阅读说明：本技术 在深层棒状杆菌培养中增加氨基酸产量的方法 (Method for increasing amino acid production in submerged corynebacteria culture ) 是由 L·G·布鲁德里克 P·G·卡伊米 T·M·格鲁伯尔 B·G·勒菲弗 Y·任 于 2018-11-20 设计创作，主要内容包括：描述了用于在深层棒状杆菌培养中提高氨基酸谷氨酸和赖氨酸产量的方法,所述方法包括向深层棒状杆菌培养中添加用过的木霉发酵液的非酶级分,其中与在没有用过的木霉发酵液的非酶级分的情况下在相同的深层培养中生长的棒状杆菌相比,在用过的木霉发酵液的非酶级分存在下生长的棒状杆菌产生的小分子量增加,其中氨基酸谷氨酸和赖氨酸产量的增加不是由于用过的木霉发酵液中的酶活性。(A method for increasing the production of the amino acids glutamic acid and lysine in a C.deep culture is described, the method comprising adding a non-enzymatic fraction of a used Trichoderma fermentation broth to the C.deep culture, wherein the increase in production of the amino acids glutamic acid and lysine is not due to enzymatic activity in the used Trichoderma fermentation broth, produces an increase in small molecular weight compared to a C.corynebacterium grown in the same submerged culture without the non-enzymatic fraction of the used Trichoderma fermentation broth, wherein the increase in production of the amino acids glutamic acid and lysine is due to the same enzyme activity in the used Trichoderma fermentation broth.)

在深层棒状杆菌培养中增加氨基酸产量的方法

技术领域

本发明方法涉及通过用用过的木霉(Trichoderma)发酵液的非酶级分补充棒状杆菌(Corynebacterium)生长培养基来增加深层棒状杆菌培养中小分子产量。

背景技术

棒状杆菌是革兰氏阳性需氧杆菌，其包括可用于工业应用的成员以及人类病原体。棒状杆菌的非致病性物种用于生产氨基酸、核苷酸、类固醇、细菌素和酶。最著名的物种是谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)，其产生在食品工业中以谷氨酸一钠出售的谷氨酸。基因工程化的谷氨酸棒状杆菌产生赖氨酸。棒状杆菌通常在使用葡萄糖、果糖或葡萄糖加果糖和蔗糖作为主要碳源的深层培养中生长。

木霉是存在于土壤中的丝状真菌(filamentous fungi)。许多物种被表征为机会性的、无毒的植物共生体。木霉产生多种酶，包括纤维素酶和半纤维素酶。木霉还被工程化以产生和分泌重组酶，例如过氧化氢酶、葡糖淀粉酶、漆酶等。木霉的生产率非常高，并且每升深层培养物超过100克重组酶的滴度并不少见。一些木霉酶产品作为完全肉汤产品出售，通常包括杀死的细胞。其他木霉酶产品以纯化形式出售，在这种情况下，用过的木霉生长培养基将被丢弃。

发明内容

本发明方法涉及通过用用过的木霉发酵液的非酶级分补充棒状杆菌生长培养基来增加深层棒状杆菌培养中小分子产量。所述方法的方面和实施例描述于以下独立编号的段落中。

1.在一方面中，提供了一种用于在深层棒状杆菌培养中提高小分子产量的方法，所述方法包括向深层棒状杆菌培养中添加用过的木霉发酵液的非酶级分，其中与在没有用过的木霉发酵液的非酶级分的情况下在相同的深层培养中生长的棒状杆菌相比，在用过的木霉发酵液的非酶级分存在下生长的棒状杆菌产生的小分子量增加，其中小分子产量的增加不是由于用过的木霉发酵液中的酶活性。

2.在段落1所述的方法的一些实施例中，通过过滤完全或分级的用过的木霉发酵液来产生所述用过的木霉发酵液的非酶级分。

3.在段落1所述的方法的一些实施例中，通过对完全或分级的用过的木霉发酵液进行热处理来产生所述用过的木霉发酵液的非酶级分。

4.在段落1所述的方法的一些实施例中，用于增加小分子产量的所述用过的木霉发酵液的非酶级分是添加到所述深层棒状杆菌培养中的完全或分级的用过的木霉发酵液的组分。

5.在前述段落中任一项所述的方法的一些实施例中，所述用过的木霉发酵液的非酶级分是产生重组酶的发酵的副产物。

6.在段落5所述的方法的一些实施例中，用于增加小分子产量的所述木霉发酵液的非酶级分还包含所述重组酶。

7.在段落5所述的方法的一些实施例中，从用于提高小分子产量的所述木霉发酵液的非酶级分中除去所述重组酶。

8.在段落5-7中任一项所述的方法的一些实施例中，所述重组酶是碳水化合物加工酶。

9.在前述段落中任一项所述的方法的一些实施例中，当对棒状杆菌培养进行接种时添加至少一部分用过的发酵液。

10.在前述段落中任一项所述的方法的一些实施例中，在接种木霉肉汤之后至少29小时从木霉生长培养物中收获所述用过的发酵液。

11.在前述段落中任一项所述的方法的一些实施例中，在所述肉汤中表达目的蛋白之前，从木霉生长培养物中收获所述用过的发酵液。

12.在前述段落中任一项所述的方法的一些实施例中，所述小分子是氨基酸。

13.在段落12所述的方法的一些实施例中，所述氨基酸是谷氨酸或赖氨酸。

14.在前述段落中任一项所述的方法的一些实施例中，小分子产量的增加不是棒状杆菌培养中细胞质量增加的结果。

15.在另一方面，提供了通过段落1-14中任一项所述的方法产生的在深层棒状杆菌培养中产生的小分子。

16.在另一方面，提供了用过的木霉发酵液的非酶级分用于增加在深层棒状杆菌培养中产生的小分子的量的用途。

17.在一些实施例中，将如段落16中所述的用过的木霉发酵液的非酶级分的用途与段落1-14中任一项所述的特征组合。

根据包括附图的说明书，本发明的方法的这些和其他方面以及实施例将是清楚的。

附图说明

图1是显示在其中添加了用过的木霉发酵液的棒状杆菌培养中葡萄糖消耗(g/L)和谷氨酸产量(g/L)随时间(小时)变化的图。

图2是显示在从其中定期取样用过的木霉发酵液的木霉培养中总分泌蛋白产量(g/L)和干细胞重量(g/kg)的图。

图3是显示不同时间点(小时)取自木霉培养的用过的木霉发酵液对棒状杆菌培养中谷氨酸产量(g/L)的影响的图。

具体实施方式

I.引言

本发明方法涉及通过用用过的木霉发酵液的非酶级分补充棒状杆菌生长培养基来增加深层棒状杆菌培养中小分子产量。

II.定义和缩写

在详细描述方法之前，为清楚起见定义以下术语。未定义的术语应当符合相关领域中所使用的常规含义。

如本文所用，“深层培养”是指用于生长微生物培养物的方法，其中使微生物在进行连续剧烈搅拌的液体培养基中孵育。

如本文所用，“发酵生物体”是当在深层培养中生长时能够产生目的产物(如氨基酸或蛋白质)的微生物。

如本文所用，“用过的肉汤”是指已经在其中生长过微生物的深层培养生长培养基。用过的肉汤含有分泌到培养基中的化合物。“完全的用过的”肉汤还包括在培养基中生长的微生物(细胞)。“分级的用过的肉汤”已经过某种方式处理，以除去用过的肉汤中的至少一些组分。

如本文所用，即使可能存在变性的酶蛋白，用过的肉汤的“非酶级分”基本上不含酶蛋白或基本上不具有酶活性。

如本文所用，“小分子”是非聚合物的低分子量(<900Da)有机化合物。

如本文所用，“木霉”是根据国家生物技术信息中心(NCBI，马里兰州贝塞斯达，美国(NCBI,Bethesda MD,USA))截至2017年具有以下谱系的生物体的属：真核生物；后鞭毛生物；真菌；双核菌亚界(Dikarya)；子囊菌门(Ascomycota)；酵母菌(saccharomyceta)；盘菌亚门(Pezizomycotina)；锤舌菌纲(leotiomyceta)；粪壳菌超纲(sordariomyceta)；粪壳菌纲(Sordariomycetes)；肉座菌亚纲(Hypocreomycetidae)；肉座菌目(Hypocreales)；肉座菌科(Hypocreaceae)。

如本文所用，“棒状杆菌”是根据NCBI截至2017年具有以下谱系的生物体的属：细菌；陆生菌(Terrabacteria group)；放线菌门(Actinobacteria)；放线菌纲(Actinobacteria)；棒杆菌目(Corynebacteriales)；棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)。

如本文所使用的，单数冠词“一个/种(a/an)”以及“所述”涵盖复数个指示物，除非上下文另外明确指明。本文引用的所有参考文献均通过引用以其全文特此并入。

除非另外说明，以下缩写/首字母缩略词具有以下含义：

Da 道尔顿

w/v 重量/体积

w/w 重量/重量

v/v 体积/体积

℃ 摄氏度

g或gm 克

μg 微克

mg 毫克

kg 千克

μL和μl 微升

mL和ml 毫升

mm 毫米

μm 微米

mol 摩尔

mmol 毫摩尔

M 摩尔的

mM 毫摩尔的

μM 微摩尔的

nm 纳米

ppm 份/百万份

hr或hrs 小时

RPM 每分钟转数

SLPM 每分钟标准升

III.用过的木霉肉汤

木霉被广泛用于在工业规模上生产和分泌重组酶(参见例如，

S.和M.(1995)Current Opinion in Biotechnology[生物技术新观点]6:534-37；Ahamed,A.和Vermette,P.(2009)Bioresource Technology[生物资源技术]100:5979-87；以及Helena Nevalainen,H和Petersonl,R.(2014)Front Microbiol[微生物学前沿].5:75)。菌株、培养基组分和培养条件是众所周知的。

本发明方法涉及完全或分级的用过的木霉发酵液(必然包括用过的肉汤的非酶级分)来增加由在深层培养中生长的棒状杆菌产生的小分子的量的用途。

在一些实施例中，仅将用过的木霉肉汤的非酶级分添加到棒状杆菌培养中。该级分可以基本上不含酶，这意味着肉汤中不存在具有酶活性的蛋白质，或者可以基本上不含活性酶，这意味着肉汤中的酶活性已经通过肉汤的物理或化学处理而被破坏。

可以通过过滤用过的木霉肉汤以将对棒状杆菌培养产生有益作用的组分从具有酶活性的蛋白质中分离出来来消除酶活性。这种过滤可以涵盖过滤以除去分子量大于约30KDa的蛋白质。

酶活性可替代地或另外地通过将用过的木霉肉汤加热至高于约70℃、高于约75℃、高于约80℃、高于约85℃、高于约90℃或甚至高于约95℃的温度，持续足以使酶变性的时间(例如至少约10分钟、至少约15分钟、至少约20分钟、至少约30分钟或至少约40分钟或更长时间)来加以破坏。

酶活性可替代地或另外地通过将用过的木霉肉汤与小分子蛋白酶抑制剂、或抑制特定种类的酶的活性的其他小分子一起孵育来加以破坏。

酶活性可替代地或另外地通过将用过的木霉肉汤与活性蛋白酶(其对于用过的木霉肉汤可以是外源的)一起孵育，使得存在于用过的木霉肉汤中的蛋白质被消化并且基本上没有酶活性保留在用过的木霉肉汤中来加以破坏。

酶活性可替代地或另外地通过使用过的木霉肉汤进行常规用于将蛋白质与用过的木霉肉汤中的其他组分分离的色谱法来加以破坏，分离的蛋白质是用过的木霉肉汤中酶活性的来源。

酶活性可替代地或另外地通过选择木霉的特定菌株或遗传修饰木霉以消除或减少用过的木霉肉汤中酶的表达或分泌来减少或消除天然或非天然(即重组)蛋白(其可以是酶)的表达和/或分泌来加以破坏。

用过的木霉肉汤的非酶级分可以作为专用产物包含在完全或其他分级的用过的木霉肉汤中。或者，用过的木霉肉汤的非酶级分可以作为用过的木霉肉汤的专用的分级产物提供。

在一些实施例中，仅用过的木霉肉汤的非酶级分还包含一种或多种目的蛋白，例如，碳水化合物加工酶和其他商业相关的多肽，包括但不限于脱氢酶、转酮醇酶、磷酸转酮酶、转醛醇酶、差向异构酶、植酸酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、磷酸酶、蛋白酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、海藻糖酶、脂肪酶、果胶酶、聚酯酶、角质酶、氧化酶、转移酶、还原酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、酯酶、异构酶、果胶酶、乳糖酶、过氧化物酶和漆酶。

在其他实施例中，只有用过的木霉肉汤的非酶级分具体地排除任何特定的目的蛋白，包括目的酶蛋白，特别是目的重组蛋白。

在一些实施例中，将用过的木霉肉汤或其级分配制，例如用于储存稳定性或易于处理。制剂组分包括但不限于甘油、山梨糖醇、盐、聚合物、防腐剂等。

IV.深层棒状杆菌培养

如本文所述，本发明方法涉及将用过的木霉肉汤添加到产生小分子的棒状杆菌培养中。棒状杆菌天然地产生大量的谷氨酸，并且可以容易地进行遗传修饰以产生其他产物，包括但不限于赖氨酸(参见，例如，de Graaf,A.A.等人(2001)Adv Biochem EngBiotechnol[生化工程-生物技术进展].73:9-29和Wendisch,V.F.等人(2016)World JMicrobiol Biotechnol[世界微生物学和生物技术杂志].32:105)。棒状杆菌的许多菌株是可商购的，最常见的是谷氨酸棒状杆菌的衍生物。谷氨酸棒状杆菌S9114的完整基因组序列是已知的。

为了产生具有商业价值的产品，用于在深层培养中生长棒状杆菌的条件是众所周知的，例如，Kusumoto,I.(2001)J.Nutr.[营养杂志]131:2552S-55S；Hermann,T.(2003)JBiotechnol.[生物技术杂志]104:155-172；Zhiting Luo,Z.等人(2016)Biotechnologyfor Biofuels[生物燃料的生物技术]9:134；和Zahoora,A.等人(2012)CSBJ.3:e201210004中所述。

棒状杆菌生长培养基通常包括主要碳源，例如葡萄糖、果糖或蔗糖，尽管也使用了例如甘蔗糖蜜、木糖、农业工业废料、菜籽粉、豆渣、玉米芯纤维和甘油的碳源。酵母提取物是合适的氮源，但硫酸铵和氯化铵更具成本效益。无机盐(并特别是锰)会影响棒状杆菌的生产率。

在一些实施例中，完全或分级的用过的木霉肉汤的量占棒状杆菌生长培养基的总量的百分比为至少0.01％、至少0.02％、至少0.03％、至少0.04％、至少0.05％、至少0.06％、至少0.07％、至少0.08％、至少0.09％、至少0.10％、至少0.12％、至少0.14％、至少0.16％、至少0.18％、至少0.2％、至少0.3％、至少0.4％、至少0.5％、至少0.6％、至少0.7％、至少0.8％、至少0.9％、至少1％、至少2％、至少5％或更多(v/v)。

优选地，当对棒状杆菌培养进行接种时添加完全或分级的用过的木霉肉汤。但是，在补料分批发酵过程中，可能需要交错添加用过的木霉肉汤。例如，可以当对棒状杆菌培养进行接种时添加50％剂量的木霉肉汤，然后在接种后约10小时添加25％，并在接种后约16小时添加剩余25％。

鉴于本说明书，本发明方法的这些和其他方面以及实施例对于技术人员是清楚的。以下实例旨在进一步说明但不限制所述方法。

实例

实例1.生物体、培养基和用过的肉汤

来自美国典型培养物保藏中心(马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国(Manassas,VA,USA))的谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC13032和ATCC15990用于所有L-谷氨酸实验。

来自美国典型培养物保藏中心(马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国(Manassas,VA,USA))的谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC 21513用于所有L-赖氨酸生产实验。

在PCT申请号WO 05/001036中所述的里氏木霉菌株Morph用于所有实验。

里氏木霉完全用过的肉汤含有(w/w)水(80％-98％)和(％)，pH为4.5-5.0。

配制的里氏木霉完全用过的肉汤含有(w/w)水(33％-45％)、甘油(47％-53％)和氯化钠(3％-4％)，pH为4.5-5.0。

CGXII培养基含有(每升)50g葡萄糖、20g硫酸铵、5g尿素、1g磷酸钾(一价)、1g磷酸钾(二价)、0.25g硫酸镁、42g 3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、10μg氯化钙、35μg 3,4-二羟基苯甲酸、微量元素(1mg FeSO₄、1mg MnSO₄、0.1mg ZnSO₄、0.02mg CuSO₄和0.002mg NiCl₂)、1.0μg生物素，使用氢氧化钠调节至pH 7.0。

谷氨酸分批补料发酵培养基含有(每升)15g Sigma玉米浆固体、10g(NH₄)₂PO₄、2.0g K₂HPO₄、0.5ml Sigma 204消泡剂、50mL 100x微量元素溶液(包含80g MGSO₄·7H₂O、2.2g FeSO₄·7H₂O和2.2g MnSO₄·H₂O)和5mL 1000x维生素溶液(包含0.2g维生素B1硫胺素)、545g 55％w/w葡萄糖。

赖氨酸种子摇瓶培养基每升含有5.0g Difco酵母提取物、10g Difco选择大豆胨、10g NaCl和10.0g葡萄糖。

赖氨酸发酵培养基每升含有52.5g豆粕水解物、2.4g糖蜜、12.4g(NH₄)₂SO₄、0.7g柠檬酸一水合物、2.2g 85％H₃PO₄、1.24g MgSO₄·7H₂O、1.24g MnSO₄·H₂O、0.002g ZnSO₄·7H₂O、0.038g FeSO₄·7H₂O、0.55g L-苏氨酸、0.60g L-甲硫氨酸、0.0006g生物素、0.00024g盐酸硫胺素、0.5ml Sigma 204消泡剂，以545g 55重量％95DE(Cargill 95DE右旋糖)的初始推注批量。

赖氨酸碳源进料含有：55重量％95DE(Cargill 95DE右旋糖)

实例2.棒状杆菌的谷氨酸产量的刺激

将配制的里氏木霉完全用过的肉汤加入含有两种不同谷氨酸棒状杆菌菌株中一种的摇瓶测定中，以确定对谷氨酸滴度和缩短发酵时间的影响。谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC13032和ATCC15990通过在30℃下孵育从LB琼脂平板上的甘油原液中生长。将细胞转移到液体CGXII培养基中，并在30℃振荡(250RPM)孵育过夜。第二次转移细胞，并在CGXII培养基中生长过夜，然后用于生产摇瓶中。

然后将ATCC13032棒状杆菌细胞以0.025-0.1(600nm)的初始OD接种到新鲜CGXII培养基中，并以不同浓度/剂量添加用过的木霉肉汤(或水作为阴性对照)。1X剂量表示用过的木霉肉汤在棒状杆菌培养基中稀释1250倍(占总体积的0.08％)。5X剂量表示625倍稀释(即占总体积的0.4％)，而10X剂量表示125倍稀释(占总体积的0.8％)。

将摇瓶在30℃下振荡(250RPM)孵育约48小时。在该孵育结束时，使用600nm的吸光度测定最终细胞质量，并使用HPLC分析(使用邻苯二甲醛进行柱前衍生化，C18柱和甲醇/乙腈梯度作为流动相)测定谷氨酸浓度。每种浓度均一式两份进行测试，平均结果列于表1中。

表1.用过的木霉肉汤对ATCC13032细胞质量和谷氨酸产量的影响

	对照	1X	5X	10X
					OD(A600nm)	16.85	18.20	22.65	25.80
相对于对照的％增加	-	7％	26％	35％
					谷氨酸(g/L)	5.77	6.73	10.02	10.18
相对于对照的％增加	-	14％	42％	43％

结果显示，在用过的木霉肉汤存在下，细胞质量和谷氨酸产量的剂量依赖性反应增加直至饱和点(在所述点不可能进一步增加)，这可能是由于可用糖的完全转化。

使用ATCC15990菌株，在棒状杆菌CGXII培养基中使用10X剂量(0.8％体积)的用过的木霉肉汤重复实验。结果在表2中示出。

表2.用过的木霉肉汤对ATCC15990细胞质量和谷氨酸产量的影响

	对照	10X
			OD(A600nm)	15.6	25.45
相对于对照的％增加	-	39％
			谷氨酸(g/L)	6.83	10.1
相对于对照的％增加	-	32％

将另外的用过的木霉肉汤样品一式两份进行测试，以确定对谷氨酸产量的积极影响是否是一种孤立现象。如上所述，使用ATCC13032菌株以10X剂量测试总共五种用过的木霉完全肉汤(A-E)。结果表明，在任一种测试的用过的木霉肉汤存在下，谷氨酸的产量一致增加(表3)。

表3.不同的用过的木霉肉汤对细胞质量和谷氨酸产量的影响

通过以与添加用过的木霉肉汤相同的方式向棒状杆菌培养中添加新鲜的(即，未接种的)木霉培养基、柠檬酸或甘油，来排除培养基和与用过的木霉肉汤相关的制剂组分的影响。没有检测到细胞质量或谷氨酸的增加(数据未显示)。

实例3.时程棒状杆菌培养实验

使用1X和10X剂量的配制的用过的木霉肉汤，在类似的摇瓶测定中进行葡萄糖消耗量和谷氨酸产量随时间的分析。在约70小时的时间内定期取出棒状杆菌培养物(ATCC13032菌株)的样品。结果显示在图1中。结果显示，添加用过的木霉肉汤可增加谷氨酸产量，这在整个过程中持续存在。

实例4.处理用过的木霉肉汤以消除酶活性

用过的木霉肉汤含有许多可能影响棒状杆菌生长的酶。为了测试这些酶中的任一种是否可引起前述实例中观察到的影响，对用过的木霉肉汤进行了处理以使酶失活。具体而言，将用过的木霉肉汤以14K x g离心20分钟，并收集上清液。通过30kDa膜(标记为“<30K”)过滤上清液，并收集渗透液以在棒状杆菌培养中进行测试。将一部分过滤的样品在90℃下进一步热处理30分钟(标记为“加热”)。当通过SDS-PAGE分析观察时，发现与粗制用过的木霉肉汤相比，处理过的样品含有低得多的总蛋白水平。在处理过的用过的木霉肉汤中测定已知在粗制用过的木霉肉汤中过表达的酶的活性，未检测到活性(数据未显示)。

表4.处理过的用过的木霉肉汤对细胞质量和谷氨酸产量的影响

尽管缺乏酶活性并且几乎完全没有蛋白质，但是处理过的用过的木霉肉汤在10X剂量下仍提高了谷氨酸产量，如表4中总结的摇瓶试验所证明的。

实例5.时程木霉培养实验

为了确定在用过的木霉肉汤中何时出现能增加棒状杆菌的谷氨酸产量的非酶组分，进行了涉及木霉培养的时程实验。使木霉在培养物中生长长达213小时，并定期取出用过的肉汤样品。培养物中的干细胞重量(“DCW”)和分泌蛋白水平如图2所示。将每个时间点样品均通过0.2μM过滤器过滤以除去细胞。

然后将在不同时间点取出的用过的木霉肉汤样品以10X剂量添加到棒状杆菌摇瓶培养物中，并如上所述测量产生的谷氨酸的量。结果显示在图3中。结果显示，提高棒状杆菌的谷氨酸产量的存在于用过的木霉肉汤中的非酶组分在木霉培养物生长的0.3小时时间点不存在。然而，所述组分在发酵时间的最早期存在，至少截至29小时，并在整个发酵过程中保留。值得注意的是，在29小时的时间点上，分泌的蛋白质水平是非常低的。与先前实例中所使用的相比，该特定的木霉生物体还过表达了不同的蛋白质，进一步强调了观察到的对棒状杆菌培养的作用并不取决于木霉可能表达的目的基因。

实例6.分批补料发酵中谷氨酸产量的刺激

将配制的里氏木霉完全用过的肉汤或加工过的肉汤添加到含有谷氨酸棒状杆菌的发酵罐中，以确定对谷氨酸生产速率、滴度和产量的影响。将谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC13032在谷氨酸种子摇瓶培养基中从甘油原液中生长，并在30℃下振荡(200RPM)孵育过夜。将细胞转移至种子摇瓶中，并在相同培养基中过夜生长，然后用于生产发酵罐。将过夜的种子培养物用于以0.1的初始OD(600nm)接种谷氨酸发酵培养基。

在混合下于30℃进行发酵，以保持通过以最小设定点300rpm至最大1200rpm搅拌而控制的30％溶解氧，然后在发酵过程中加压至最大1.5巴和通气至最大10.0(标准升/分钟)。

从发酵时间的14小时开始，使用碳源进料(含有55重量％的95DE(Cargill 95DE右旋糖))，恒定进料速率为0.75g/min。将1X或5X剂量的完全用过的木霉肉汤或1X剂量的热处理过的用过的肉汤(或不添加肉汤作为对照)添加到棒状杆菌发酵中。在用棒状杆菌接种时添加木霉肉汤总剂量的一半，在接种后10小时添加25％，在接种后16小时添加剩余的25％。

在该孵育结束时，使用1200系列安捷伦科技荧光检测器，使用HPLC分析(使用邻苯二甲醛进行柱前衍生化，C18柱和甲醇/乙腈梯度作为流动相)测定了最终的谷氨酸浓度。表X中的结果总结了与未处理的对照罐相比，在发酵结束时谷氨酸的速率、滴度和产率的增加百分比的结果。结果显示，与测试罐相比，对照发酵罐中的谷氨酸滴度(报告为酸)更低。与对照相比，含有1X或5X剂量的完全用过的木霉肉汤或1X剂量的热处理过的完全用过的木霉肉汤的发酵罐中谷氨酸水平更高。结果还显示，与未处理的对照罐相比，发酵结束时谷氨酸的速率和产率提高。

表5.分批补料发酵中处理过的用过的木霉肉汤对谷氨酸产量的影响

发酵参数	谷氨酸滴度	谷氨酸体积速率	谷氨酸产率
				对照	0.0	0.0	0.0
1X剂量	9.5	8.6	5.2
				1X热处理剂量	4.6	4.5	5.9
5X剂量	12.9	11.9	6.8

实例7.棒状杆菌的赖氨酸产量的刺激

将配制的木霉完全用过的肉汤或热处理过的肉汤添加到含有谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC 21513的发酵罐中，以测定对L-赖氨酸滴度和缩短发酵时间的影响。将谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC 21513从甘油原液培养基中生长，并在赖氨酸种子培养基中在30℃下振荡(250RPM)孵育过夜。将细胞转移到较大的种子摇瓶中，并在液体种子摇瓶培养基中生长过夜，然后用于生产发酵罐。然后将细胞以0.1的初始OD(600nm)接种到新鲜的赖氨酸发酵培养基中，并以不同的浓度/剂量添加用过的木霉肉汤或加工过的肉汤。1X剂量表示发酵培养基的0.10重量％。

在混合下于30℃进行发酵，以保持通过以最大1200rpm搅拌而控制的30％溶解氧，然后在发酵过程中加压至最大1.5巴和通气至最大10.00SLPM。从发酵时间14的14小时开始，使用赖氨酸碳源进料(含有55重量％的95DE(Cargill 95DE右旋糖))，恒定进料速率为0.75g/min。将1X或5X剂量的完全用过的木霉肉汤或1X剂量的热处理过的用过的肉汤(或不添加肉汤作为对照)添加到棒状杆菌发酵中。在用棒状杆菌接种时添加木霉肉汤总剂量的一半，在接种后10小时添加25％，在接种后16小时添加剩余的25％。

在该孵育结束时，使用1200系列安捷伦科技荧光检测器，使用HPLC分析(使用邻苯二甲醛进行柱前衍生化，C18柱和甲醇/乙腈梯度作为流动相)测定了最终的L-赖氨酸浓度。

表6中的结果进一步总结了与对照相比，在运行结束时发酵的赖氨酸的速率、滴度和产率的增加百分比的结果。在运行结束时观察到峰值赖氨酸滴度。结果表明，在用过的木霉肉汤存在下，赖氨酸产率显著增加。

表6.处理过的用过的木霉肉汤对赖氨酸产量的影响