阅读说明：本技术 一种载氧微球及其制备方法和应用 (Oxygen-carrying microsphere and preparation method and application thereof ) 是由 彭盛 张福君 于 2020-02-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种载氧微球,包括载体基质、放射性核素和产氧材料,载体基质包裹产氧材料,放射性核素由载体基质包裹或与载体基质表面螯合。本发明还公开了载氧微球的制备方法以及载氧微球在制备治疗肿瘤放射栓塞的药物中的应用。本发明的载氧微球具备自身供给氧气的能力,从而缓解或消除肿瘤放射栓塞治疗过程中栓塞效应造成肿瘤区域缺氧情况,最终提高治疗效果及减少由于缺氧造成的不良反应。(The invention discloses an oxygen-carrying microsphere, which comprises a carrier matrix, a radionuclide and an oxygen-producing material, wherein the oxygen-producing material is wrapped by the carrier matrix, and the radionuclide is wrapped by the carrier matrix or chelated with the surface of the carrier matrix. The invention also discloses a preparation method of the oxygen-carrying microsphere and application of the oxygen-carrying microsphere in preparing a medicament for treating tumor radio-embolism. The oxygen-carrying microsphere has the capability of supplying oxygen by itself, so that the condition of hypoxia in a tumor region caused by embolism effect in the tumor radioactive embolism treatment process is relieved or eliminated, the treatment effect is finally improved, and adverse reactions caused by hypoxia are reduced.)

一种载氧微球及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及肿瘤治疗技术领域，尤其是一种载氧微球及其制备方法和应用。

背景技术

正常肝脏的血液供给为75％来自门静脉和25％来自肝动脉。而肝细胞癌(HCC)的血液供给几乎完全来自肝动脉。利用这一独特的血液供给方式，放射性核素标记的微球从而可以选择性在向肝癌组织供血的肝动脉滞留，其所携带的核素释放放射性射线引起周围肿瘤细胞的死亡，而对距离微球较远的正常肝细胞几乎没有损害。

目前有两种放射微球已被投入临床使用，分别是由加拿大NORDION开发的和澳大利亚的Sirtex Medical开发的两种微球的物理性质和生产方式不同，但是它们都是利用放射性核素钇-90释放的β射线发挥治疗作用。是一种含有非放射性钇-89的玻璃微球，使用前通过中子活化使玻璃微球中的钇-89活化为放射性的钇-90，其具体的生产过程被披露在专利US 4,789,501¹和US 5,011,677²。使用离子交换树脂微球吸附活化的钇-90离子，并以其磷酸盐形式固化在吸附位点(US 20070253898 A1和US 20100215571 A1)。

在放射治疗中，放射线对DNA链的永久破坏需要氧气参与，放射微球需要控制大小在直径20-40μm之间从而避免产生明显的缺血现象及栓塞效应，但是其粒径同时要足够大以至于不能通过毛细血管网进入静脉循环。尽管通过对栓塞微球大小进行精细的设计，预期放射微球造成栓塞效应不显著，但是一些研究报道了病人进行肿瘤放射栓塞治疗后，栓塞效应相关的血管内皮生长因子(VEGF)迅速增加并且治疗结果较差^3-4。微球的栓塞效应会引起肝癌组织的局部缺氧，从而使肝癌细胞的放射抗性增加。为杀死肿瘤细胞，放射剂量不得不提高而增加放射微球的注射量。此外，由于放射栓塞治疗的栓塞效应诱导机体系统性释放血管生成因子，该血管生成因子会促进未治疗的病变生长或肝外(微)转移，并可能影响患者的存活率。

为了抑制栓塞效应引起的血管生成反应和提高治疗效果，一些研究尝试在钇-90放疗栓塞治疗的过程中联用索拉非尼(Sorafenib)^4-5。索拉非尼是一种多激酶抑制剂，其靶向涉及血管生成和肝癌细胞增殖的多个因子，包括VEGF受体、PDGF和RAF-1等，被用来抑制栓塞效应引起的血管生成反应和提高治疗效果。

传统放射栓塞微球如和

只具有放射核素及其相应载体基质。微球由于设计的物理大小会停留在肿瘤部位的毛细血管从而靶向聚集在肿瘤部位，但是其造成的栓塞效应会造成肿瘤组织局部缺氧，肿瘤细胞的放射抗性因而增加。为杀死肿瘤细胞，不得不提高放射剂量。此外，栓塞效应会诱导机体系统性释放血管生成因子。该因子会促进未治疗的病变生长和/或肝外(微)转移。本发明主要解决传统放射栓塞治疗过程中的肿瘤区域局部缺氧所造成的疗效不佳及不良反应的问题。

发明内容

基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种用于肿瘤放射栓塞治疗的载氧微球，其具备自身供给氧气的能力，从而缓解或消除肿瘤放射栓塞治疗过程中栓塞效应造成肿瘤区域缺氧情况，最终提高治疗效果及减少由于缺氧造成的不良反应。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：

在第一个方面，本发明提供了一种载氧微球，所述载氧微球包括载体基质、放射性核素和产氧材料，所述载体基质包裹所述产氧材料，所述放射性核素由所述载体基质包裹或与所述载体基质表面螯合。优选地，载体基质具有中空的腔体，腔体内填充有产氧材料或/和放射性核素。其中，产氧材料用来减缓或消除放射栓塞治疗过程中栓塞效应引起的肿瘤区域局部缺氧情况，提高肿瘤细胞对射线的敏感性，从而提高放疗效果。

优选地，所述载氧微球中载体基质的含量为9～90wt％，放射性核素的含量为5～90wt％，产氧材料的含量为1～80wt％。更优选地，所述载氧微球中载体基质为聚(丙交酯-乙交酯)共聚物(PLGA，分子量：～20,000),其含量为20wt％左右，放射性核素为¹⁷⁷Lu、¹⁶⁶Ho或⁹⁰Y的一种，其含量为55wt％，产氧材料为过氧化钙，所占微球得质量比为25wt％左右。尤其是，载氧微球中载体基质(为PLGA)的含量为20wt％，放射性核素含量为55wt％，产氧材料(为过氧化钙)含量为25wt％时，用于***放射栓塞时，疗效最佳。

在一个实施方案中，载氧微球中载体基质的含量为16wt％，放射性核素含量为55wt％，过氧化钙含量为29wt％。

在一个实施方案中，载氧微球中载体基质的含量为23wt％，放射性核素含量为55wt％，过氧化钙含量为22wt％。

在一个实施方案中，载氧微球中载体基质的含量为25.7wt％，放射性核素含量为55wt％，过氧化钙含量为19.3wt％。

优选地，所述载体基质为高分子聚合物和/或蛋白质；更优选地，载体基质是生物可降解的聚合物，所述聚合物优选脂肪族聚内酯、内酯间的二元或三元无规或嵌段共聚物、内酯与聚醚间的二元或三元无规或嵌段共聚物；蛋白质优选人血清蛋白或明胶。

优选地，所述产氧材料为氧气、无机过氧化物和含有过氧键的有机高分子材料中的至少一种。更优选地，无机过氧化物包括但不限于过碳酸钠(SPC)、过氧化钙(CaO₂)、过氧化镁(MgO₂)及过氧化氢(H₂O₂)等。

优选地，所述放射性核素为：

1)放射性元素⁹⁰Y、³²P、¹⁸F、¹⁴⁰La、¹⁵³Sm、¹⁶⁵Dy、¹⁶⁶Ho、¹⁶⁹Er、¹⁶⁹Yb、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁰³Pd、¹⁹⁸Au、¹⁹²Ir、⁹⁰Sr、¹¹¹In和⁶⁷Ga中至少一种；

2)所述放射性元素的无机盐；

3)所述放射性元素的金属氧化物；或

4)所述放射性元素的有机配位物。

优选地，所述产氧材料为氧气与含氟气体的混合气体，所述含氟气体占混合气体的体积比为0.5～50％。或者，产氧材料优选具有吸附氧气能力且沸点中等(60-160℃)的全氟化碳，如全氟戊烷、全氟己烷、全氟庚烷、全氟辛烷、全氟壬烷、全氟辛烷、全氟溴辛烷、全氟-15-冠-5-醚等。

优选地，所述含氟气体为六氟化硫、全氟丙烷、全氟丁烷、全氟戊烷和全氟己烷中至少一种。

在第二个方面，本发明提供上述载氧微球的制备方法，其采用乳液溶剂蒸发法、化学交联或者加热蛋白变性法制得所述载氧微球。

在第三个方面，本发明提供所述载氧微球在制备***放射栓塞的药物中的应用。

在第四个方面，本发明提供了一种***放射栓塞的药物，其中含有上述的载氧微球。

综上所述，本发明的有益效果为：

本发明首次提供了一种用于肿瘤放射栓塞治疗的载氧微球及其制备方法，相比现有的放射栓塞微球如

和只具有放射核素及其相应载体基质，本发明的新型栓塞微球具备自身供给氧气的能力，从而缓解或消除肿瘤放射栓塞治疗过程中栓塞效应造成肿瘤区域缺氧情况，最终提高治疗效果及减少由于缺氧造成的不良反应。

附图说明

图1是不同的产氧材料的包埋方式示意图，其中(A)氧气被填充在微球的中空空腔；(B)全氟化油被包裹在载体基质中间形成核壳结构的微球；(C)过氧化物纳米颗粒被包埋在载体基质之间；

图2是不同的核素的包埋方式示意图，其中(A)核素无机盐被包埋在微球的中空空腔；(B)核素纳米颗粒或其有机配位物被包埋在载体基质之间；(C)核素被螯合在微球表面的螯合基团上；

图3(A)是载体基质和螯合基团的结合结构的示意图；(B)为不同的螯合基团的化学结构式；

图4是结合配位基团的载体基质PLGA-PEG-DOTA的合成路线图；

图5是聚合物PLGA-PEG-DOTA的¹H NMR图谱；

图6是载氧栓塞微球的光学图像；

图7是栽氧栓塞微球在磷酸盐缓冲液的氧气释放曲线。

具体实施方式

在一些实施例中，本发明提供的用于肿瘤放射栓塞治疗的载氧微球主要包括产氧材料、放射性核素以及载体基质三种组分，其中：

1)产氧材料

产氧材料指可以直接或通过某些化学反应提供氧气的材料，如氧气、无机过氧化物或含有过氧键的有机高分子材料等，其含量在载氧微球中占比为1wt％～80wt％。

在某些情况下，产氧材料可以直接是氧气，如图1-A所示，氧气储藏在中空或者多孔的放射微球的间隙中，然后其所携带的氧气通过物理扩散缓慢释放到肿瘤环境中。为了调控氧气的释放速率，氧气中可以按一定比例(0.5％至50％)混入一种或多种含氟气体，如六氟化硫、全氟丙烷、全氟丁烷、全氟戊烷、全氟己烷等。

在某些情况下，产氧材料是具有吸附氧气能力且沸点中等(60-160℃)的全氟化碳，如全氟戊烷、全氟己烷、全氟庚烷、全氟辛烷、全氟壬烷、全氟辛烷、全氟溴辛烷、全氟-15-冠-5-醚等。如图1-B所示，全氟化碳被包裹在载体基质中间形成核壳结构的微球。

在某些情况下，产氧材料是无机过氧化合物，包括但不限于过碳酸钠(SPC)、过氧化钙(CaO₂)、过氧化镁(MgO₂)及过氧化氢(H₂O₂)等。如图1-C所示，无机过氧化物以固体纳米颗粒(如过氧化钙纳米颗粒)包埋在微球基质之间或以液体状态(如过氧化氢)填充在中空微球的空腔中。

2)放射性核素

放射性核素指⁹⁰Y、³²P、¹⁸F、¹⁴⁰La、¹⁵³Sm、¹⁶⁵Dy、¹⁶⁶Ho、¹⁶⁹Er、¹⁶⁹Yb、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁰³Pd、¹⁹⁸Au、¹⁹²Ir、⁹⁰Sr、¹¹¹In和⁶⁷Ga等,其含量在载氧微球中占比为5wt％-90wt％。放射核素可以其无机盐、金属氧化物或有机配位物等形式包裹在微球中。

在某些情况下，如图2-A和图2-B所示，核素先以其无机盐、金属氧化物或有机配位物等形式包裹在微球的载体基质之间或载体基质所构成的中空腔内。在使用前，通过中子辐射处理激发微球中的所携带的核素，使之具有放射性。

在某些情况下，放射性核素离子结合在微球表面的螯合位点，如DOTA,DATP等。

3)载体基质

载体基质指用于包裹或携带放射核素和产氧材料的材料，一般为高分子聚合物【如聚甲基丙烯酸甲酯,聚乙烯醇,聚(丙交酯-乙交酯)共聚物等】或者蛋白质(如人血清蛋白，明胶等)，其含量在载氧微球中占比为10wt％-90wt％。

在某些情况下，载体基质是生物可降解的聚合物，所述聚合物为脂肪族聚内酯、内酯间的二元或三元无规或嵌段共聚物、内酯与聚醚间的二元或三元无规或嵌段共聚物(分子量为5000～500000)，如聚丙交酯(PLA)、聚己内酯(PCL)、聚(丙交酯-乙交酯)共聚物(PLGA)、聚(丙交酯-己内酯)共聚物(PLC)和聚(丙交酯-乙交酯-聚乙二醇醚)共聚物(PLGE)等。

在某些情况下，聚合物需要化学修饰结合一种或多种用于螯合放射性核素的化学结构，如图3-A所示，螯合基团和聚合物之间一般会增加一段间隔基团。间隔基团一般为聚乙二醇(PEG)，其分子量为300-500之间，螯合基团一般为DOTA、DTAP或其衍生物等，其化学结构式如图3-B所示。

4)栓塞微球的制备

根据含核素材料、产氧材料和载体基质的化学物理特性，通过乳液溶剂蒸发法、化学交联、或者加热蛋白变性等方法制备治疗栓塞的载氧微球。

在某些情况下，载氧微球通过乳液溶剂蒸发法来制备。一般来说，含核素材料(核素有机配位物或者无机纳米颗粒)、产氧材料和载体基质溶解或者均匀分散在不溶于水的有机溶剂中；然后将有机溶液通过机械搅拌、超声乳化、膜乳化法或者微流体乳化法等在含有表面活性剂的水溶液中制备成直径在10-200μm之间的微滴，搅拌乳浊液使有机溶剂蒸发，最后得到载氧微球。

在某些情况下，载氧微球通过W/O/W复乳溶剂蒸发法来制备，含核素材料(无机盐)溶解在水相，先在溶解有载体基质或者产氧材料的有机溶剂乳化，然后，乳浊液再在含有表面活性剂的水溶液第二次乳化，制备成直径在10-200μm之间的微滴，搅拌乳浊液使溶剂蒸发最后得到载氧微球。

在某些情况下，载氧微球通过化学交联法来制备，其中，含核素材料(核素有机配位物，或者无机纳米颗粒)、产氧材料和载体基质溶解或者均匀分散在不溶于水的有机溶剂中，并向溶剂加入交联剂，然后在含有表面活性剂的水溶液乳化成微滴，通过加热或者向水相加入催化剂触发反应，微滴固化形成载氧微球。

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，本发明中的实验方法均为常规方法。

实施例1含钬有机配位物携氧栓塞微球的制备

称取1g的乙酰丙酮钬(HoAcAc,Sigma-Aldrich,USA)、1g的聚乳酸(PDLLA,分子量：～20,000,Sigma-Aldrich,USA)和5ml的环辛烷(Sigma-Aldrich,USA)加入30ml的氯仿溶解。将氯仿溶液加入200ml的2％(w/v)的聚乙烯醇(PVA,分子量：13,000-23,000,87-89％水解)水溶液，放置磁力搅拌器上以1000rpm搅拌上述混合液20h获得微球。微球通过离心进行收集，然后加入双蒸水清洗三次。将清洗好的微球分散到50ml的冷冻保护液(25mM甘油,0.5％Pluronic F-127(w/v),0.1％(w/v)蔗糖,3.0％(w/v)甘露醇和5％(w/v)聚乙二醇4000水溶液)中，通过不锈钢筛分离尺寸在20-40μm的微球，然后分装到玻璃小瓶中(每瓶5ml)。将玻璃小瓶置于液氮中迅速冷却，然后通过冻干机(FreeZone 6,Labconco,USA)进行冻干48h，抽去水分和聚合物包裹的环辛烷从而得到中空的微球干粉。将含有冻干粉的小瓶用橡胶塞密封，然后将瓶中的空气抽出，填充氧气，即得载氧微球。

实施例2含钬无机盐携氧栓塞微球的制备

称取1g的氯化钬(HoCl₃，Sigma-Aldrich,USA)溶解到10ml的0.5％Pluronic F-68(Thermo Fisher,USA)水溶液中。将HoCl₃水溶液加入30ml溶解有1g的PLGA(分子量：～20,000,Sigma-Aldrich,USA)的氯仿溶液中，放置磁力搅拌器上以2000rpm搅拌5min获得乳浊液。然后，将上述乳浊液缓慢加入200ml的2％(w/w)的聚乙烯醇(PVA,分子量：13,000-23,000,87-89％水解,Sigma-Aldrich,USA)水溶液并以1000rpm搅拌上述混合液20h获得微球。微球通过离心进行收集，然后加入双蒸水清洗三次。将清洗好的微球分散到50ml的冷冻保护液(25mM甘油,0.5％(w/v)Pluronic F-127,0.1％(w/v)蔗糖,3.0％(w/v)甘露醇和5％(w/v)聚乙二醇4000水溶液)中，通过不锈钢筛分离尺寸在20-40μm的微球，然后分装到玻璃小瓶中(每瓶5ml)。将玻璃小瓶置于液氮中迅速冷却，然后通过冻干机(FreeZone 6,Labconco,USA)进行冻干48h，抽去水分获得中空的微球。将含有冻干粉的小瓶用橡胶塞密封，然后将瓶中的空气抽出，填充氧气，即得载氧微球。

实施例3含钇载氧栓塞微球制备

将8.4mmol的硝酸钇(Y(NO₃)₃,Sigma-Aldrich,USA)和磷酸(H₃PO₄,Sigma-Aldrich,USA)溶解于300mL的双蒸水中。在不停搅拌情况下，将150ml的56mM NaOH溶液缓慢加入硝酸钇-磷酸溶液，继续搅拌20分钟得到不透明的悬浮液。将悬浮液以4000rpm离心5分钟收集白色沉淀。用双蒸水洗涤沉淀物三次。在真空环境下，烘干上述磷酸钇纳米颗粒。称取1g的磷酸钇纳米颗粒加入10ml的0.5％Pluronic F-68(Thermo Fisher,USA)水溶液中，超声30min以上使磷酸钇纳米颗粒均匀分散在水溶液里，然后通过0.45μm孔径的过滤器除去较大颗粒。将磷酸钇纳米颗粒悬浮液加入30ml溶解有1g的PLGA(分子量：～20,000)的氯仿溶液中，放置磁力搅拌器上以2000rpm搅拌5min获得乳浊液。然后，将上述乳浊液缓慢加入200ml的2％(w/v)的聚乙烯醇(PVA,分子量：13,000-23,000,87-89％水解)水溶液并以1000rpm搅拌上述混合液20h获得微球。微球通过离心进行收集，然后加入双蒸水清洗三次。将清洗好的微球分散到50ml的冷冻保护液(25mM甘油,0.5％Pluronic F-127(w/v),0.1％(w/v)蔗糖,3.0％(w/v)甘露醇和5％(w/v)聚乙二醇4000水溶液)中，通过不锈钢筛分离尺寸在20-40μm的微球，然后分装到样品瓶中(每瓶5ml)。将样品瓶置于液氮中迅速冷却，然后通过冻干机(FreeZone 6,Labconco,USA)进行冻干48h,抽去水分获得中空的微球。将含有冻干粉的小瓶用橡胶塞密封，然后将瓶中的空气抽出，填充氧气，即得载氧微球。

实施例4过氧化钙纳米颗粒制备

称取10g氯化钙(CaCl₂,Sigma-Aldrich,USA)加入100ml双蒸水中，然后加入50ml1M的氨水(Sigma-Aldrich,USA)和300ml的聚乙二醇(分子量：～200,Sigma-Aldrich,USA)搅拌30分钟。将50ml的35％双氧水溶液(Sigma-Aldrich)逐滴加入上述混合溶液继续搅拌3h后，加入0.1M氢氧化钠溶液(Sigma-Aldrich)将上述混合液的pH调节至11.5，溶液逐渐由澄清变成白色乳浊液。继续搅拌20min将悬浮液以8000rpm离心5min收集白色沉淀。用双蒸水洗涤沉淀物三次。在真空环境下，烘干后得到过氧化钙纳米颗粒。

实施例5含钬过氧化钙栓塞微球的合成

称取1g实施例4制备的过氧化钙纳米颗粒加入20ml的氯仿中，超声30分钟使过氧化钙纳米颗粒均匀分散在氯仿中，然后通过0.45μm孔径的过滤器除去较大颗粒。另外，称取1g的乙酰丙酮钬(HoAcAc，Sigma-Aldrich,USA)和1g的聚乳酸(PDLLA,分子量：～20,000,Sigma-Aldrich,USA)加入10ml的氯仿溶解。将上述两种溶液混合到一起，超声5分钟，然后缓慢加入200ml的2％(w/v)的聚乙烯醇(PVA,分子量：13,000-23,000,87-89％水解,Sigma-Aldrich,USA)水溶液并以1000rpm搅拌上述混合液20h后获得微球。微球通过离心进行收集，然后加入双蒸水清洗三次。将清洗好的微球分散到50ml的冷冻保护液(25mM甘油,0.5％Pluronic F-127(w/v),0.1％(w/v)蔗糖,3.0％(w/v)甘露醇和5％(w/v)聚乙二醇4000水溶液)中，通过不锈钢筛分离尺寸在20-40μm的微球，然后分装到样品瓶中(每瓶5ml)。将玻璃小瓶置于液氮中迅速冷却，然后通过冻干机(FreeZone 6,Labconco,USA)进行冻干48h，获得载氧微球的冻干粉。

实施例6含有螯合位点的聚合物PLGA-PEG-DOTA合成

PLGA-PEG-DOTAP按照如图4所示的合成路径进行制备。具体来讲，首先，称量2g的PLGA(lactide:glycolide 50:50,Mw～10,000,0.2mmol,Sigma-Aldrich,USA)，46mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC,0.24mmol,Sigma-Aldrich,USA)和52mg的N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS,0.24mmol,Sigma)溶解在10ml无水二甲基亚砜(DMSO)中，然后在氮气环境下搅拌24小时活化羧酸得到PLGA-NHS。将上述溶液逐滴加入5ml溶解有聚乙二醇(PEG-bisamine,Mw～1000,0.4mmol Sigma)的无水DMSO溶液，继续搅拌24小时后，将反应溶液逐滴加入100ml以1000rpm搅拌的双蒸水中，白色沉淀析出。将悬浮液以4000rpm离心20分钟收集白色沉淀。用双蒸水洗涤沉淀物三次，除去过量的PEG-bisamine和其他杂质，在真空环境下烘干后得到PLGA-PEG-amine粉末。称量91.38mg DOTA-NHS ester(0.12mmol,西安瑞禧，中国)溶解在3ml无水二甲基亚砜(DMSO)中，将5ml溶解有1.1g PLGA-PEG-amine(0.1mmol)无水二甲基亚砜溶液逐滴加入上述溶液，在氮气环境下搅拌24小时后，将反应溶液逐滴加入50ml以1000rpm搅拌的双蒸水中，白色沉淀析出。将悬浮液以4000rpm离心20分钟收集白色沉淀。用双蒸水洗涤沉淀物三次，除去过量的DOTA-NHS ester和其他杂质。在真空环境下，烘干后得到PLGA-PEG-DOTA粉末；其合成粉末的化学结构通过¹H NMR来表征，如图5所示。

实施例7含螯合位点DOTA的载氧PLGA微球合成

秤取1g的过氧化钙纳米颗粒(实施例4制备)加入20ml的氯仿中，超声30分钟使过氧化钙纳米颗粒均匀分散在氯仿中，然后通过0.45μm孔径的过滤器除去较大颗粒。另外，称取1g的PLGA/PLGA-PEG-DOTA(9:1mol/mol)加入10ml的氯仿溶解。将上述两种溶液混合到一起，超声5分钟，然后缓慢加入200ml的2％(w/v)的聚乙烯醇(PVA,分子量：13,000-23,000,87-89％水解，Sigma-Aldrich)水溶液并以1000rpm搅拌上述混合液20h后获得微球。微球通过离心进行收集，然后加入双蒸水清洗三次。将清洗好的微球分散到50ml的冷冻保护液【25mM甘油,0.5％Pluronic F-127(w/v),0.1％(w/v)蔗糖,3.0％(w/v)甘露醇和5％(w/v)聚乙二醇4000水溶液】中，通过不锈钢筛分离尺寸在20-40μm的微球，然后通过冻干获得微球的冻干粉。

实施例8 PLGA微球合成

称取1g的PLGA/PLGA-PEG-DOTA(9:1mol/mol)加入30ml的氯仿溶解，然后缓慢加入200ml的2％(w/v)的聚乙烯醇(PVA,分子量：13,000-23,000,87-89％水解，Sigma-Aldrich,USA)水溶液并以1000rpm搅拌上述混合液20h后获得微球。微球通过离心进行收集，然后加入双蒸水清洗三次。将清洗好的微球分散到50ml的冷冻保护液(25mM甘油,0.5％PluronicF-127(w/v),0.1％(w/v)蔗糖,3.0％(w/v)甘露醇和5％(w/v)聚乙二醇4000水溶液)中，通过不锈钢筛分离尺寸在20-40μm的微球，然后通过冻干获得微球的冻干粉。

实施例9栓塞微球的放射性核素标记

称取100mg实施案例7制备的微球分散在25ml的0.5M醋酸铵缓冲液(pH 5.0,Sigma-Aldrich,USA)。¹⁷⁷LuCl₃(500μl,5000MBq)溶液加入微球悬浮液并且将溶液在90℃条件下热水浴15分钟，然后冷却至室温，继续升温至90℃加热15分钟，然后冷却至室温，如此重复三次。微球通过离心进行收集(1000g,5分钟)，然后加入双蒸水清洗三次来除去游离的¹⁷⁷Lu³⁺。

实施例10栓塞微球的表征

现场配置的实施例8制备的栓塞微球稀释至1mg/mL,滴在载玻片上，置于倒置光学显微镜下观察，其光学图片如图6所示，通过图像分析软件Image J分析，其粒径为26.3μm。

实施例11栓塞微球在体外的氧气释放

将20mg的实施例7制备的载氧栓塞微球分散在20mL磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)，整个体系置于乏氧环境下，氧气浓度控制在0.05mmol/L。PBS溶液的氧气浓度在特定时间点通过溶解氧测量仪(JPB-607A,上海雷磁，中国)来测量，连续测量15天。另外，使用实例8制备的不含过氧化钙纳米颗粒的栓塞微球(普通微球)用作对照。氧气释放曲线如图7所示，表明本发明的载氧栓塞微球可以在10天内持续释放氧气，改善微球所处的乏氧环境。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

参考文献：

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