制备螯合放射性同位素的且其表面被靶向psma受体的特异性分子修饰的聚合物纳米颗粒的方法及其用途
阅读说明：本技术 制备螯合放射性同位素的且其表面被靶向psma受体的特异性分子修饰的聚合物纳米颗粒的方法及其用途 (Method for producing polymeric nanoparticles which are chelated to radioisotopes and whose surface is modified by specific molecules targeting the PSMA receptor, and use thereof ) 是由 托马斯·夏奇 玛格达莱纳·扬切夫斯卡 格泽戈兹·皮库斯 康斯坦卡·科皮拉 于 2019-03-19 设计创作，主要内容包括：一种制备螯合放射性同位素的且其表面被靶向癌细胞表面上PSMA受体的特异性分子修饰的聚合物纳米颗粒的方法,其中由连接子分子修饰的靶向剂附着到葡聚糖链上的自由醛基。根据本发明方法合成的螯合放射性同位素的葡聚糖粒子用于诊断和治疗前列腺癌和转移性癌以及所述纳米颗粒对其病变部位显示亲和力的其他癌症。(A method of preparing a polymeric nanoparticle chelated with a radioisotope and having its surface modified with a specific molecule targeting PSMA receptors on the surface of cancer cells, wherein a targeting agent modified with a linker molecule is attached to the free aldehyde groups on the dextran chain. The radioisotope chelated dextran particles synthesized according to the method of the invention are useful for the diagnosis and treatment of prostate and metastatic cancers as well as other cancers for which the nanoparticles show affinity for their diseased sites.)
技术领域
本发明涉及一种用于制备能够持久和稳定螯合放射性同位素且具有针对肿瘤细胞表面PSMA受体的附着靶向剂的聚合物纳米颗粒的方法。所述颗粒主要用于前列腺癌细胞和转移性前列腺癌细胞的治疗和诊断，以及局灶疗法(靶向局部近距离放射疗法)。
背景技术
美国癌症协会的数据显示，2012年，世界范围内有记录的患癌病例为1410万，因癌症死亡人数约820万。2015年，美国预计新增癌症1，658，370例，其中220，800例为前列腺癌；预计死亡589，430例(35.5％)，其中27，540例死于前列腺癌。据估计，2030年将有大约2170万新增癌症病例，其中死亡大约1300万。上述数值产生的背景考虑了正出生率和日益严重和普遍的人口老龄化。因与文明和生活方式相关的决定因素(吸烟、不良饮食、缺乏体育活动)，这些预测数值可能会继续增长。
前列腺癌的诊断已有成熟技术。目前使用的超声成像和磁共振成像的混合诊断方法能够越来越清晰地识别前列腺内的严重病变部位。得益于此，后续的、且仍然不可替代的活检会更加准确。然而，转移性癌细胞的治疗依然是现代医学面临的一大挑战。当前已知的使用放射性同位素的方案可分为3个子组:(I)偶联物其由螯合放射性同位素的靶向分子引导，(ii)小分子其利用代谢改变作为靶向元素的或(iii)放射性同位素的游离混合物其利用放射性同位素在骨组织中的自然蓄积，骨组织是转移性前列腺癌细胞的最常见部位。
偶联物是指由如下三种成分组成的化合物:螯合剂(通常是双功能螯合剂)、连接子和靶向分子(适体、寡肽、抗体、抗代谢物)。
抗代谢物和小分子(葡萄糖)更易被肿瘤吸收和利用。这种作用机制能够普适地靶向各种类型的癌症。该类化合物用于FDG(氟-18标记的葡萄糖)和(氟-18标记的氟昔洛韦)或C-choline(碳-11胆碱)等标记。上述产品的共有特征是作为碳化合物骨架组成部分的放射性同位素。然而，这需要放射性药物的“热”合成和快速递送。
由于放射性同位素对骨细胞的天然生物亲和性及其易于在骨组织中蓄积，市场上已有以游离放射性同位素的溶液的形式施予患者的放射性药物。该制剂最适合治疗转移性前列腺癌患者。拜耳的可能是这类制剂的一个例子。给药游离同位素意味着放射活动是非定位的。这不仅影响骨组织中的转移性前列腺癌细胞，也影响骨骼正常功能所必需的成骨和骨吸收细胞。
基于纳米颗粒的治疗是一种有益的解决方案，因为单一药剂既可以递送药物又可以通过识别癌细胞高度表达的表面受体而作为前列腺癌的造影剂。前列腺特异性膜抗原(PSMA)是首次在人前列腺癌细胞系LNCaP中检测到的II型跨膜糖蛋白。根据现有知识，前列腺癌细胞膜具有的PSMA受体是健康前列腺细胞的十倍以上[《前列腺》2004，58，200-210。]
PSMA表达通常随着前列腺癌的发展和转移而增强，从而为有效的癌细胞靶向以及成像和癌症治疗提供完美靶点，尤其是在疾病侵袭性更强的情况下。在过去二十年里，已经测试了大量的低分子PSMA抑制剂，如膦酸盐、磷酸盐和磷酸酰胺盐，以及硫醇和尿素。此外，高PSMA水平还见于与包括乳腺、肺、结肠和胰腺在内的其他实体瘤系统相关的癌症内皮细胞。
癌症治疗中的靶向疗法在临床前和临床试验中的发展势头强劲。利用纳米颗粒通过向肿瘤微环境进行细胞外释放药物(被动转运)或通过内吞作用进行细胞内药物释放(主动转运)，可以将药物定位递送至癌细胞。
将另一种物质附着到药物纳米颗粒上的主动靶向疗法似乎非常有益，该种物质对癌细胞膜受体的亲和力非常高，从而显著增加了药物与癌细胞的结合以及药物的摄取(Moghimi等人，2001)。这使得找到合适的配体来匹配特定癌症类型的受体特征变得非常重要。
发明内容
本发明的目的是向前列腺癌细胞、转移性前列腺癌细胞和任何已经证实的PSMA受体过表达癌症提供携带放射性同位素的特异性靶向聚合物纳米颗粒。
本发明的目的是提供一种用于制备其表面被靶向PSMA受体的特异性分子修饰的纳米颗粒的方法。本发明的另一个目的是提供一种可用于疗法(局部近距离放射疗法)以及PET、PET/MR诊断的特异性靶向纳米颗粒。
本发明涉及一种用于制备螯合放射性同位素的且其表面被靶向癌细胞表面上PSMA受体的特异性分子修饰的聚合物纳米颗粒的方法。本发明还涉及根据所要求保护的方法获得的纳米颗粒及其用途。
上述用于制备螯合放射性同位素的且其表面被靶向癌细胞表面上PSMA受体的特异性分子修饰的聚合物纳米颗粒的方法包括以下步骤，其中:
a)通过高碘酸盐将葡聚糖链氧化成多醛，
b)将由连接子分子修饰的靶向剂附着到葡聚糖链中的游离醛基上，
c)附着疏水或亲水胺、二胺或多胺形式的折叠剂，其中折叠剂的一个或两个氨基附着到醛基上，
d)将所得亚胺键还原成胺键，
e)将螯合剂分子通过酰胺键附着到已附着折叠剂的游离氨基上，
f)将所得混合物进行纯化，
g)将纳米颗粒成分进行冷冻干燥。
优选地，步骤(f)中的混合物通过透析纯化。
优选地，PSMA受体所在的细胞是前列腺癌细胞和转移性前列腺癌细胞。
同样优选地，PSMA受体所在的细胞是乳腺癌、肺癌、结肠癌和胰腺癌细胞。
根据本发明的方法，靶向剂取代醛基的比例为1-50％，优选2.5-5％。
螯合剂使用DOTA、DTPA和/或NOTA的衍生物。
靶向剂使用谷氨酸和赖氨酸的α，α-脲。
连接子优选地使用2，5-二氧吡咯烷-1-基-2，2-二甲基-4-氧代-3，8，11，14，17，20-六氧杂-5-氮杂-23-酸酯(PEG5)。
折叠剂使用疏水性或亲水性胺、二胺或多胺，例如十二胺、二氨基辛烷、二氨基癸烷(DAD)、聚醚二胺、聚丙烯二胺和嵌段共聚物二胺。
根据本发明的方法，以放射化学法标记所得纳米颗粒。优选地，纳米颗粒用同位素标记，其中衰变途径包括β正衰变、β负衰变、γ发射体，例如Cu-64、Ga-68、Ga-67、It-90、In-111、Lu-177、Ak-227、以及Gd(用于磁共振)。
本发明还提供一种用于诊断和治疗的、根据上述方法获得的螯合放射性同位素并且其表面被靶向PSMA受体的特异性分子修饰的聚合物纳米颗粒。
本发明提供一种螯合放射性同位素的聚合物纳米颗粒在正电子发射断层摄影(PET)或混合正电子发射断层摄影/磁共振成像(PET/MRI)诊断中的用途。
本发明还涉及一种螯合放射性同位素的聚合物纳米颗粒在局部近距离放射疗法中的用途。
进一步地，本发明提供一种螯合放射性同位素的聚合物纳米颗粒在前列腺癌和转移性前列腺癌细胞以及纳米颗粒对其显示亲和力的残留病变细胞的治疗和诊断中的用途。
本发明的纳米颗粒可以通过使用诸如葡聚糖、透明质酸、纤维素及其衍生物的聚合物来获得。天然形式的聚合物以及被氧化成醛基或羧基后的聚合物均可使用。纳米颗粒的合成是通过亚胺的形成及后续还原和羧酸酯来进行的。
折叠剂使用疏水性或亲水性胺、二胺、聚乙二醇、聚丙二醇或短嵌段-嵌段聚合物，其中的一个或两个胺基可以进行反应。
靶向剂使用谷氨酸和赖氨酸的α，α-urea，即使用Glu-CO-Lys(GuL)，其化学式为：
该小分子化合物是两个氨基酸的尿素衍生物，对PSMA受体有很高的亲和力。它与氨基酸形成氢键，与蛋白质内部活性中心的锌原子形成配位键。结果，它与受体强烈结合，形成一种通过内吞作用穿透细胞的复合物。GuL是一种可以在伯氨基中被选择性修饰的化合物，这为该颗粒的生物偶联开启了相当大的可能性。
根据受体蛋白的结构，选择并应用靶向分子(GuL)所附着的连接子分子。连接子使用ω-氨基酸衍生物，包括寡肽衍生物，其中氨基被诸如叔丁氧羰基(Boc)、9-芴甲基羰基(Fmoc)、苄氧羰基(Cbz)、苄基(Bn)、三苯基甲基(Tr)等基团保护，而羰基以游离酸(羧基)或酯的形式存在。所用连接子的总结构式如下：
其中R和R’可能具有以下结构:
由于靶向剂对受体的蛋白质结构显示亲和力，使用以下类型的连接子:
特别优选地使用含有聚氧化乙烯(PEG)的连接子，其中n为5(PEG5)或n为4(PEG4)，如下所示:
本发明的纳米颗粒通过聚合物链的化学修饰获得，随后通过在水环境中的自组织形成动态微胞结构。
在初始步骤，将葡聚糖链氧化成多醛葡聚糖(PAD)。
使用高碘酸盐氧化葡聚糖以形成醛基。醛基的形成没有使聚合物链断裂。
为准确计算靶向剂和折叠剂的加入量，有必要测定氧化过程中形成的醛基。制剂制备的百分比比例保持不变，以确保后续制备的一系列纳米颗粒之间的工艺可重复性和相似性。醛基的量为200至800μmol/1g PAD，优选的300至600μmol/1g PAD。
在将靶向剂连接至纳米颗粒之前，将靶向剂与连接子组合。在反应中以三酯的形式使用的Glu-CO-Lys(GuL)通过与连接子交联的方式进行修饰以延长其胺分支。该方法的这一步骤会为抑制剂-靶向分子提供进入PSMA受体活性位点口袋的精确路径。同时，与纳米颗粒组合后的抑制剂将充分显露在该颗粒的表面。
在下一步中，将此前制备的已经附着到连接子上的靶向剂附着到多醛葡聚糖的醛基上，其中亚胺化反应导致希夫(Schiff)碱的形成。然后，将亲脂性二胺形式的折叠剂附着到PAD醛基上，从而进一步形成亚胺键。
所形成的亚胺键用硼氢化物乙醇溶液还原。该硼氢化物可以是硼氢化钠或硼氢化钾或氰基硼氢化物。随后，将螯合剂分子附着到来自与附着到葡聚糖链的二胺的游离胺基上。通过胺与螯合剂分子的NHS酯(N-羟基琥珀酰亚胺酯)的偶联，附着螯合剂分子。
制备待标记产物的关键步骤是通过透析对制剂纯化。
用水或合适的缓冲液进行透析12-72h，优选地24-48h，并以一定频次更换液体。外加液体与待纯化样品的容积比为20∶1至200∶1，优选100∶1。螯合剂分子附着后，反应所得混合物用pH5.0的乙酸缓冲液进行纯化；然后，在叶酸(FA)分子附着后，用pH7.4的磷酸盐缓冲液纯化混合物。
然后对已纯化纳米颗粒进行冷冻干燥，从而可以干泡沫的形式将其储存至少3个月。在与水重新结合后，轻轻搅拌目标缓冲液，纳米颗粒在大约20分钟内重组。
纳米颗粒制备的最后步骤可以涉及放射化学标记。
根据本发明的纳米颗粒用同位素标记，其中衰变途径包括β正衰变、β负衰变、γ发射体衰变。这些同位素是指Cu-64、Ga-68、Ga-67、It-90、In-111、Lu-177、Ak-227和Gd(用于MRI)。这使得本发明可用于治疗和诊断目的。诊断可以使用各种可用的方法:PET、SCEPT、MRI、及其混合，例如PET/MRI。
在成像诊断中的使用以上述方法制备的纳米颗粒，因早期癌症检测和同时靶向疗法，增加了完全治愈患有前列腺癌或转移性前列腺癌的患者的机会，并且可以监测治疗的进展。
附图说明
附于描述本发明的说明书之后的各图如下:
图1示出了针对纳米颗粒的PSMA受体酶活性抑制荧光分析，其中，该纳米颗粒的醛基为GuL靶向剂取代的比例为：10％(BCS 0277)、30％(BCS 0290)和2.5％(BCS 0319)，以及无取代(无纳米颗粒的对照)，分析使用各种浓度的纳米颗粒溶液，如16μg、4μg、1.6μg、0.4μg、以及0.16μg。
图2示出了针对于不同量的靶向剂，即8000ng、800ng、80ng和8ng，具有不含连接子(408)和含连接子(277)的GuL的纳米颗粒抑制PSMA的荧光分析。
具体实施方式
将在以下描述的优选实施例中阐述本发明的目的。
实施例1
使用DAD折叠剂取代度为90％的Gul靶向剂制备醛基取代度为10％的纳米颗粒(BCS277)
1.1.将葡聚糖氧化成多醛葡聚糖(PAD)
葡聚糖氧化反应:
将5.00g葡聚糖溶解在100ml超纯水中。加入0.66g高碘酸钠。氧化反应在室温、黑暗中持续一夜。在100倍容积的超纯水中透析72h以纯化产物，其中至少换水两次。在40℃蒸发去除水。
测定PAD中的醛基:
将100μl 0.8mM盐酸羟胺溶液、300μl 0.6M乙酸缓冲液(pH 5.8)、以及20-100μlPAD加入2ml管中，然后加入超纯水(0-80μl)至总容积500μl。对不同的三种PAD容积(20、60和100μl)进行测定。制备对照样品:将100μl0.8mM盐酸羟胺溶液、300μl 0.6M乙酸缓冲液(pH 5.8)、以及100μl超纯水加入试管。混合样品，在95℃下培养15分钟，然后在室温下培养5分钟。向每个样品加入500μl0.05％TNBS溶液。混合样品，在室温、黑暗中培养60分钟。培养完成后，立即在500nm波长下测量样品吸光度。将300μlpH5.8的0.6M乙酸盐缓冲液与200μl超纯水混合以用作空白试样。基于以上测定值，确定醛基含量为480.3μmol/1g PAD。
1.2.Glu-CO-Lys(OBut)3NH2与连接子PEG5的反应
将10.40mg(0.0205mmol)的连接子(化合物1)溶解在0.5ml无水二氯甲烷中。随后，加入10.00mg(0.0205mmol)叔丁基三酯形式的谷氨酸和赖氨酸的α，α-脲(化合物2)和4μl的DIPEA。反应在室温下进行24h。然后，加入150升TFA，并在室温下进行反应24h。蒸发溶剂，将油状残余物溶解在0.5ml超纯水中，然后用5M氢氧化钠溶液碱化至pH>11，其中该酸碱度使用万用试纸测量。所得被连接子修饰的GuL(化合物5)水溶液用于下一合成步骤，无需纯化。
1.3.形成已附着靶向剂Glu-CO-Lys的葡聚糖纳米颗粒。
将427mg PAD(含有205.1μmolCHO)溶解在4.3ml超纯水中，得到10％(w/v)的溶液。将被连接子修饰的Glu-CO-Lys(化合物5)的水溶液加入该混合物。在所得反应混合物中，使用0.5M NaOH溶液使酸碱度达到11.00，在30℃下搅拌混合物60分钟，得到修饰的多醛葡聚糖(化合物6)。此后，加入2.27ml1，10-二氨基癸烷二盐酸盐的2％(w/v)超纯水溶液，将所得反应混合物在30℃下搅拌10分钟，控制酸碱度并每隔20分钟调节至10。反应结束后，用0.5M盐酸溶液将酸碱度调至7.4。然后，加入1.60ml硼氢化钠的1％(w/v)乙醇溶液。在37℃下进行还原反应60分钟。反应结束后，用0.5M盐酸溶液将酸碱度调至7.4。最终产物8通过在100倍容积的超纯水中透析48h来纯化，换水6次。通过冷冻干燥从所得纯化纳米颗粒中除去水。
1.4.将DOTA螯合剂附着在含有GuL靶向剂的纳米颗粒上
将100mg的纳米颗粒冻干剂(化合物8)溶解在2.0mlpH 8.0的0.1M磷酸盐缓冲液中。然后，加入0.5ml含有18.5mg螯合剂的超纯水DOTA-NHS悬浮液。所得反应混合物在室温下搅拌90分钟。用100倍容积的pH5.0的10nM醋酸缓冲溶液透析48h以纯化产物，更换缓冲溶液6次。通过冷冻干燥从所得纯化纳米颗粒(化合物9)中除去水。
实施例2
使用DAD折叠剂(BCS290)取代度为70％的Gul靶向剂制备醛基取代度为30％的纳米颗粒
2.1.将葡聚糖氧化成多醛葡聚糖(PAD)
葡聚糖氧化反应:
将5.00g葡聚糖溶解在100ml超纯水中。加入0.66g高碘酸钠。氧化反应在室温下、黑暗中持续一夜。在100倍容积的超纯水中透析72h以纯化产物，其中至少换水两次。在40℃蒸发除去水。
PAD中醛基的测定:
将100μl 0.8mM盐酸羟胺溶液、300μl 0.6M乙酸缓冲液(pH5.8)、以及20-100μlPAD加入到2ml管中，然后加入超纯水(0-80μl)至总容积为500μl。对三种不同的PAD容积(20、60和100μl)进行测定。制备对照样品:将100μl0.8mM盐酸羟胺溶液、300μl0.6mMpH5.8的乙酸缓冲液、以及100μl超纯水加入试管中。混合样品，在95℃培养15分钟，然后在室温培养5分钟。向每个样品加入500μl 0.05％TNBS溶液。混合样品，在室温、黑暗中培养60分钟。培养完成后，立即在500nm波长下测量样品吸光度。将300μlpH5.8的0.6M乙酸盐缓冲液与200μl超纯水混合以作为空白试样。以上分析测定的醛基含量为508.1μmol/1gPAD。
2.2.Glu-CO-Lys(OBut)3NH2与连接子PEG5的反应
将15.50mg(0.0307mmol)连接子(化合物1)溶解在0.75ml无水二氯甲烷中。随后，加入15.00mg(0.0307mmol)叔丁基三酯形式的谷氨酸和赖氨酸的α，α-脲(化合物2)和6μl的DIPEA。反应在室温下进行24h。此后，加入234μlTFA，并在室温下继续搅拌24h。蒸发溶剂，将油状残余物溶解在0.75ml超纯水中，然后用5M氢氧化钠溶液碱化至pH>11，其中该酸碱度使用万用试纸测量。所得被连接子修饰的GuL(化合物5)水溶液用于下一步骤的合成，无需纯化。
2.3.具有已附着靶向剂GuL的葡聚糖纳米颗粒的形成
将200mgPAD(含有101.6μmolCHO)溶解在2.0ml超纯水中，得到10％(w/v)的溶液。向该混合物中加入已被连接子修饰的GuL(化合物5)的水溶液。在所得反应混合物中，使用0.5M氢氧化钠溶液使酸碱度达到11.00，在30℃下将混合物搅拌60分钟，得到修饰的多醛葡聚糖(化合物6)。此后，加入0.87ml1，10-二氨基癸烷二盐酸盐的2％(w/v)超纯水溶液，将由此获得的反应混合物在30℃下搅拌10分钟，每隔20分钟控制和调节酸碱度至10。反应结束后，用0.5M盐酸溶液将酸碱度调至7.4。然后，加入0.88ml硼氢化钠的1％(w/v)乙醇溶液。还原反应在37℃下进行60分钟。反应结束后，用0.5M盐酸溶液将酸碱度调至7.4。最终产物8在100倍容积的超纯水中透析48h以进行纯化，其中换水6次。通过冷冻干燥从已纯化的纳米颗粒中除去水。
2.4.将DOTA螯合剂附着在含有GuL靶向剂的纳米颗粒上
将100mg纳米颗粒冻干剂(化合物8)溶解在2.0mlpH 8.0的0.1M磷酸盐缓冲液中。然后，加入0.5ml含有18.5mg螯合剂的超纯水DOTA-NHS悬浮液。将所得反应混合物在室温下搅拌90分钟。用100倍容积的pH5.0的10mM乙酸盐缓冲液进行透析48h以纯化产物，更换缓冲液6次。通过冷冻干燥从所得纯化纳米颗粒(化合物9)中除去水。
实施例3
使用DAD折叠剂(BCS318)取代度为95％的Gul靶向剂制备醛基取代度为5％的纳米颗粒。
3.1.将葡聚糖氧化成多醛葡聚糖
葡聚糖氧化反应:
将5.00g葡聚糖溶解在100ml超纯水中。加入0.66g高碘酸钠。氧化反应在室温、黑暗中持续一夜。在100倍容积的超纯水中透析72h以纯化产物，其中至少换水两次。在40℃蒸发除去水。
PAD中醛基的测定:
将100μl 0.8mM盐酸羟胺溶液、300μl 0.6m乙酸缓冲液(pH5.8)、以及20-100μlPAD加入到2ml试管中，然后加入超纯水(0-80μl)至总容积500μl。对三种不同的PAD容积(20、60和100μl)进行测定。制备对照样品:将100μl0.8mM盐酸羟胺溶液、300μl0.6mMpH为5.8的乙酸缓冲液和100μl超纯水加入试管中。混合样品，在95℃培养15分钟，然后在室温培养5分钟。向每个样品加入500μl0.05％的TNBS溶液。混合样品，在室温、黑暗中培养60分钟。培养完成后，在500nm的波长下测量样品吸光度。300μlpH5.8的0.6M乙酸盐缓冲液与200μl超纯水混合以用作空白试样。这种测定确定醛基含量为480.3μmol/1gPAD。
3.2.Glu-CO-Lys(OBut)3NH2与连接子PEG5的反应
将10.40mg(0.0205mmol)连接子(化合物1)溶解在0.5ml无水二氯甲烷中。随后，加入10.00mg(0.0205mmol)叔丁基三酯形式的谷氨酸和赖氨酸的α，α-脲(化合物2)和4μl的DIPEA。反应在室温下进行24h。此后，加入150μlTFA，并在室温下继续混合24h。蒸发溶剂，将油状残余物溶解在0.5ml超纯水中，然后用5M氢氧化钠溶液碱化至pH>11，其中该酸碱度使用万用试纸测量。所得连接子修饰的GuL(化合物5)的水溶液用于下一步骤的合成，无需纯化。
3.3.利用已附着的靶向剂Glu-CO-Lys形成葡聚糖纳米颗粒。
将854mgPAD(包含410.2μmolCHO)溶解在8.54ml超纯水中，得到10％(w/v)的溶液。向该混合物中加入被连接子修饰的GuL(化合物5)的水溶液。在所得反应混合物中，使用0,5M氢氧化钠溶液确定pH11.00，将混合物在30℃搅拌60分钟，得到修饰的多醛葡聚糖(化合物6)。此后，加入4.78ml1，10-二氨基癸烷二盐酸盐的2％(重量/容积)超纯水溶液，将所得反应混合物在30℃搅拌10分钟，每隔20分钟控制和调节酸碱度至10。反应结束后，用0.5M盐酸溶液将酸碱度调至7.4。然后，加入3.18ml硼氢化钠的1％(重量/容积)乙醇溶液。还原反应在37℃下进行60分钟。反应结束后，用0.5M盐酸溶液将酸碱度调至7.4。最终产物8通过在100倍容积的超纯水中透析48h进行纯化，中间换水6次。通过冷冻干燥从所得纯化纳米颗粒中除去水。
3.4.将DOTA螯合剂附着在含有GuL靶向剂的纳米颗粒上
将100mg纳米颗粒冻干剂(化合物8)溶解在2.0ml8.0pH的0.1M磷酸盐缓冲液中。然后，加入0.5ml含有18.5mg螯合剂的超纯水DOTA-NHS悬浮液。将所得反应混合物在室温下搅拌90分钟。用100倍容积的pH5.0的10mM乙酸盐缓冲液透析48h以纯化产物，更换缓冲液6次。通过冷冻干燥从已纯化纳米颗粒(化合物9)中除去水。
实施例4
使用DAD折叠剂(BCS319)取代度为97.5％的Gul靶向剂制备醛基取代度为2.5％的纳米颗粒。
4.1.将葡聚糖氧化成多醛葡聚糖(PAD)
葡聚糖氧化反应:
将5.00g葡聚糖溶解在100ml超纯水中。加入0.66g高碘酸钠。氧化反应在在室温、黑暗中持续一夜。在100倍容积的超纯水中透析72h以纯化产物，其中至少换水两次。在40℃蒸发除去水。
测定PAD中的醛基:
将100μl 0.8mM盐酸羟胺溶液、300μl 0.6M乙酸缓冲液(pH为5.8)、以及20-100μlPAD加入到2ml管中，然后加入超纯水(0-80μl)至总容积500μl。对三种不同的PAD容积(20、60和100μl)进行测定。制备对照样品:将100μl0.8mM盐酸羟胺溶液、300μl0.6mMpH5.8乙酸缓冲液和100μl超纯水加入试管中。将样品混合，在95℃培养15分钟，然后在室温培养5分钟。向每个样品加入500μl0.05％TNBS溶液。将样品混合，在室温、黑暗中培养60分钟。培养完成后，立即在500nm波长下测量样品吸光度。将300μlpH5.8的0.6M乙酸盐缓冲液与200μl超纯水混合以用作空白试样。以上测定确定醛基含量为480.3μmol/1gPAD。
4.2.Glu-CO-Lys(OBut)3NH2与连接子PEG5的反应。
将5.20mg(0.01025mmol)连接子(化合物1)溶解在0.25ml无水二氯甲烷中。随后，加入5.00mg(0.01025mmol)叔丁基三酯形式的谷氨酸和赖氨酸的α，α-脲(化合物2)和2μl的DIPEA。反应在室温下进行24h。此后，加入75μlTFA，并在室温下继续混合24h。蒸发溶剂，将油状残余物溶解在0.25ml的超纯水中，然后用5M氢氧化钠溶液碱化至pH>11，其中该酸碱度使用万用试纸测量。如此制备的已被连接子修饰的GuL(化合物5)的水溶液用于合成的下一阶段，无需纯化。
4.3.附接的靶向剂Glu-CO-Lys形成葡聚糖纳米颗粒。
将854mgPAD(含410.2μmolCHO)溶解在8.54ml超纯水中，得到10％(w/v)的溶液。向该混合物中加入被连接子修饰的GuL(化合物5)的水溶液。在所得反应混合物中，使用0,5M氢氧化钠溶液确立pH 11.00，在30℃搅拌混合物60分钟，得到修饰的多醛葡聚糖(化合物6)。此后，加入4.90ml1，10-二氨基癸烷二盐酸盐的2％(w/v)超纯水溶液，将所得反应混合物在30℃搅拌10分钟，控制酸碱度并每隔20分钟调节至10。反应结束后，用0.5M盐酸溶液将酸碱度调至7.4。然后，加入3.14ml硼氢化钠的1％(w/v)乙醇溶液。在37℃下进行还原反应60分钟。反应结束后，用0.5M盐酸溶液将酸碱度调至7.4。在100倍容积的超纯水中透析最终产物848h以进行纯化，其中换水6次。通过冷冻干燥从纯化纳米颗粒中除去水。
4.4.将DOTA螯合剂附着在含有GuL靶向剂的纳米颗粒上
将100mg纳米颗粒冻干剂(化合物8)溶解在2.0mlpH 8.0的0.1M磷酸盐缓冲液中。然后，加入0.5ml含有18.5mg螯合剂的超纯水DOTA-NHS悬浮液。所得反应混合物在室温下搅拌90分钟。用100倍容积的pH5.0的10mM乙酸盐缓冲液透析48h以纯化产物，更换缓冲液6次。通过冷冻干燥从该纯化纳米颗粒(化合物9)中除去水。
实施例5
使用DAD折叠剂(BCS319)取代度为99％的Gul靶向剂制备醛基取代度为1％的纳米颗粒。
5.1.将葡聚糖氧化成多醛葡聚糖
葡聚糖氧化反应:
将5.00g葡聚糖溶解在100ml超纯水中。加入0.66g高碘酸钠。，氧化反应在室温、黑暗中持续一夜。在100倍容积的超纯水中透析72h来纯化产物，其中至少换水两次。在40℃蒸发除去水。
测定PAD中醛基:
将100μl 0.8mM盐酸羟胺溶液、300μl 0.6m乙酸缓冲液(pH5.8)、以及20-100μlPAD加入到2ml试管中，然后加入超纯水(0-80μl)至总容积500μl。对三种不同的PAD容积(20、60和100μl)进行测定。制备对照样品:将100μl0.8mM盐酸羟胺溶液、300μl0.6mMpH为5.8的乙酸缓冲液和100μl超纯水加入试管中。混合样品，在95℃培养15分钟，然后在室温培养5分钟。向每个样品加入500μl0.05％TNBS溶液。混合样品，在室温、黑暗中培养60分钟。培养完成后，立即在500nm的波长下测量样品吸光度。将300μlpH5.8的0.6M乙酸盐缓冲液与200μl超纯水混合以用作空白试样。上述测定确定醛基含量为480.3μmol/1gPAD。
5.2Glu-CO-Lys(OBut)3NH2与连接子PEG5反应
将5.20mg(0.01025mmol)连接子(化合物1)溶解在0.25ml无水二氯甲烷中。随后，加入5.00mg(0.01025mmol)叔丁基三酯形式的谷氨酸和赖氨酸的α，α-脲(化合物2)和2μl的DIPEA。反应在室温下进行24h。此后，加入75μlTFA，并在室温下继续混合24h。蒸发溶剂，将油状残余物溶解在0.25μl超纯水中，然后用5M氢氧化钠溶液碱化至pH>11，其中该酸碱度使用万用试纸测量。所得被连接子修饰的GuL(化合物5)水溶液用于下一步骤的合成，无需纯化。
5.3.使用附接的靶向剂Glu-CO-Lys形成葡聚糖纳米颗粒。
将2135mgPAD(含有1025.5μmolCHO)溶解在21.35ml的超纯水中，得到10％(w/v)的溶液。向该混合物中加入已被连接子修饰的GuL(化合物5)的水溶液。在所得反应混合物中，使用0.5M氢氧化钠溶液使酸碱度达到11.00，在30℃搅拌混合物60分钟，得到修饰的多醛葡聚糖(化合物6)。此后，加入12.45ml1，10-二氨基癸烷二盐酸盐的2％(重量/容积)超纯水溶液，所得反应混合物在30℃下搅拌10分钟，控制酸碱度并每隔20分钟调节至10。反应结束后，用0.5M盐酸溶液将酸碱度调至7.4。然后，加入8.84ml硼氢化钠的1％(w/v)乙醇溶液。还原反应在37℃下进行60分钟。反应结束后，用0.5M盐酸溶液将酸碱度调至7.4。在100倍容积的超纯水中透析最终产物848h以进行纯化，换水6次。通过冷冻干燥从上述已纯化纳米颗粒中除去水。
5.4.将DOTA螯合剂附着在含有GuL靶向剂的纳米颗粒上
将100mg纳米颗粒冻干剂(化合物8)溶解在2.0mlpH 8.0的0.1M磷酸盐缓冲液中。然后，加入0.5ml含有18.5mg螯合剂的超纯水DOTA-NHS悬浮液。所得反应混合物在室温下搅拌90分钟。用100倍容积的pH为5.0的10mM乙酸盐缓冲液透析48h以纯化产物，更换缓冲液6次。通过冷冻干燥从上述已纯化纳米颗粒(化合物9)中除去水。
实施例6
已附着GuL靶向剂的纳米颗粒对PSMA受体的抑制作用
具有嵌入在连接子上的附着GuL靶向剂的纳米颗粒针对PSMA受体的特异性进行了研究。进行体外酶测定以研究由GuL阻断PSMA活性位点引起的PSMA活性的降低。该研究针对以下纳米颗粒:
-BCS 0277–用GuL靶向剂取代10％的醛基；
-BCS 0290–用GuL靶向剂取代30％的醛基；
-BCS 0319–用GuL靶向剂取代2.5％的醛基；
用于分析的多种浓度的纳米颗粒溶液，即16g、4g、1.6g、0.4g、0.16g。
结果显示在图1中，示出了反映酶活性降低的荧光下降。通过这种方式，确定了具有已附着GuL靶向剂的纳米颗粒的PSMA抑制。
测试表明，纳米颗粒的结合性越强(GuL含量)，表示PSMA酶活性的荧光越低。观察到的趋势证实：用GuL靶向剂取代30％、10％以及2.5％的醛基，结合的GuL靶向剂的量逐渐增加。同时，对各种纳米颗粒溶液浓度值的测试结果进行分析，表明所提出的方法能够定量测定GuL试剂并明确发生抑制所需的最小纳米颗粒浓度。
这些试验是决定性的，证明了一旦附着到纳米颗粒结构上，置于连接子上的GuL靶向剂对前列腺癌细胞表面存在的PSMA受体具有高亲和力。
实施例7
具有GuL靶向剂的纳米颗粒对PSMA受体的亲和力
通过测量其在表现出PSMA受体高度过表达的LNCaP细胞(前列腺癌细胞系)表面上的结合程度，测试具有沉积在连接子上的GuL靶向剂的纳米颗粒对PSMA受体的亲和力。
用放射性镥标记纳米颗粒，然后在多孔板上以50μg/ml的浓度与LNCaP一起培养。通过测量γ放射来确定纳米颗粒结合能力和细胞内化。该方法的特点是测量灵敏度高。
给出了以下纳米颗粒的测试结果:
-BCS 0290–用GuL靶向剂取代30％的醛基
-BCS 0318–用GuL靶向剂取代5％的醛基
-BCS 0319–用GuL靶向剂取代2.5％的醛基
表1中示出的结果表明，所有受测的纳米颗粒都表现出PSMA受体高度过表达。测试表明，具有2.5％至5％醛基被GuL靶向剂取代的纳米颗粒对PSMA受体具有显著更高的亲和力
表1
实施例8
测试GuL靶向剂连接子对纳米颗粒附着PSMA受体的特异性的重要性
GuL靶向剂通过连接子-PEG5(BocNH-PEG5-NHS)分子进行附着，该分子使得靶向剂更易到达PSMA受体。已经进行的研究证实了纳米颗粒表面上的GuL-连接子分子优于附着在纳米颗粒上的无连接子GuL分子。
图2中给出的结果说明了对于不同量的靶向剂，即8000ng、800ng、80ng和8ng，无连接子GuL(408)和有连接子(277)的纳米颗粒对PSMA的抑制。
基于所进行的测试，发现荧光的降低反映了纳米颗粒与针对PSMA受体蛋白的GUL靶向剂结合的程度。
所得结果证实了纳米颗粒通过附接到连接子的靶向剂进行结合的特异性。它们还表明，与不含连接子的靶向剂相比，含连接子的靶向剂提高了附着过程的效率与所获纳米颗粒相对于受体的效力。
缩写:
DOTA：1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸
DTPA：戊烯酸
NOTA：1，4，7-三氮杂环壬烷-1，4，7-三乙酸
DOTA-NHS：1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸和N-羟基琥珀酰亚胺单酯
DOTA-丁胺：1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三(乙酸)-10-(4-氨基丁酰基)乙酰胺
DOTA-马来酰亚胺：1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三-乙酸-10-马来酰亚胺乙基乙酰胺
DOTA-SCN：2-(4-异硫氰酸苄酯)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三乙酸
PET：正电子发射断层摄影
PET/MRI：正电子发射断层扫描和磁共振成像
NHS：N-羟基琥珀酰亚胺
SulfoNHS：N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠盐
PFP：五氟苯酚
TFP：2，3，5，6–四氟苯酚
STP：2，3，5，6-四氟-4-羟基苯磺酸钠盐
SCN：硫氰酸盐
PAD：多醛葡聚糖
DAD：二氨基癸烷
DIPEA：二异丙基乙胺
TFA：三氟乙酸
GuL or Glu-CO-Ly：谷氨酸和赖氨酸-α，α-尿素
Glu-CO-Lys(OBut)3NH2：叔丁基三酯形式的谷氨酸和赖氨酸的α，α-脲。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种用于制备螯合放射性同位素的且其表面被靶向癌细胞表面上PSMA受体的特异性分子修饰的聚合物纳米颗粒的方法，其特征在于包括如下步骤：
a)通过高碘酸盐将葡聚糖链氧化成多醛，
b)将由连接子分子修饰的谷氨酸和赖氨酸的α，α-脲靶向剂附着到所述葡聚糖链的游离醛基上，
c)附着疏水胺、二胺或多胺形式的折叠剂，其中所述折叠剂的一个或两个氨基附着到所述醛基上，
d)将所得亚胺键还原成胺键，
e)将螯合剂分子通过酰胺键附着到已附着折叠剂的游离氨基上，
f)将所得混合物进行纯化，
g)将纳米颗粒成分进行冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(f)中的混合物通过透析纯化。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述PSMA受体所在的细胞是前列腺癌细胞和转移性前列腺癌细胞。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述PSMA受体所在的细胞是乳腺癌、肺癌、结肠癌和胰腺癌细胞。
5.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述靶向剂取代所述醛基的比例为1-50％。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述靶向剂取代所述醛基的比例为2.5-5％。
7.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述螯合剂是DOTA、DTPA和/或NOTA的衍生物。
8.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述连接子是2，5-二氧吡咯烷-1-基2，2-二甲基-4-氧代-3，8，11，14，17，20-六氧杂-5-氮杂-23-酸酯(PEG5)。
9.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述折叠剂使用亲脂性二胺，例如十二胺、二氨基辛烷、二氨基癸烷(DAD)、聚醚二胺、聚丙烯二胺和嵌段共聚物二胺。
10.根据前述任一权利要求所述的方法，其中以放射化学法标记所得纳米颗粒，优选地，使用其衰变途径包括β正衰变、β负衰变、γ发射体衰变的同位素标记。
11.一种用于诊断和治疗的、根据权利要求1-10所述的方法获得的螯合放射性同位素的聚合物纳米颗粒，其中所述聚合物纳米颗粒的表面被靶向所述PSNA受体的特异性分钟所修饰。
12.一种用于正电子发射断层扫描PET和PET/MRI诊断的、根据权利要求11所述的螯合放射性同位素的聚合物纳米颗粒。
13.一种用于局部近距离放射疗法的、根据权利要求11所述的螯合放射性同位素的聚合物纳米颗粒。
14.一种根据权利要求1-10制备的、用于治疗和诊断前列腺癌和转移性癌以及所述纳米颗粒对其病变部位显示亲和力的其他癌症的、螯合放射性同位素的聚合物纳米颗粒。
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