载。当置于药物浓度较低的环境中时，吸附的药物会以持续方式从锂藻土中释放出来。与单独的基材相比，所述系统允许释放更灵活的各种药剂，例如生长因子。

本主题的各种实施方式包括包含成孔支架组合物的递送载体。例如，在将水凝胶注射到受试者中后，在水凝胶内原位形成孔(例如大孔)。通过周围水凝胶(块状水凝胶)内的牺牲致孔剂水凝胶的降解原位形成的孔促进细胞的募集和运输，以及本发明所述的任何组合物或药剂(例如生长因子(例如BMP-2)、分化因子或归巢因子或其任何组合)的释放。在一些实施方式中，所述牺牲致孔剂水凝胶、块状水凝胶或牺牲致孔剂水凝胶和本体水凝胶两者可以包含本发明所述的任何组合物或药剂，例如生长因子、分化因子和/或归巢因子或其任何组合。

在各种实施方式中，当所述成孔组合物存在于受体动物(例如哺乳动物受试者)的体内时，其随时间变成大孔。例如，所述成孔组合物可包含牺牲致孔剂水凝胶和块状水凝胶，其中所述牺牲致孔剂水凝胶比所述块状水凝胶降解快至少约10％(例如快至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％)。所列举值的中间值和范围旨在是本发明的一部分。所述牺牲致孔剂水凝胶可降解而在其位置留下大孔。在某些实施方式中，所述大孔是开放的互联大孔。在一些实施方式中，所述牺牲致孔剂水凝胶可比所述块状水凝胶降解得更快，因为所述牺牲致孔剂水凝胶(i)更易溶于水(包括较低的溶解度指数)，(ii)与蛋白酶介导的降解基序交联，描述于2005年6月2日出版的美国专利申请公开号2005-0119762(其全部内容通过引用并入本文)，(iii)包含与较长本体水凝胶聚合物相比降解更快的较短聚合物，(iv)被改性以使其比块状水凝胶更容易水解(例如通过氧化)，和/或(v)与块状水凝胶相比，更容易被酶降解。

在各种实施方式中，所述支架在聚合后装载(例如浸透)一种或多种活性化合物。在某些实施方式中，装置或支架聚合物形成材料在聚合之前与一种或多种活性化合物混合。在一些实施方式中，装置或支架聚合物形成材料在聚合之前与一种或多种活性化合物混合，然后在聚合后加载更多相同的或一种或多种另外的活性化合物。

在一些实施方式中，选择组合物或支架的孔径或总孔体积以影响化合物从装置或支架的释放。示例性孔隙率(例如纳米孔、微孔和大孔支架和装置)和总孔体积(例如约支架体积的5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95％或更多)在本文中描述。所列举值的中间值和范围旨在是本发明的一部分。增加的孔径和总孔体积增加了可以递送到组织中或组织附近的化合物的量，例如骨髓。在一些实施方式中，选择孔径或总孔体积以增加活性成分离开组合物或支架的速度。在各种实施方式中，可以将活性成分掺入水凝胶或冷冻凝胶的支架材料中，例如，与可从孔腔扩散的活性成分相比，以实现活性成分在更长时间内从指甲或装置中连续释放。

孔隙率影响细胞向装置和支架的募集以及物质从装置和支架的释放。孔可以是例如纳米孔、微孔或大孔。例如，纳米孔的直径小于约10nm。微孔的直径为约100nm至约20μm的范围内。大孔的直径大于约20μm(例如大于约100μm或大于约400μm)。示例性的大孔尺寸包括直径为约50μm、约100μm、约150μm、约200μm、约250μm、约300μm、约350μm、约400μm、约450μm、约500μm、约550μm和约600μm。所列举值的中间值和范围旨在是本发明的一部分。大孔的大小允许真核细胞进入或离开组合物。在一个实施例中，所述大孔组合物具有直径为约400μm至约500μm的孔。优选的孔径取决于应用。在某些实施方式中，孔具有约50μm至约80μm的直径。

在各种实施方式中，所述组合物在一个阶段制造，其中制造一层或隔室并用一种或多种化合物输注或涂覆。示例性的生物活性组合物包含多肽和多核苷酸。在某些实施方式中，所述组合物在两个或更多(3、4、5、6……10或更多)个阶段制造，其中制造一层或隔室并用一种或多种化合物输注或涂覆，然后构建第二、第三、第四或更多层，然后依次输注或涂覆一种或多种化合物。在一些实施方式中，每一层或隔室彼此相同或通过生物活性组合物的数量或混合物以及不同的化学、物理和生物学特性而彼此区分。通过控制分子量、降解速率和支架形成方法，可以为特定应用配制聚合物。偶联反应可用于将生物活性剂(例如分化因子)共价连接到聚合物骨架上。

在一些实施方式中，使用已知方法将一种或多种化合物添加到支架组合物，包括表面吸附、物理固定，例如使用相变将物质截留在支架材料中。例如，当支架组合物处于水相或液相时，将生长因子与支架组合物混合，并在环境条件(例如pH、温度、离子浓度)发生变化后，液体凝胶或凝固从而截留生物活性物质。在一些实施方式中，例如使用烷基化或酰化试剂的共价偶联用于提供化合物在支架上以定义的构象稳定、长期呈现。下表中提供了用于此类物质共价偶联的示例性试剂。

表1：肽/蛋白与聚合物共价偶联的方法

[a]EDC:l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐；

DCC:二环己基碳二亚胺

海藻酸盐支架

在某些实施方式中，本发明所述的组合物包含海藻酸盐水凝胶。所述海藻酸盐是多糖基聚合物，其可通过控制分子量、降解速率和支架形成方法来配制用于特定应用。所述海藻酸盐聚合物由两种不同的单体单元组成，(1-4)-连接的β-D-甘露糖醛酸(M单元)和αL-古洛糖醛酸(G单元)单体，其可以沿聚合物链按比例和顺序分布变化。所述海藻酸盐聚合物是聚电解质系统，其对二价阳离子(例如Ca⁺²、Mg⁺²、Ba⁺²)具有很强的亲和力，并在暴露于这些分子时形成稳定的水凝胶。参见Martinsen A.等,1989,Biotech.&Bioeng.,33:79-89)。例如，钙交联海藻酸盐水凝胶可用于牙科应用、伤口敷料、软骨细胞转移以及作为其他细胞类型的基质。不希望受理论束缚，应相信G单元优选地使用钙交联进行交联，而基于点击反应的交联对G单元或M单元更不加区分(即G和M单元两者都可以通过点击化学交联)。所述海藻酸盐水凝胶及其制造方法是本领域已知的。参见例如2017年5月4日公布的国际专利申请公开号WO2017/075055A1，其全部内容通过引用并入本文。

在本发明的上下文中有用的海藻酸盐聚合物可具有约20kDa至约500kDa的平均分子量，例如约20kDa至约40kDa、约30kDa至约70kDa、约50kDa至约150kDa、约130kDa至约300kDa、约230kDa至约400kDa、约300kDa至约450kDa、或约320kDa至约500kDa。在一个实施例中，可用于本发明的海藻酸盐聚合物可具有约32kDa的平均分子量。在另一个实施例中，可用于本发明的海藻酸盐聚合物可具有约265kDa的平均分子量。在一些实施方式中，海藻酸盐聚合物具有小于约1000kDa的分子量，例如小于约900kDa、小于约800kDa、小于约700kDa、小于约600kDa、小于约500kDa、小于约400kDa、小于约300kDa、小于约200kDa、小于约100kDa、小于约50kDa、小于约40kDa、小于约30kDa或小于约25kDa。在一些实施方式中，海藻酸盐聚合物具有约1000kDa的分子量，例如约900kDa、约800kDa、约700kDa、约600kDa、约500kDa、约400kDa、约300kDa、约200kDa、约100kDa、约50kDa、约40kDa、约30kDa、或约25kDa。在一个实施方式中，海藻酸盐聚合物的分子量是约20kDa。

偶联反应可用于共价连接生物活性剂(例如原子、化学基团、核苷、核苷酸、核碱基、糖、核酸、氨基酸、肽、多肽、蛋白或蛋白复合物)到聚合物主链。

术语“海藻酸盐”与术语“海藻酸盐聚合物”可互换使用，包括未改性的海藻酸盐或改性的海藻酸盐。改性的海藻酸盐包括但不限于氧化海藻酸盐(例如包含一种或多种海藻酸盐单体单元)和/或还原海藻酸盐(例如包含一种或多种海藻酸盐单体单元)。在一些实施方式中，氧化的海藻酸盐包括含有一个或多个醛基的海藻酸盐，或含有一个或多个羧酸根基团的海藻酸盐。在其他实施方式中，氧化的海藻酸盐包括高度氧化的海藻酸盐，例如含有一个或多个海藻酸盐单元。氧化的海藻酸盐还可包含相对少量的醛基(例如，少于15％，例如14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％醛基或氧化(以摩尔计))。所列举值的中间值和范围旨在是本发明的一部分。术语“海藻酸盐”或“海藻酸盐聚合物”还可以包括海藻酸盐，例如未改性的海藻酸盐、氧化的海藻酸盐或还原的海藻酸盐、或甲基丙烯酸化海藻酸盐或丙烯酸化海藻酸盐。所述海藻酸盐还可以指任何数量的藻酸衍生物(例如钙盐、钠盐或钾盐、或藻酸丙二醇酯)。参见例如WO1998012228A1，通过引用并入本文。

透明质酸

在某些实施方式中，本发明所述的组合物包含透明质酸水凝胶。透明质酸(HA；共轭碱透明质酸盐)是一种阴离子非硫酸化糖胺聚糖，广泛分布于结缔组织、上皮组织或神经组织。作为细胞外基质的主要成分之一，透明质酸对细胞增殖和迁移有显著贡献。天然透明质酸是关节软骨、肌肉结缔组织和皮肤的重要成分。

透明质酸是一种双糖聚合物，由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-葡萄糖胺组成，通过交替的β-(1→4)和β-(1→3)糖苷键连接。透明质酸的长度可以是25,000个双糖重复。透明质酸聚合物的大小范围为5,000至20,000,000Da。透明质酸也可以含有硅。

透明质酸在能量上是稳定的，部分原因是其成分二糖的立体化学。每个糖分子上的大体积基团处于空间有利的位置，而较小的氢则占据不太有利的轴向位置。

透明质酸可以通过被称为透明质酸酶的酶家族降解，透明质酸酶存在于许多哺乳动物中，例如人。透明质酸也可以通过非酶促反应降解。这些包括酸性和碱性水解、超声波分解、热分解和氧化剂降解。

由于其高生物相容性和其在组织的细胞外基质中的普遍存在，透明质酸可用于形成水凝胶，例如冷冻凝胶，作为组织工程研究中的生物材料支架。透明质酸水凝胶通过交联形成。透明质酸可以将水凝胶例如冷冻凝胶形成为所需形状以将治疗分子递送至宿主中。用于本组合物的透明质酸可以通过连接硫醇、甲基丙烯酸酯、十六烷基酰胺和酪胺而交联。透明质酸也可以直接与甲醛或二乙烯砜交联。

术语“透明质酸”包括未改性的透明质酸或改性的透明质酸。改性的透明质酸包括但不限于氧化的透明质酸和/或还原的透明质酸。术语“透明质酸”或“透明质酸聚合物”还可包括透明质酸，例如未改性的透明质酸、氧化的透明质酸或还原的透明质酸、或甲基丙烯酸化的透明质酸或丙烯酸化的透明质酸。透明质酸还指任何数量的透明质酸衍生物。

多孔和成孔支架

本发明所述的支架可以是无孔的或多孔的。在某些实施方式中，本发明所述的支架是多孔的。所述支架组合物的孔隙率影响细胞通过装置的迁移。孔可以是纳米孔、微孔或大孔。例如，纳米孔的直径小于约10nm。微孔的直径为约100nm至约20μm的范围内。大孔的直径大于约20μm(例如大于约100μm或大于约400μm)。示例性的大孔尺寸包括直径为约50μm、约100μm、约150μm、约200μm、约250μm、约300μm、约350μm、约400μm、约450μm、约500μm、约550μm和约600μm。所列举值的中间值和范围旨在是本发明的一部分。大孔的大小允许真核细胞进入或离开组合物。在某些实施方式中，所述大孔组合物具有直径为约400μm至约500μm的孔。可针对不同目的调整孔的大小。例如，对于细胞募集和细胞释放，孔径可能大于50μm。在某些实施方式中，所述大孔组合物具有直径为约50μm至约80μm的孔。

在一些实施方式中，所述支架在施用于受试者前含有孔。在一些实施方式中，所述支架包含成孔支架组合物。成孔支架及制备成孔支架的方法是本领域已知的。参见例如美国专利公开US2014/0079752A1，其全部内容通过引用并入本文。在某些实施方式中，成孔支架最初不是多孔的，而是随着时间在受体动物如哺乳动物受试者体内停留时变成大孔的。在某些实施方式中，成孔支架是水凝胶支架。孔可在不同时间形成，例如在施用即驻留在受试者体内约12小时后，或1、3、5、7或10天或更长时间后。

在某些实施方式中，成孔支架包含第一水凝胶和第二水凝胶，其中第一水凝胶比第二水凝胶降解快至少约10％(例如至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、快至少约2或快至少约5倍)。所列举值的中间值和范围旨在是本发明的一部分。在某些实施方式中，第一水凝胶包含降解而在其位置留下孔的致孔剂。例如，第一水凝胶是致孔剂并且在原位降解后所得的孔在初始致孔剂尺寸的25％以内，例如在初始致孔剂尺寸的20％以内、15％以内或10％以内。优选地，所得孔在初始致孔剂尺寸的5％以内。所列举值的中间值和范围旨在是本发明的一部分。由于它们的物理、化学和/或生物学特性的差异，第一水凝胶可能比第二水凝胶降解得更快。在某些实施方式中，第一水凝胶比第二水凝胶降解得更快，因为第一水凝胶更易溶于水(包括较低的溶解度指数)。在某些实施方式中，第一水凝胶降解得更快，因为它与蛋白酶介导的降解基序交联，如美国专利公开US2005/0119762A1中所述，其内容通过引用并入本文。

在某些实施方式中，用于形成第一水凝胶组合物(致孔剂)的聚合物的分子量为约50千道尔顿(kDa)，以及用于形成第二水凝胶组合物(块状)的聚合物的分子量为约250kDa。与较长的聚合物(例如块状组合物的聚合物)相比，较短的聚合物(例如致孔剂的聚合物)降解得更快。在某些实施方式中，由于糖基团的存在(例如，海藻酸盐组合物的约3-10％糖)，组合物被改性以使其更可水解降解。在某些实施方式中，致孔剂水凝胶经化学改性例如氧化使其更易于降解。在一些实施方式中，与块状水凝胶相比，致孔剂水凝胶更容易被酶降解。复合物(第一和第二水凝胶)组合物对体液是可渗透的，例如包含暴露于组合物并降解致孔剂水凝胶的酶。在一些实施方式中，第二水凝胶在第一水凝胶周围交联，即致孔剂(第一水凝胶)完全物理地包埋在块状(第二)水凝胶中。

本文公开的点击试剂可以提供在块状水凝胶或致孔剂水凝胶中。在示例性实施方式中，点击试剂例如聚合物和纳米颗粒提供在块状水凝胶中。

在某些实施方式中，形成水凝胶微珠(“致孔剂”)。致孔剂被包封在“块状”水凝胶中，与致孔剂相比，该水凝胶不可降解或降解速度较慢。在水凝胶形成或注射到体内所需部位后，复合材料立即缺乏孔。随后，致孔剂降解导致原位形成孔。孔的大小和分布在致孔剂形成期间受控，并与形成的块状水凝胶的聚合物混合。

在一些实施方式中，用于成孔支架的聚合物是天然存在或合成的。在一个实施例中，致孔剂和块状水凝胶两者均由海藻酸盐形成。

在某些实施方式中，适用于致孔剂形成的海藻酸盐聚合物具有5,000至500,000道尔顿的分子量。聚合物任选地进一步改性(例如通过用高碘酸钠氧化)(Bouhadir等.,2001,Biotech.Prog.17:945-950，其通过引用并入本文)以促进快速降解。在某些实施方式中，聚合物通过带有同轴气流的喷雾器挤出到二价阳离子(例如Ca²⁺或Ba²⁺)浴中而交联以形成水凝胶微珠。较高气流速率导致较低的致孔剂直径。

在一些实施方式中，致孔剂水凝胶微珠含有氧化海藻酸盐。例如，致孔剂水凝胶可包含约1-50％(w/v)氧化海藻酸盐。在示例性实施方式中，致孔剂水凝胶可包含约1-10％(w/v)氧化海藻酸盐。在一个实施方式中，致孔剂水凝胶可包含约7.5％氧化海藻酸盐。

在某些实施方式中，用于形成致孔剂的二钾离子的浓度可以在约5至约500mM变化，并且聚合物的浓度为约1％至约5％(重量/体积)。然而，任何产生显著小于体相的致孔剂的方法都是合适的。可以进一步操作致孔剂化学以产生与宿主蛋白和/或细胞的相互作用或抑制与宿主蛋白和/或细胞相互作用的致孔剂。

适用于形成块状水凝胶的海藻酸盐聚合物具有约5,000至约500,000Da的分子量。聚合物可以进一步改性(例如通过用高碘酸钠氧化)以促进降级，只要块状水凝胶比致孔剂降解更慢。聚合物也可以被改性以呈现控制细胞响应的生物学线索(例如整合素结合粘附肽，例如RGD)。致孔剂或块状水凝胶也可以包封生物活性因子，例如寡核苷酸、生长因子或药物以进一步控制细胞响应。用于形成块状水凝胶的二价离子的浓度可在约5至约500mM变化，并且聚合物的浓度为约1％至约5％(重量/体积)。块状聚合物的弹性模块根据其目的进行调整，例如以募集干细胞或祖细胞。

与产生本文所述的水凝胶相关的方法包括如下。Bouhadir等,1999,Polymer,40:3575-84(通过引用整体并入本文)描述了用高碘酸钠氧化海藻酸盐，并表征了该反应。Bouhadir等,2001,Biotechnol.Prog.,17:945-50(通过引用整体并入本文)描述了高分子量海藻酸盐氧化形成海藻酸醛(海藻酸二醛是高分子量(M_w)海藻酸盐，其中海藻酸盐中一定百分比，例如5％的糖被氧化形成醛)，以及使水凝胶快速降解的应用。Kong等,2002,Polymer,43:6239-46(通过引用整体并入本文)描述了使用伽马辐射以降低富含古洛糖醛酸(GA)的海藻酸盐的重均分子量(M_w)，而不会显著降低GA含量(例如，伽马辐射选择性地攻击甘露糖醛酸、海藻酸盐的MA嵌段)。所述海藻酸盐由GA嵌段和MA嵌段构成，其正是GA嵌段赋予海藻酸盐刚性(弹性模块)。Kong等,2002,Polymer,43:6239-46(通过引用整体并入本文)显示了高分子量、富含GA的海藻酸盐与辐射的、低分子量、高GA海藻酸盐与钙交联形成刚性水凝胶的二元组合，但与由相同总重量浓度仅高分子量制成的水凝胶相比，其降解速度更快且溶液粘度更低、富含GA海藻酸盐。Alsberg等,2003,J Dent Res,82(11):903-8(通过引用整体并入本文)描述了由辐射、低分子量、富含GA海藻酸盐制成的水凝胶的降解曲线，在骨组织工程中的应用。Kong等,2004,Adv.Mater,16(21):1917-21(通过引用整体并入本文)描述了通过将伽马辐射程序与氧化反应相结合来控制水凝胶降解曲线，并应用于软骨工程。

控制氢生物材料降解的技术是本领域公知的。例如Lutolf MP等,2003,NatBiotechnol.,21:513-8(通过引用整体并入本文)描述了基于聚(乙二醇)的材料，它们被工程化为通过哺乳动物酶(MMP)进行降解。Bryant SJ等,2007,Biomaterials,28(19):2978-86(US 7,192,693B2；通过引用整体并入本文)描述了一种生产具有宏观孔隙的水凝胶的方法。孔模板(例如聚甲基丙烯酸甲酯珠)包封在块状水凝胶中，然后使用丙酮和甲醇提取致孔剂同时保持块状水凝胶完整。Silva等,2008,Proc.Natl.Acad.Sci USA,105(38):14347-52(通过引用整体并入本文；US 2008/0044900)描述了从海藻酸盐海绵中部署内皮祖细胞。海绵是通过形成海藻酸盐水凝胶然后冷冻干燥制成的(冰晶形成孔)。Ali等,2009,NatMater(通过引用整体并入本文)描述了多孔支架的使用以募集树突细胞并对它们进行编辑以引发抗肿瘤反应。Huebsch等,2010,Nat Mater,9:518-26(通过引用整体并入本文)描述了水凝胶弹性模具的使用以控制包封间充质干细胞的分化。

在一些实施方式中，所述支架组合物包含开放的互联大孔。或者或另外，所述支架组合物包含成孔支架组合物。在某些实施方式中，成孔支架组合物可包含牺牲致孔剂水凝胶和块状水凝胶，其中成孔支架组合物没有大孔。例如，在将所述成孔支架施用于受试者后，牺牲致孔剂水凝胶比留下大孔的块状水凝胶降解快至少10％。在一些实施方式中，所述牺牲致孔剂水凝胶呈降解形成所述大孔的致孔剂形式。例如，所述大孔可包括直径为例如约10-400μm的孔。

生长因子

本发明的组合物可包含生长因子。如在本文中所使用的术语“生长因子”指能够刺激细胞生长、增殖、愈合和/或细胞分化的药剂。在某些实施方式中，所述生长因子是多肽。生长因子多肽通常充当信号分子。在某些实施方式中，所述生长因子多肽是细胞因子。

在某些实施方式中，在向受试者施用组合物后，生长因子可以募集细胞至支架。募集细胞是自体的。例如，所述募集细胞可以是来自受试者的基质细胞。在某些实施方式中，自体细胞可以是受试者的干细胞(例如脐带干细胞)。募集细胞也可以是同基因的、同种异基因的或异种的。如在本文中所使用的术语“同基因”指遗传相同、或足够相同且免疫相容以允许移植。例如，同基因细胞可包括从同卵双胞胎获得的移植细胞。如在本文中所使用的术语“同种异基因”指虽然来自同一物种的个体但在遗传上不同的细胞。如在本文中所使用的术语“异种”指衍生自不同物种并因此遗传上不同的细胞。

例如，所述募集细胞可以是移植中的供体细胞。在某些实施方式中，所述移植是造血干细胞移植(HSCT)。如在本文中所使用的，HSCT指多能造血干细胞或造血祖细胞的移植，通常衍生自骨髓、外周血或脐带血。HSCT可以是自体的(使用患者自己的干细胞或祖细胞)、同种异基因的(干细胞或祖细胞来自供体)、同基因的(来自同卵双胞胎)或异体的(来自不同物种)。

本发明的生长因子可以在所施用的组合物内或周围诱导组织或器官的形成。在某些实施方式中，所述组织或所述器官是骨组织或造血组织。组织形成可局限于组合物的支架。

掺入多肽(例如生长因子多肽)的方法是本领域已知的。参见美国专利号8,728,456；8,067,237和10,045,947；美国专利公开号US20140079752；国际专利公开号WO2017/136837；在此通过引用整体并入。可以控制生长因子多肽的释放。多肽(例如生长因子多肽)的控释方法是本领域已知的。参见美国专利号8,728,456；8,067,237；10,045,946，通过引用整体并入。在某些实施方式中，所述生长因子(例如BMP-2)可在延长的时间段内释放，例如7-30天或更长。生长因子的控释可能影响支架内组织或器官形成的时间。在某些实施例中，生长因子的释放受到控制，目的是在皮下注射本发明的组合物后一周或两周内产生功能性、活性骨结节或组织。

在某些实施方式中，所述生长因子在延长的时间段内保持其生物活性。如在本文中所使用的术语“生物活性”指例如生长因子的药剂的有益或不良反应。生长因子的生物活性可以通过任何合适的方式测量。例如，BMP-2的生物活性可以通过其诱导骨结节或组织形成和/或募集细胞至支架中的能力来测量。在某些实施例中，在将生物因子掺入支架后，生长因子保持其生物活性至少10天、12天、14天、20天或30天。

示例性生长因子包含但不限于骨形态发生蛋白(BMP)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子β(TGF-β)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、神经生长因子(NGF)、神经营养因子、血小板源生长因子(PDGF)、促红细胞生成素(EPO)、促血小板生成素(TPO)、肌生成抑制蛋白(GDF-8)、生长分化因子-9(GDF9)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF或FGF-1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF或FGF-2)、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素生长因子(IGF)和白介素。

在一些实施方式中，所述生长因子包含属于转化生长因子蛋白β(TGF-β)超家族的蛋白。如在本文中所使用的，TGF-β超家族是一大组结构相关的细胞调节蛋白。TGF-β超家族包括四个主要亚家族：TGF-β亚家族、骨形态发生蛋白和生长分化因子、激活和抑制亚家族、以及一个包含各种不同成员的亚家族。来自TGF-β亚家族的蛋白作为同二聚体或异二聚体具有活性，两条链通过一个二硫键连接。TGF-β亚家族蛋白与细胞表面丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶受体的保守家族相互作用，并使用称为SMAD的保守蛋白家族产生细胞内信号。TGF-β亚家族蛋白在生长、发育、组织稳态和免疫调节等基本生物过程的调控中发挥重要作用。

示例性TGF-β亚家族蛋白包括但不限于AMH、ARTN、BMP10、BMP15、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8A、GDF1、GDF10、GDF11、GDF15、GDF2、GDF3、GDF3A、GDF5、GDF6、GDF7、GDF8、GDF9、GDNF、INHA、INHBA、INHBB、INHBC、INHBE、LEFTY1、LEFTY2、MSTN、NODAL、NRTN、PSPN、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3和TGF-β4。在一个特定的实施方式中，所述生长因子是BMP2.

在某个实施方式中，所述生长因子包含骨形态发生蛋白(BMP)。如在本文中所使用的，BMP是术语也称为细胞因子和代谢原的一组生长因子的蛋白。BMP可以诱导骨骼和软骨的形成，并构成一组重要的形态发生信号，协调整个身体的组织结构。BMP信号缺失或缺乏可能是疾病或病症的重要因素。

在某些实施方式中，BMP选自BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-12、BMP-14及其任何组合。在某些实施方式中，BMP是BMP-2。BMP-2在骨骼和软骨的发育中起重要作用。BMP-2可有效诱导多种细胞类型的成骨细胞分化。

在某些实施方式中，所述生长因子包含TGF-β亚家族蛋白。如在本文中所使用的，TGF-β亚家族蛋白或TGF-β是一种多功能细胞因子，包括四种不同亚型(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3和TGF-β4)。激活的TGF-β与其他因子复合以形成丝氨酸/苏氨酸激酶复合物，与TGF-β受体结合，由1型和2型受体亚基组成。与TGF-β结合后，2型受体激酶磷酸化并激活1型受体激酶，从而激活信号级联反应。这导致不同下游底物和调节蛋白的激活，诱导不同靶基因的转录，这些靶基因在许多免疫细胞的分化、趋化、增殖和激活中起作用。

在某些实施方式中，所述生长因子包含TGF-β1。TGF-β1在CD4+T细胞诱导具有调节性功能的Treg(iTreg)和分泌促炎细胞因子的T_h17细胞中均发挥作用。TGF-β1单独沉淀Foxp3的表达和激活的T辅助细胞分化的Treg。

生长因子(例如BMP-2或TGF-β1)可以从内源性来源分离或体外或体内合成。内源性生长因子多肽可以从健康人组织中分离。合成的生长因子多肽在模板DNA转染或转化到宿主器官或细胞(例如哺乳动物或人细胞系)后，在体内合成。或者，合成的生长因子多肽是通过无细胞翻译或其他领域公认的方法(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY,Vol.1,2,3(1989)，其通过引用并入本文)在体外合成的。

在某些实施方式中，所述生长因子(例如BMP-2或TGF-β1)多肽是重组的。在一些实施方式中，所述生长因子多肽是哺乳动物生长因子多肽的人源化衍生物。衍生生长因子多肽的示例性哺乳动物物种包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、雪貂、猫、狗、猴或灵长类动物。在一些实施方式中，所述生长因子是重组人蛋白。在一些实施方式中，所述生长因子是重组鼠(小鼠)蛋白。在一些实施方式中，所述生长因子是重组小鼠蛋白的人源化衍生物。

在某些实施方式中，修饰生长因子多肽以增加体内蛋白稳定性。在某些实施方式中，所述生长因子多肽可以工程化以更多或更少具有免疫原性。术语“免疫原性的”和“免疫原性”指特定物质(例如蛋白、抗原或表位)在人或其他动物体内引发免疫反应的能力。

在某些实施方式中，所述生长因子可以以每个支架约0.001nmol至约1000nmol、或每个支架0.001至约100nmol、或每个支架约0.001nmol至约1nmol存在。

在一些实施方式中，所述生长因子可以以每个支架约1ng至1000微克的量存在。例如，生长因子可以以约1μg至约1000μg、约1μg至约500μg、约1μg至约200μg、约1μg至约100μg、约1μg至约50μg或约1μg至约10μg的量存在。

在某些实施方式中，本发明所述的组合物包含纳克量的生长因子(例如约1ng至约1000ng的BMP-2)。例如，生长因子可以以约5ng至约500ng、约5ng至约250ng、约5ng至约200ng、约10ng至约200ng、约50ng至约200ng、约100ng至约200ng和约200ng的量存在。纳克量的生长因子也以受控方式释放。与使用高剂量生长因子并具有次优释放动力学的的其他递送系统相比，纳克量的生长因子和/或控释可有助于降低本发明的组合物和方法的毒性。

在各种实施方式中，所述支架中存在的生长因子的量可根据支架的尺寸而变化。例如，生长因子可以以约0.03ng/mm³(生长因子的量与支架体积的重量比)至约350ng/mm³存在，例如约0.1ng/mm³至约300ng/mm³、约0.5ng/mm³至约250ng/mm³、约1ng/mm³至约200ng/mm³、约2ng/mm³至约150ng/mm³、约3ng/mm³至约100ng/mm³、约4ng/mm³至约50ng/mm³、约5ng/mm³至约25ng/mm³、约6ng/mm³至约10ng/mm³或约6.5ng/mm³至约7.0ng/mm³。

在一些实施方式中，所述生长因子的量以约300ng/mm³至约350μg/mm³的量存在，例如约400ng/mm³至约300μg/mm³、约500ng/mm³至约200μg/mm³、约1μg/mm³至约100μg/mm³、约5μg/mm³至约50μg/mm³、约10μg/mm³至约25μg/mm³。

分化因子

本发明的组合物可包含分化因子。如在本文中所使用的，所述分化因子是可诱导细胞例如募集细胞的分化的药剂。在某些实施方式中，所述分化因子是多肽。如在本文中所使用的，“分化”、“细胞分化”、“细胞分化”或其他类似术语是指细胞从一种细胞类型变为另一种细胞类型的过程。在某些实施方式中，所述细胞变为更特化的类型，例如从干细胞或祖细胞变为T细胞祖细胞。分化在多细胞生物的发育过程中发生多次，因为它从简单的受精卵变为复杂的组织和细胞类型系统。随着成体干细胞在组织修复和正常细胞更新过程中分裂并产生完全分化的子细胞，分化会在成年期继续进行。分化可以改变细胞大小、形态、膜电位、代谢活性和对信号的响应。这些变化可能是由于基因表达的高度受控修改。

在分裂细胞中，存在多个水平的细胞效力，即细胞分化成其他细胞类型的能力。更强的效力表明可以衍生出更多的细胞类型。可以分化为所有细胞类型的细胞(包括胎盘组织)被称为全能细胞。可以分化为成年生物体的所有细胞类型的细胞被称为多能细胞。在哺乳动物例如人中，多能细胞可以包括胚胎干细胞和成体多能细胞。诱导多能干细胞(iPS)可以通过某些转录因子例如Oct4、Sox2、c-Myc和KIF4的诱导表达由成纤维细胞产生。多能细胞是一种可以分化为多种不同但密切相关的细胞类型的细胞。寡能细胞比多能细胞受到更多限制，但仍可分化为一些密切相关的细胞类型。最终，单能细胞只能分化为一种细胞类型，但能自我更新。

在某些实施方式中，本发明的分化因子诱导干细胞或祖细胞分化为T细胞祖细胞。如在本文中所使用的，术语“T细胞祖细胞”指最终可分化为T淋巴细胞(T细胞)的祖细胞。如在本文中所使用的，术语“淋巴细胞”指脊椎动物(例如人类)免疫系统中的一种白细胞亚型。淋巴细胞包括自然杀伤细胞、T细胞和B细胞。淋巴细胞在造血过程中起源于一个共同的淋巴祖细胞，在这个过程中，所述干细胞分化为不同的淋巴细胞类型之前，在骨髓内分化为多种血细胞。

在一些实施方式中，所述T细胞祖细胞包括共同淋巴祖细胞。如在本文中所使用的，术语“共同淋巴祖细胞”指最早的淋巴祖细胞，其产生淋巴细胞，包括T谱系细胞、B谱系细胞和自然杀伤(NK)细胞。在各种实施方式中，所述T细胞族系报包括T细胞感受态共同淋巴祖细胞。如在本文中所使用的，术语“T细胞感受态共同淋巴祖细胞”指分化为T谱系祖细胞的共同淋巴祖细胞。T细胞感受态共同淋巴祖细胞通常以缺乏生物标记物Ly6D为特征。本发明的组合物可以产生模拟骨髓的重要特征并诱导干细胞或祖细胞分化为T细胞祖细胞的异位生态位。

在某些实施方式中，所述淋巴细胞包括T细胞。在一些实施方式中，所述T细胞是初始T细胞。如在本文中所使用的，初始T细胞是已在骨髓中分化的T细胞。初始T细胞可包括CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞和调节性T细胞(T_reg)。

在某些实施方式中，所述分化因子诱导募集细胞分化为T细胞祖细胞。在某些实施方式中，所述分化因子通过Notch信号传导通路诱导募集细胞分化为T细胞祖细胞。Notch信号传导通路是一种高度保守的细胞信号传导系统，存在于许多多细胞生物中。哺乳动物拥有四种不同的Notch受体，称为Notch1、Notch2、Notch3和Notch4。Notch信号传导在T细胞谱系从共同淋巴祖细胞分化中起重要作用。在某些实施方式中，所述分化因子与一种或多种Notch受体结合并激活Notch信号传导通路。在某些实施方式中，所述分化因子选自δ样1(DLL-1)、δ样2(DLL-2)、δ样3(DLL-3)、δ样4(DLL-4)、Jagged 1、Jagged2及其任何组合。在某些实施方式中，所述分化因子与一种或多种Notch受体的结合激活Notch信号传导通路并诱导T细胞谱系分化。

在某些实施方式中，所述分化因子是δ样4(DLL-4)。DLL-4是果蝇Delta蛋白的同源物。Delta蛋白家族包括Notch配体，其特征在于DSL结构域、EGF重复序列和跨膜结构域。

在某些实施方式中，所述分化因子多肽是从内源性来源分离或在体内或体外合成的。内源分化因子多肽可以从健康人组织中分离。合成的分化因子多肽在模板DNA转染或转化到宿主生物体或细胞(例如哺乳动物或培养的人细胞系)后，在体内合成。或者，合成的分化因子多肽通过无细胞翻译或其他领域公认的方法(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring HarborLaboratory Press,NY,Vol.1,2,3(1989)，其通过引用并入本文)在体外合成的。

在某些实施方式中，所述分化因子多肽可以是重组的。在一些实施方式中，所述分化因子多肽是哺乳动物分化因子多肽的人源化衍生物。衍生分化因子多肽的示例性哺乳动物物种包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、雪貂、猫、狗、猴或灵长类动物。在一些实施方式中，所述分化因子是重组人蛋白。在一些实施方式中，所述分化因子是重组鼠(小鼠)蛋白。在一些实施方式中，所述分化因子是重组小鼠蛋白的人源化衍生物。

在某些实施方式中，修饰分化因子多肽以实现所需的活性，例如增加体内蛋白稳定性。在某些实施方式中，所述分化因子多肽可以工程化以更多或更少具有免疫原性。

在某些实施方式中，所述分化因子(例如DLL-4)可以与本发明所述的支架共价连接。例如，不是从支架材料中释放，所述分化因子可以共价结合到局化合物主链并保留在组合物内，所述组合物在组合物植入受试者后形成。通过将分化因子与支架材料共价结合或偶联，这种分化因子将保留在向受试者施用组合物后形成的支架内，因此可用于促进肝细胞或祖细胞的分化，如本文所考虑的。在某些实施方式中，所述分化因子利用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)化学偶联至支架材料。可以使用本领域已知的共价结合或偶联分化因子的任何方法并不受限制。参见“Bioconjugate Techniques Bioconjugate Techniques(Third Addition)”,GregT.Hermanson,Academic,Greg T.Hermanson,Academic Press,2013Press,2013。在一些实施方式中，所述分化因子利用点击化学与所述支架共价连接。共价结合或偶联分化因子的方法包括但不限于亲和素-生物素反应、叠氮化物和二苯并环辛炔化学、四嗪和反式环辛烯化学、四嗪和降冰片烯化学、或二硫键。

在某些实施方式中，本发明的分化因子(例如DLL-4)还包含系链(例如，PEG、PEG_2k)和甲基丙烯酸酯基团(MA)。在某些实施方式中，所述分化因子是甲基丙烯酸酯化的DLL-4-PEG_2k。

在某些实施方式中，共价连接将分化因子保留在支架内以向支架中募集细胞提供分化信号。例如，在支架外检测到小于1％的总分化因子。分化因子的生物活性可保持较长时间，例如在掺入支架后至少三个月。分化因子的生物活性可以通过任何合适的方法测量，例如DLL-4的比色测定。

在某些实施方式中，所述分化因子以每个支架约0.01nmol至约1000nmol、约0.1nmol至约100nmol、或约1nmol至约10nmol存在。

在一些实施方式中，所述分化因子以每个支架约1ng至约1000μg的量存在。例如，所述分化因子可以以约10ng至约500μg、约50ng至约250μg、约100ng至约200μg、约1μg至约100μg、约1μg至约50μg、约1μg至约25μg、约1μg至约10μg、约2μg至约10μg或约6μg的量存在。

在各种实施方式中，存在于支架的分化因子的量可根据支架的尺寸而变化。例如，所述分化因子可以以约0.03ng/mm³(分化因子的量与支架体积的重量比)至约350μg/mm³存在，例如约0.1ng/mm³至约300μg/mm³、约1ng/mm³至约250μg/mm³、约10ng/mm³至约200μg/mm³、约0.1μg/mm³至约100μg/mm³、约0.1μg/mm³至约50μg/mm³、约0.1μg/mm³至约20μg/mm³、约0.1μg/mm³至约10μg/mm³、约0.1μg/mm³至约5μg/mm³、约0.1μg/mm³至约1μg/mm³、约0.1μg/mm³至约0.5μg/mm³、或约0.2μg/mm³。

在某些实施方式中，DLL-4以每个支架约6μg存在。

归巢因子

在某些实施方式中，本发明所述的组合物还包含归巢因子。如在本文中所使用的，术语“归巢因子”指能够诱导细胞例如干细胞或祖细胞定向运动的药剂。在某些实施方式中，本发明的归巢因子是可在附近响应细胞中诱导定向趋化性的信号蛋白。在各种实施方式中，所述归巢因子是细胞因子和/或趋化因子。

在某些实施方式中，在本发明的组合物中的这种归巢因子促进细胞(例如移植的干细胞和/或祖细胞)归巢至施用于受试者的支架组合物。在某些方面，这种归巢因子促进细胞(例如移植的干细胞或祖细胞)向施用于受试者的支架组合物的浸润。在一些实施方式中，所述归巢因子包括基质细胞衍生因子(SDF-1)。在某些实施方式中，所述归巢因子包封在材料中。在某些实施方式中，所述归巢因子在延长的时间段内(例如7-30天或更长，约17-18天)从材料中释放。

在某些实施方式中，所述归巢因子在延长的时间段内保持其生物活性。生长因子的生物活性可以通过任何合适的方式测量。在某些实施例中，在将归巢因子掺入支架后，归巢因子保持其生物活性至少10天、12天、14天、20天或30天。

在一些实施方式中，所述归巢因子以每个支架约0.01nmol至约1000nmol、约0.1nmol至约100nmol、或约1nmol至约10nmol存在。

在一些实施方式中，所述归巢因子以每个支架约1ng至约1000μg的量存在。例如，归巢因子可以以约10ng至约500μg、约50ng至约250μg、约100ng至约200μg、约1μg至约100μg、约1μg至约50μg、约1μg至约25μg、约1μg至约10μg、约2μg至约10μg或约6μg的量存在。

在各种实施方式中，存在于支架的分化因子的量可根据支架的尺寸而变化。例如，所述分化因子可以以约0.03ng/mm³(分化因子的量与支架体积的重量比)至约350μg/mm³存在，例如约0.1ng/mm³至约300μg/mm³、约1ng/mm³至约250μg/mm³、约10ng/mm³至约200μg/mm³、约0.1μg/mm³至约100μg/mm³、约0.1μg/mm³至约50μg/mm³、约0.1μg/mm³至约20μg/mm³、约0.1μg/mm³至约10μg/mm³、约0.1μg/mm³至约5μg/mm³、约0.1μg/mm³至约1μg/mm³、约0.1μg/mm³至约0.5μg/mm³、或约0.2μg/mm³。

示例性支架组合物

本发明提供了用于调节受试者中免疫系统的支架组合物。本发明的组合物包含多孔支架；生长因子，其以有效诱导组织或器官在所述支架内形成并将细胞募集到所述支架中的量存在；和诱导募集细胞分化为T细胞祖细胞的分化因子。

一方面，本发明提供了一种用于调节受试者中免疫系统的组合物，其包括多孔支架；生长因子，其以每个支架约1ng至约1000μg存在，并且以有效诱导组织或器官在所述支架内形成并将细胞募集到所述支架内的量存在；和诱导募集细胞分化为T细胞祖细胞的分化因子。例如，生长因子可以以约1μg至约500μg、约1μg至约200μg、约1μg至约100μg、约1μg至约50μg或约1μg至约10μg的量存在。

另一方面，本发明提供了一种用于调节受试者中免疫系统的组合物，其包括多孔支架；生长因子，其以每个支架约1ng至约1000ng存在，并且以有效诱导组织或器官在所述支架内形成并将细胞募集到所述支架内的量存在；和诱导募集细胞分化为T细胞祖细胞的分化因子。在更具体的实施方式中，所述生长因子以约5ng至约500ng、约5ng至约250ng、约5ng至约200ng、或约200ng的量存在。

在又一方面，本发明涉及一种用于调节受试者中免疫系统的组合物，包括多孔支架；生长因子，其以约0.03ng/mm³至约350ng/mm³的支架体积存在，并且以有效诱导组织或器官在所述支架内形成并将细胞募集到所述支架内的量存在；和诱导募集细胞分化为T细胞祖细胞的分化因子。在各种实施方式中，所述生长因子可以以约0.1ng/mm³至约300ng/mm³、约0.5ng/mm³至约250ng/mm³、约1ng/mm³至约200ng/mm³、约2ng/mm³至约150ng/mm³、约3ng/mm³至约100ng/mm³、约4ng/mm³至约50ng/mm³、约5ng/mm³至约25ng/mm³、约6ng/mm³至约10ng/mm³、或约约6.5ng/mm³至约7.0ng/mm³存在。

组合物可以设计为以受控方式释放生长因子。生长因子和/控释的量减少提供了优于现有技术的优点，例如与使用高水平生长因子例如BMP-2和次优释放动力学相关的毒性降低。

在各种实施方式中，所述生长因子是骨形态发生蛋白，例如BMP-2、BMP-4、BMP-7、BMP-12、BMP-14或其任意组合。在一些实施方式中，所述生长因子是BMP-2。在某些实施方式中，所述生长因子是TGF-β，例如TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或其任意组合。在一个特定的实施方式中，所述生长因子包含TGF-β1。

根据本发明的组合物的多孔支架可以是任何生物相容的和可生物降解的支架。在某些实施方式中，多孔支架包含水凝胶和冷冻凝胶。在各种实施方式中，水凝胶或冷冻凝胶包含海藻酸盐或海藻酸盐衍生物、凝胶或明胶衍生物、或透明质酸或透明质酸衍生物。

在某些实施方式中，本发明的分化因子包含与Notch受体结合的多肽。在各种实施方式中，所述分化因子选自δ样1(DLL-1)、δ样2(DLL-2)、δ样3(DLL-3)、δ样4(DLL-4)、Jagged1、Jagged2及其任何组合。在一些实施方式中，所述分化因子包含DLL-4。在某些实施方式中，所述分化因子与多孔支架共价连接。

在一个特定的实施方式中，本发明的族化合物包含可注射的冷冻凝胶，其包含海藻酸盐或海藻酸盐衍生物例如甲基丙烯酸化海藻酸盐、或透明质酸或透明质酸衍生物；一种骨形态发生蛋白的生长因子例如BMP-2；以及是Delta-like家族蛋白的分化因子，例如DLL-4。生长因子可以以每个支架约200ng存在或约6.5ng/mm³至约7.0ng/mm³存在。

III.调节免疫系统的方法

本发明的特征在于调节受试者中免疫系统的方法。在本发明的某些实施方式中，所述用于调节受试者中免疫系统的方法包括向受试者施用一种或多种本发明的组合物。所述组合物可包含多孔支架；生长因子，其以有效诱导组织或器官在所述支架内形成并将细胞募集到所述支架中的量存在；和诱导募集细胞分化为T细胞祖细胞的分化因子。在一个特定的实施方式中，所述组合物包含多孔支架；生长因子，其以每个支架约1ng至约1000ng存在，并且以有效诱导组织或器官在所述支架内形成并将细胞募集到所述支架内的量存在；和诱导募集细胞分化为T细胞祖细胞的分化因子。

在某些实施方式中，所述方法进一步包括向所述受试者施用造血干细胞或造血祖细胞。

在某些实施方式中，所述细胞是干细胞或祖细胞。如在本文中所使用的，术语“干细胞”指能够分化为其他类型的细胞并且能够分裂以产生更多相同类型的干细胞的生物细胞。干细胞包括从囊胚的内细胞团中分离出来的胚胎干细胞和存在于各种组织中的成体干细胞。在成体生物中，干细胞和祖细胞充当身体的修复系统，补充成体组织。在某些实施方式中，所述干细胞是胚胎干细胞、胎儿干细胞、羊膜干细胞、脐带干细胞、成体干细胞或诱导多能干细胞。在某些实施方式中，所述干细胞是造血干细胞。造血干细胞是产生其他血细胞的干细胞，包括血细胞的髓系和淋巴系。

如在本文中所使用的，术语“祖细胞”指可以分化为特定类型细胞的生物细胞。祖细胞通常比干细胞分化程度更高。通常，祖细胞只能分裂有限的次数。

在某些实施方式中，祖细胞是母细胞，例如成淋巴细胞、淋巴母细胞、骨髓细胞或骨髓前体细胞。在某些实施方式中，祖细胞是能够分化为T细胞祖细胞的细胞。在某些实施方式中，所述淋巴细胞包括T细胞，例如初始T细胞。

在某些实施方式中，所述募集细胞是造血骨髓细胞，或动员外周血细胞。

在某些实施方式中，所述细胞是重组细胞。如在本文中所使用的，术语“重组细胞”指已引入基因修饰的细胞。基因修饰可以在染色体水平或染色体外。“染色体水平的基因修饰”指细胞基因组中的基因修饰，例如细胞染色体上的插入、缺失和/或置换。染色体外基因修饰指不位于细胞基因组中的基因修饰。例如，可以将含有蛋白编码基因的质粒引入细胞。质粒可以复制并从亲代细胞传递到后代细胞。

在各种实施方式中，基因修饰将基因引入细胞。引入的基因可以补偿细胞缺陷基因的功能。例如，所述细胞可以含有突变的缺陷基因。基因修饰可以将野生型功能基因引入到细胞以恢复该基因的功能。在一些实施方式中，基因修饰可以增加或减少某些基因的表达。例如，基因修饰可以引入对基因特异的小干扰RNA(siRNA)以抑制基因的表达。

基因修饰细胞的方法是本领域公知的，例如描述于Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring HarborLaboratory Press,NY,Vol.1,2,3(1989),(其通过引用并入本文)的方法。

在某些实施方式中，基因修饰可以通过基因编辑引入，也称为基因组编辑。基因编辑是一组技术，它使熟练的工匠能够改变生物的DNA。这些技术允许在基因组的特定位置添加、移除或改变遗传物质。基因编辑技术包括但不限于大范围核酸酶系统、锌指核酸酶(ZFN)系统、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)系统和CRISPR-Cas系统。CRISPR-Cas系统是成簇规则间隔短回文重复序列和CRISPR相关蛋白系统的缩写，特别是CRISP-Cas9，比其他现有的基因组编辑方法更快、更便宜、更准确和更有效。

在某些实施方式中，本发明的特征在于在受试者接受移植后调节受试者中免疫系统的方法。例如，受试者可以接受造血干细胞移植。在某些实施方式中，在造血干细胞移植的同时或之后，向所述受试者施用本发明的组合物。

在某些实施方式中，向所述受试者施用至少两种组合物。所述组合物可以是相似的。

在某些实施方式中，本发明的方法调节30岁以上人的免疫反应。例如，所述人可能超过40岁、超过50岁、超过60岁、超过70岁、超过80岁。

在一些实施方式中，本发明的一种或多种组合物(例如骨髓冷冻凝胶)可以与干细胞动员技术联合施用。干细胞动员是使用某些细胞动员剂使干细胞从骨髓移动到血液中的过程，例如描述于Hopman and DiPersio,Advances in Stem Cell Mobilization,BloodRev.,2014,28(1):31-40，其内容通过引用并入本文。这类技术也可用于祖细胞的动员。

因此，在某些实施方式中，以有效诱导干细胞和/或祖细胞从骨髓移动到血液中的量向所述受试者施用干细胞和/或祖细胞动员剂。释放的干细胞和/或祖细胞随后被募集到本发明的组合物中(例如骨髓冷冻凝胶)以分化成T细胞祖细胞。在使用组合物(例如骨髓冷冻凝胶)之前、同时或之后施用干细胞和/或祖细胞动员剂。

在各种实施方式中，本发明所述的组合物(例如骨髓冷冻凝胶)可以与干细胞和/或祖细胞动员剂联合施用于受试者。在特定的实施方式中，所述受试者是高龄人，例如人可能超过30、40、50、60、70或80岁。干细胞和/或祖细胞动员剂可以将受试者自身的干细胞和/或祖细胞从骨髓中动员出来，这样这些细胞就可以归巢到本发明的组合物中，从而增强受试者中的T细胞产生而不涉及其他调理或干细胞移植。

在某些实施方式中，本发明所述的组合物(例如骨髓冷冻凝胶)可以与干细胞和/或祖细胞动员技术以及干细胞移植联合施用于受试者。移植可以是自体的、同种异基因的或异种的。

在一些实施方式中，施用治疗有效量的一种或多种细胞动员剂，其可以刺激动员到外周血流中、产生和/或改善一种或多种细胞类型的功能。药剂可通过任何所需的给药途径给药，例如口服、直肠、静脉内、肌肉内、皮下或气雾剂。可以刺激动员到外周血流中、产生和/或改善细胞类型的功能的药剂的一些非限制性实施方式包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、GM-CSF、G-CSF、普乐沙福、PDGF、TGF-β、NGF、IGF、生长激素、促红细胞生成素、促血小板生成素等。除了天然存在的生长因子外，也可以使用生长因子类似物和生长因子衍生物例如融合蛋白。在一些实施方式中，所述方法包括施用治疗有效量的G-CSF和治疗有效量的电磁辐射。在一些实施方式中，所述方法包括使用治疗有效量的普乐沙福和治疗有效量的电磁辐射的组合。在一些实施方式中，治疗有效量的电磁辐射与另一种药剂组合，在一些实施方式中，该药剂可以是造血干细胞动员剂。在一些实施方式中，治疗有效量的电磁辐射与GM-CSF、G-CSF、普乐沙福、IL-1、IL-2、IL-3、IL-6PDGF、TGF-β、NGF、IGF、生长激素、促红细胞生成素、促血小板生成素或另一种药剂中的两种或更多种的组合相组合。

细胞至T细胞祖细胞的募集和分化

一方面，本发明的特征在于将细胞募集到支架并诱导募集细胞分化为T细胞祖细胞的方法。具体地，所述方法包括向受试者施用一种或多种本发明的组合物，所述组合物包含多孔支架；生长因子，其以有效诱导组织或器官在所述支架内形成并将细胞募集到所述支架中的量存在；和诱导募集细胞分化为淋巴细胞的分化因子。在一个特定的实施方式中，向受试者施用组合物，所述组合物包含多孔支架；生长因子，其以每个支架约1ng至约1000ng(例如约5ng至约500ng、约5ng至约250ng、约5ng至约200ng或约200ng)存在，并且以有效诱导组织或器官在所述支架内形成并将细胞募集到所述支架内的量存在；和诱导募集细胞分化为淋巴细胞的分化因子。在另一个特定的实施方式中，向受试者施用组合物，所述组合物包含多孔支架；生长因子，其以每个支架约1ng至约1000ng(例如约1ng至约500μg、约5μg至约250μg、约10μg至约100μg)存在，并且以有效诱导组织或器官在所述支架内形成并将细胞募集到所述支架内的量存在；和诱导募集细胞分化为淋巴细胞的分化因子。在另一个实施方式中，向受试者施用组合物，所述组合物包含多孔支架；生长因子，其以约0.03ng/mm³(生长因子的重量与支架的体积的比)至约350ng/mm³(例如约0.1ng/mm³至约300ng/mm³、约0.5ng/mm³至约250ng/mm³、约1ng/mm³至约200ng/mm³、约2ng/mm³至约150ng/mm³、约3ng/mm³至约100ng/mm³、约4ng/mm³至约50ng/mm³或约5ng/mm³至约25ng/mm³)存在，并且以有效诱导组织或器官在所述支架内形成并将细胞募集到所述支架内的量存在；和诱导募集细胞分化为淋巴细胞的分化因子。

在某些实施方式中，所述生长因子和/或归巢因子用于将细胞募集到本发明所述的支架中。所述组合物的分化因子和任选地生长因子随后诱导细胞分化为T细胞祖细胞。

在一些实施方式中，所述方法进一步包括向所述受试者施用造血干细胞或造血祖细胞。

在某些实施方式中，所述生长因子(例如BMP-2)和/或归巢因子(例如SDF-1)募集能够分化为T细胞祖细胞的干细胞或祖细胞。分化因子(例如DLL-4)诱导干细胞或祖细胞分化为T细胞祖细胞。在某些实施方式中，所述淋巴细胞包括初始T细胞。在某些实施方式中，所述淋巴细胞包括T细胞，例如CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞和/或调节性T细胞(T_reg)。

在某些实施方式中，所述募集细胞是移植细胞。所述移植细胞(例如造血干细胞或祖细胞)可以是自体的。例如，所述移植细胞可以是受试者自身的脐带干细胞或在治疗例如放疗之前从受试者获得的干细胞。所述移植细胞可以是同基因的，例如来自受试者的同卵双胞胎的造血干细胞或祖细胞。所述移植细胞也可以是同种异基因的，例如从同一物种的供体获得的造血干细胞或祖细胞。所述移植细胞也可以是异种的，例如从不同物种获得的造血干细胞或祖细胞。

在某些实施方式中，所述细胞可以是来自受试者的骨髓基质细胞。所述基质细胞指器官的结缔组织细胞，例如骨髓。所述基质细胞支持该器官的实质细胞的功能(例如骨髓)。骨髓基质细胞产生DLL-4，其为产生T细胞感受态共同淋巴祖细胞提供了一个重要的功能环境。生长因子(例如BMP-2)也可以促进基质细胞的骨谱系分化。

在某些实施方式中，所述募集细胞可以不是干细胞或祖细胞。

免疫过度反应的降低

一方面，本发明提供了通过向受试者施用一种或多种本发明的组合物来降低受试者的免疫过度反应的方法，所述组合物包含多孔支架；生长因子，其以有效诱导组织或器官在所述支架内形成并将细胞募集到所述支架中的量(例如每个支架约1ng至约1000ng，约5ng至约500ng、约5ng至约250ng、约5ng至约200ng或约200ng)存在；和诱导募集细胞分化为T细胞祖细胞的分化因子。

另一方面，本发明提供了通过向受试者施用一种或多种本发明的组合物来降低受试者的免疫过度反应的方法，所述组合物包含多孔支架；生长因子，其以每个支架约1ng至约1000ng(例如约1ng至约500μg、约5μg至约250μg、约10μg至约100μg)存在，并且以有效诱导组织或器官在所述支架内形成并将细胞募集到所述支架内的量存在；和诱导募集细胞分化为淋巴细胞的分化因子。

另一方面，本发明提供了通过向受试者施用一种或多种本发明的组合物来降低受试者的免疫过度反应的方法，所述组合物包含多孔支架；生长因子，其以约0.03ng/mm³(生长因子的重量与支架的体积的比)至约350ng/mm³(例如约0.1ng/mm³至约300ng/mm³、约0.5ng/mm³至约250ng/mm³、约1ng/mm³至约200ng/mm³、约2ng/mm³至约150ng/mm³、约3ng/mm³至约100ng/mm³、约4ng/mm³至约50ng/mm³或约5ng/mm³至约25ng/mm³)存在，并且以有效诱导组织或器官在所述支架内形成并将细胞募集到所述支架内的量存在；和诱导募集细胞分化为淋巴细胞的分化因子。

在一些实施方式中，所述方法进一步包括向所述受试者施用造血干细胞或造血祖细胞。

免疫系统是一个严格调控的网络，能够在正常生理调价下维持免疫稳态的平衡。通常，当收到外来抗原攻击时，会启动旨在恢复体内平衡的特异的适当响应。然而，在特定情况下，这种平衡无法维持并且免疫反应反应不足或过度。当免疫反应过度反应时，可能会导致自身免疫性疾病、过敏和/或GVHD等疾病。

在某些实施方式中，本发明的特征在于增加受试者中调节性T细胞(T_reg)的水平的方法。T_reg细胞，也称为抑制性T细胞，是调节免疫系统、维持对自身抗原的耐受性以及预防和/或治疗自身免疫性疾病的T细胞亚群。T_reg细胞具有免疫抑制作用并且通过抑制或下调效应T细胞的诱导和增殖。T_reg细胞细胞搭生物标记物CD4、FOXP3和CD25。不希望受任何理论束缚，通过本发明的方法增加的T_reg细胞水平被认为导致过度反应性的降低。

自身免疫性疾病

在一个特定方面，本发明提供了通过向受试者施用一种或多种本发明的组合物来预防和/或治疗自身免疫性疾病的方法，所述组合物包含多孔支架；生长因子，其以有效诱导组织或器官在所述支架内形成并将细胞募集到所述支架中的量(例如每个支架约1ng至约1000ng，约5ng至约500ng、约5ng至约250ng、约5ng至约200ng或约200ng)存在；和诱导募集细胞分化为T细胞祖细胞的分化因子。如在本文中所使用的，术语“自身免疫性疾病”指受试者的免疫系统攻击和/或损害其自身组织的疾病、病症或疾病。示例性免疫系统性疾病包括但不限于1型糖尿病、类风湿性关节炎、银屑病、关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、炎症性肠病、艾迪生病、格雷夫斯病、舍格伦综合征、桥本甲状腺炎、重症肌无力、血管炎、恶性贫血和乳糜泻。

在某些实施方式中，受试者缺乏T_reg细胞并发展为自身免疫性疾病。可以向受试者施用本发明的组合物和造血干细胞或祖细胞。造血干细胞或祖细胞可以从受试者获得。本发明的组合物可包含生长因子(例如TGF-β家族蛋白)以诱导造血干细胞分化为T_reg细胞。

过敏

在某些实施方式中，本发明的特征在于通过向受试者施用一种或多种本发明的组合物来预防和/或治疗过敏，所述组合物包含多孔支架；生长因子，其以有效诱导组织或器官在所述支架内形成并将细胞募集到支架中的量(例如每个支架约1ng至约1000ng，约5ng至约500ng、约5ng至约250ng、约5ng至约200ng或约200ng)存在；和诱导募集细胞分化为T细胞祖细胞的分化因子。

过敏，也称为变应性疾病，是由免疫系统对环境中通常无害的物质的超敏反应引起的多种病症。不希望受任何理论束缚，通过本发明的方法增加的T_reg细胞水平可以预防和/或治疗过敏。

GVHD

在另一方面，本方法提供了通过向受试者施用一种或多种本发明的组合物来减轻移植物抗宿主病(GVHD)相关症状的方法，所述组合物包含多孔支架；生长因子，其以有效诱导组织或器官在所述支架内形成并将细胞募集到支架中的量(例如每个支架约1ng至约1000ng，约5ng至约500ng、约5ng至约250ng、约5ng至约200ng或约200ng)存在；和诱导募集细胞分化为T细胞祖细胞的分化因子。GVHD是在接受来自基因不同的供体的移植组织后的医疗情况。GVHD通常与干细胞移植例如造血干细胞移植相关。GVHD也发证在其他形式的移植组织中，例如实体器官移植。

在某些实施方式中，所述GVHD与造血干细胞移植相关。在某些实施方式中，所述GVHD与实体器官移植相关。

在某些实施方式中，本发明的特征在于增加T_reg细胞的水平。在某些实施方式中，T_reg细胞是从移植的造血干细胞(例如供体造血干细胞)分化而来的。不希望受任何理论束缚，鉴于供体T_reg细胞在GVHD抑制中发挥重要作用，造血干细胞移植中供体T_reg细胞的增强可能有助于减轻接受造血干细胞移植的受试者的GVHD症状。在某些实施方式中，本发明的特征在于提高受试者自体T_reg细胞水平的方法。

接受移植的受试者中供体嵌合的增强

在另一方面，本发明提供了通过向受试者施用一种或多种本发明的组合物来增强接受移植的受试者中供体嵌合的方法，所述组合物包含多孔支架；生长因子，其以有效诱导组织或器官在所述支架内形成并将细胞募集到支架中的量存在；和诱导募集细胞分化为T细胞祖细胞的分化因子。在一个特定的实施方式中，向受试者施用组合物，所述组合物包含多孔支架；生长因子，其以每个支架约1ng至约1000ng(例如约5ng至约500ng、约5ng至约250ng、约5ng至约200ng或约200ng)存在，并且以有效诱导组织或器官在所述支架内形成并将细胞募集到所述支架内的量存在；和诱导募集细胞分化为T细胞祖细胞的分化因子。在另一个特定的实施方式中，向受试者施用组合物，所述组合物包含多孔支架；生长因子，其以每个支架约1ng至约1000μg(例如约1ng至约500μg、约5μg至约250μg、约10μg至约100μg)存在，并且以有效诱导组织或器官在所述支架内形成并将细胞募集到所述支架内的量存在；和诱导募集细胞分化为淋巴细胞的分化因子。在另一个实施方式中，向受试者施用组合物，所述组合物包含多孔支架；生长因子，其以约0.03ng/mm³(生长因子的重量与支架的体积的比)至约350ng/mm³(例如约0.1ng/mm³至约300ng/mm³、约0.5ng/mm³至约250ng/mm³、约1ng/mm³至约200ng/mm³、约2ng/mm³至约150ng/mm³、约3ng/mm³至约100ng/mm³、约4ng/mm³至约50ng/mm³或约5ng/mm³至约25ng/mm³)存在，并且以有效诱导组织或器官在所述支架内形成并将细胞募集到所述支架内的量存在；和诱导募集细胞分化为淋巴细胞的分化因子。

在一些实施方式中，所述方法进一步包括向所述受试者施用造血干细胞或造血祖细胞。

供体嵌合通常发生在受试者接受造血干细胞移植时。如在本文中所使用的，术语“嵌合现象”指非宿主来源的淋巴造血细胞的存在。完全或完整嵌合现象通常指供体淋巴造血完全替代宿主。混合嵌合现象表明在给定细胞区室中存在的供体和受体细胞两者，例如淋巴细胞。在同种异基因造血干细胞或祖细胞移植中，低水平的供体嵌合通常与T细胞生成不足有关，这使患者容易感染病原体并可能导致GVHD。

T细胞平衡重建

在另一方面，本发明提供了通过向受试者施用一种或多种本发明的组合物来导致受试者中T细胞平衡重建的方法，所述组合物包含多孔支架；生长因子，其以有效诱导组织或器官在所述支架内形成并将细胞募集到支架中的量存在；和诱导募集细胞分化为T细胞祖细胞的分化因子。在一个特定的实施方式中，向受试者施用组合物，所述组合物包含多孔支架；生长因子，其以每个支架约1ng至约1000ng(例如约5ng至约500ng、约5ng至约250ng、约5ng至约200ng或约200ng)存在，并且以有效诱导组织或器官在所述支架内形成并将细胞募集到所述支架内的量存在；和诱导募集细胞分化为T细胞祖细胞的分化因子。在另一个特定的实施方式中，向受试者施用组合物，所述组合物包含多孔支架；生长因子，其以每个支架约1ng至约1000μg(例如约1ng至约500μg、约5μg至约250μg、约10μg至约100μg)存在，并且以有效诱导组织或器官在所述支架内形成并将细胞募集到所述支架内的量存在；和诱导募集细胞分化为淋巴细胞的分化因子。在另一个实施方式中，向受试者施用组合物，所述组合物包含多孔支架；生长因子以约0.03ng/mm³(生长因子的重量与支架的体积的比)至约350ng/mm³(例如约0.1ng/mm³至约300ng/mm³、约0.5ng/mm³至约250ng/mm³、约1ng/mm³至约200ng/mm³、约2ng/mm³至约150ng/mm³、约3ng/mm³至约100ng/mm³、约4ng/mm³至约50ng/mm³或约5ng/mm³至约25ng/mm³)存在，并且以有效诱导组织或器官在所述支架内形成并将细胞募集到所述支架内的量存在；和诱导募集细胞分化为淋巴细胞的分化因子。

在一些实施方式中，进一步向受试者施用造血干细胞或祖细胞。在造血干细胞或祖细胞施用的同时或之后施用本发明的组合物。

如在本文中所使用的，术语“T细胞平衡重建”指以CD4⁺:CD8⁺比率在特定时间段(例如30天)内正常范围内为特征的T细胞的重建。例如，CD4⁺细胞的重建通常在HSCT接受者中会延迟。本发明的方法可以加速CD4⁺T细胞的重建并导致T细胞平衡重建。

造血干细胞移植(HSCT)是多种疾病的治愈性治疗，但同种异基因HSCT收到T细胞缺陷和失调的限制。在接受同种异基因HSCT的受试者中，CD4⁺T细胞恢复通常会延迟，导致正常CD4/CD8比率倒置，外周血中该比率为约0.9至约2.5。该比率在其他组织或器官中可能不同。

在某些实施方式中，本发明的方法将CD4⁺:CD8⁺比率稳定到正常范围，而仅接受HSCT的受试者中的CD4⁺T细胞区室尚未完全重建。在某些实施方式中，平衡的T细胞重建的特征在于在移植造血干细胞和施用本发明的组合物后30天或更短时间内处于正常范围内的稳态CD4⁺:CD8⁺比率。

在根据本发明的某些实施方式中，受试者例如人在造血干细胞移植中接受每千克所述受试者的体重约1x10⁵至约50x10⁶个的造血干细胞或祖细胞。在某些实施方式中，受试者接受每千克所述受试者的体重约1x10⁵个的造血干细胞。

与只接受造血干细胞或T细胞祖细胞输注(即未接受本发明的组合物的治疗)的受试者相比，本发明的方法产生相似或更好的治愈和/或治疗效果。例如，用本发明的组合物治疗可导致胸腺和外周中更多数量的T细胞祖细胞和功能性T细胞，例如，即使当使用相对于单独T细胞祖细胞输注更低的剂量。在一些实施方式中，当将单独用于HSCT的造血干细胞或祖细胞的少于百分之十(10％)与本发明的组合物联合施用于受试者时，可以达到类似或更好的治愈和/或治疗效果。

在各种实施方式中，所述T细胞平衡重建的特征还在于增强的T细胞新生。如在本文中所使用的，术语“新生”指新细胞的产生。在各种实施方式中，增强的T细胞新生的特生在于增强的T细胞受体切除环(TREC)。在某些实施方式中，使用本发明的组合物和方法的T细胞新生达到基线或正常数量的TREC。如在本文中所使用的，术语“TREC的基线数”指受试者在接受任何损害受试者中免疫系统的治疗之前受试者的TRESCs数。如在本文中所使用的，术语“TREC的正常数量”指免疫系统未受损的个体的TREC数量。TREC的正常数量可能在一定范围内。在某些实施方式中，可以通过估计外周血细胞中的TREC以定量和无创方式在人中评估TREC。

抗原特异性T细胞响应

在另一方面，本发明提供了通过向受试者施用一种或多种本发明的组合物以在受试者中诱导抗原特异性T细胞响应的方法，所述组合物包含多孔支架；生长因子，其以有效诱导组织或器官在所述支架内形成并将细胞募集到支架中的量存在；和诱导募集细胞分化为T细胞祖细胞的分化因子。在一个特定的实施方式中，向受试者施用组合物，所述组合物包含多孔支架；生长因子，其以每个支架约1ng至约1000ng(例如约5ng至约500ng、约5ng至约250ng、约5ng至约200ng或约200ng)存在，并且以有效诱导组织或器官在所述支架内形成并将细胞募集到所述支架内的量存在；和诱导募集细胞分化为T细胞祖细胞的分化因子。在另一个特定的实施方式中，向受试者施用组合物，所述组合物包含多孔支架；生长因子，其以每个支架约1ng至约1000μg(例如约1ng至约500μg、约5μg至约250μg、约10μg至约100μg)存在，并且以有效诱导组织或器官在所述支架内形成并将细胞募集到所述支架内的量存在；和诱导募集细胞分化为淋巴细胞的分化因子。在另一个实施方式中，向受试者施用组合物，所述组合物包含多孔支架；生长因子，其以约0.03ng/mm³(生长因子的重量与支架的体积的比)至约350ng/mm³(例如约0.1ng/mm³至约300ng/mm³、约0.5ng/mm³至约250ng/mm³、约1ng/mm³至约200ng/mm³、约2ng/mm³至约150ng/mm³、约3ng/mm³至约100ng/mm3、约4ng/mm³至约50ng/mm³或约5ng/mm³至约25ng/mm³)存在，并且以有效诱导组织或器官在所述支架内形成并将细胞募集到所述支架内的量存在；和诱导募集细胞分化为淋巴细胞的分化因子。

在一些实施方式中，所述方法进一步包括向所述受试者施用造血肝细胞和造血祖细胞。

在某些实施方式中，所述受试者具有受损的免疫系统。如在本文中所使用的，术语“受损的免疫系统”指免疫系统对抗床染病和癌症的能力受损或完全不存在的状态。由于影响受试者中免疫系统的外在因素，许多免疫系统受损的情况是后天获得的(“继发性”)。这些外在因素的实例包括HIV感染、年龄和环境因素例如营养。在某些实施方式中，某些药物例如类固醇的免疫抑制可以是副作用或治疗的预期目的。这些用途的实例包括(i)在器官移植手术中作为抗排斥措施和(ii)在患有过度或约免疫系统例如自身免疫疾病的患者中。在某些实施方式中，一些抗癌疗法，例如放疗和/或化疗，会导致免疫系统受损。受试者中免疫系统受损的情况可称为“免疫缺陷”。

在某些实施方式中，受试者已接受造血干细胞移植。在某些实施方式中，受试者患有血液或骨髓癌症，例如骨髓癌或白血病。受试者可能会经历调节性细胞毒放射和/或化疗以破坏肿瘤细胞，这会由于适应性免疫系统的T细胞和B细胞破坏而导致严重的淋巴细胞减少。

在某些实施方式中，诱导抗原特异性反应的方法包括向受试者施用本发明的组合物和包含抗原的疫苗。

免疫受损的受试者中免疫系统的调节

一方面，本发明提供了通过向受试者施用一种或多种本发明的组合物来调节免疫受损的受试者的免疫系统的方法，所述组合物包含多孔支架；生长因子，其以有效诱导组织或器官在所述支架内形成并将细胞募集到支架中的量(例如每个支架约1ng至约1000ng，约5ng至约500ng、约5ng至约250ng、约5ng至约200ng或约200ng)存在；和诱导募集细胞分化为T细胞祖细胞的分化因子。

在另一方面，本发明提供了通过向受试者施用一种或多种本发明的组合物来调节免疫受损的受试者的免疫系统的方法，所述组合物包含多孔支架；生长因子，其以每个支架约1ng至约1000μg(例如约1ng至约500μg、约5μg至约250μg、约10μg至约100μg)存在，并且以有效诱导组织或器官在所述支架内形成并将细胞募集到所述支架内的量存在；和诱导募集细胞分化为淋巴细胞的分化因子。

在另一方面，本发明提供了通过向受试者施用一种或多种本发明的组合物来调节免疫受损的受试者的免疫系统的方法，所述组合物包含多孔支架；生长因子，其以约0.03ng/mm³(生长因子的重量与支架的体积的比)至约350ng/mm³(例如约0.1ng/mm³至约300ng/mm³、约0.5ng/mm³至约250ng/mm³、约1ng/mm³至约200ng/mm³、约2ng/mm³至约150ng/mm³、约3ng/mm³至约100ng/mm³、约4ng/mm³至约50ng/mm³或约5ng/mm³至约25ng/mm³)存在，并且以有效诱导组织或器官在所述支架内形成并将细胞募集到所述支架内的量存在；和诱导募集细胞分化为淋巴细胞的分化因子。

在一些实施方式中，进一步向受试者施用造血干细胞或祖细胞。

在某些实施方式中，进一步向所述受试者施用干细胞和/或祖细胞动员剂，使得释放的干细胞和/或祖细胞被募集到本发明的组合物(例如骨髓冷冻凝胶)。在施用本发明的组合物(例如骨髓冷冻凝胶)之前、同时或之后施用干细胞/祖细胞动员剂。

在一些实施方式中，免疫系统受损是由免疫衰老引起的。如在本文中所使用的，术语“免疫衰老”指由于自然年龄增长而导致的免疫系统退化。它涉及宿主对感染的反应能力和长期免疫记忆的发展，特别是通过接种疫苗。免疫衰老是一种多因素疾病，其导致老年人群出现许多具有病理学意义的健康问题。免疫衰老与造血干细胞自我更新能力降低有关。免疫衰老的受试者可能会表现出CD4+/CD8+比率降低、T细胞受体(TCR)多样性的抗原识别库减少和/或响应抗原刺激的增殖受损。免疫衰老甚至可能在很小的时候就开始，例如人类30岁。

在一些实施方式中，所述受试者由于先天性免疫缺陷而具有受损的免疫系统。如在本文中所使用的，“先天性免疫缺陷”也称为“原发性免疫缺陷”指免疫系统的一种或多种主要组分的缺陷、缺失或缺陷。这些疾病由基因决定并通常在婴儿期和儿童期表现为频繁、慢性或机会性感染。分类是基于免疫系统的主要组分是有缺陷、缺失或缺陷的。诊断可通过分类WBC计数、绝对淋巴细胞计数、定量免疫球蛋白(Ig)测量和抗体滴度等测试来确定。治疗通常包括预防性抗生素以控制和预防感染。原发性免疫缺陷疾病的预后是可变的并取决于具体的疾病。

示例性先天免疫缺陷疾病包括但不限于B西巴奥免疫缺陷，例如布鲁顿无丙种球蛋白血症、选择性IgA缺乏症、常见变异型免疫缺陷病，先天性t细胞免疫缺陷，例如迪乔治综合症、常染色体显性高免疫球蛋白E综合征、IL-12受体缺乏症、慢性皮肤粘膜念珠菌病、IPEX综合征(免疫失调、多发内分泌病、肠道病、X连锁)，先天性免疫缺陷混合，例如重症综合性免疫缺陷(SCID、气泡男孩症、Glanzmann–Riniker综合征、淋巴细胞缺乏)、威斯科特-奥尔德里奇综合征、高IgM症候群、共济失调毛细血管扩张、先天性中性粒细胞和吞噬细胞疾病，例如慢性肉芽肿性疾病(CGD)、白细胞粘附缺陷1型、Chediak-Higashi综合征、髓过氧化物酶缺乏症、重症先天性中性白细胞减少症、先天性补充不足例如终端补不足、C3不足。

在某些实施方式中，所述受试者由于获得性免疫缺陷而具有受损的免疫系统。如在本文中所使用的，术语“获得性免疫缺陷”指由于影响受试者中免疫系统的外在因素引起的免疫缺陷。获得性免疫缺陷也称为继发性免疫缺陷，可由各种免疫抑制剂，例如营养不良、衰老、特定药物或治疗(例如化疗(细胞毒性药物)、改变病情抗风湿药物、器官移植后的免疫抑制药物、糖皮质激素、放疗)和环境毒素(如汞和其他重金属)、杀虫剂和石化产品(如苯乙烯、二氯苯、二甲苯和乙基苯酚)引起。对于药物，术语“免疫抑制”通常指降低免疫系统功能的有益的和潜在不良反应，而“免疫缺陷”通常仅指感染风向增加的不良反应。

许多特定疾病直接或间接引起免疫抑制。这包括许多类型的癌症，特别是骨髓和血细胞癌症(白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤)和某些慢性感染。免疫缺陷也是获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的标志，由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起。HIV直接感染少量T辅助细胞，也间接损害其他免疫系统反应。各种激素和代谢紊乱也可导致免疫缺陷，包括但不限于贫血、甲状腺功能减退症、糖尿病和低血糖症。吸烟、酗酒和药物滥用也会抑制免疫反应。

不希望受任何理论束缚，由本发明的组合物和方法提供的T细胞平衡重建和抗原特异性T细胞响应可以调节免疫系统受损的受试者的免疫系统。

IV.试剂盒

本文所述的任何组合物都可以包括于试剂盒中。在非限制性实施例中，所述试剂盒包括组合物，所述组合物包含多孔支架；生长因子，其以有效诱导组织或器官在所述支架内形成并将细胞募集到所述支架中的量存在；和诱导募集细胞分化为T细胞祖细胞的分化因子。在一个特定的实施方式中，所述试剂盒包括组合物，所述组合物包含多孔支架；生长因子，其以每个支架约1ng至约1000ng(例如约5ng至约500ng、约5ng至约250ng、约5ng至约200ng或约200ng)存在，并且以有效诱导组织或器官在所述支架内形成并将细胞募集到所述支架内的量存在；和诱导募集细胞分化为T细胞祖细胞的分化因子。在另一个特定的实施方式中，所述试剂盒包括组合物，所述组合物包含多孔支架；生长因子，其以每个支架约1ng至约1000μg(例如约1ng至约500μg、约5μg至约250μg、约10μg至约100μg)存在，并且以有效诱导组织或器官在所述支架内形成并将细胞募集到所述支架内的量存在；和诱导募集细胞分化为淋巴细胞的分化因子。在另一个实施方式中，所述试剂盒包括组合物，所述组合物包含多孔支架；生长因子，其以约0.03ng/mm³(生长因子的重量与支架的体积的比)至约350ng/mm³(例如约0.1ng/mm³至约300ng/mm³、约0.5ng/mm³至约250ng/mm³、约1ng/mm³至约200ng/mm³、约2ng/mm³至约150ng/mm³、约3ng/mm³至约100ng/mm³、约4ng/mm³至约50ng/mm³或约5ng/mm³至约25ng/mm³)存在，并且以有效诱导组织或器官在所述支架内形成并将细胞募集到所述支架内的量存在；和诱导募集细胞分化为淋巴细胞的分化因子。

在一些实施方式中，所述试剂盒包括本文别处描述的组合物。

在一个特定的实施方式中，所述试剂盒包括用于施用该组合物的注射器或替代注射装置。在一个具体的实施方式中，预装注射器或预装注射装置预装有组合物。

所述试剂盒还可包括用于向受试者施用本发明所述的组合物的试剂或说明书。其还可以包括一种或多种试剂。

所述试剂盒的组分可以包装在水性介质或以冻干形式包装。所述试剂盒的容器装置通常至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器装置，可将组分放入其中并优选地适当等分。当所述试剂盒中有不止一种组分时，所述试剂盒通常还包括第二、第三或其他额外的容器，额外的组分可以单独放置在其中。所述试剂盒还可以包括用于容纳无菌的、药学上可接受的缓冲液和/或其他稀释剂的第二容器装置。然而，小瓶中可以包含各种组分的组合。本发明所述的试剂盒通常还包括用于容纳本发明的组合物的装置，例如用于调节免疫系统的组合物，以及用于商业销售的任何其他密闭的试剂容器。

当所述试剂盒的组分以一种和/或多种液体溶液提供时，液体溶液是水溶液，特别优选无菌水溶液。然而，所述试剂盒的组分可以作为干燥粉末提供。当所述试剂盒和/或组分以干粉形式提供时，可以通过添加合适的溶剂来冲调粉末。设想溶剂也可以提供在另一个容器装置中。

通过以下实施例进一步说明本发明，其不应被解释为限制性的。所有引用的来源，例如，在此引用的参考文献、出版物、数据库、数据库条目和技术，即使在引文中没有明确说明，也通过引用并入本申请。如果引用的来源和本申请的陈述发生冲突，以本申请中的陈述为准。

章节和表格标题不旨在是限制性的。

实施例

摘要

同种异基因造血干细胞抑制(HSCT)是多种疾病的治愈性治疗，但T细胞的缺乏和失调限制了其应用。这里报道了一种基于生物材料的支架，其模拟了骨髓中T细胞淋巴细胞生成的特征。骨髓冷冻凝胶(BMC)释放骨形态发生蛋白2以募集基质细胞，并提供Notch配体Delta样配体4以促进小鼠和人造血祖细胞的T细胞谱系专向分化。在HSCT时皮下注射到小鼠体内的BMC增强了胸腺的T细胞祖细胞接种、T细胞新生和T细胞受体库的多样化。外周T细胞重建在小鼠HSCT中增加了约6倍，在人异种HSCT中增加了约2倍。此外，BMC促进了供体CD4+调节性T细胞的产生并提高了同种异基因HSCT后的存活率。与T细胞祖细胞的过继性转移相比，BMC增加了供体嵌合、T细胞产生和抗原特异性T细胞对疫苗接种的反应。BMC可以提供一种现成的方法来增强T细胞再生和减轻HSCT中的移植物抗宿主病。

介绍

T细胞是对生命很重要的抗原特异性免疫的重要辅助细胞、效应细胞和调节细胞。T细胞数量减少和功能缺陷与先天性民阿姨缺陷、自身免疫和免疫监视障碍等疾病有关(Goronzy,J.J.&Weyand,C.M.Successful and maladaptive T cell aging.Immunity 46,364-378(2017)；Liston,A.,Enders,A.&Siggs,O.M.Unravelling the association ofpartial T-cell 883immunodeficiency and immune dysregulation.Nature ReviewsImmunology 8,545-558 884(2008))。在同种异基因HSCT中，T细胞生成明显不足，这使患者容易感染病原体并可能导致移植物抗宿主病(GVHD)(Blazar,B.R.,Murphy,W.J.&Abedi,M.Advances in graft-versus-host disease biology and therapy.Nature ReviewsImmunology 12,443-458(2012))。这些并发症可能是致命的并限制了HSCT在可以治愈的环境中的应用。初始辅助和效应T细胞亚群的平衡重建，以及T细胞受体库的恢复仍然是一个重要的未满足临床需求(Krenger,W.,Blazar,B.R.&Holl？nder,G.A.Thymic T-celldevelopment in allogeneic stem cell transplantation.Blood 117,6768-6776(2011))。

从移植的造血细胞再生新的T细胞需要足够的源自骨髓的T细胞祖细胞库(Zlotoff,D.A.等，Delivery of progenitors to the thymus limits T-lineagereconstitution after bone marrow transplantation，Blood 118,1962-1970(2011))和足够的胸腺功能(Chaudhry,M.S.,Velardi,E.,Dudakov,J.A.&Brink,M.R.Thymus:thenext(re)generation，Immunological reviews 271,56-71(2016))。虽然目前没有用于增强体内T细胞生成的临床标准，但大多数工作都集中在使用来自T细胞淋巴细胞生成的骨髓后阶段的细胞因子和基于细胞的疗法。然而，在临床试验中，T细胞扩增细胞因子IL-7和IL-2(Mohtashami,M.,Shukla,S.,Zandstra,P.&-Pflücker,J.C.in SyntheticImmunology 95-120(Springer,2016))增加主要成熟的T细胞亚群(Perales,M.-A.等，Recombinant human interleukin-7(CYT107)promotes T-cell recovery afterallogeneic stem cell transplantation，Blood 120,4882-4891(2012))，并且IL-2进一步受限于毒性(Skrombolas,D.&Frelinger,J.G.Challenges and developing solutionsfor increasing the benefits of IL-2treatment in tumor therapy，Expert reviewof clinical immunology 10,207-217(2014))。相反地，在临床前小鼠研究中，IL-22的给药已被证实增加早期胸腺细胞的恢复(Dudakov,J.A.等，Interleukin-22drivesendogenous thymic regeneration in mice.Science 336,91-95(2012)。或者，已使用过继供体T细胞输注提供针对常见病原体的抗原特异性T细胞保护(Cobbold,M.等，Adoptivetransfer of cytomegalovirus-specific CTL to stem cell transplant patientsafter selection by HLA–peptide tetramers，Journal of Experimental Medicine202,379-386(2005)；Rooney,C.M.等，Infusion of cytotoxic T cells for theprevention and treatment of Epstein-Barr virus–induced lymphoma in allogeneictransplant recipients.Blood 92,1549-1555(1998))，但与瞬时响应、GVHD风险增加和T细胞耗竭有关。上述策略都受限于足够的T细胞祖细胞库的可用性，以促进胸腺依赖性T细胞的生成。T细胞前体可以通过Notch信号传导的激活在体外产生，并且这些细胞与HSCT的共施用可改善胸腺生成和胸腺结构，而无需外源共施用细胞因子(Zakrzewski,J.L.等，Tumor immunotherapy across MHC barriers using allogeneic T-cell precursors，Nature biotechnology 26,453(2008)；Van Coppernolle,S.等，Functionally matureCD4 and CD8 TCRαβcells are generated in OP9-DL1 cultures from human CD34+hematopoietic cells，The Journal of Immunology 183,4859-4870(2009)；Awong,G.等，Human proT-cells generated in vitro facilitate hematopoietic stemcell-derivedT-lymphopoiesis in vivo and restore thymic architecture.Blood 122,4210-4219(2013))。然而，体外细胞培养以产生足够的祖细胞是费劲的，并且仅证明了供体细胞胸腺生成的瞬时增强。因此，这种方法的广泛临床转化可能很复杂。

为了开发一种广泛适用的技术，重点放在胸腺前骨髓驻留的共同淋巴祖细胞(CLP)，当Notch信号传导被激活时，其具有分化为初始T淋巴细胞的能力，并且是胸腺生成的主要来源(Love,P.E.&Bhandoola,A.Signal integration and crosstalk duringthymocyte migration and emigration，Nature Reviews Immunology 11,469(2011)；Radtke,F.,MacDonald,H.R.&Tacchini-Cottier,F.Regulation of innate and adaptiveimmunity by Notch，Nature Reviews Immunology 13,427(2013)；Serwold,T.,Ehrlich,L.I.R.&Weissman,I.L.Reductive isolation from bone marrow and blood implicatescommon lymphoid progenitors as the major source of thymopoiesis，Blood 113,807-815(2009))。增强T细胞谱系专向分化的骨髓生态位的基质成分由表达骨钙素的骨髓基质细胞组成，其产生delta样配体-4(DLL-4)，它提供了一个对产生T细胞感受态CLP至关重要的功能性微环境(Vionnie,W.等，Specific bone cells produce DLL4 to generatethymus-seeding progenitors from bone marrow.Journal of Experimental Medicine,jem.20141843(2015))这些基质细胞被预处理过程损坏，这可能会影响它们的T细胞谱系指导功能。此外，AIDS患者的临床经验表明，成人胸腺有能力显著改善细胞成分和T细胞新生，尽管之前有功能障碍和萎缩(Smith,K.Y.等，Thymic size and lymphocyte restorationin patients with human immunodeficiency virus infection after 48weeks ofzidovudine,lamivudine,and ritonavir therapy，The Journal of infectiousdiseases 181,141-147(2000)。这些先前的发现支持了基于骨髓中T细胞淋巴生成的特定生物学方面的生态位的发展。

假设可以设计T细胞淋巴细胞生成骨髓生态位以促进体内T细胞祖细胞的产生，这些祖细胞迁移到天然胸腺中，从而经历宿主驱动的选择以产生更平衡和更广泛的免疫组库。为了验证这一假设，创建了一种可注射的、基于生物材料的冷冻凝胶(BMC)支架。BMC支架通过整合出现在骨髓生态位的分子信号来促进体内T细胞发育。BMC包含一个基于大孔水凝胶的支架，其允许细胞浸润。它释放骨形态发生蛋白2(BMP-2)以促进宿主基质细胞的募集及其骨谱系分化，并以预定义的密度将生物活性Notch配体DLL-4提供给浸润的造血细胞。这些T谱系线索增强了祖细胞的胸腺接种，并使供体T细胞在小鼠的同基因(syn)和同种异基因(allo)HSCT后重建。BMC重建的T细胞是有功能的，具有不同的T细胞受体(TCR)库，并减少GVHD的诱导。

实施例1：生物活性大孔骨髓冷冻凝胶(BMC)在体外将造血祖细胞分化为祖T细胞

基于支架的海藻酸盐PEG BMC是一种大孔水凝胶，具有直径50-80μm的互联孔(图1A–1C)。DLL-4被整合到聚合物骨架中以促进造血祖细胞中的T细胞谱系程序(Radtke,F.,MacDonald,H.R.&Tacchini-Cottier,F.Regulation of innate and adaptive immunityby Notch，Nature Reviews Immunology 13,427(2013))。为了实现从新骨形成(Wozney,J.M.等，Novel regulators of bone formation:molecular clones and activities，Science 242,1528-1534(1988))，在低温聚合之前将BMP-2添加到反应混合物中以便随后在体内以可溶形式释放。这些冷冻农交同时具有固定化(DLL-4)和可溶性(BMP-2)信号，这与之前转为控释蛋白而设计的冷冻凝胶不同(Koshy,S.T.,Zhang,D.K.,Grolman,J.M.,Stafford,A.G.&Mooney,D.J.Injectable nanocomposite cryogels for versatileprotein drug delivery，Acta biomaterialia 65,36-43(2018))。

在这项工作中，BMC还支持骨和造血组织的生长。体外BMP-2释放(包封率90％)显示出加载量的约5％的初始爆发，然后以持续的方式释放(图1D)。在上清液中检测到少于总加载DLL4的1％，并且修饰的DLL-4具有与未修饰蛋白相似的结合动力学(图1E)。在集中释放的样品中，相对于新鲜重构的BMP-2，所释放的BMP-2超过90％的生物活性得以保留(图1F)。BMP-2的生物活性范围从释放第3天的95％到第12天的～85％，证实释放的BMP-2高活性(图1G)。在第0天和第10天的早期时间点发现了DLL-4的最高体外生物活性(图1H和1I)。生物活性在随后的时间点下降，但仍在3个月后高于基线。为了测量BMC通过Notch信号传导诱导造血祖细胞小鼠和人细胞分化的能力，来自小鼠的原代谱系贫化的骨髓细胞和脐带血衍生的人CD34+造血细胞在BMC中培养(图1J)。

在聚合物骨架上的MA-COOH基团用MA-DLL4官能化1％时饱和的共同淋巴祖细胞的扩增，对应于每个凝胶约6μg MA-DLL4，并且选择该条件用于进一步评估。在所分析的任何实验条件下，总人和小鼠细胞的倍数扩增和活力数没有显著差异(图1K和1L)。然而，仅当DLL-4单独或与BMP-2组合掺入BMC中时，淋巴祖细胞的部分才会增强(图1M)。

实施例2：BMC在体内形成具有造血组织特征的骨结节

接下来分析BMC在HSCT小鼠模型中诱导宿主和移植细胞运输的能力。在致死性全身辐射(L-TBI)小鼠静脉内移植从供体小鼠骨髓中分离的谱系贫化的造血细胞(5x10⁴；～93％谱系贫化，图2A)，并且BMC(无细胞)同时注射到背侧皮下组织中(图2B)。为了全面量化BMC中的细胞浸润，在6周的时间内测量了每个皮下结节的大小(图2C)。在具有BMP-2的BMC中，到移植后10天，结节大小迅速增大至初始体积的3倍，并被供体造血细胞充分浸润(图2D)，并在约2周的时间内形成局部骨结节(图2E和2F)。值得注意的是，骨形成伴随着血管化，DLL-4仍然可以阶级恩，并且骨被限制在BMC支架上，这表明BMC在异位部位对这个过程提供了控制(图2G-2L)。

在板层骨区域周围的BMC内表面上的骨结节中可见造血组织(图2F)。早在移植后2天(图2G)就注意到浸润入BMC的毛细血管网格，并在第10天开始量化。组织形态测定法用于在多个时间间隔评估BMC中的血管密度，直至移植后3个月(图2F)。到第10天，血管以约25个血管/mm²存在(图2I)。在第30天后血管密度增加至70个血管/mm²并保持不变。为了量化BMC中海藻酸盐/DLL-4的分布和可及性，使用番红-O染色进行了组织形态学分析。大约85％的海藻酸盐在最早时间点第10天是可及的，并且到第90天逐渐减少到25％(图2I-2K)。在任何时间点，海藻酸盐都没有被隔离在BMC内的任何特定区域。

实施例3：BMC募集和扩增宿主基质和移植的造血细胞

评估移植后不同时间点BMC中移植造血细胞的浸润和细胞组分。当包含BMP-2但不存在单独的DLL-4时，供体GFP+细胞会扩增(图3A和3B)。发现填充BMC的基质细胞和天然骨髓相似，BMC处理和未处理小鼠的天然骨髓中造血细胞的移植没有差异，并且SDF-1α和白介素7的浓度在BMC和天然骨髓中相似(图3C-3G)。

使用通常与小鼠间充质基质细胞相关的免疫表型标记物(Sca-1、CD29、CD44、CD73、CD105、CD106)鉴定了填充BMC的基质细胞，并与移植的496只小鼠的骨髓进行比较(图3C)。相对于骨髓，BMC中的Sca-1⁺基质亚群适度升高，但这些基质亚群的整体再增殖动力学在两种组织中相似。在含有BMP-2的BMC中，骨碱性磷酸酶(BAP)与天然骨相当(图3D)。油红O(ORO)用于量化脂肪组织，发现其在BMC中的含量低于整体天然骨骼。相对于不含BMP-2的BMC，在含有BMP-2的BMC中定量了更高的ORO(图3D)。为了测量BMC是否影响移植的内源性骨髓中的细胞的移植，在3个时间点进行集落形成测定(图3E)。注意到来自用或不用双BMC治疗的小鼠的骨髓的细胞产生的CFU总数或类型没有差异。收获的BMC中归巢因子基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)和淋巴祖细胞支持细胞因子白介素-7(IL-7)的浓度((Brainard,D.M.等，Induction of robust cellular and humoral virus-specific adaptive immuneresponses in human immunodeficiency virus-infected humanized BLT mice，Journalof virology 83,7305-7321(2009))也与来自相同小鼠的受辐射骨髓中相似或更高(图2F)。在BMC中未检测到ETP、DN2和DN3样细胞。

在较晚的时间点(移植后＞5天)，在BMC中定量了更多原始供体造血细胞(HSC)和淋巴引发的多能祖细胞(LMPP)。在第14天，在含有单因子BMP-2或双因子BMP-2和DLL-4的BMC中定量了6至700万个总GFP⁺细胞。两组中超过80％的细胞均是CD11b⁺骨髓细胞。然而，移植的供体细胞中的CLP部分仅在双因子BMC内扩增，导致在移植后2周时相对于仅含有BMP-2的BMC增加约100倍(图3A)。在移植后6周，双因子BMC中的CLP高约10倍，其中约30％和70％分别位于T细胞感受态Ly6D亚群中(图3G)。

来自骨髓的祖T细胞迁移到胸腺以分化为初始T细胞。为了直接评估来自BMC的细胞是否迁移到胸腺，将双因子BMC与干细胞疗法一起递送到一组初始的致死辐射小鼠中(图3H和3I)。然后在第10天时从这些小鼠中取出双BMC，并通过手术将其移植到接受亚致死辐射的受体的背侧皮下。在BMC移植后的第20天，定量这些小鼠胸腺中的供体GFP⁺和宿主细胞。GFP⁺DP、SP CD4⁺和SP CD8⁺细胞在BMC移植的受体小鼠的胸腺中被定量，其证实T细胞祖细胞从BMC迁移到胸腺。在一项单独的研究中，与无BMC的移植细胞给药剂量增加10倍相比，双BMC治疗导致胸腺中ETP数量的更大增加(图3J)。随着时间推移，双BMC在产生胸腺细胞亚群方面也显着优于BMC中因子的推注递送和仅BMP-2BMC(图3K-3P)。

为了分析细胞剂量对T细胞祖细胞在胸腺中接种的影响，早期胸腺祖细胞(ETP)亚群在L-TBI(5x10⁴–5x10⁵个细胞)后移植的谱系贫化细胞的剂量不断增加时进行定量。在此剂量范围内发现ETP的剂量依赖性增强(图3A和3H)。当施用具有最低细胞剂量(5x10⁴个细胞)的双功能化BMC时，与具有最高细胞剂量的仅移植组相比，胸腺中的ETP增加了5倍。双BMC治疗最初增强了ETP(第12天和第42天的3倍)，并且在随后的时间点，DN2、DN3、DP和SP胸腺细胞亚群增加(图3I-3N和图5Q)。来自双BMC治疗的小鼠的胸腺细胞结构和体重在12至42天显著高于来自仅移植组的小鼠。在HSCT后22天，胸腺基质亚群(mTEC、cTEC、成纤维细胞和内皮细胞；图3S和3T)的数量没有显著差异。

实施例4：BMC在HSCT后增强T细胞再生并减轻GVHD

在用双功能化BMC治疗的小鼠的外周血中，在移植后大约4周观察到T细胞重构的加速，但在B细胞或骨髓细胞重建中没有观察到显著差异(图4A-4C)。血液、脾脏和骨髓中T细胞亚群的分析表明，移植30天后在脾脏和骨髓中以及移植40天后在外周血中，具有双功能化BMC的小鼠体内平衡的CD4⁺:CD8⁺T细胞比率恢复(图4D-4F)。在亚致死全身辐射(SL-TBI)后在HSCT的背景下使用BMC治疗时，T细胞重建增强(图4G-4N)。在移植后28天，BMC治疗的小鼠中供体嵌合和DP供体胸腺细胞的绝对数量分别比仅接受移植的小鼠高1.5倍和2倍(图4G)。在BMC治疗的小鼠中，还有更高的供体嵌合和供体来源的单阳性CD4⁺(分别为2倍和3倍)和单阳性CD8⁺(分别为1.7倍和15倍)胸腺细胞的绝对数量(图4H和4I)。在外围，供体嵌合在CD4⁺(3.5倍)和CD8⁺(2.5倍)T细胞中更高。在嵌合现象或B细胞绝对数量方面没有观察到差异。

接下来使用已建立的异种NSG-BLT小鼠模型测量人T细胞重建的速率(Brainard,D.M.等，Induction of robust cellular and humoral virus-specific adaptiveimmune responses in human immunodeficiency virus-infected humanized BLT mice，Journal of virology 83,7305-7321(2009))。在BMC处理的NSG-BLT小鼠中，T细胞重建的初始速率早期增强，B细胞重建速率湿度、短暂降低(图5A和5B)，而BMC处理的NSG-BLT小鼠骨髓中的前B细胞CFU暂时减少(图5C)。在移植后50天至60天，BMC处理的小鼠中外周CD4⁺:CD8⁺T细胞比率稳定，而对照NSG-BLT中CD4⁺区室没有完全重建(图5D)。引人注目的是，T细胞重建速率的提高没有加速GVHD相关死亡率。相反，接受双功能化BMC的NSG-BLT小鼠比NSG-BLT小鼠存活时间更长(图5F)。在BMC处理的NSG-BLT小鼠中，在该模型中移植后50天，BMC处理小鼠的胸腺和脾脏中的CD4⁺FoxP3⁺调节性T细胞(T_reg)高2倍(图5G和5H)。在接受BMC的同种异基因MHC错配HSCT小鼠模型中观察到类似的存活率提高(图5I)，并且供体来源的CD4+FoxP3+T_reg在该模型的BMC处理小鼠在移植15天后胸腺和脾脏中分别高出5倍和4倍(图5J)。

接下来将本发明的BMC治疗与广泛研究的T细胞祖细胞输注方法进行比较，所述方法主要由施用OP9-DL1饲养细胞离体产生的双阴性(DN)2和双阴性(DN)3前体(＞90％)组成(图5K)。在HSCT后28天，在DP、SP4和SP8胸腺细胞群中，BMC处理小鼠的供体嵌合显著更高(图5L-5N)。在脾脏中，CD4⁺和CD8⁺T细胞的供体嵌合均更高，并且在BMC处理中发现供体CD4⁺和CD8⁺T细胞的绝对数量更高(图5O和5P)。

实施例5：BMC增强再生T细胞的多样性和功能

T细胞受体的多样性(TCR多样性)是通过胸腺中基因片段的随机体细胞重组产生的。在双BMC处理的小鼠中，移植后约6周，胸腺细胞结构和胸腺重量显著高于仅移植对照组(图3Q和3R)。为了表征胸腺细胞结构的增加是否也增强了同基因移植中再生的T细胞的功能和多样性，定量了TCR切除环(TREC)。TREC是TCR重排的标志。还进行了TCR库分析。移植后1个月，双BMC处理小鼠胸腺中的TREC数与未辐射对照小鼠相似，并且均大于仅移植小鼠和BMP-2BMC处理小鼠的TREC数(图6A)。在脾脏中，相较于未辐射对照组，在相同组中注意到总体TREC数量较少，但与仅移植和单因子BMP-2BMC组相比，用双BMC处理的小鼠仍具有个更高的TREC计数(图6B)。在HSCT后30天，使用辛普森指数(SI)在BMC处理和移植小鼠中评估了CDR3β链中TCR V和J片段的多样性，该指数考虑了存在的T细胞克隆的数量以及每个克隆的相对丰度。具有双功能化BMC的小鼠的SI是未辐射对照小组的40％，而仅移植或BMP-2BMC的小鼠的SI较低(分别为16％和8％)(图6C)。在HSCT中，缺乏具有广泛TCR库的初始T细胞与免疫并发症和机会性感染的风险增加有关(Douek,D.C.等，Assessment of thymic outputin adults after haematopoietic stem cell transplantation and prediction of T-cell reconstitution，The Lancet 355,1875-1881 1076(2000))。双BMC处理小鼠的胸腺和外周中大量TREC的恢复反映了胸腺生成的增加。在用双BMC处理的小鼠中也观察到相对较高的特定TCR克隆频率，但更大的整体多样性表明胸腺衍生重建更加平衡。

为了测量再生T细胞以抗原特异性方式响应的能力，将同基因移植物接种并随后在移植后30天用模型蛋白卵清蛋白(OVA)挑战(图6D)。与未接受BMC或仅接受BMP-2的BMC的移植小鼠相比，OVA表位(SIINFEKL)-四聚体⁺CD8+T细胞在接受双功能化BMC的小鼠中显著更高(图6E)。类似地，在接受同种异基因移植的双BMC处理的小鼠中，供体抗原特异性T细胞响应比原T细胞疗法产生的响应高约3倍(图6F)。发现体外刺激后干扰素(IFN)-γ和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的产生与BMC治疗组和T细胞祖细胞治疗组在第22天供体CD4⁺和CD8⁺T细胞相当，但是在第42天来自BMC治疗组的显著更大比例的T细胞产生了这些因子(图6G和6H)。在HSCT后BMC处理小鼠中接种后CD8⁺T细胞的强大抗原特异性生成表明BMC治疗有可能与HSCT后接种结合使用。

实施例6：材料和方法

本发明是使用以下材料和方法进行的。

通用方法和统计

动物研究的样本量基于先前的工作，没有使用额外的统计估计(Brainard,D.M.等，Induction of robust cellular and humoral virus-specific adaptive immuneresponses in human immunodeficiency virus-infected humanized BLT mice，Journalof virology 83,7305-7321(2009)；Bencherif,S.A.等，Injectable cryogel-basedwhole-cell cancer vaccines.Nature communications 6,7556(2015)；Palchaudhuri,R.等，Non-genotoxic conditioning for hematopoietic stem cell 1066transplantationusing a hematopoietic-cell-specific internalizing immunotoxin，Naturebiotechnology 34,738(2016))。使用GraphPad Prism软件通过使用单向反差分析和Tukeypost hoc测试分析结果。在使用方差分析的情况下，通过Bartlett检验发现组之间的差异相似。通过使用对数秩(Mantel–Cox)检验分析生存曲线。字数编码用于盲法样本和血液计数。

材料

高古洛糖酸盐含量的UP LVG海藻酸钠购自ProNova Biomedical；2-吗啉乙磺酸(MES)、氯化钠(NaCl)、氢氧化钠(NaOH)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)、甲基丙烯酸2-氨基乙酯盐酸盐(AEMA)和丙酮购自Sigma-Aldrich。ACRL-PEG-NH2(3.5kDa)和4arm PEG丙烯酸酯(10kDa)购自JenKem Technology。

骨髓冷冻凝胶(BMC)制造

骨髓冷冻凝胶是按照先前描述的技术进行一些修改制成的(Bencherif,S.A.等Injectable preformed scaffolds with shape-memory properties.Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the United States of America 109,19590-19595(2012)。所述海藻酸盐与AEMA反应制备甲基丙烯酸海藻酸盐(MA-海藻酸盐)。将海藻酸钠溶解在100mM MES缓冲液的缓冲溶液(0.6％(wt/vol)，pH≤6.5)中。向混合物中加入NHS和EDC以激活海藻酸盐骨架上的羧酸基团，然后加入AEMA(NHS:EDC:AEMA的摩尔比＝1:1.3:1.1)，并将溶液在室温(RT)下搅拌24小时。混合物在丙酮中沉淀，过滤并在真空烘箱中室温干燥过夜。通过在去离子水中制备2.5wt％的MA-海藻酸盐和4arm PEG丙烯酸酯大分子单体溶液(摩尔比MA-海藻酸盐：4arm PEG丙烯酸酯＝4：1)，然后加入四甲基乙二胺(TEMED)(0.5％(wt/vol))和过硫酸铵(APS)(0.25％(wt/vol))合成海藻酸盐-PEG BMC。使用碳二亚胺化学(NHS:EDC:DLL4的摩尔比＝1:1.3:1.1)将ACRYL-PEG-NH2与Delta样配体4(DLL-4)(R&DSystems)缀合。在低温聚合之前将BMP-2(R&D Systems)加入到聚合物溶液中。所有前体溶液在冷冻前均预冷至4℃以降低聚合速率。在预聚物溶液中加入引发剂后，将溶液迅速地转移到预冷(-20℃)的聚四氟乙烯模具上。孵育过夜后，将凝胶解冻并收集在冰上的培养皿中。

对于扫描电子显微镜(SEM)，将BMC在浓度增加的新鲜制备的乙醇溶液(30、50、70、90和100％)中各孵育20分钟。然后将BMC在六甲基二硅氮烷(电子显微镜科学)中孵育10分钟并在干燥器/真空室中干燥至少1小时，然后将它们安装用于SEM。使用碳带将干燥的BMC粘附到样品存根上，并在溅射涂布机中涂上铂/钯。在Carl Zeiss Supra 55VP场发射扫描电子显微镜(SEM)上使用二次电子检测对样品进行成像。

生物分子释放定量

BMP-2的储备浓度从制造商处获知并使用ELISA进行验证。为了确定BMP-2的释放动力学包封率并确认DLL-4的稳定结合，将BMC在1ml无菌PBS中在37℃下振荡孵育。定期更换介质。通过ELISA(Peprotech)检测上清液中释放的药剂。样品被释放直到在释放介质中不再检测到BMP-2。随后，使用至少1000U的海藻酸盐裂解酶消化冷冻凝胶。使用ELISA分析消化产物的BMP-2。将冷冻凝胶和释放介质中BMP-2和DLL-4的量与加载的BMP-2和DLL-4的已知量进行比较，以计算包封率。

生物分子活性测定

BMP-2生物活性的碱性磷酸酶活性测定

MC3T3-E1亚克隆4细胞用于进行碱性磷酸酶测定，如Macdonald,M.L.等，Tissueintegration of growth factor-eluting layer-by-layer polyelectrolytemultilayer coated implants,Biomaterials 32,1446-1453(2011)中所述。细胞在不同的实验条件下培养：(1)生长培养基，(2)补充有BMP-2从BMC释放的分化培养基和(3)天然BMP-2。DLL-4生物活性的Notch激活测定

为了定量暴露于血清蛋白后DLL-4的体外生物活性，这可以在体内使该形态发生素失活，使用先前表征的Notch报告细胞系CHO-K1+2xHS4-UAS-H2B-Citrine-2xHS4 cH1+hNECD-Gal4esn c9，是来自M.Elowitz(Caltech)的礼物(Sprinzak,D.等，Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signalingstates.Nature 465,86(2010)；Nandagopal,N.等Dynamic ligand discrimination inthe Notch signaling pathway.Cell 172,869-880,e819(2018))。这些细胞在补充有10％Tet System Approved FBS(Clontech)、100U/ml青霉素-100μg链霉素-0.292mg/ml L-谷氨酰胺(Gibco)的Alpha MEM Earle’sSalts(Irvine Scientific)中，在37℃在潮湿环境中存在5％的CO2下生长。含有或不含DLL-4的BMC在96孔板中与完全细胞培养基一起孵育，不含细胞。在预定的时间间隔(最多3个月)，将2万个Notch报告细胞接种到BMC的孔中。24小时后，使用Zeiss LSM 710共聚焦系统进行共聚焦显微镜检查。响应于Notch配体DLL-4结合的比色输出被定量并用作支架中DLL-4生物活性的指标(图1H)。特别是，计算了视野中每个细胞的总YFP荧光(50-100；4-5个视野，包括超过80％的凝胶表面)并减去背景荧光。计算中值YFP荧光并将其除以接种在没有DLL-4的BMC上的细胞的中值荧光并报告。

通过表面等离子体共振进行的亲和力测定

野生型DLL4和MA-DLL4对于Notch1的解离常数通过表面等离子体共振使用BIAcore T200仪器(GE Healthcare)如前所述来测定(Heliotis,M.,Lavery,K.,Ripamonti,U.,Tsiridis,E.&Di Silvio,L.Transformation of a prefabricatedhydroxyapatite/osteogenic protein-1implant into a vascularised pedicled boneflap in the human chest,International journal of oral and maxillofacialsurgery 35,265-269(2006))。简而言之，生物素化的重组Notch1被固定在链霉素亲和素涂层的传感器芯片上(GE Healthcare)。在20℃下，将缓冲液中浓度不断增加的野生型甲基丙烯酸化DLL4蛋白流过芯片。结合和解离阶段分别以10μl/min进行120秒和60秒。使用BIAcore评估软件将稳态结合曲线拟合到1:1Langmuir模型以确定K_d。

骨髓冷冻凝胶(BMC)中的体外细胞培养

从四肢收获小鼠BM细胞。粉碎的组织和细胞通过70微米的筛网过滤。将细胞通过20号针头，制备单细胞悬液。通过使用血细胞计数器对细胞进行计数来确定总细胞数量。通过磁选择(BD Biosciences)去除BM细胞中的成熟免疫细胞(表达CD3-β、CD45R/B220、Ter-119、CD11b或Gr-1)。细胞与Pacific Blue偶联谱系抗体(CD3、NK1.1、Gr-1、CD11b、CD19、CD4和CD8的抗体)以及Sca-1和c-kit特异性抗体的混合物一起孵育。使用FacsAria细胞分选仪(BD)分离造血细胞(Lin^-Sca-1^hic-kit^hi)。分选的细胞纯度≥95％。购买人脐血衍生的CD34+细胞(Allcells)并使用扩增补充剂(Stemcell Technologies)扩增7天。使用阳性选择试剂盒(StemCell Technologies)分离CD34⁺细胞。96孔板用Pluronic F127(Sigma)预涂覆。每个BMC单独放置在96孔板的孔中。将一万个如上所述分离的小鼠或人细胞加入到同一孔中的200μl体积的RPMI(含L-谷氨酰胺)1640中，其中含有10％胎牛血清(FBS)和1％抗生素和抗菌溶液(含青霉素、链霉素和两性霉素B)。对于小鼠细胞，培养基中添加了10ng/ml干细胞因子(SCF；R&D Systems)、10ng/mL FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt3L；R&D Systems)和1ng/mL白介素7(IL-7；R&D Systems)在第2、4和6天进行50％培养基置换步骤。对于人细胞，培养基中添加了100ng/mL SCF、100ng/mL Flt3L、100ng/mL TPO(R&D Systems)。培养一周后，通过用1mg/ml海藻酸盐裂解酶(Sigma)消化BMC来分离细胞。将溶液通过70μm过滤器，如下所述处理细胞用于FACS分析。

BM移植和血液分析

所有的动物工作都得到了哈佛机构动物护理和使用委员会的批准，并遵循了美国国立卫生研究院的指导方针和相关的伦理规定。C57BL/6(B6,H-2^b)、BALB/c(H-2^d)、C57BL/6(CD 45.1⁺)、CByJ.B6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J(GFP)和NSG小鼠(Jackson Laboratories)是雌性，并在实验开始时年龄为6至8周。每个实验中的所有小鼠都是年龄匹配的，没有进行随机化。预先建立的动物遗漏标准是未能在移植的小鼠中注射所需的细胞剂量，并由于人源化小鼠的手术后并发症而死亡。与手术无关的健康问题(例如，咬合不正、严重皮炎)是遗漏和安乐死的标准。

移植模型

所有TBI实验均用Cs-137γ辐射源进行。亚致死TBI(SL-TBI，B6受体)，1x500cGy+5x10⁵谱系贫化骨髓细胞；同基因HSCT(syn-HSCT，B6受体)1x1000cGy+5x10⁴至5x10⁵(如图所示)谱系贫化的GFP BM细胞；具有GVHD的同种异基因HSCT(BALB/cMHC错配受体)1x850cGy+5x10⁵谱系贫化的GFP BM细胞+1x10⁶GFP脾细胞；没有GVHD的同种异基因HSCT(BALB/c MHC错配受体)1x850cGy+5x10⁵谱系贫化的GFP BM细胞或5x10⁶体外产生的GFP T细胞祖细胞+103同基因HSC，如其他地方所述，未经修改48。人源化BLT(骨髓-肝-胸腺)小鼠研究由MGH和Ragon研究所人类免疫系统小鼠项目进行，并获得IACUC机构的批准，如前所述(Brainard,D.M.等，Induction of robust cellular and humoral virus-specific adaptiveimmune responses in human immunodeficiency virus-infected humanized BLT mice,Journal of virology 83,7305-7321(2009))。用于移植或分析的BM细胞是通过分别压碎所有四肢或一根股骨来收获的，并如上所述进行处理。当小鼠被麻醉时，通过16号针头将悬浮在0.2ml无菌PBS中的两种BMC皮下注射到背侧。在脊柱的每一侧注射一个BMC，并位于后肢和前肢之间的大约中间位置。通过使用卡尺测量结节的长度、宽度和高度，随时间量化皮下结节大小。对所有组的小鼠(通常10只小鼠/组)进行连续放血。通过CBC分析(AbaxisVetScan HM5)量化白细胞、血红蛋白、红细胞、血小板和血细胞比容水平。.

为了直接评估来自BMC的细胞是否迁移到胸腺，将双因子BMC与干细胞疗法一起递送到一组初始的致死辐射小鼠中(接受1000cGy L-TBI和5x10⁵谱系贫化的GFP BM细胞及双因子BMC的B6受体)。HSCT后10天，双因子BMC被移出并立即通过手术移植到第二组B6小鼠的皮下口袋中，这些小鼠在48小时前接受了500cGy SL-TBI，没有任何额外的细胞移植。手术后20天，处死小鼠并分析这些小鼠的胸腺细胞。

流式细胞术(FACS)分析

针对CD8-α(53-6.7)、CD3-α(145-2C11)、B220(RA3-6B2)、CD11b(M1/70)、CD25(PC61)、CD117(2B8)的抗小鼠抗体)、Sca-1(D7)、CD127(A7R34)和针对CD45(H130)、CD3(HIT3a)、CD4(SK3)、CD19(HIB19)、CD34(581)、CD38(HB-7)的抗人抗体)和CD7(CD7-6B7)、IFN-γ(XMG1.1)、TNF-α(MP6-XT22)和相应的同种型抗体购自BioLegend。抗人CD8(RPA-T8)购自BD Biosciences。CD44(IM7)购自eBioscience。SIINFEKL四聚体(Alexa Fluor 647H-2K^b OVA)获自NIH Tetramer Core Facility。所有细胞都基于前向和侧向散射特性进行门控，以限制包括死细胞在内的碎片。根据制造商的建议稀释抗体。基于荧光减去一个对照对细胞进行门控，并记录每个标记物染色阳性的细胞频率。为了定量T、B和骨髓细胞，血液样本被红细胞裂解并用抗CD45、-B220、-CD3、-CD4、-CD8和-CD11b抗体染色，以及使用流式细胞术频率和通过CBC分析获得的白细胞值计算T、B和骨髓细胞的绝对数量。分析基于血细胞的CD45+和基质细胞的CD45门内的供体事件。

骨、脂肪定量和组织学

安乐死后，移出BMC和组织。为了使用骨碱性磷酸酶(BALP)对骨进行定量，将BMC和股骨压碎并均质化并通过70μm过滤器过滤。随后，根据制造商的方案，使用BALP ELISA试剂盒(Creative Diagnostics)对BALP进行定量。油红O染色试剂盒(Biovision)用于脂质定量。根据制造商的方案对收获的BMC和骨进行清洗、固定、处理和染色。在测量吸光度(OD₄₉₂)之前，BMC和骨骼随后被压碎、变形并等体积重悬。对于组织学染色，将组织固定在4％多聚甲醛(PFA)中。使用快速脱钙甲酸/盐酸混合物(脱钙溶液，VWR)对固定PFA的样品进行部分脱钙约4小时，并嵌入石蜡中。样品切片(5μm)用常规三色、番红-O或Verhoeff–Van Gieson染色。

胸腺T细胞受体切除环(TREC)的定量

如前所述进行TREC定量(Warnke,P.等，Growth and transplantation of acustom vascularised bone graft in a man,The Lancet364,766-770(2004))。简而言之，从未辐射的C57BL/6小鼠、移植小鼠和注射BMC的移植小鼠(调理后30天)收获胸腺。在Bullet Blender Storm BBX24仪器(Next Advance,Inc.)中组织匀浆后，使用TRIZOL提取总DNA。DNA通过UV-Vis定量，每个样品1μg DNA用作实时PCR的输入。使用小鼠sjTREC质粒的标准曲线计算每个样本的信号连结TREC(sjTREC)的绝对数量。

TCR分析

使用UV-Vis定量提取的淋巴细胞RNA。将来自每个样品的等摩尔量的RNA提交给iRepertoire进行测序和生物信息学分析，其中使用特异性扩增βTCR RNA的引物组对样品进行逆转录和扩增。测序结果给出了每个样本的总读数范围和独特CDR3的数量。

接种和非特异性T细胞刺激研究

移植后30天，用含有100μg卵清蛋白(OVA)、100μg CpG-ODN和1μg GM-CSF的推注疫苗免疫动物。10天后，用静脉注射卵清蛋白挑战动物。在第12天，在接种研究中从安乐死的小鼠中收集脾脏。通过对70μm细胞过滤器机械破碎脾脏来分离脾细胞。裂解收集的组织中的红细胞并制备白细胞用于分析。对于非特异性刺激，将细胞与PMA(10ng/mL)+离子霉素(2μM)孵育5小时。育2小时后加入布雷菲尔德菌素A(10μg/mL)。然后收获细胞，洗涤，并用荧光染料偶联的T细胞表面抗原抗体染色。随后，用固定/透化溶液试剂盒试剂(BD)固定和透化细胞，并用IFN-γ、TNF-α特异性抗体染色。

讨论

在此，证明了基于无细胞生物材料的BMC模仿了T细胞淋巴细胞生产骨髓生态位的关键特征，并在造血干细胞移植后促进了免疫活性T细胞的再生。皮下注射BMC与宿主脉管系统连接以形成宿主-装置界面，并在体内向供体募集的祖细胞提供谱系指导性线索。众所周知，BMP-2诱导募集的间充质细胞的骨系分化并间接促进快速新血管生成(Smadja,D.M.等Bone morphogenetic proteins 2and 4are selectively expressed by lateoutgrowth endothelial progenitor cells and promote neoangiogenesis,Arteriosclerosis,thrombosis,and vascular biology 28,2137-2143(2008)。在这项工作中，观察到早期心血管生成，随后血管系统成熟到与内源性骨髓中观察到的密度一致的密度(Lafage-Proust,M.-H.等Assessment of bone vascularization and its role inbone remodeling.BoneKEy reports 4(2015))。在BMC内定量的各种造血和基质祖细胞群的发现与先前对异位骨结节内发生的造血的观察结果一致(Kuznetsov,S.A.等，Theinterplay of osteogenesis and hematopoiesis:expression of a constitutivelyactive PTH/PTHrP receptor in osteogenic cells perturbs the establishment ofhematopoiesis in bone and of skeletal stem cells in the bone marrow,J CellBiol 167,1113-1122(2004))；Song,J.等，An in vivo model to study and manipulatethe hematopoietic stem cell niche,Blood 115,2592-2600(2010))。在聚合物支架上掺入生物活性Notch配体DLL-4促进了BMC中T细胞祖细胞生成的早期增强，并导致胸腺祖细胞数量相对于接受谱系贫化的骨髓移植的对照组显著增加，并且对照组与已建立的同基因和同种异基因HSCT模型一致(Wils,E.-J.等，Flt3 ligand expands lymphoid progenitorsprior to recovery of thymopoiesis and accelerates T cell reconstitution afterbone marrow transplantation,The Journal of Immunology 178,3551-3557(2007)；Maillard,I.等，Notch-dependent T-lineage commitment occurs at extrathymicsites following bone marrow transplantation,Blood 107,3511-3519(2006)。这一发现得到了TREC生成增加、TCR库的复杂性增加和接种效力增加的支持。

BMC方法在概念上和实践中与促进HSCT后T细胞再生的其他策略不同，并且其在HSCT中的相关性得到了这项工作中的临床前研究的支持。当使用比T细胞祖细胞输注低10倍的剂量时，它导致胸腺和外周中T细胞祖细胞和功能性T细胞数量增多。BMC治疗与其他方法不同，因为它可以在HSCT时同时施用。相反，所述T细胞祖细胞是在2-4周内从供体造血细胞体外产生的，在临床前模型中具有复杂的细胞培养要求，并且具有患者特异性。通过为体内移植的HSCT提供T细胞促进线索，无需离体培养，BMC方法可能是一种现成的产品，避免了细胞制造所需的大量基础设施(Garber,K.(Nature Publishing Group,2018)并可能补充细胞因子疗法的活动。当在HSCT前使用较低的辐射剂量时，BMC适度增强外周的T细胞重建，但显著增加胸腺中供体衍生T细胞生成和供体T细胞嵌合现象。这一发现表明BMC的应用将与较低强度的HSCT设定有关。

异种NSG-BLT小鼠中人T细胞重建的增强伴随着B细胞重建的适度和短暂的减少，与前B CFU的相应减少一致。虽然这种人源化小鼠模型被人免疫细胞广泛接受，但众所周知，关键的小鼠细胞因子在诱导造血方面效率低下，包括在该模型中从人CD34⁺细胞发育人B细胞(Jangalwe,S.,Shultz,L.D.,Mathew,A.&Brehm,M.A.Improved B cell developmentin humanized NOD-scid IL2Rγnull mice transgenically expressing human stemcell factor,granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin-3,Immunity,inflammation and disease 4,427-440(2016))。可能是移植细胞部分的Notch激活，其种子BMC以牺牲B细胞专向分化为代价增强了T细胞专向分化。然而，B细胞生成的短暂减少是适度的并且不太可能具有临床意义。

骨结节的形成仅限于支架的几何形状，这与之前关于支架诱导的骨形成的报道一致，其在许多物种中已被很好地耐受，包括非人灵长类动物(Ripamonti,U.Bone inductionby recombinant human osteogenic protein-1(hOP-1,BMP-7)in the primate Papioursinus with expression of mRNA of gene products of the TGF-βsuperfamily,Journal of cellular and molecular medicine 9,911-928(2005)以及在人类中(Heliotis,M.,Lavery,K.,Ripamonti,U.,Tsiridis,E.&Di Silvio,L.Transformation ofa prefabricated hydroxyapatite/osteogenic protein-1implant into avascularisedpedicled bone flap in the human chest.International journal of oral andmaxillofacial surgery 35,265-269(2006)；Warnke,P.等Growth and transplantationof a custom vascularised bone graft in a man,The Lancet 364,766-770(2004))。过去使用其他基于支架的系统的临床经验表明，该装置的尺寸在不同物种之间可能保持不变(Hodi,S.(2012))。即使对于人类使用可能需要更大的生长因子剂量，预计这种基于聚合物的水凝胶系统提供的控释将允许使用BMP-2的剂量比目前在临床上使用的大剂量低几个数量级，其以推注形式递送并且与不良副作用有关(Carragee,E.J.,Hurwitz,E.L.&Weiner,B.K.Acritical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2trialsin spinal surgery:emerging safety concerns and lessons learned,The SpineJournal 11,471-491(2011))。T细胞再生后，BMC可以很容易地去除，类似于HSCT中常用的其他装置或由可生物降解材料制成以再吸收(Biffi,R.等，Use of totally implantablecentral venous access ports for high-dose chemotherapy and peripheral bloodstem cell transplantation:results of a monocentre series of patients,Annalsof oncology 15,296-300(2004))。

同种异基因HSCT后CD4⁺T细胞的恢复通常会延迟，导致正常CD4/CD8比率的倒置(Li,M.O.&Rudensky,A.Y.T cell receptor signalling in the control of regulatoryT cell differentiation and function.Nature Reviews Immunology 16,220(2016))。在BMC治疗的小鼠中，人源化和同种异基因移植小鼠的胸腺和脾脏中的T细胞重建更加平衡并且供体CD4⁺调节性T细胞(T_reg)增强。鉴于供体T_reg在GVHD抑制中的关键作用(Hoffmann,P.,Ermann,J.,Edinger,M.,Fathman,C.G.&Strober,S.Donor-type CD4⁺CD25⁺regulatoryT cells suppress lethal acute graft-versus-host disease after allogeneic bonemarrow transplantation,Journal of Experimental Medicine 196,389-399(2002))，BMC介导的供体T_reg生成增强可能有助于减轻GVHD样病理学和提高小鼠生存率，这可能是通过TGF-β家族蛋白(是Treg扩增的关键调节因子)的BMP-2调节((Wan,Y.Y.&Flavell,R.A.‘Yin–Yang’functions of transforming growth factor-βand T regulatory cells inimmune regulation,Immunological reviews 220,199-213(2007))。此外，同种异基因GVHD模型中的时间过程与至少一些BMC作用一致，这是由于对预先存在的T型或成熟T细胞的影响。

总而言之，这些发现表明BMC代表了一种易于使用、现成的系统，其可以增强HSCT后的T细胞再生。如果BMC系统在人类环境中表现相似，则它可能是消除限制潜在治愈性HSCT临床应用的免疫并发症和机会性感染的一种手段。

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