一种放射性铜标记纳米颗粒的用途
阅读说明：本技术 一种放射性铜标记纳米颗粒的用途 (Application of radioactive copper labeled nanoparticles ) 是由 周惠君 李军 于 2021-07-26 设计创作，主要内容包括：本发明提供了放射性铜标记纳米颗粒在制备肿瘤多模态成像检测试剂中的用途。本发明放射性铜标记的黑色素纳米颗粒,可将多种成像技术结合,获得全面生物学信息；而且组织渗透能力强,具有高分辨率、高灵敏度,有利于提高对肿瘤的早期精确诊断,具有良好的应用前景。(The invention provides application of radioactive copper labeled nanoparticles in preparation of a tumor multi-modal imaging detection reagent. The radioactive copper marked melanin nano-particles can combine various imaging technologies to obtain comprehensive biological information; and the tissue permeability is strong, the high resolution and the high sensitivity are realized, the early accurate diagnosis of the tumor is favorably improved, and the application prospect is good.)
技术领域
本发明属于医学成像技术领域，具体涉及一种放射性铜标记纳米颗粒的用途。
背景技术
恶性肿瘤是严重威胁人类身心健康的重大疾病，其发病率和死亡率在国内外均呈明显的上升趋势。不断提高肿瘤的诊断与检测水平，对提高肿瘤患者的疗效，改善预后和生存质量具有重要意义。
临床上常用的肿瘤影像学检查手段，如正电子发射(PET)、磁共振成像(MRI)、光声成像(PAI)等都各具特点，但每种影像术都不能对生物组织做出完整的描述，无法获得足够的生物学信息满足需要，由若干个成像技术组成的多模态成像技术，是获得组织更多信息的有效途径。因此，同一探针的多模态成像成为目前医学成像的发展趋势。
黑色素纳米颗粒(melanin nanoparticles，MNPs)是一种纳米级别的黑色素颗粒，它不仅保留了黑色素的固有特性如金属离子螯合、光热转化等，而且还具有较高的分散稳定性、良好的生物相容性和可降解性等优良性能，吸引了研究者的关注。Huijun Zhou etal，64Cu-labeled melanin nanoparticles for PET/CT and radionuclide therapy oftumor.Nanomedicine，2020报道了用放射性铜标记对黑色素纳米颗粒进行PET成像，仍难以满足临床检测需要。
发明内容
本发明的目的在于解决现有肿瘤诊断存在的问题，提供一种放射性铜标记黑色素纳米颗粒的用途。
本发明提供了放射性铜标记纳米颗粒在制备肿瘤多模态成像检测试剂中的用途。
其中，所述多模态成像包括光学成像、磁共振成像、核素成像。
其中，所述检测试剂是用于肿瘤光学成像的试剂。
其中，所述肿瘤为皮肤癌。
其中，所述放射性铜为64Cu。
其中，所述放射性铜标记的黑色素纳米颗粒的制备方法为：取聚乙二醇化黑色素纳米颗粒，用64Cu进行核素标记即可。
其中，所述放射性铜标记的黑色素纳米颗粒的制备方法如下：
a、取聚乙二醇化黑色素纳米颗粒，加入可溶性铜盐溶液，40℃振荡1小时后，用PD-10柱纯化，得到Cu-PEG-MNPs；
b、加入可溶性放射性铜盐溶液，在NaOAc缓冲液中振摇1h，用PD-10柱纯化，即可。
PEG-MNPs：聚乙二醇化黑色素纳米颗粒。
64Cu-PEG-MNP：放射性铜标记的黑色素纳米颗粒。
进一步地，步骤a中，聚乙二醇化黑色素纳米颗粒与铜盐溶液的用量比例为10:1。
进一步地，步骤b中，NaOAc缓冲液的pH为5.5；振摇的温度为40℃
本发明放射性铜标记的黑色素纳米颗粒，具备良好的生物相容性和水溶性，在肿瘤病灶有效积聚，可将多种成像技术包括光声成像、磁共振成像、PET成像结合起来，有机的达到同步的多模态成像，以获得生物组织更全面的生物学信息；而且组织渗透能力强，具有高分辨率、高灵敏度，有利于提高对肿瘤的早期精确诊断，具有良好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的
具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图164Cu-PEG-MNP多模态纳米颗粒应用示意图
图264Cu-PEG-MNP的放射性标记率检测结果
图364Cu-PEG-MNP在室温盐水中和37℃胎牛血清中分别孵育1、2和4小时后的放化纯度测定。
图4A431细胞对64Cu-PEG-MNP的摄取测定(n＝3,均数±标准差)。
图5A431细胞对64Cu-PEG-MNP的流出测定(n＝3,均数±标准差)。
图6静脉注射Cu-PEG-MNPs和Fe-PEG-MNP 2小时及4小时后的A431荷瘤鼠(右肩肿瘤)的光声图像(A)及信号增强百分比(B)。
图7不同浓度的Cu-PEG-MNP的MRI T1加权图像。
图8静脉注射Cu-PEG-MNP 4小时后的A431荷瘤鼠(右肩肿瘤)的MR T1加权图像(A)及MR信号强度(B)。
图9静脉注射64Cu-PEG-MNP(11.1MBq)2,4,8和24小时后的A431荷瘤鼠(右肩肿瘤)的时间衰减校正的冠状位(上)和横断位(下)PET图像。
具体实施方式
下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。
本发明所用的实验试剂与仪器如下：
实验试剂：黑色素美国Sigma-Aldrich公司；氢氧化钠美国Sigma-Aldrich公司；盐酸(37wt％)美国Sigma-Aldrich公司；NH4OH溶液(28wt％,)美国Sigma-Aldrich公司；NH2-PEG5000-NH2(5kDa)美国Laysan Bio公司；磷酸盐缓冲液(PBS)美国Gibco公司；细胞增殖检测试剂盒日本Dojindo公司；DMEM培养基美国Gibco公司；Trypsin-EDTA美国Gibco公司；RPMI-1640培养基美国Gibco公司；无水乙醇美国Sigma-Aldrich公司；胎牛血清(FBS)美国AMRESCO公司；Cu-64麦迪逊威斯康星大学医学物理系。
主要仪器：细胞培养箱美国Thermo公司；细胞培养皿美国Corning公司；低温离心机美国Sigma-Aldrich公司；恒温水浴箱德国Julabo公司；-80℃低温冰箱美国Thermo公司；透射电子显微镜(TEM)日本Olympus公司；倒置荧光显微镜(IX71)日本Olympus公司；微量加样器德国Eppendorf公司；动态光散射粒径分析仪器英国Malvern公司；冷冻干燥机美国Labconco公司；超声清洗仪美国Bransonic公司；微量电子天平美国Mettler公司；生物组织石蜡包埋剂德国Leica公司；石蜡切片机德国Microm公司；小动物麻醉剂美国Matrx公司；PH测试仪美国Mettler公司；micro-PET/CT小动物正电子断层成像系统德国Siemens公司；Miniscan TLC scanner美国Bioscan公司；γ计数仪测定仪美国PerkinELmer公司。
实施例1本发明纳米颗粒的制备方法
一、制备放射性铜标记的黑色素纳米颗粒
PEG-MNPs可以按照现有文献制备，也可自行制备，本发明中使用的制备方法如下：
将酪氨酸衍生黑色素(20mg)溶解于10mL 0.1N NaOH水溶液中，磁力搅拌器持续搅拌。待固体完全溶解后迅速加入HCl水溶液(0.1N)，在输出功率为10W的超声下将pH调节至7.0(1分钟)，获得黑色素水溶液。将中性溶液经超滤离心(Amicon，截留分子量为30kDa)并用去离子水洗涤3次以除去产生的NaCl。通过冷冻干燥除去水性溶剂，得到15mg水溶性MNPs黑色固体。将NH4OH溶液(28wt％)加入5mL MNPs水溶液(1mg/mL)中，将pH调节至9，将NH2-PEG5000-NH2(5,10,25,和50mg)溶液逐滴加入混合溶液中。磁力搅拌器持续搅拌12小时，获得PEG修饰的MNPs，去离子水洗涤后经超滤离心(Amicon，截留分子量为30kDa)，除去未参与反应的NH2-PEG5000-NH2，既得。
1.制备Cu-PEG-MNPs
取2ml EP管，加入200ulPEG-MNPs、800ul PBS、20ul 10mg/mL CuCl2。此处，40℃震荡1小时后使用PD-10柱(GE Healthcare)纯化，按照1.5ml/管收集馏分，取颜色最深两管合并进行进一步实验。
2.制备64Cu-PEG-MNP
将300μCi 64CuCl2加入到70μl PEG-MNPs溶液，再加入0.1N NaOAc(pH 5.5)缓冲液(体积为164CuCl2放射性溶液体积的1/3)，另将1.5mCi64CuCl2加入到300μl PEG-MNPs溶液，再加入0.1N NaAc(pH＝5.5)缓冲液(体积为64CuCl2放射性溶液体积的1/3)，之后在40℃下振摇1h以完成标记反应。标记后的MNPs使用PD-10柱(GE Healthcare)PBS洗脱纯化，按照1.5ml/管收集馏分，取具有最高放射性活度的馏分进行进一步测试和实验。
二、64Cu-PEG-MNP的放射化学测定
放射性标记率测定:用点样毛细管取2μL反应液点样于waterman 1号滤纸1.2cm处，置于0.1M,pH＝7.4的PBS溶液中展开，纸带吹干后，使用MiniScan TLC扫描仪扫描，根据各个峰的面积百分比，计算放射性标记率和产物的放射化学纯度。
全部标记过程在1小时内完成。终产物64Cu-PEG-MNP经PD-10柱纯化去除游离64Cu2+后，使用纸层析法对其进行放射化学纯度的鉴定。用Waterman 1号滤纸及Mini Scan TLC仪测定放化纯度。
实验结果显示，64Cu-PEG-MNP的放射化学纯度高达96.78％(图2)。三、64Cu-PEG-MNP的体外稳定性测定
取7.4MBq(200μCi)64Cu-PEG-MNP分别与胎牛血清和的生理盐水体积比1:1混合均匀后置于37℃，分别于1,2和4小时取样，用TLC法测定其放化纯度以评估64Cu-PEG-MNP的体外稳定性。
结果显示，64Cu-PEG-MNP在生理盐水中孵育4小时后放化纯度大于95.0％，而64Cu-PEG-MNP在胎牛血清中于37℃孵育4小时后测定64Cu-PEG-MNP的放化纯度为90.0％(图3)，展示了较好的稳定性。
以下通过试验例具体说明本发明的有益效果：
试验例1本发明纳米颗粒的细胞摄取与流出测定
实验方法如下：
细胞摄取实验：将A431细胞按照1×105个细胞/孔的密度接种于24孔板并生长过夜。随后按照2uCi/孔比例加入64Cu-PEG-MNPs，在37℃孵育15、30、60和120分钟，每组三个复孔。之后用预冷的PBS溶液冲洗三次洗去未结合的纳米颗粒，用胰酶消化法收集细胞，用γ计数仪测定细胞的放射活性。细胞对64Cu-PEG-MNPs的摄取值用百分数值表示并进行衰减校正计算。
细胞流出实验：A431细胞以1×105个细胞/孔的密度接种于24孔板并生长过夜，加入标记探针后，在37℃下孵育2小时以便纳米颗粒内化进入细胞。然后用预冷的PBS溶液冲洗三次，加入培养基孵育15、30、60和120分钟，每个时间点三个复孔。用预冷的PBS溶液冲洗三次，用胰酶消化法收集细胞及裂解液。用γ计数仪测定细胞的放射活性。标记探针的流出值用百分数表示并进行衰减校正计算。
A431细胞对64Cu-PEG-MNP的摄取和流出结果证实，标记探针64Cu-PEG-MNP可以与A431细胞靶向结合。细胞的15分钟药物摄取比例为2.72±0.2％，30分钟为2.22±0.3％，1小时为2.55±0.12％，2小时后达到最大摄取值4.91±0.27％(图4)。而进一步的药物细胞流出实验显示，在2小时后，仅有大约2.96％的药物从A431细胞流出，A431细胞能够较好的内化并保留摄取的探针(图5)。
试验例2本发明纳米颗粒用于肿瘤光声成像
荷瘤裸鼠建立动物模型：肿瘤模型通过在雌性裸鼠(5-7周，20-25g)的右侧肩部皮下接种150μl的细胞悬液(5×106个细胞/mL)获得。当肿瘤直径达到5-8mm时,进行多模态显像和体内生物分布研究。
螯和金属离子的光声成像方法对比：为了评估金属离子螯和后的PEG-MNP在活体肿瘤中的聚集效应，分别用实施例1的Cu-PEG-MNP及Fe-PEG-MNP进行。Fe-PEG-MNP的制备方法如下：取2ml EP管，加入200ul PEG-MNPs、800ul PBS、20ul 10mg/mLFeCl3，40℃震荡1小时后使用PD-10柱(GE Healthcare)纯化，按照1.5ml/管收集馏分，取颜色最深两管合并进行进一步实验。
利用黑色素自身的光学特性，使用Vevo LAZR光声成像系统对A431荷瘤裸鼠(n＝3)进行光声(PA)预显像(采样频率:25MHz，波长:680nm)，预显像后立即经尾静脉分别注射200μl(浓度200μM)的Cu-PEG-MNP及Fe-PEG-MNP，2小时及4小时后再次对注射后的肿瘤小鼠进行PA成像检测。通过Image J软件处理图像。
结果提示，PEG-MNPs在分别螯和Cu和Fe离子后仍然具有光声显像功能。如图6所示，随着时间推移，注射后2小时及4小时的光声图像显示出比预扫描样品更明显的光声信号，且Cu-PEG-MNP的光声信号强度较Fe-PEG-MNP的光声信号更强，记录在680nm近红外光激发下所产生的光声信号强度进行半定量计算，Cu-PEG-MNP的信号增强幅度为71.3％，Fe-PEG-MNP的信号增强幅度为49.5％。可见Cu-PEG-MNP及Fe-PEG-MNP均能穿透肿瘤部位血管，在肿瘤部位有效累积，用于肿瘤光声成像，尤其是Cu-PEG-MNP的效果更加明显，证明Cu的光声成像效果优于Fe，可顺利用于光声成像。
因此，螯合Cu的PEG-MNP具有良好的光声成像能力，对64Cu-PEG-MNP，其中64Cu是根据放射性剂量，通过Cu离子与MNP结合，因此，可知64Cu标记的MNP具有优良的光声成像能力。
试验例3本发明纳米颗粒用于肿瘤磁共振成像
从体外和体内两方面研究螯和金属离子到PEG-MNP后的MR信号增强效能。
一、体外MRI显像
MRI实验在磁共振(MR)扫描仪(Siemens 1.0T)中进行。不同浓度Cu-PEG-MNPs与琼脂糖水溶液(体积比为1:1)的混合物，将浓度为0.121,0.242,0.484和1.21μM的Cu填充到PCR管。将管放入MR扫描仪中选择合适的MR序列(TR:50-3000ms；TE:5.5ms)，通过Image J软件处理图像。
通过体外MR T1加权扫描检测，结果显示，随着MNP浓度的增加，MR信号逐渐增强，表明Cu-PEG-MNP在其表面产生高磁场梯度(图7)。
二、体内MRI显像
为了进一步测量Cu-PEG-MNP在活体肿瘤中的聚集效应及MR显像效果，使用A431荷瘤裸鼠(n＝3)体内进行MR预显像，预显像后立即经尾静脉分别注射200μl(浓度200μM)Cu-PEG-MNP，4小时后再次进行MR显像。使用MR T1序列如下:TR:500ms，TE:28ms。采集后的图像通过Image J软件处理并进行半定量计算。
结果显示，在注射4小时后，A431肿瘤显示出增强的MR信号(图8)。与0小时相比，注射Cu-PEG-MNP 4小时后肿瘤的相对MR信号强度为1.16±0.58倍，出现了显著增强，证明了Cu-PEG-MNP可有效用于A431肿瘤的MR显像。
因此，螯合Cu的PEG-MNP具有良好的磁共振成像能力，对64Cu-PEG-MNP，其中64Cu是根据放射性剂量，通过Cu离子与MNP结合，因此，可知64Cu标记的MNP具有优良的磁共振成像能力。
试验例4本发明纳米颗粒用于肿瘤MicroPET显像
用A431肿瘤荷瘤鼠进行(n＝8)。
每只裸鼠经尾静脉注射11.1MBq(300μCi)的64Cu-PEG-MNPs，以2％异氟烷-氧气混合气体对裸鼠模型进行吸入麻醉，以足先位俯卧于Micro PET扫描床，分别在注射后2、4、8和24小时进行30分钟的PET/CT静态扫描，图像采用OSEM(ordered-subsets expectationmaximum)算法进行重建。
尾静脉注射后2、4、8和24小时分别采集荷瘤鼠的静态PET图像(n＝8)。延迟采集的冠状位及横断位图像在所有时间点肿瘤均清晰可见(图9)，并且展示了良好的肿瘤与背景对比，证实64Cu-PEG-MNP在注射后2h即可在肿瘤部位出现明显聚集，此后可在肿瘤组织能有效停留长达24小时。同时，图像也显示出64Cu-PEG-MNP在肝脏中的高度的聚集，这也是大多数纳米微粒在体内的主要停留位置。
可知，64Cu-PEG-MNP同样具有良好的PET成像能力。
综上，本发明放射性铜标记的黑色素纳米颗粒，可用于光声、磁共振和PET成像，具有良好的多模态成像能力，效果优于使用其它金属离子标记，具有良好的应用前景。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：蒸气灭菌锅废热回收系统