阅读说明：本技术 用锆-89标记的超小纳米颗粒及其方法 (Ultra-small nanoparticles labeled with zirconium-89 and methods thereof ) 是由 M·S·布拉德伯里 陈风 U·维斯纳 马凯 于 2018-05-17 设计创作，主要内容包括：本文描述了包括用锆-89(<Sup>89</Sup>Zr)标记的超小胺化和cRGDY缀合纳米颗粒的纳米探针及其使用方法。所提供的组合物是肾可清除的,并且具有合适的血液循环半衰期、高肿瘤主动靶向能力、显著的肾清除、低肝蓄积和高肿瘤/本底比值。所描述的纳米探针表现出作为人类受试者的“靶向或清除”示踪剂用于癌症的全身性靶向成像(或治疗)的巨大潜力。(Described herein include the use of zirconium-89 ( 89 Zr) marked ultra-small amination and cRGDY conjugated nano-particle nano-probe anda method of use thereof. The provided compositions are renal-clearing and have a suitable blood circulation half-life, high tumor active targeting capacity, significant renal clearance, low liver accumulation and high tumor/background ratio. The nanoprobes described show great potential as "targeting or clearance" tracers for human subjects for systemic targeted imaging (or treatment) of cancer.)

用锆-89标记的超小纳米颗粒及其方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年5月25日提交的美国申请序列号62/510,859的权益，其公开内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明一般涉及包括纳米颗粒、放射性标记和靶向剂(例如抗体，例如靶向配体)的纳米探针(例如直径小于20纳米)，其可用于例如癌症和其它疾病的检测、预防和/或治疗。

政府资助

本发明是在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权号CA161280和CA199081的政府支持下完成的。政府拥有本发明中的某些权利。

背景技术

长期以来，在全身性施用后主动定位到目标靶标并在网状内皮系统(RES)中保持较低的非特异性蓄积的“靶向或清除”多官能纳米平台一直是纳米医学领域的主要挑战之一。

在过去的三十年中，尽管在小型动物中有各种类型的固体(或无机基)纳米材料的临床前研究成果，但是这些纳米材料中只有极少数已经进入了首次人类临床试验。纳米颗粒制造中的挑战、监管障碍、临床试验成本的快速上升、试验设计的复杂性增加、体内主动靶向功效受限以及肝蓄积率高(即30-99％的施用颗粒来自血流)是大多数现有纳米材料都需要解决的主要障碍的实例。对于具有大于10nm的流体动力学(HD)尺寸的纳米材料，即使具有隐形聚合物(例如聚乙二醇[PEG])的保护并且已通过肿瘤归巢配体(例如肽或抗体)进行了官能化，仍然普遍可见显著的网状内皮系统(RES)(即肝和脾)摄取、小于1的肿瘤/肝活性浓度比值和相对较低的肿瘤/本底(例如血液或肌肉)比值。高RES摄取还引起肝的长期体内毒性问题，这是由于肝的肝胆清除率极慢且通常无法预测，导致了获得美国食品和药物管理局(FDA)的研究用新药(IND)批准的延迟。

纳米药物所需性质的实例包含：1)制造过程容易，成本低廉；2)对疾病(例如癌症)部位的主动靶向功效高，脱靶率低(例如RES或其它健康器官中的非特异性摄取低)；3)适当(且可调)的血液循环半衰期，以确保纳米药物在癌症中的充分蓄积，以用于诊断或治疗目的；4)显著的肾清除，以使保证有利的安全性；5)经由临床相关成像技术(例如正电子发射断层扫描[PET]、单光子发射计算机断层扫描[SPECT]、磁共振成像(MRI)、计算机断层扫描[CT]和光学成像)的全身无创跟踪；和6)将足够的治疗剂(例如小分子药物、单线态氧、抑制剂、辐射、热量)特异性递送到癌细胞，以进行治疗。

尽管尺寸大于10nm的固体纳米材料相对于尺寸小于10nm的其同类材料具有显著增强的载药量的优势，但此些材料的临床转译仍可能因低肿瘤靶向功效和高脱靶性(例如与剂量限制性毒性相关的肝蓄积)而受到阻碍。

快速的肾清除、相对较短的血液循环半衰期(几分钟到几小时)和低RES摄取(大约5％ID/g或更少)表示限定了超小(小于10nm)肾可清除纳米颗粒的生物学特征。尽管已开发出合适的PEG化技术来改善此些平台的血液循环半衰期(最长>10小时)，但是以促进大量肾清除并同时保留主动肿瘤靶向能力的方式精确地控制生理化学性质(包含表面配体数量)的能力长期以来一直对本领域构成重大挑战。

仍然需要可以用于癌症和其它疾病的检测、预防和/或治疗的平台。

发明内容

本文描述了通过附接靶向配体和放射性标记[例如锆-89(⁸⁹Zr)]而由超小胺化纳米颗粒形成的纳米探针及其使用方法。所提供的组合物是肾可清除的，并且具有合适的血液循环半衰期、高肿瘤主动靶向能力、显著的肾清除、低肝蓄积和高肿瘤/本底比值。所描述的纳米探针表现出作为用于癌症的全身性靶向成像(或治疗)的人类受试者的“靶向或清除”示踪剂的巨大潜力。

特别地，本公开描述了使用各种放射性标记策略的放射性金属(例如锆-89(⁸⁹Zr，t_1/2＝78.4小时))的缀合如何影响纳米颗粒的生物学性质。例如，将⁸⁹Zr附接到表面胺化的整联蛋白靶向超小纳米颗粒(例如C'点)产生了有利的PK和清除曲线，并且相对于生物学对照在黑素瘤模型中显著改善了靶向肿瘤摄取和靶标/本底比值，同时将粒径保持在有效肾小球滤过粒径临界值(<10nm)以下。使用放射性标记策略开发的纳米探针的特征在于放射稳定性和血浆停留半衰期。所描述的纳米探针提供了适合于增强人类分子靶向癌症成像的放射生物学性质。

经发现，即使此较小的基于二氧化硅的纳米颗粒的硅烷醇密度随着其曲率半而降低，并且表面上可用官能团的数量减少，仍然可以附接放射性标记和靶向配体以产生所观察到的性质，使得纳米颗粒可以用于诊断和/或治疗应用。经发现，即使使用此些较小的纳米颗粒，也可以实现无螯合剂的标记。

一方面，本发明涉及一种由胺化纳米颗粒形成的纳米探针(例如放射性缀合物，例如纳米缀合物)，所述纳米探针包括：纳米颗粒(例如超小纳米颗粒，例如基于二氧化硅的纳米颗粒，例如C'点(例如NH₂-cRGDY-PEG-C'点))；与所述纳米颗粒缀合(例如直接或间接)的靶向剂(例如抗体片段，例如靶向肽(例如cRGD或其类似物)，例如小蛋白质(例如VEGF₁₂₁))；和放射性标记，其中所述纳米颗粒在与所述靶向剂和/或所述放射性标记缀合或缔合之前被胺官能化，并且其中所述纳米颗粒的直径(例如平均直径)不大于20纳米(例如在水溶液(例如盐水溶液)中通过动态光散射(DLS)测量)(例如其中所述平均纳米颗粒直径为1到20nm，例如1到15nm，例如1到10nm，例如1到8nm，例如4到10nm，例如4到8nm)(例如其中所述纳米探针的平均直径不大于50nm，例如不大于40nm，例如不大于30nm，例如不大于20nm，例如不大于15nm，例如不大于10nm)。

在某些实施例中，所述纳米颗粒包括超小纳米颗粒。

在某些实施例中，所述放射性标记包括⁸⁹Zr。在某些实施例中，所述放射性标记与所述纳米颗粒缔合(例如经由连接体共价或非共价键合到所述纳米颗粒，或直接共价或非共价键合到所述纳米颗粒，或与所述纳米颗粒或包围所述纳米颗粒的组合物缔合，例如经由范德华力)(例如没有螯合剂(例如其中所述纳米探针不含螯合剂))(例如具有螯合剂))。

在某些实施例中，所述靶向剂经由连接体共价或非共价键合到所述纳米颗粒，或直接共价或非共价键合到所述纳米颗粒，或与所述纳米颗粒或包围所述纳米颗粒的组合物缔合，例如经由范德华力。

在某些实施例中，所述纳米颗粒涂覆有有机聚合物。在某些实施例中，所述有机聚合物包括聚乙二醇(PEG)。

在某些实施例中，所述靶向剂包括靶向肽(例如RGD，例如cRGD，例如RGD的类似物，例如αMSH，例如任何已知具有免疫调节性质和抗炎性质的肽)。在某些实施例中，所述靶向肽包括选自由以下组成的群组的成员：精氨酰甘氨酰天冬氨酸(RGD)、环状精氨酰甘氨酰天冬氨酸(cRGD)、RGD的类似物、α-黑素细胞刺激激素(αMSH)和任何已知具有免疫调节性质和抗炎性质的肽。在某些实施例中，所述靶向剂包括抗体片段，并且其中所述抗体片段在约5kDa到约25kDa的范围内(例如约10kDa到约20kDa，例如约15kDa)(例如其中所述抗体片段包括功能性单域抗体片段)。在某些实施例中，所述靶向剂包括抗体片段，并且其中所述抗体片段为约20kDa到约45kDa(例如约25kDa到约30kDa)(例如其中所述抗体片段包括功能性单链抗体片段)。在某些实施例中，所述靶向剂包括抗体片段，并且其中所述抗体片段为约40kDa到约80kDa(例如约50kDa到约70kDa，例如约60kDa)(例如其中所述抗体片段包括功能性fab片段)。

在某些实施例中，纳米颗粒包括二氧化硅。在某些实施例中，所述纳米颗粒包括基于二氧化硅的核和包围所述核的至少一部分的二氧化硅壳。在某些实施例中，所述纳米颗粒包括在所述核内的荧光化合物(例如Cy5)。

在某些实施例中，所述靶向剂包括小蛋白质，并且其中所述小蛋白质包括VEGF₁₂₁。

在某些实施例中，所述靶向剂包块抗体片段，并且其中所述抗体片段是选自由以下组成的组的成员：重组抗体片段(fAb)、单链可变区片段(scFv)和单域抗体(sdAb)片段。在某些实施例中，所述靶向剂包括抗体片段，并且其中所述抗体片段是单链可变区片段(scFv)。在某些实施例中，所述靶向剂包括抗体片段，并且其中所述抗体片段是单域(sdAb)片段。

在某些实施例中，所述纳米颗粒(单个纳米颗粒)具有附接到其上的一到十种靶向剂(例如其中特定物种的一组纳米颗粒的每纳米颗粒靶向剂的平均数量在1到8的范围内，例如1到7，例如1到5，例如1到4，例如1到3，例如1到2)(例如其中每纳米颗粒靶向剂的数量取决于所述抗体片段的尺寸而选择，例如使得所述纳米探针可以通过肾清除，例如其中所述纳米探针是诊断剂，例如和/或其中每纳米颗粒靶向剂的数量取决于能够附接到所述纳米颗粒的抗体片段的数量而选择和/或使得所述纳米探针不通过肾清除(或使得肾清除被抑制)，例如其中所述纳米探针是治疗诊断剂或治疗剂)。

在某些实施例中，所述靶向剂经由PEG部分缀合到所述纳米颗粒。

在某些实施例中，所述纳米颗粒的直径(例如平均直径)不大于15纳米(例如不大于13纳米，例如不大于10纳米)。在某些实施例中，纳米颗粒的直径(例如平均直径)在1nm到20nm的范围内(例如2nm到15nm，例如5nm到15nm，例如1nm到10nm，例如2nm到10nm，例如5nm到10nm)。

在某些实施例中，所述靶向剂包括选自由以下组成的组的成员：抗CEA scFv、抗GPIIb/IIIa、抗VEGF-A、抗VEGF-R和抗-TNF-α(例如PEG化)。

在某些实施例中，所述纳米探针包括一或多种显像剂(例如在所述纳米颗粒内，附接到所述纳米颗粒和/或附接到所述靶向剂)。在某些实施例中，所述一或多种显像剂包括PET或SPECT示踪剂。在某些实施例中，所述PET或SPECT示踪剂包括选自由以下组成的群组的成员：⁸⁹Zr、⁶⁴Cu、[¹⁸F]氟脱氧葡萄糖、¹⁷⁷Lu、²²⁵At和⁹⁰Y。在某些实施例中，所述一或多种显像剂包括荧光团(例如花青)。

在某些实施例中，所述纳米探针包括治疗剂(例如其中所述治疗剂附接到所述纳米颗粒，或附接到所述靶向剂，或附接到所述纳米颗粒和所述靶向剂两者，例如其中所述附接是共价或非共价的)。在某些实施例中，所述治疗剂包括化学治疗药物。在某些实施例中，所述化学治疗药物包括选自由以下组成的群组的成员：索拉非尼、紫杉醇、多西他赛、MEK162、依托泊苷、拉帕替尼、尼洛替尼、克唑替尼、氟维司群、维罗非尼，贝沙罗汀(bexorotene)和/或喜树碱。在某些实施例中，所述治疗剂包括检查点抑制剂(例如其中检查点抑制剂的种类和/或物种基于微环境的变化来选择，例如其中所述变化是由于施用第一治疗剂引起的)(例如对于组合治疗，例如对于放射性治疗)(例如此些变化经由绘制免疫细胞谱来确定)。

在某些实施例中，所述螯合剂包括去铁胺(DFO)。在某些实施例中，所述螯合剂包括选自由以下组成的群组的成员：1,4,8,11-四氮杂双环[6.6.2]十六烷-4,11-二基)二乙酸(CB-TE2A)；去铁胺(DFO)；二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)；1,4,7,10-四氮杂环十四烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)；thylene二胺四乙酸(EDTA)；乙二醇双(2-氨基乙基)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)；1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)；亚乙基双-(2-4羟基-苯基甘氨酸)(EHPG)；5-Cl-EHPG；5Br-EHPG；5-Me-EHPG；5t-Bu-EHPG；5-sec-Bu-EHPG；苯并二亚乙基三胺五乙酸(苯并-DTPA)；二苯并-DTPA；苯基-DTPA、二苯基-DTPA；苄基-DTPA；二苄基DTPA；双-2(羟基苄基)-亚乙基-二胺二乙酸(HBED)及其衍生物；Ac-DOTA；苯并-DOTA；二苯并-DOTA；1,4,7-三氮杂环壬烷Ν,Ν',Ν"-三乙酸(NOTA)；苯并-NOTA；苯并-TETA，苯并-DOTMA，其中DOTMA为1,4,7,10-四氮环十四烷-1,4,7,10-四(甲基四乙酸)、苯并-TETMA，其中TETMA为1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-(甲基四乙酸)；1,3-丙二胺四乙酸(PDTA)的衍生物；三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)；1,5,10-N,N',N"-三(2,3-二羟基苯甲酰基)-三儿茶酚酸酯(LICAM)的衍生物；和1,3,5-N,N',N"-三(2,3-二羟基苯甲酰基)氨基甲基苯(MECAM)和其它金属螯合剂。

在某些实施例中，所述纳米探针包括cRGDY-PEG-C'点。在某些实施例中，所述纳米探针包括cRGDY-PEG-[⁸⁹Zr]C'点。在某些实施例中，所述纳米探针包括NH₂-cRGDY-PEG-C'点。在某些实施例中，所述纳米探针包括DFO-cRGDY-PEG-C'点。在某些实施例中，所述纳米探针包括⁸⁹Zr-DFO-cRGDY-PEG-C'点。

另一方面，本发明涉及一种用于所述由胺化纳米颗粒形成的纳米探针的无螯合剂的放射性标记(例如⁸⁹Zr标记)的方法，其包括：使所述纳米颗粒与所述放射性标记(例如⁸⁹Zr草酸盐的HEPES缓冲液溶液(pH 8)，在75℃下)接触以产生第一溶液；使所述第一溶液与流动相溶剂(例如EDTA，例如PBS)接触，从而产生无螯合剂的放射性标记的纳米颗粒。

在某些实施例中，游离放射性标记与所述流动相溶剂形成复合物。

在某些实施例中，所述方法包括在所述接触步骤之前使所述纳米颗粒胺化。

另一方面，本发明涉及一种用于根据权利要求1到39中任一权利要求所述的由胺化纳米颗粒形成的纳米探针的基于螯合剂的放射性标记(例如⁸⁹Zr标记)的方法，所述方法包括：使所述纳米颗粒与螯合剂(例如DFO-NCS)接触(例如在约8到约9的pH下)以产生中间组合物(例如以1纳米颗粒∶20螯合剂的摩尔比)(例如在室温下，例如在约8到约9的pH下)；使所述中间组合物与流动相溶液(例如PBS)接触；和使所述中间组合物与放射性标记(例如⁸⁹Zr)接触(例如在室温下，例如在约pH 7下)。

在某些实施例中，所述方法包括去除非特异性结合的放射性标记(例如⁸⁹Zr)。在某些实施例中，所述方法包括在所述接触步骤之前使所述纳米颗粒胺化。

另一方面，本发明涉及一种治疗疾病或病状的方法，所述方法包括向受试者施用包括以下的组合物(例如药物组合物)：所述由胺化纳米颗粒形成的纳米探针，其中所述放射性标记是缀合到所述纳米颗粒的治疗性放射性标记(例如经由连接体共价或非共价键合到所述纳米颗粒，或直接共价或非共价键合到所述纳米颗粒，或与所述纳米颗粒或包围所述纳米颗粒的组合物缔合，例如经由范德华力)。

在某些实施例中，所述方法包括施用免疫治疗。在某些实施例中，所述免疫治疗包括向受试者施用包括所述纳米探针的药物组合物。

另一方面，本发明涉及一种由胺化纳米颗粒形成的纳米探针(例如放射性缀合物，例如纳米缀合物)，所述纳米探针包括：纳米颗粒(例如超小纳米颗粒，例如基于二氧化硅的纳米颗粒，例如C'点(例如NH₂-cRGDY-PEG-C'点))；与所述纳米颗粒缀合(例如直接或间接)的靶向剂(例如抗体片段，例如靶向肽(例如cRGD或其类似物))；和放射性标记(例如⁸⁹Zr)(例如其中所述放射性标记与所述纳米颗粒缔合(例如经由连接体共价或非共价键合到所述纳米颗粒，或直接共价或非共价键合到所述纳米颗粒，或与所述纳米颗粒或包围所述纳米颗粒的组合物缔合，例如经由范德华力)(例如没有螯合剂(例如其中所述纳米探针不含螯合剂))(例如具有螯合剂))，其中所述纳米颗粒在与所述靶向剂和/或所述放射性标记缀合或缔合之前被胺官能化，并且其中所述纳米颗粒的直径(例如平均直径)不大于20纳米(例如在水溶液(例如盐水溶液)中通过动态光散射(DLS)测量)(例如其中所述平均纳米颗粒直径为1到20nm，例如1到15nm，例如1到10nm，例如1到8nm，例如4到10nm，例如4到8nm)(例如其中所述纳米探针的平均直径不大于50nm，例如不大于40nm，例如不大于30nm，例如不大于20nm，例如不大于15nm，例如不大于10nm)，用于一种治疗受试者中的疾病和/或病状的方法，其中所述治疗包括向所述受试者递送所述组合物。

另一方面，本发明涉及一种由胺化纳米颗粒形成的纳米探针(例如放射性缀合物，例如纳米缀合物)，所述纳米探针包括：纳米颗粒(例如超小纳米颗粒，例如基于二氧化硅的纳米颗粒，例如C'点(例如NH₂-cRGDY-PEG-C'点))；与所述纳米颗粒缀合(例如直接或间接)的靶向剂(例如抗体片段，例如靶向肽(例如cRGD或其类似物))；和放射性标记(例如⁸⁹Zr)(例如其中所述放射性标记与所述纳米颗粒缔合(例如经由连接体共价或非共价键合到所述纳米颗粒，或直接共价或非共价键合到所述纳米颗粒，或与所述纳米颗粒或包围所述纳米颗粒的组合物缔合，例如经由范德华力)(例如没有螯合剂(例如其中所述纳米探针不含螯合剂))(例如具有螯合剂))，其中所述纳米颗粒在与所述靶向剂和/或所述放射性标记缀合或缔合之前被胺官能化，并且其中所述纳米颗粒的直径(例如平均直径)不大于20纳米(例如在水溶液(例如盐水溶液)中通过动态光散射(DLS)测量)(例如其中所述平均纳米颗粒直径为1到20nm，例如1到15nm，例如1到10nm，例如1到8nm，例如4到10nm，例如4到8nm)(例如其中所述纳米探针的平均直径不大于50nm，例如不大于40nm，例如不大于30nm，例如不大于20nm，例如不大于15nm，例如不大于10nm)，用于一种监测受试者中的疾病和/或病状的方法，其中所述监测包括向所述受试者递送所述组合物。

另一方面，本发明涉及一种由胺化纳米颗粒形成的纳米探针(例如放射性缀合物，例如纳米缀合物)，所述纳米探针包括：纳米颗粒(例如超小纳米颗粒，例如基于二氧化硅的纳米颗粒，例如C'点(例如NH₂-cRGDY-PEG-C'点))；与所述纳米颗粒缀合(例如直接或间接)的靶向剂(例如抗体片段，例如靶向肽(例如cRGD或其类似物))；和放射性标记(例如⁸⁹Zr)(例如其中所述放射性标记与所述纳米颗粒缔合(例如经由连接体共价或非共价键合到所述纳米颗粒，或直接共价或非共价键合到所述纳米颗粒，或与所述纳米颗粒或包围所述纳米颗粒的组合物缔合，例如经由范德华力)(例如没有螯合剂(例如其中所述纳米探针不含螯合剂))(例如具有螯合剂))，其中所述纳米颗粒在与所述靶向剂和/或所述放射性标记缀合或缔合之前被胺官能化，并且其中所述纳米颗粒的直径(例如平均直径)不大于20纳米(例如在水溶液(例如盐水溶液)中通过动态光散射(DLS)测量)(例如其中所述平均纳米颗粒直径为1到20nm，例如1到15nm，例如1到10nm，例如1到8nm，例如4到10nm，例如4到8nm)(例如其中所述纳米探针的平均直径不大于50nm，例如不大于40nm，例如不大于30nm，例如不大于20nm，例如不大于15nm，例如不大于10nm)，用于(a)一种治疗受试者中的疾病和/或病状的方法或(b)一种监测受试者中的疾病和/或病状的方法，其中所述监测包括向所述受试者递送所述组合物。

另一方面，本发明涉及一种由胺化纳米颗粒形成的纳米探针(例如放射性缀合物，例如纳米缀合物)，所述纳米探针包括：纳米颗粒(例如超小纳米颗粒，例如基于二氧化硅的纳米颗粒，例如C'点(例如NH₂-cRGDY-PEG-C'点))；与所述纳米颗粒缀合(例如直接或间接)的靶向剂(例如抗体片段，例如靶向肽(例如cRGD或其类似物))；和放射性标记(例如⁸⁹Zr)(例如其中所述放射性标记与所述纳米颗粒缔合(例如经由连接体共价或非共价键合到所述纳米颗粒，或直接共价或非共价键合到所述纳米颗粒，或与所述纳米颗粒或包围所述纳米颗粒的组合物缔合，例如经由范德华力)(例如没有螯合剂(例如其中所述纳米探针不含螯合剂))(例如具有螯合剂))，其中所述纳米颗粒在与所述靶向剂和/或所述放射性标记缀合或缔合之前被胺官能化，并且其中所述纳米颗粒的直径(例如平均直径)不大于20纳米(例如在水溶液(例如盐水溶液)中通过动态光散射(DLS)测量)(例如其中所述平均纳米颗粒直径为1到20nm，例如1到15nm，例如1到10nm，例如1到8nm，例如4到10nm，例如4到8nm)(例如其中所述纳米探针的平均直径不大于50nm，例如不大于40nm，例如不大于30nm，例如不大于20nm，例如不大于15nm，例如不大于10nm)，用于治疗。

另一方面，本发明涉及一种由胺化纳米颗粒形成的纳米探针(例如放射性缀合物，例如纳米缀合物)，所述纳米探针包括：纳米颗粒(例如超小纳米颗粒，例如基于二氧化硅的纳米颗粒，例如C'点(例如NH₂-cRGDY-PEG-C'点))；与所述纳米颗粒缀合(例如直接或间接)的靶向剂(例如抗体片段，例如靶向肽(例如cRGD或其类似物))；和放射性标记(例如⁸⁹Zr)(例如其中所述放射性标记与所述纳米颗粒缔合(例如经由连接体共价或非共价键合到所述纳米颗粒，或直接共价或非共价键合到所述纳米颗粒，或与所述纳米颗粒或包围所述纳米颗粒的组合物缔合，例如经由范德华力)(例如没有螯合剂(例如其中所述纳米探针不含螯合剂))(例如具有螯合剂))，其中所述纳米颗粒在与所述靶向剂和/或所述放射性标记缀合或缔合之前被胺官能化，并且其中所述纳米颗粒的直径(例如平均直径)不大于20纳米(例如在水溶液(例如盐水溶液)中通过动态光散射(DLS)测量)(例如其中所述平均纳米颗粒直径为1到20nm，例如1到15nm，例如1到10nm，例如1到8nm，例如4到10nm，例如4到8nm)(例如其中所述纳米探针的平均直径不大于50nm，例如不大于40nm，例如不大于30nm，例如不大于20nm，例如不大于15nm，例如不大于10nm)，用于监测疾病或病状。

涉及本发明的一个方面的实施例(例如方法)的元素可以应用于涉及本发明的其它方面的实施例(例如系统)，反之亦然。

定义

为了使本公开更容易理解，下面首先定义某些术语。在整个说明书中阐述了以下术语和其它术语的另外的定义。

在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用是指“和/或”。如在本申请中使用，术语“包括(comprise)”和所述术语的变体(例如“comprising”和“comprises”)并非旨在排除其它添加剂、组分、整数或步骤。如在本申请中使用，术语“约”和“大约”被用作等同物。在本申请中使用的具有或不具有约/大约的任何数字旨在涵盖相关领域的普通技术人员所理解的任何正常波动。在某些实施例中，术语“大约”或“约”是指落入所述参考值的任一方向(大于或小于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小的范围内的一些列值，除非另有说明或从上下文可以明显看出(此数字超过可能值的100％的情况除外)。

“施用”：术语“施用”是指将物质引入受试者。通常，可以利用任何施用途径，包含例如肠胃外(例如静脉内)、口服、局部、皮下、腹膜、动脉内、吸入、***、直肠、鼻内、引入脑脊髓液或滴入体内区室。在某些实施例中，施用是口服的。另外地或可替代地，在某些实施例中，施用是肠胃外的。在某些实施例中，施用是静脉内的。

“抗体”：如本文使用，术语“抗体”是指包含足以赋予对特定靶抗原的特异性结合的规范性免疫球蛋白序列元件的多肽。在自然界中产生的完整抗体是大约150kD的四聚试剂，其包含两个相同的重链多肽(每个约50kD)和两个相同的轻链多肽(每个约25kD)，它们彼此缔合成通常所称的“Y形”结构。每条重链均包含至少四个域(每个域长约110个氨基酸)——一个氨基末端可变(VH)域(位于Y结构的尖端)，随后是三个恒定域：CH₁、CH₂和羧基末端CH₃(位于Y茎的基部)。被称为“开关”的短区域连接重链可变区和恒定区。“铰链”将CH₂和CH₃域连接到抗体的其余部分。本铰链区中的两个二硫键在完整抗体中将两个重链多肽彼此连接。每条轻链包含两个域——一个氨基末端可变(VL)域，随后是一个羧基末端恒定(CL)域，通过另一个“开关”彼此分开。完整的抗体四聚体包含两个重链-轻链二聚体，其中重链和轻链通过单个二硫键相互连接；另外两个二硫键将重链铰链区彼此连接，使得二聚体彼此连接并形成四聚体。天然产生的抗体通常在CH₂域上还被糖基化。天然抗体中的每个域具有以“免疫球蛋白折叠”为特征的结构，所述“免疫球蛋白折叠”由彼此相靠堆积在压缩的反平行β桶中的两个β折叠片(例如3、4或5链折叠片)形成。每个可变域都含有三个被称为“互补决定区”(CDR1、CDR2和CDR3)的高变环和四个稍微不变的“框架”区(FR1、FR2、FR3和FR4)。当天然抗体折叠时，FR区形成为域提供结构框架的β折叠片，并且来自重链和轻链的CDR环区被一起带入三维空间中，使得它们形成位于Y结构的尖端的单个高变抗原结合位点。天然存在的抗体的Fc区结合到补体系统的元件，并且还结合到效应细胞(包含例如介导细胞毒性的效应细胞)上的受体。可以通过糖基化或其它修饰来调节Fc区对Fc受体的亲和力和/或其它结合属性。在某些实施例中，根据本发明产生和/或利用的抗体包含糖基化的Fc域，包含具有修饰或工程化改造的此类糖基化的Fc域。为了本发明的目的，在某些实施例中，包含足够的在天然抗体中发现的免疫球蛋白域序列的任何多肽或多肽复合物都可以被称为和/或用作“抗体”，无论此多肽是天然产生的(例如由有机体与抗原反应生成)还是通过重组工程化改造、化学合成或其它人工系统或方法产生的。在某些实施例中，抗体是多克隆的；在某些实施例中，抗体是单克隆的。在某些实施例中，抗体具有恒定区序列，所述恒定区序列是小鼠、兔、灵长类动物或人类抗体的特征。在某些实施例中，如本领域已知，抗体序列元件是人源化的、灵长类化的、嵌合的等。此外，本文使用的术语“抗体”在适当的实施例中(除非另有说明或从上下文中可以清楚看出)可以是指用于在替代呈现中利用抗体结构和功能特征的任何本领域已知或开发的构建体或形式。例如实施例，根据本发明利用的抗体是选自但不限于以下的形式：完整的IgG、IgE和IgM、双特异性或多特异性抗体(例如

等)、单链Fv、多肽-Fc融合物、Fab、骆驼样抗体、隐匿性(masked)抗体(例如

)、小型模块化免疫药物(Small Modular ImmunoPharmaceuticals，“SMIPs^TM”)、单链或串联双抗体

VHH、

迷你抗体、锚蛋白重复蛋白或

DART、TCR样抗体、

微量蛋白、

和

在某些实施例中，抗体可以缺少其天然产生时具有的共价修饰(例如聚糖的附接)。在某些实施例中，抗体可以含有共价修饰(例如聚糖、有效负载[例如可检测部分、治疗部分、催化部分等]或其它侧基[例如聚乙二醇等]的附接)。

“抗体片段”：如本文使用，“抗体片段”包含完整抗体的一部分，诸如例如抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包含Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；三抗体；四抗体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。例如抗体片段包含分离的片段、由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段、其中轻链和重链可变区通过肽连接体连接的重组单链多肽分子(“ScFv蛋白”)和由模拟高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元。在许多实施例中，抗体片段含有足够的亲本抗体序列，其是与亲本抗体结合到同一抗原的片段；在某些实施例中，片段以与亲本抗体相当的亲和力结合到抗原和/或与亲本抗体进行竞争以结合到抗原。抗体的抗原结合片段的实例包含但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、scFv片段、Fv片段、dsFv双抗体、dAb片段、Fd'片段、Fd片段、分离的互补决定区(CDR)区。抗体的抗原结合片段可以通过任何方式产生。例如抗体的抗原结合片段可以通过完整抗体的片段化而酶促或化学地产生，和/或其可以由编码部分抗体序列的基因重组地产生。可替代地或另外地，抗体的抗原结合片段可以全部或部分合成地产生。抗体的抗原结合片段可以任选地包括单链抗体片段。可替代地或另外地，抗体的抗原结合片段可以包括多条链，所述多条链例如通过二硫键连接在一起。抗体的抗原结合片段可以任选地包括多分子复合物。功能性单域抗体片段在约5kDa到约25kDa的范围内，例如约10kDa到约20kDa，例如约15kDa；功能性单链片段为约10kDa到约50kDa，例如约20kDa到约45kDa，例如约25kDa到约30kDa；功能性fab片段为约40kDa到约80kDa，例如约50kDa到约70kDa，例如约60kDa。

“缔合的”：如本文使用，术语“缔合的”通常是指两个或两个以上实体直接或间接地(例如经由用作连接剂的一或多个另外的实体)彼此物理接近，以形成足够稳定的结构，使得所述实体在相关条件(例如生理条件)下保持物理邻近。在某些实施例中，缔合的部分彼此共价连接。在某些实施例中，缔合的实体是非共价连接的。在某些实施例中，缔合的实体通过特异性非共价相互作用(例如通过在相互作用的配体之间的相互作用，所述相互作用的配体区分了其相互作用配偶体和使用的上下文中存在的其它实体，例如链霉亲和素/亲和素相互作用、抗体/抗原相互作用等)彼此连接。可替代地或另外地，足够数量的较弱的非共价相互作用可以为部分保持缔合提供足够的稳定性。示范性非共价相互作用包含但不限于静电相互作用、氢键合、亲和力、金属配位、物理吸附、主体-客体相互作用、疏水相互作用、π堆积相互作用、范德华相互作用、磁性相互作用、静电相互作用、偶极-偶极相互作用等。

“生物相容性的”：如本文使用，术语“生物相容性的”旨在描述不会在体内引起实质性有害反应的材料。在某些实施例中，如果材料对细胞无毒，则它们是“生物相容性的”。在某些实施例中，如果材料在体外向细胞中加入导致小于或等于20％的细胞死亡，和/或它们在体内的施用未引起炎症或其它此类不利作用，则它们是“生物相容性的”。在某些实施例中，材料是可生物降解的。

“可生物降解的”：如本文使用，“可生物降解的”材料是当被引入细胞时通过细胞机制(例如酶促降解)或通过水解被分解成细胞可以重复使用或处置而对细胞没有明显毒性作用的组分的那些材料。在某些实施例中，由可生物降解的材料分解生成的组分在体内不引起炎症和/或其它不利作用。在某些实施例中，可生物降解的材料被酶促分解。可替代地或另外地，在某些实施例中，可生物降解的材料通过水解被分解。在某些实施例中，可生物降解的聚合材料分解成它们的组分聚合物。在某些实施例中，可生物降解的材料(包含例如可生物降解的聚合材料)的分解包含酯键的水解。在某些实施例中，材料(包含例如可生物降解的聚合材料)的分解包含氨基甲酸酯连键的断裂。

“癌症”：如本文使用，术语“癌症”是指疾病、病症或病状，其中细胞表现出相对异常、不受控制和/或自主的生长，使得它们表现出以明显丧失细胞增殖控制为特征的异常升高的增殖速率和/或异常生长表型。在某些实施例中，癌症可以以一或多种肿瘤为特征。本领域技术人员知晓多种类型的癌症，包含例如肾上腺皮质癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、类癌、贲门癌、胆管癌、脊索瘤、慢性骨髓增殖性肿瘤、颅咽管瘤、导管原位癌、室管膜瘤、眼内黑素瘤、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、妊娠滋养细胞疾病、神经胶质瘤、组织细胞增多病、白血病(例如急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓样白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、毛细胞白血病、骨髓性白血病、骨髓样白血病)、淋巴瘤(例如伯基特淋巴瘤[非霍奇金淋巴瘤]、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、蕈样真菌病、Sezary综合征、AIDS相关性淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤)、黑素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤)、骨髓增生异常综合征、***状瘤、副神经节瘤、嗜铬细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、肉瘤(例如尤文肉瘤、卡波西肉瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、子宫肉瘤、血管肉瘤)、威尔姆氏瘤、和/或肾上腺皮质、***、阑尾、胆管、膀胱、骨骼、大脑、乳腺、支气管、中枢神经系统、子宫颈、结肠、子宫内膜、食道、眼睛、输卵管、胆囊、胃肠道、生殖细胞、头颈、心脏、肠、肾(例如威尔姆氏瘤)、喉、肝、肺(例如非小细胞肺癌、小细胞肺癌)、口部、鼻腔、口腔、卵巢、胰腺、直肠、皮肤、胃、睾丸、喉咙、甲状腺、***、咽、腹膜、垂体、***、直肠、唾液腺、输尿管、尿道、子宫、***或外阴的癌症。

“载剂”：如本文使用，“载剂”是指与化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒剂。此些药物载剂可以是无菌液体(例如水和油)，包含石油、动物、植物或合成来源(例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等)的无菌液体。特别地对于可注射溶液来说，优选将水或水溶液、盐水溶液以及右旋糖和甘油水溶液用作载剂。合适的药物载剂描述于E.W.马丁(E.W.Martin)的“雷明登氏药学科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)”中。

“显像剂”：如本文使用，“显像剂”是指有助于检测与其接合的试剂(例如多糖纳米颗粒)的任何元素、分子、官能团、化合物、其片段或部分。显像剂的实例包含但不限于：各种配体、放射性核素(例如³H、¹⁴C、¹⁸F、¹⁹F、³²P、³⁵S、¹³⁵I、¹²⁵I、¹²³I、¹³¹I、⁶⁴Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、¹⁸⁷Re、¹¹¹In、⁹⁰Y、^99mTc、¹⁷⁷Lu、⁸⁹Zr等)、荧光染料(具体的示范性荧光染料，见下文)、化学发光剂(诸如例如吖啶酯、稳定的二氧杂环丁烷等)、生物发光剂、光谱可分辨的无机荧光半导体纳米晶体(即量子点)、金属纳米颗粒(例如金、银、铜、铂等)纳米簇、顺磁性金属离子、酶(酶的具体实例，见下文)、比色标记(诸如例如染料、胶体金等)、生物素、异羟基洋地黄毒苷、半抗原和可获得抗血清或单克隆抗体的蛋白质。放射性核素可以例如经由点击化学附接。在某些实施例中，抗体片段被修饰以包含叠氮化物。在某些实施例中，聚合物涂覆的纳米颗粒的表面被修饰以包含二苯并环辛炔(DBCO)。在某些实施例中，通过使胺化纳米颗粒与DBCO-NHS酯反应然后缀合到点击化学官能化(例如叠氮化物官能化)抗体片段，来预合成DBCO官能化纳米颗粒。

“蛋白质”：如本文使用，术语“蛋白质”是指多肽(即，一串通过肽键彼此连接的至少3-5个氨基酸)。蛋白质可以包含除氨基酸以外的部分(例如可以是糖蛋白、蛋白聚糖等)和/或可以以其它方式加工或修饰。在某些实施例中，“蛋白质”可以是由细胞产生的和/或在细胞中有活性的完整多肽(有或没有信号序列)；在某些实施例中，“蛋白质”是或包括特征部分，例如由细胞产生和/或在细胞中有活性的多肽。在某些实施例中，蛋白质包含一个以上多肽链。例如多肽链可以通过一或多个二硫键连接或通过其它方式缔合。在某些实施例中，本文所述的蛋白质或多肽可以含有L-氨基酸、D-氨基酸或两者，和/或可以含有本领域已知的多种氨基酸修饰或类似物中的任何一种。有用的修饰包含例如末端乙酰化、酰胺化、甲基化等。在某些实施例中，蛋白质或多肽可以包括天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸和/或其组合。在某些实施例中，蛋白质是或包括抗体、抗体多肽、抗体片段、其生物学活性部分和/或其特征部分。在某些实施例中，蛋白质是小蛋白质(例如其中小蛋白质小于20kDa，例如其中小蛋白质优选小于15kDa，例如其中小蛋白质优选12kDa或更小)。

“药物组合物”：如本文使用，术语“药物组合物”是指与一或多种药学上可接受的载剂一起调配的活性剂。在某些实施例中，活性剂以适合于在治疗方案中施用的单位剂量存在，所述治疗方案在所述活性剂向相关人群施用时表现出达到预定治疗作用的统计学显著概率。在某些实施例中，可以将药物组合物特别调配成用于以固体或液体形式施用，包含适于以下的那些：口服施用，例如药液(drench)(水性或非水性溶液或混悬液)、片剂(例如靶向口腔、舌下和全身吸收的那些)、大丸剂、粉末、颗粒、施加于舌头的糊剂；肠胃外施用，例如通过皮下、肌肉内、静脉内或硬膜外注射，例如呈无菌溶液或混悬液或缓释调配物的形式；局部施用，例如呈霜剂、软膏或施加于皮肤、肺或口腔的控释贴剂或喷雾剂的形式；***内或直肠内，例如呈子宫托、霜剂或泡沫的形式；舌下；眼部；透皮；或鼻内、肺和到其它粘膜表面。

“基本上”：如本文使用，术语“基本上”和语法上的等同物是指表现出目标特征或性质的全部或接近全部范围或程度的定性条件。本领域的普通技术人员将理解，生物学和化学现象很少(如果有的话)完整进行和/或延续完整性或实现或避免绝对结果。

“受试者”：如本文使用，术语“受试者”包含人和哺乳动物(例如小鼠、大鼠、猪、猫、狗和马)。在许多实施例中，受试者是哺乳动物，特别是灵长类动物，尤其是人。在某些实施例中，受试者是牲畜，例如牛、绵羊、山羊、奶牛、猪等；家禽，例如鸡、鸭、鹅、火鸡等；以及驯养动物，特别是宠物，例如狗和猫。在某些实施例中(例如特别是在研究背景下)，受试者是例如啮齿类动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠)、兔子、灵长类动物或猪，例如近交猪等。

“治疗剂”：如本文使用，短语“治疗剂”是指当施用于受试者时具有治疗作用和/或引起期望的生物学和/或药理作用的任何试剂。

“治疗有效量”：如本文使用，是指因其施用而产生期望作用的量。在某些实施例中，所述术语是指在根据治疗给药方案向患有或易患疾病、病症和/或病状的人群施用时足以治疗所述疾病、病症和/或病状的量。在某些实施例中，治疗有效量是降低所述疾病、病症和/或病状的一或多种症状的发生率和/或严重程度和/或延迟其发作的量。本领域普通技术人员将理解，术语“治疗有效量”实际上并不要求在特定个体中实现成功的治疗。而是，治疗有效量可以是在向需要此治疗的患者施用时在大量受试者中提供特定期望的药理学反应的所述量。在某些实施例中，对治疗有效量的提及可以是对在一或多种特定组织(例如受疾病、病症或病状影响的组织)或体液(例如血液、唾液、血清、汗水、眼泪、尿液等)的量的提及。本领域普通技术人员将理解，在某些实施例中，可以以单次剂量调配和/或施用治疗有效量的特定试剂或治疗。在某些实施例中，可以以多次剂量调配和/或施用治疗有效试剂，例如作为给药方案的一部分。

“治疗”：如本文使用，术语“治疗”(treatment/treat/treating)是指物质的任何施用，其部分或完全缓解、改善、减轻、抑制特定疾病、病症和/或病状的一或多种症状、特征和/或原因，延迟其发作，降低其严重程度，和/或减少其发生率。此治疗可以针对没有表现出相关疾病、病症和/或病状的征象的受试者和/或针对仅表现出所述疾病、病症和/或病状的早期征象的受试者。可替代地或另外地，此治疗可以针对表现出相关疾病、病症和/或病状的一或多种确定的征象的受试者。在某些实施例中，治疗可以针对已被诊断患有相关疾病、病症和/或病状的受试者。在某些实施例中，治疗可以针对已知患有一或多种易感因素的受试者，所述易感因素在统计学上与相关疾病、病症和/或病状的发展的风险增加相关。

本文中呈现的附图出于说明性目的，而不是为了限制。

附图说明

通过参考结合附图进行的以下描述，本公开的前述和其它目的、方面、特征和优点将变得更加明显且更好理解，在附图中：

图1A-1F示出了描绘cRGDY-PEG-C'点和NH₂-cRGDY-PEG-C'点的表征的图。cRGDY-PEG-C'点相较于PEG-C'点的GPC洗脱图(图1A)、FCS相关拟合曲线(图1B)和紫外-可见光吸收光谱(图1C)。胺官能化NH₂-cRGDY-PEG-C'点相较于PEG-C'点的GPC洗脱图(图1D)、FCS相关拟合曲线(图1E)和紫外-可见光吸收光谱(图1F)。

图2A-2F是描绘了无螯合剂的和基于螯合剂的⁸⁹Zr放射性标记研究的图。

图2A是示出了cRGDY-PEG-C'点的浓度依赖性无螯合剂的⁸⁹Zr标记的图。标记温度设置为75℃；标记pH设置为8；C'点(nmol)/⁸⁹Zr(mCi)比值在零到7.5nmol/mCi的范围内。

图2B是示出了pH依赖性无螯合剂的⁸⁹Zr标记的图。标记温度：75℃；C'点/⁸⁹Zr比值：7.5nmol/mCi；标记pH范围：2-9。

图2C是示出了温度依赖性无螯合剂的⁸⁹Zr标记的图。标记pH：8；C'点/⁸⁹Zr比值：7.5nmol/mCi；标记温度范围：25℃到75℃。

图2D是示出了利用常规PEG化程序的C'点和用另外的小硅烷分子(例如二乙氧基二甲基硅烷)修饰的颗粒之间的无螯合剂的⁸⁹Zr标记比较的图。标记温度：75℃；标记pH：8；C'点/⁸⁹Zr比值：7.5nmol/mCi。

图2E是示出了DFO-cRGDY-PEG-C'点的浓度依赖性基于螯合剂的⁸⁹Zr标记的图。标记温度：37℃；标记pH：7.5；C'点/⁸⁹Zr比值范围：零到0.75nmol/mCi。

图2F是示出了以各种颗粒/DFO-NCS比值合成的颗粒的每DFO-cRGDY-PEG-C'点^natZr数量的微波等离子体-原子发射光谱仪(MP-AES)测试的图。

图3A-3D是描绘了无螯合剂的和基于螯合剂的⁸⁹Zr标记的C'点性质的比较的图。(图3A)体外和(图3B)体内放射稳定性以及(图3C)无螯合剂的⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点和(图3D)基于螯合剂的⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点的血液循环半衰期。(**p<0.005)。

图4A-4D示出了描绘小鼠中的无螯合剂的和基于螯合剂的⁸⁹Zr标记的C'点的动态PET成像结果的比较的图像和图。(图4A)无螯合剂的⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点和(图4B)基于螯合剂的⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点。i.v.注射(图4C)无螯合剂的⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-[⁸⁹Zr]C'点和(图4D)基于螯合剂的⁸⁹Zr标记的⁸⁹Zr-DFO-cRGDY-PEG-C'点的小鼠中的主要器官(即心脏、膀胱、肝、肌肉和肾)的前60分钟时间-活性曲线。(图4A)和(图4B)中的所有图像都是冠状最大强度投影(MIP)正电子发射断层扫描(PET)图像。

图5A-5C是描述了小鼠中的无螯合剂的和基于螯合剂的⁸⁹Zr标记的C'点的生物分布研究的图。(图5A)健康小鼠(n＝3)中的无螯合剂的⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-[⁸⁹Zr]C'点和(图5B)基于螯合剂的⁸⁹Zr标记的⁸⁹Zr-DFO-cRGDY-PEG-C'点。(图5C)注射⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点的小鼠中的时间依赖性骨骼摄取的比较。(**p<0.005)

图6A-6J是描绘了小鼠的体内肿瘤靶向冠状PET图像及其分析的图像和图。(图6A)M21荷瘤小鼠(n＝3)中注射cRGDY-PEG-[⁸⁹Zr]C'点(无螯合剂的标记)的小鼠，(图6B)M21荷瘤小鼠(n＝3)中注射⁸⁹Zr-DFO-cRGDY-PEG-C'点(基于螯合剂的标记)的小鼠，和(图6C)M21L荷瘤小鼠(n＝3)中注射⁸⁹Zr-DFO-cRGDY-PEG-C'点(基于螯合剂的标记)的小鼠。呈现了2小时和72小时的MIP图像，以显示颗粒的延长的血液半衰期，注射后2小时肾对进入膀胱的颗粒的清除以及注射后72小时的骨骼和关节摄取。示出了(图6D)M21异种移植物中的无螯合剂的⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-[⁸⁹Zr]C'点，(图6E)M21异种移植物中的基于螯合剂的⁸⁹Zr标记的⁸⁹Zr-DFO-cRGDY-PEG-C'点，和(图6F)M21-L异种移植物中的基于螯合剂的⁸⁹Zr标记的⁸⁹Zr-DFO-cRGDY-PEG-C'点的时间活性曲线。三组之间的(图6G)肿瘤摄取、(图6H)肿瘤/血液比值、(图6I)肿瘤/肝比值和(图6J)肿瘤/肌肉比值的比较。每组N＝3。

图7是描绘了通过使用MP-AES估计每Mal-cRGDY-PEG-C'点^natZr数量的图。

图8A是描绘了在注射后4小时和24小时的时间点的⁸⁹Zr-DFO-cRGDY-PEG-C'点的PET成像的图像(使用GSH连接体)。肠摄取用红色箭头标记。GSH：谷胱甘肽。

图8B是描绘了在注射后0.5、24和48小时的时间点的⁸⁹Zr-DFO-cRGDY-PEG-C'点的PET成像的图像(使用APTES作为连接体)。APTES：(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷。

图9A和9B是描绘了(图9A)无螯合剂的⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点、(图9B)基于螯合剂的⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点的代表性PD-10洗脱曲线的图。

图10是描绘了在各个注射后时间点小鼠血浆中的⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点的摄取的图(n＝3)。

图11是描绘了代表性健康小鼠中的游离⁸⁹Zr草酸盐的MIP图像的图，其示出了小鼠骨骼和关节中快速和保留的同位素摄取。

图12A-12B是描绘了PET筛选研究的图像，其示出了(图12A)没有EDTA攻击和(图12B)有过夜EDTA攻击的注射cRGDY-PEG-[⁸⁹Zr]C'点的小鼠中的骨骼摄取差异。

图12C示出了描绘代表性小鼠的生物分布结果的图。仅观察到～20％骨骼摄取降低。EDTA攻击条件为10mM EDTA，37℃，并以650rpm过夜振摇。

图13示出了描绘生物分布结果的图，其示出了注射后第3天和第7天无螯合剂的⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点的时间依赖性变化，以及在骨骼中的摄取的显著保留及在肝、脾和肾中的摄取的降低(n＝3)。

图14A和14B是示出了在各个注射后时间点的注射(图14A)无螯合剂的和(图14B)基于螯合剂的⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点的荷瘤小鼠的冠状MIP PET图像的图像。肿瘤用黄色箭头标记。骨骼和关节摄取用白色箭头标记。

图15是示出了在注射后24小时的M21和M21-L荷瘤小鼠中的⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点的离体生物分布研究的图(n＝3)。

图16A和16B是示出了根据本发明的一个说明性实施例的cRGDY-PEG-C'点的⁸⁹Zr放射性标记策略的示意图。

图16A是示出了根据本发明的一个说明性实施例的无螯合剂的策略的示意图：来自(1)cRGDY-PEG-C'点的表面和/或内部去质子化硅烷醇基团(-Si-O-)用作固有的氧供体(或硬路易斯碱)，用于在75℃，pH 8下成功标记⁸⁹Zr(硬路易斯酸)，形成(2)cRGDY-PEG-[⁸⁹Zr]C'点。

图16B是示出了根据本发明的一个说明性实施例的基于螯合剂的策略的示意图：通过使DFO-NCS与C'点的二氧化硅表面上的胺基团反应，DFO螯合剂缀合到胺官能化NH₂-cRGDY-PEG-C'点的表面；然后，合成的(4)DFO-cRGDY-PEG-C'点在37℃，pH 7下用89Zr标记，形成(5)⁸⁹Zr-DFO-cRGDY-PEG-C'点。两种策略的螯合放射性金属的分子结构在右侧以3D和2D渲染。3D渲染中的硅、氧、碳、氮、硫、氢和锆的原子分别以紫色、红色、灰色、蓝色、黄色、白色和浅绿色着色。

图17是示出了根据本发明的一个说明性实施例的使用一锅合成技术进行的cRGDY-PEG-C'点和/或NH₂-cRGDY-PEG-C'点的合成的示意图。使cRGDY-C'点与胺-硅烷接触以形成胺-cRDGY-C'点。然后，在同一“锅”中使胺-cRDGY-C'点与DFO-NCS接触，以生成DFO-cRGDY-C'点。

具体实施方式

在整个说明书中，当组合物被描述为具有、包含或包括特定组分时，或当方法被描述为具有、包含或包括特定步骤时，可以预期，另外存在基本由所述组分组成或由所述组分组成的本发明的组合物，并且存在基本由所述加工步骤组成或由所述加工步骤组成的根据本发明的方法。

应当理解，步骤的顺序或执行某些动作的顺序并不重要，只要本发明保持可操作性即可。而且，可以同时进行两个或两个以上步骤或动作。

本文对任何出版物的提及(例如在背景技术部分中)并不表示承认所述出版物用作关于本文呈现的任何权利要求的现有技术。呈现背景技术部分是为了清楚的目的，并非旨在作为对关于任何权利要求的现有技术的描述。

本文描述了放射性纳米探针的多种表面放射性标记策略，用于(i)在微调表面化学性质后获得的有利的临床前和临床药代动力学特征。本公开描述了使用不同的放射性标记策略的放射性金属(例如锆-89)(⁸⁹Zr，t_1/2＝78.4小时)的缀合如何影响这些纳米探针(例如放射性缀合物)的生物学性质。经由各种放射性标记策略将⁸⁹Zr附接到表面胺化的整联蛋白靶向超小纳米颗粒(例如C'点)产生了有利的PK和清除曲线。此外，放射性标记策略产生了相对于生物学对照在黑素瘤模型中显著改善了靶向肿瘤摄取和靶标/本底比值，同时将粒径保持在有效肾小球滤过粒径临界值(小于10nm)以下。纳米探针的特征还在于其放射稳定性和血浆停留半衰期。所描述的⁸⁹Zr标记的超小杂化有机-无机颗粒示踪剂提供了适合于增强人类分子靶向癌症成像的放射生物学性质。

在某些实施例中，纳米探针由布拉德伯里(Bradbury)等人，“纳米颗粒免疫缀合物(NANOPARTICLE IMMUNOCONJUGATES)”，国际专利申请号PCT/US16/26434描述，其内容通过引用整体并入本文。在某些实施例中，纳米探针由布拉德伯里(Bradbury)等人在美国公开号US 2015/0343091A1中的“纳米颗粒药物最合物(NANOPARTICLE DRUG CONJUGATES)”描述，其内容通过引用整体并入本文。在某些实施例中，纳米探针和放射性标记方法由陈，F.(Chen，F.)等人“用于黑素瘤中的增强癌症定向摄取的靶向或清除锆-89标记的二氧化硅纳米颗粒：放射性标记策略的比较(Target-or-Clear Zirconium-89Labeled SilicaNanoparticles for Enhanced Cancer-Directed Uptake in Melanoma:A Comparison ofRadiolabeling Strategies)”，材料化学(Chem Mater)，29,8269-8281(2017)；马，K.(Ma,K.)等人，“在水中控制超小小于10nm的配体官能化荧光核-壳二氧化硅纳米颗粒的生长(Control of Ultrasmall Sub-10nm Ligand-Functionalized Fluorescent Core-ShellSilica Nanoparticle Growth in Water)”，材料化学(Chem Mater)，27,4119-4133(2015)；和马，K.(Ma,K.)和威斯纳，U.(Wiesner,U.)，“实现了五官能超小有机-二氧化硅杂化纳米颗粒的模块化和正交PEG化后通过***进行的表面修饰(Modular and OrthogonalPost-PEGylation Surface Modifications by Insertion Enabling Penta-FunctionalUltrasmall Organic-Silica Hybrid Nanoparticles)”，材料化学(Chem Mater)，29,6840-6855(2017)描述，其内容通过引用整体并入本文。

快速的肾清除、相对较短的血液循环半衰期(几分钟到几小时)和低RES摄取(大约5％ID/g或更少)表示限定了超小(小于10nm)肾可清除纳米颗粒的生物学特征(表1)。表1示出了小于10nm的肾***纳米颗粒的体内肿瘤(主动/被动)靶向的总结。例如碘-124(¹²⁴I，t_1/2＝100.2小时)标记的cRGDY-C点PEG PET/光学双模态探针目前处于2A期临床试验研究中(NCT01266096，NCT02106598)。

表1

^[a]核-壳型QD或基于CdSe/ZnS-Cys的纳米颗粒与GPI缀合，所述GPI是靶向***特异性膜抗原阳性***癌细胞的小分子配体。纳米颗粒用^99mTc进行放射性标记，用于离体生物分布研究。肝和肾中的摄取以％ID/g呈现。对于体重为～25g的6-8周龄的裸小鼠，肝和肾的重量分别为大约1.5和0.17g。未利用PEG化进行表面保护。注射后4小时测量肝和肾摄取；尚无肿瘤摄取数据。

^[b]QD是核壳结构的CdSe/ZnS-Cys纳米颗粒，其与cRGD肽缀合并用^99mTc进行放射性标记。肝和肾摄取以％ID/g呈现。对于体重为～25g的6-8周龄的裸小鼠，肝和肾的重量分别为大约1.5和0.17g。未利用PEG化进行表面保护。注射后4小时测量肝和肾摄取；尚无肿瘤摄取数据。

^[c][¹⁹⁸Au]Au-GSH(¹⁹⁸Au:T_1/2～2.7天)是用于SPECT-CT成像的固有放射性标记的纳米颗粒，它发射近红外光(～800nm)。未示出体内肿瘤靶向数据。

^[d]Au-PEG_1k是通过在存在分子量为1kDa的硫醇化聚乙二醇(PEG)的情况下热还原HAuCl₄而合成的。在注射后12小时，基于电感耦合等离子体质谱法估计最大肿瘤摄取为约8％ID/g，其在注射后48小时降低了50％。

^[e]对¹²⁴I-cRGDY-PEG-C点进行放射性标记并使其与靶向配体(cRGDY)缀合，用于体内双模态肿瘤靶向成像。⁸这也是获得FDA研究用新药(IND)批准用于首次人类临床试验的首例无机颗粒。

^[f][⁶⁴Cu]CuS-PVP是一种固有⁶⁴Cu标记和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)封端的CuS纳米颗粒。所述纳米颗粒可以用于PET成像和光热治疗。在4T1荷瘤小鼠中注射后2小时，肿瘤摄取达到3.6％ID/g的峰值。然而，注射后24小时消除了～95％的肿瘤蓄积，导致～0.2％ID/g肿瘤摄取。

^[g]通过使NOTA螯合剂与Au-GSH纳米颗粒缀合，然后用⁶⁴Cu标记以进行动态PET成像来合成⁶⁴Cu-NOTA-Au。令人惊讶的是，血液循环半衰期估计小于10分钟，显著短于Au-GSH纳米颗粒(>10小时)。

具有与¹²⁴I相当的物理半衰期，锆-89(⁸⁹Zr，t_1/2＝78.4小时)现已成为临床前和临床试验中广泛使用的正电子发射放射性同位素(表2)。表2示出了常用PET同位素的衰变性质的总结。

表2

而且，⁸⁹Zr具有更低的平均β⁺能量(396keV相较于820keV)，这可以提高PET空间分辨率。与¹²⁴I(已知在摄取到细胞中后通常会发生脱卤)相比，据报道⁸⁹Zr在内化后会在细胞内稳定地停留，除了更精确地估计了肿瘤中的实际纳米探针摄取，还强调了其在增强靶向颗粒蓄积和靶标/本底比值方面的潜力。

如本文所述，将放射性核素从¹²⁴I扩展到⁸⁹Zr，需要对经由本文所述的放射性标记策略将表面放射性金属(例如⁸⁹Zr)附接到超小纳米颗粒(C'点)的基于螯合剂的和无螯合剂的放射性标记策略进行研究和比较。确定(1)以前适用于较大尺寸(多孔和无孔)二氧化硅颗粒的无螯合剂的放射性标记程序是否可以成功扩展到10nm以下的粒径，和(2)所得的⁸⁹Zr标记的肽和PEG官能化C'点(或cRGDY-PEG-C'点)是否在完善的整联蛋白表达黑素瘤模型中产生了高靶向摄取和靶标/本底比值并同时保持有利于肾***的小于10nm的尺寸。

例如迄今为止，基于二氧化硅的⁸⁹Zr无螯合剂的放射性标记仅专注于直径大于100nm的纳米颗粒，以提供足够的硅烷醇基团密度(>105/颗粒)。本文描述，为了显著降低表面和内部硅烷醇基团密度，能够利用超小(6-7nm)PEG化二氧化硅纳米颗粒的⁸⁹Zr无螯合剂的标记。

不希望被任何理论所束缚，这些研究结果可以通过用诊断性放射性标记替代治疗性放射性标记(例如镥-177)来为靶向放射性治疗平台的发展提供信息。例如如本文所述，通过利用适合于小粒径(显著减小的曲率半径)的表面官能化策略并同时保持粒径以保留所开发的C'点平台的清除性质，用诊断性同位素替代治疗性同位素(例如Lu-177或Y-90)是可能的。所提供的胺化C'点平台还有助于DFO以外的其它合适的螯合剂(例如NOTA、DOTA、DTPA)的缀合以进行放射性标记。

通过在高温下(75℃，pH 8，图16A)对表面上和每个颗粒内的固有去质子化硅烷醇基团(例如-Si-O^-)进行⁸⁹Zr标记，实现了无螯合剂的策略。还通过仔细控制所选螯合剂(例如DFO-NCS)的表面密度以最大化比活性和放射化学产率并同时保持肾清除性质，开发了一种基于螯合剂的⁸⁹Zr标记技术(37℃，pH 7.5)(图16B)。通过PET成像，纳米探针被广泛表征为其放射稳定性、药代动力学、辐射剂量学性质、主动肿瘤靶向和靶标/本底比值。据发明人所知，这是用于双模态成像的首例⁸⁹Zr标记的肾可清除的目标有机-无机杂化颗粒。基于其有利的生物学性质(包含延长的血液循环半衰期(～15小时)、高肿瘤靶向摄取(>10％ID/g)、肾清除(1-2天之内>60％ID)、低肝蓄积(～5％ID/g)和高肿瘤/本底比值(肿瘤:肌肉>9；肿瘤:肝>2))，本平台可作为用于患有癌症(例如黑素瘤)的患者中的癌症特异性检测和定位的诊断成像工具和用于治疗疾病的靶向放射治疗性探针。

在某些实施例中，纳米颗粒包括二氧化硅、聚合物(例如聚(乳酸-羟基乙酸共聚物)(PLGA))、生物剂(例如蛋白质载剂)和/或金属(例如金、铁)。在某些实施例中，纳米颗粒是如布拉德伯里(Bradbury)等人的美国公开号2013/0039848A1中所述的“C点”，其通过引用并入本文。

在某些实施例中，纳米颗粒是球形的。在某些实施例中，纳米颗粒是非球形的。在某些实施例中，纳米颗粒是或包括选自由以下组成的群组的材料：金属/半金属/非金属，金属/半金属/非金属氧化物、硫化物、碳化物、氮化物，脂质体，半导体和/或其组合。在某些实施例中，金属选自由以下组成的群组：金，银，铜和/或其组合。

纳米颗粒可以包括金属/半金属/非金属氧化物，包含二氧化硅(SiO₂)，二氧化钛(TiO₂)、氧化铝(Al₂O₃)、氧化锆(Z_rO₂)、氧化锗(GeO₂)、五氧化二钽(Ta₂O₅)、NbO₂等，和/或非氧化物，包含金属/半金属/非金属硼化物、碳化物、硫化物和氮化物，例如钛及其组合(Ti、TiB₂、TiC、TiN等)。

纳米颗粒可以包括一或多种聚合物，例如经美国食品药品管理局(FDA)依据21C.F.R.§177.2600批准用于人类的一或多种聚合物，包含但不限于聚酯(例如聚乳酸、聚(乳酸-羟基乙酸共聚物)、聚己内酯、聚戊内酯、聚(1,3-二恶烷-2-酮))；聚酸酐(例如聚(癸二酸酐))；聚醚(例如聚乙二醇)；聚氨酯；聚甲基丙烯酸酯聚丙烯酸酯；聚氰基丙烯酸酯；PEG和聚(环氧乙烷)(PEO)的共聚物。

纳米颗粒可以包括一或多种可降解的聚合物，例如某些聚酯、聚酸酐、聚原酸酯、聚磷腈、聚磷酸酯、某些聚羟基酸、聚丙基富马酸酯、聚己内酯、聚酰胺、聚(氨基酸)、聚缩醛、聚醚、可生物降解的聚氰基丙烯酸酯、可生物降解的聚氨酯和多糖。例如可以使用的具体的可生物降解的聚合物包含但不限于聚赖氨酸、聚(乳酸)(PLA)、聚(羟基乙酸)(PGA)、聚己内酯(PCL)、聚(丙交酯-乙交酯共聚物)(PLG)、聚(丙交酯-己内酯共聚物)(PLC)和(聚乙交酯-己内酯共聚物)(PGC)。另一种示范性可降解聚合物是聚(β-氨基酯)，其可以适合根据本申请使用。

在某些实施例中，纳米颗粒可以具有或被修饰以具有一或多个官能团。此些官能团(在纳米颗粒内或在其表面上)可以用于与任何试剂(例如可检测的实体、靶向实体、治疗性实体或PEG)缔合。除了通过引入或改变表面官能度来改变表面电荷之外，引入不同的官能团还可以使连接体(例如(可裂解或可(生物)降解的)聚合物，例如但不限于聚乙二醇、聚丙二醇、PLGA等)、靶向/归巢剂和/或其组合的缀合。

在某些实施例中，纳米颗粒包括一或多种靶向配体(例如附接到其上)，例如但不限于小分子(例如叶酸盐、染料等)、适体(例如A10、AS1411)、多糖、小生物分子(例如叶酸、半乳糖、双膦酸酯、生物素)、寡核苷酸和/或蛋白质(例如(多)肽(例如αMSH、RGD、奥曲肽、AP肽、表皮生长因子、氯毒素、转铁蛋白等)、抗体、抗体片段、蛋白质等)。在某些实施例中，纳米颗粒包括一或多种造影剂/显像剂(例如荧光染料、(螯合的)放射性同位素(SPECT、PET)、MR活性剂、CT剂)和/或治疗剂(例如小分子药物(例如检查点抑制剂)、治疗性(多)肽、治疗性抗体、(螯合的)放射性同位素等)。

在某些实施例中，用于附接到纳米颗粒的检查点抑制剂的种类和/或物种的选择取决于向受试者施用的初始治疗剂的选择(例如在组合治疗中)，其中在施用包括纳米颗粒和附接的检查点抑制剂的纳米探针之前，先施用第一药物和/或第一治疗(例如辐射)。检查点抑制剂的种类和/或物种的选择也可以或替代地基于初始治疗剂如何改变组织微环境来选择。微环境的变化可以例如通过绘制免疫细胞谱来确定。而且，可以基于针对特定治疗剂观察的微环境中观察到的变化，使用分类方法对抑制剂进行分组。

在某些实施例中，PET(正电子发射断层扫描)示踪剂用作显像剂。在某些实施例中，PET示踪剂包括⁸⁹Zr、⁶⁴Cu、[¹⁸F]氟脱氧葡萄糖。在某些实施例中，纳米颗粒包含这些和/或其它放射性标记。

在某些实施例中，纳米颗粒包括一或多种荧光团。荧光团包括荧色物、荧色物猝灭剂分子、任何有机或无机染料、金属螯合物或任何荧光酶底物(包含蛋白酶可激活的酶底物)。在某些实施例中，荧光团包括长链嗜碳花青。在其它实施例中，荧光团包括DiI、DiR、DiD等。荧色物包括远红和近红外荧色物(NIRF)。荧色物包含但不限于羰花青和吲哚花青荧色物。在某些实施例中，显像剂包括市售荧色物，包含但不限于Cy5.5、Cy5和Cy7(GEHealthcare)；AlexaFlour660、AlexaFlour680、AlexaFluor750和AlexaFluor790(Invitrogen)；VivoTag680、VivoTag-S680和VivoTag-S750(VisEn Medical)；Dy677、Dy682、Dy752和Dy780(Dyomics)；DyLight547、DyLight647(Pierce)；HiLyte Fluor647、HiLyte Fluor 680和HiLyte Fluor 750(AnaSpec)；IRDye 800CW、IRDye 800RS和IRDye700DX(Li-Cor)；和ADS780WS、ADS830WS和ADS832WS(American Dye Source)和Kodak X-SIGHT 650、Kodak X-SIGHT 691、Kodak X-SIGHT 751(Carestream Health)。

在某些实施例中，纳米颗粒包括(例如具有附接的)一或多种靶向配体，例如用于靶向目标癌组织/细胞。

在某些实施例中，纳米颗粒包括1到20个分立的靶向部分(例如相同类型或不同类型)，其中靶向部分结合到肿瘤细胞上的受体(例如其中纳米颗粒的平均直径不大于15nm，例如不大于10nm，例如约5nm到约7nm，例如约6nm)。在某些实施例中，所述1到20个靶向部分包括α-黑素细胞刺激激素(αMSH)。在某些实施例中，纳米颗粒包括靶向部分(例如αMSH)。在某些实施例中，将诊断性纳米颗粒在其物理和/或化学性质(例如表面化学、表面电荷、直径、形状、配体数量)方面进行优化，使得它们能够通过肾清除。在某些实施例中，将治疗诊断性纳米颗粒在其物理和/或化学性质(例如表面化学、表面电荷、直径、形状、配体数量)方面进行优化，使得它们能够通过肾清除(例如用于成像或其它诊断应用)或使得它们不通过肾清除(例如用于治疗和/或治疗诊断应用)。

可以治疗的癌症包含例如***癌、乳腺癌、睾丸癌、子***、肺癌、结肠癌、骨癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、多发性骨髓瘤、肉瘤、小细胞癌、黑素瘤、肾癌、肝癌、头颈癌、食道癌、甲状腺癌、淋巴瘤、胰腺癌(例如BxPC3)、肺癌(例如H1650)和/或白血病。此外，所描述的组合物可以用于治疗病理性血管生成，包含肿瘤新血管形成。人肿瘤的生长和转移的发展取决于血管的从头形成。新血管的形成受到例如VEGF和VEGF-R的严格调节。

在某些实施例中，纳米颗粒包括治疗剂，例如药物部分(例如化学治疗药物)和/或治疗性放射性同位素。如本文使用，“治疗剂”是指当施用于受试者时具有治疗作用和/或引起期望的生物学和/或药理作用的任何试剂。

可以调节纳米颗粒的表面化学、涂覆均匀性(在存在涂层的情况下)、表面电荷、组成、浓度、施用频率、形状和/或尺寸，以产生所需的治疗左右。

在某些实施例中，纳米探针包括螯合剂，例如1,4,8,11-四氮杂双环[6.6.2]十六烷-4,11-二基)二乙酸(CB-TE2A)；去铁胺(DFO)；二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)；1,4,7,10-四氮杂环十四烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)；thylene二胺四乙酸(EDTA)；乙二醇双(2-氨基乙基)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)；1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)；亚乙基双-(2-4羟基-苯基甘氨酸)(EHPG)；5-Cl-EHPG；5Br-EHPG；5-Me-EHPG；5t-Bu-EHPG；5-sec-Bu-EHPG；苯并二亚乙基三胺五乙酸(苯并-DTPA)；二苯并-DTPA；苯基-DTPA、二苯基-DTPA；苄基-DTPA；二苄基DTPA；双-2(羟基苄基)-亚乙基-二胺二乙酸(HBED)及其衍生物；Ac-DOTA；苯并-DOTA；二苯并-DOTA；1,4,7-三氮杂环壬烷Ν,Ν',Ν"-三乙酸(NOTA)；苯并-NOTA；苯并-TETA，苯并-DOTMA，其中DOTMA为1,4,7,10-四氮环十四烷-1,4,7,10-四(甲基四乙酸)、苯并-TETMA，其中TETMA为1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-(甲基四乙酸)；1,3-丙二胺四乙酸(PDTA)的衍生物；三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)；1,5,10-N,N',N"-三(2,3-二羟基苯甲酰基)-三儿茶酚酸酯(LICAM)的衍生物；和1,3,5-N,N',N"-三(2,3-二羟基苯甲酰基)氨基甲基苯(MECAM)和其它金属螯合剂。

在某些实施例中，纳米缀合物包括一种以上螯合剂。

在某些实施例中，放射性同位素-螯合剂对是⁸⁹Zr-DFO。在某些实施例中，放射性同位素-螯合剂对是¹⁷⁷Lu-DOTA。在某些实施例中，放射性同位素-螯合剂对是²²⁵Ac-DOTA。

实验例

cRGDY-PEG-C'点的无螯合剂的锆-89放射性标记。

在过去的几年中，基于纳米颗粒的无螯合剂的放射性标记已成为一种固有的放射性标记技术，尤其是对于放射性同位素(例如砷-72[⁷²As，t_1/2＝26小时]，锗-69[⁶⁹Ge，t_1/2＝39.1小时])和钛-45[⁴⁵Ti，t_1/2＝3.8小时]³⁶)，目前尚无合适的螯合剂。

开发超小肾可清除纳米颗粒的无螯合剂的放射性标记技术是特别有利的，因为引入另外的表面修饰步骤可以增加颗粒的流体动力学半径，且进而降低或消除肾清除，同时促进高肝摄取。由于每个纳米颗粒的表面上(或内部)存在固有的硅烷醇基团(-Si-OH)，因此已知二氧化硅是用于使用各种放射性金属(包含⁸⁹Zr)成功进行无螯合剂的标记的最通用的纳米平台之一。

不希望被任何理论所束缚，认为标记机制是由于硬路易斯酸(即放射性金属⁸⁹Zr^{4 +})和硬路易斯碱(例如来自二氧化硅表面的去质子化硅烷醇基团-Si-O^-)之间的强相互作用。尽管在使用硅烷-PEG的表面PEG化步骤之后，大部分表面硅烷醇基团已被猝灭，但据推测，每个微孔C'点的内部硅烷醇基团仍可用于无螯合剂的⁸⁹Zr标记。

为此，使用⁸⁹Zr⁴⁺经由无螯合剂的策略对cRGDY-PEG-C'点进行放射性标记。合成了C'点。近红外荧光Cy5染料共价包封在C'点的二氧化硅基质中，从而赋予了C'点荧光性质；然后，在PEG化期间将癌症靶向cRGDY肽共价附接到C'点的外表面，从而实现主动肿瘤靶向。纯化所得的cRGDY-PEG-C'点，并进行质量分析(图1A-1F)。纯化的cRGDY-PEG-C'点的GPC洗脱图示出了在9分钟左右的单个峰，对应于C'点纳米颗粒(图1A)。所述峰通过单一高斯分布很好地拟合，表明100％纯度和窄粒度分布(图1A)。如通过FCS测量，纯化的cRGDY-PEG-C'点的平均流体动力学直径为约6.4nm(图1B)，与TEM观察结果一致(图1A)。除了粒径外，FCS还提供了颗粒浓度，所述颗粒浓度用于估计每颗粒官能团的数量，包含染料、靶向肽和⁸⁹Zr放射性同位素。纯化的cRGDY-PEG-C'点的紫外-可见光光谱在约650nm的波长处表现出强吸收，对应于Cy5荧光染料的吸收最大值(图1C)。与没有进行cRGDY表面修饰的C'点(PEG-C'点)相比，在约275nm的波长处识别出额外吸收峰，所述额外吸收峰归因于cRGDY肽上的酪氨酸残基(图1C)。通过用根据紫外-可见光光谱计算的Cy5和cRGDY的浓度除以通过FCS测量的C'点的浓度，估计每C'点的Cy5和cRGDY的数量分别为约1.6和20。

对于放射性标记程序，将4nmol纯化的cRGDY-PEG-C'点与1mCi ⁸⁹Zr草酸盐的HEPES缓冲液溶液(pH 8)在75℃下混合。通过放射性TLC监测放射化学产率。结果表明，在最初的1小时内，实现了超过50％的⁸⁹Zr标记产率。在4小时的放射性标记期间，总共～75％的⁸⁹Zr成功地附接到颗粒(图2A)。标记过程取决于颗粒浓度：颗粒/⁸⁹Zr(nmol/mCi)比值越高，⁸⁹Zr标记产率就越高(图2A)。经发现，不含螯合剂的⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点(表示为cRGDY-PEG-[89Zr]C'点)的比活性在100-500Ci/mmol的范围内。

去质子化硅烷醇基团在二氧化硅纳米颗粒的无螯合剂的⁸⁹Zr标记中起着至关重要的作用。当pH低于二氧化硅的等电点(pH～2-3)时，C'点的表面硅烷醇基团将质子化，使其不适合与带正电的⁸⁹Zr螯合。这由以下事实证明：在pH 2和75℃下观察到不到1％的标记产率(图2B)。还表明了无螯合剂的⁸⁹Zr标记是温度依赖性的，较高的标记温度导致较快的⁸⁹Zr标记(图2C)。推荐的标记pH和温度范围分别为pH 8-9和50-75℃。

为了进一步表明去质子化硅烷醇基团的具体⁸⁹Zr标记，经由加入二乙氧基二甲基硅烷将PEG化后C'点表面上的其余硅烷醇基团猝灭。所得的修饰的cRGDY-PEG-C'点表现出反应性硅烷醇基团的较低表面密度，从而降低了无螯合剂的放射性标记的效率。实际上，在这种情况下，观察到⁸⁹Zr标记产率降低了大约25％(图2D)。考虑到⁸⁹Zr草酸盐的平均比活性为约833Ci/mmol锆，且放射化学纯度大于99.9％，因此对于cRGDY-PEG-[⁸⁹Zr]C'点，估计每cRGDY-PEG-C'点约0.14-0.63个⁸⁹Zr(表3)。通过以不同比值用冷Zr(或^natZr)标记，可以进一步增加每颗粒Zr原子的数量。如图8A和8B中所示，通过以1:10的摩尔比用^natZr标记cRGDY-PEG-C'点，可以达到2.27±0.08的^natZr密度。迄今为止，基于二氧化硅的⁸⁹Zr无螯合剂的放射性标记一直专注于直径大于100nm的纳米颗粒，以提供足够的硅烷醇基团密度(大于10⁵/颗粒)。本数据示出了成功地对表面和内部硅烷醇基团密度显著降低的超小(例如6-7nm)PEG化二氧化硅纳米颗粒进行⁸⁹Zr无螯合剂的标记的第一实例。

表3示出了无螯合剂的放射性标记方法的每C'点⁸⁹Zr的数量的估计。

表3

cRGDY-PEG-C'点的基于螯合剂的锆-89放射性标记

为了实现基于螯合剂的⁸⁹Zr标记，使用了p-SCN-Bn-去铁胺(DFO-NCS，提供了六个氧供体)。在最初的尝试中，通过引入谷胱甘肽(GSH)作为连接体，将DFO螯合剂附接到马来酰亚胺官能化C'点(mal-cRGDY-PEG-C'点)，从而将C'点表面上的马来酰亚胺基团转化为用于DFO-NCS缀合的伯胺基团。首先使用PD-10柱纯化所得的GSH修饰的点，然后使其经由GHS胺基团与DFO-NCS螯合剂缀合，得到DFO-cRGDY C'点，用于⁸⁹Zr标记。尽管获得了高标记产率(大于80％)，但是在筛选PET研究中观察到⁸⁹Zr-DFO-cRGDY-PEG-C'点的每一次高肠摄取(图8A)。不希望被任何理论所束缚，本摄取可能是由于⁸⁹Zr-DFO-GSH从颗粒的脱离。注射后24小时未观察到可见的骨骼摄取，表明游离⁸⁹Zr没有从放射性缀合物脱离(图8A)。

为了解决本问题，使用最近开发的PEG化后通过***进行的表面修饰(PPSMI)方法，将伯胺基团直接附接到C'点表面。为此，在C'点PEG化后，将另外的氨基硅烷分子加入到反应中并***到PEG层中，所述PEG层附接到下面的二氧化硅表面。所得的NH₂-cRGDY-PEG-C'点在PEG层下的二氧化硅表面上含有反应性胺基团，从而允许与例如NCS官能化DFO螯合剂的进一步缀合。纯化后，NH₂-cRGDY-PEG-C'点表现出良好的产品质量，类似于没有胺官能化的cRGDY-PEG-C'点(图1D-1E)。纯化的NH₂-cRGDY-PEG-C'点的平均直径为约6.5nm。估计每C'点Cy5和cRGDY肽的数量分别为约1.5和18(图1D-1E)。然后，使用颗粒和DFO-NCS之间的1:20反应摩尔比将纯化的NH₂-cRGDY-PEG-C'点与DFO-NCS缀合，然后使用PD-10柱进行纯化以去除未反应的DFO-NCS。将⁸⁹Zr草酸盐标记到所得的DFO-cRGDY-PEG-C'点在37℃下进行60分钟。通过使用0.4nmol/1mCi的颗粒/⁸⁹Zr比值，获得了接近100％的标记产率(图2E)。估计比活性在1300-4300Ci/mmol的范围内，显著高于通过使用无螯合剂的方法合成的样品的比活性。在最终的⁸⁹Zr-DFO-cRGDY-PEG-C'点产品中，估计每C'点约1.59-5.14个⁸⁹Zr(表4)。为了估计每颗粒可用DFO的数量，首先将合成的DFO-cRGDY-PEG-C'点用^natZr标记，然后通过使用微波等离子体-原子发射光谱法(MP-AES)进行^natZr量量化。结果表明，对于以1:10的颗粒/DFO比值合成的DFO-cRGDY-PEG-C'点颗粒，每C'点平均有3.42±0.13个^natZr；并且以1:30的颗粒/DFO比值合成的DFO-cRGDY-PEG-C'点颗粒，每C'点平均有4.76±0.13个^natZr(图2F)。不希望被任何理论所束缚，由于在标记期间使用了过量的^natZr并通过与EDTA螯合去除了未反应的^natZr，因此每C'点^natZr的数量(约3-5个)应等于每DFO-cRGDY-PEG-C'点可用DFO的数量。通过使用所开发的⁸⁹Zr-DFO-cRGDY-PEG-C'点，随后的先导PET成像研究示出了显著降低的肠摄取(图8B)。

表4示出了基于螯合剂的放射性标记方法的每C'点⁸⁹Zr的数量的估计。

表4

⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点的放射稳定性和血液循环半衰期

接下来，研究了两种⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点的体外稳定性、体内放射稳定性和血液循环半衰期。开发具有高放射稳定性的放射性标记的纳米颗粒至关重要，因为PET仅检测放射性同位素，而不检测纳米颗粒。使用PD-10柱合成并纯化了两种⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点。图9A和9B示出了PD-10柱中两种⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点的代表性洗脱曲线。收集2.5mL到4.0mL的级分，用于后续研究。

结果表明，在室温下经过一周的时间，两种⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的稳定性相当。⁸⁹Zr-DFO-cRGDY-PEG-C'点表现出稍好一点的稳定性，甚至在一周后纯度也超过95％，而cRGDY-PEG-[⁸⁹Zr]C'点的纯度低于90％(图3A)。在测量小鼠血浆中的完整的⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点的百分比后，在体内观察到了放射稳定性的显著差异。如图3B中所示，基于放射性TLC，在小鼠血浆中注射48小时后估计有超过98％的完整⁸⁹Zr-DFO-cRGDY-PEG-C'点，但注射cRGDY-PEG-[⁸⁹Zr]C'点的小鼠小于75％，表明在体内循环cRGDY-PEG-[⁸⁹Zr]C'点期间的游离⁸⁹Zr的脱离。以下各部分将呈现关于体内生物分布和骨骼摄取的差异的更多讨论。

为了评价血液循环半衰期，在各个注射后时间点对来自静脉内(i.v.)注射⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点的小鼠的血液进行采样，并通过γ计数进行测定(n＝3)。将血液吸收值转换为每克注射剂量的百分比(％ID/g)，并用两区室模型拟合。如图3C和3D中所示，结果表明了相当等同的体内血液循环半衰期(约15小时)，大于先前针对较早一代的放射性碘标记的颗粒所发表的体内血液循环半衰期(表1)。

使用⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点的动态PET成像

PET是一种用于以高敏感度在体内无创且量化地跟踪各种类型的放射性标记的探针的药代动力学(PK)的合适的分子成像模态。受组织穿透深度的限制，众所周知的是，光学成像通常不适用于体内全身筛查和组织内颗粒分布的量化。为了跟踪全身注射的C'点的分布和快速肾清除(特别是在注射后早期)，对代表性小鼠进行了60分钟动态PET成像研究，每只动物注射两种⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点探针中的一种。如图4A和4B中所示，最大强度投影(MIP)图像示出了i.v.注射后的小鼠心脏中的⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点的显著活性。在两种情况下均观察到心脏活性逐渐降低，对于注射cRGDY-PEG-[⁸⁹Zr]C'点的小鼠(图4C)，在注射后60分钟，估计总活性浓度为20.5％ID/g，并且对于注射⁸⁹Zr-DFO-cRGDY-PEG-C'点的小鼠(图4D)，估计总活性浓度为19.3％ID/g。关于肝摄取也观察到相似的趋势，估计两种探针的注射后60分钟摄取值均为～6.5％ID/g。早在注射后5分钟，并且在MIP图像和时间-活性曲线中都观察到显著的肾和膀胱摄取，这清楚地突出表明了两种⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点探针的肾清除能力。

体内药代动力学和辐射剂量学研究。

进行了详细的生物分布研究，以通过在各个注射后时间点处死小鼠并对目标器官收获、称重并测定(即5、24和72小时，表5和6，图5A-5C)来研究两种⁸⁹Zr-标记的cRGDY-PEG-C'点在主要器官中的摄取。

表5示出了在各个注射后时间点的注射cRGDY-PEG-[⁸⁹Zr]C'点的小鼠的器官摄取。

表5

表6示出了在各个注射后时间点的注射⁸⁹Zr-DFO-cRGDY-PEG-C'点的小鼠的器官摄取。

表6

如在动态PET成像研究中所证明(图4A-4D)，生物分布研究证实了两种⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点探针在血液区室中的显著活性(图5A和5B)。血浆活性浓度是全血活性浓度的两倍(图10)。注射后早期时间点的尿摄取因小鼠而异，范围从小于10％ID/g到大于20％ID/g。在本研究中，在注射后72小时内清除了总共60-70％ID的⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点探针。与大于10nm尺寸的纳米颗粒的代表性研究结果相反，通常表现出显著的肝摄取(例如30-99％ID)摄取，两种⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点探针均表现出显著较低的肝摄取(小于5％ID/g或2-5％ID)。有趣的是，与可替代的肾可清除颗粒(例如超小量子点或Au纳米颗粒)相比，⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点还在注射后早期时间点表现出显著降低的(降低5-10倍的)肾摄取(例如2-4％ID/g，如图5A-5C中所示)。

在两种⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点探针之间发现了总骨骼摄取的明显差异。对于cRGDY-PEG-[⁸⁹Zr]C'点，在i.v.注射后24小时和72小时的时间点，值开始增加超过5％和10％ID/g(如图5C中所示，p<0.005)。此高骨骼摄取可能并不反映cRGDY-PEG-[⁸⁹Zr]C'点探针的骨髓蓄积，而是表明游离⁸⁹Zr⁴⁺由于其相对较低的体内放射稳定性从cRGDY-PEG-[⁸⁹Zr]C'点脱离(图3B)。游离⁸⁹Zr⁴⁺是一种亲骨性阳离子，其可以很容易地依附到骨矿物质中，如图10中所示。监测骨骼摄取随时间的变化也已被证明是研究⁸⁹Zr标记的纳米探针的体内稳定性的最佳方法之一。通过在注射前使用EDTA攻击从cRGDY-PEG-[⁸⁹Zr]C'点去除螯合较差的表面⁸⁹Zr来降低cRGDY-PEG-[⁸⁹Zr]C'点的骨骼摄取的尝试被证明是在最小化骨骼摄取方面勉强有效的。即使在过夜EDTA攻击后，也仅观察到～20％的骨骼摄取降低(条件：10mMEDTA，37℃，以650rpm振摇，图12C)。图12B中的PET成像表现出进行另外的EDTA攻击过程的cRGDY-PEG-[⁸⁹Zr]C'点的明显且持久的骨骼和关节摄取。此外，发现⁸⁹Zr从小鼠骨骼的清除缓慢，在一周后没有明显降低(图13)。骨骼中的放射性⁸⁹Zr⁴⁺的过量和保留的蓄积可能增加对本区室(尤其是对放射敏感的组织)的辐射剂量，从而可能阻碍临床转译。

为了估计70kg标准人的平均器官吸收剂量和有效剂量，基于图5A-5C中所示的生物分布数据并且使用OLINDA计算机程序进行两种⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点探针的剂量学计算(产生以mSv/MBq表示的剂量)。表7比较了两种⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点探针在人类中的估计组织吸收剂量。表7示出了使用OLINDA剂量学程序估计的70kg标准人中的⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点的辐射剂量。

表7

与基于螯合剂的cRGDY-PEG-[⁸⁹Zr]C'点的吸收剂量(0.062mSv/MBq)相比，发现无螯合剂的⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点的红骨髓中的吸收剂量稍微更高(0.084mSv/MBq)。在人肝中，估计两种⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点探针的吸收剂量均为～0.1mSv/MBq，仅为先前报道的⁸⁹Zr-DFO-曲妥珠单抗的值的十分之一(肝摄取为～12％ID，肝中的平均估计吸收剂量为1.54mSv/MBq)。尽管在小型动物研究中观察到显著更高的骨骼摄取，但是70kg标准人中的估计辐射剂量表明，不含螯合剂的⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-[⁸⁹Zr]C'点产品的全身剂量和有效剂量仅略有增加(小于20％)。综合来说，体内药代动力学研究证实了在注射后的前24小时内的⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点探针的肾清除和延长血液循环。在整个研究期间，所有主要器官(尤其是肝、脾和肾)均表现出极少的摄取(小于5％ID/g)。无螯合剂的和基于螯合剂的⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点探针之间的主要区别是，注射后24小时，前者的体内放射性稳定性更低，骨骼摄取显著更高(2-4倍)。然而，辐射剂量学分析表现出两种⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点探针的有利全身剂量和有效剂量，这促进了在特征明确的整联蛋白α_vβ₃表达人黑素瘤异种移植物模型中对两种放射性标记的纳米探针的体内肿瘤特异性靶向的探究。

通过PET成像的体内肿瘤靶向。

如本文所述，设计在全身性施用后主动定位目标靶标并同时在网状内皮系统(RES)中保持较低的非特异性蓄积的“靶向或清除”多官能纳米颗粒平台长期以来一直是纳米医学领域的主要挑战之一。表1列出了表现出肾清除和体内活性肿瘤靶向能力的超小纳米颗粒的当前研究状况。

如图6A-6J中所示，在注射[⁸⁹Zr]cRGDY-PEG-C'点(图6A)和⁸⁹Zr-DFO-cRGDY-PEG-C'点(图6B、6C)的小鼠的2小时最大强度投影(MIP)图像中观察到显著的膀胱活性。观察到的高心脏摄取(～20％ID/g)清楚地表明了⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点在血液区室中的循环。图6D-6F中示出的时间-活性曲线描绘了血液中⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点的清除，摄取值在注射后24小时和72小时分别估计为约5-6％ID/g和1-2％ID/g。注射后2小时，估计RES器官(例如肝)对⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点的清除仅为5-6％ID/g，3天后轻微降低到4-5％ID/g；对于大于10nm的颗粒，这些值显著低于先前报道的值。经发现，在3天内，脾摄取仅为肝摄取的一半。经发现，肌肉摄取低至～1％ID/g。不希望被任何理论所束缚，此突出的肾清除、显著降低的RES摄取、肌肉中极低的本底活性水平以及适当的血液循环半衰期(～15小时)，表明显著增强的肿瘤/本底比值因此可以是可以实现的。

如图6A-6B中所示，注射后2小时，在注射cRGDY-PEG-[⁸⁹Zr]C'点(图6A，10.1±2.1％ID/g)和⁸⁹Zr-DFO-cRGDY-PEG-C'点(图6B，10.5±4.0％ID/g)的小鼠中观察到高M21(α_vβ₃阳性)肿瘤摄取。肿瘤摄取在注射后24小时达到峰值，并分别稍微增加到约10.7±1.3％ID/g和12.0±1.4％ID/g(图6G)。与用¹²⁴I标记的第一代C点(cRGDY配体密度：～6)(注射后4小时，最大M21肿瘤摄取：～2％ID/g)相比，估计肿瘤摄增强5倍以上。在注射两种类型的⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点(图6D和6E)的M21荷瘤小鼠中观察到在测试的72小时内的颗粒活性的保留(仅具有低清洗率)。注射无螯合剂的⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点的小鼠表现出游离⁸⁹Zr的脱离以及其在骨骼、关节和脊柱中的蓄积(图6A、14A-14B)，同时在注射⁸⁹Zr-DFO-cRGDY-PEG-C'点的小鼠中发现了显著降低的骨骼和关节摄取(图6B、14A-14B)。

注射⁸⁹Zr-DFO-cRGDY-PEG-C'点后，在M21-L荷瘤小鼠(α_vβ₃阴性)中进行对照研究，以进一步表明⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点的靶标特异性。研究结果表明，主要器官(例如膀胱、心脏、肝和肌肉)中的颗粒分布相似，M21-L肿瘤中的摄取显著降低(平均2-3％ID/g)，如图6C、6F和15中所示。注射cRGDY-PEG-[⁸⁹Zr]C'点或⁸⁹Zr-DFO-cRGDY-PEG-C'点的小鼠的绝对肿瘤摄取值或肿瘤/器官比值均未发现显著差异(图6G-6J、15)。对于注射⁸⁹Zr-DFO-cRGDY-PEG-C'点的小鼠，在注射后72小时，最高的肿瘤/血液比值和肿瘤/肌肉比值分别估计为6.4±2.6和9.6±2.5。其比M21-L荷瘤小鼠中的相应比值高3到4倍(肿瘤/血液：1.5±0.6；肿瘤/肌肉：2.8±0.7，图6H和6J)。最后，基于高肿瘤摄取和低RES蓄积，在注射cRGDY-PEG-[⁸⁹Zr]C'点或⁸⁹Zr-DFO-cRGDY-PEG-C'点的M21荷瘤小鼠中观察到约(或大于)2或更高的肿瘤/肝比值(图6I)，其是将⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点探针与其它肿瘤靶向纳米颗粒区分开的独特特征之一。综合来说，表明了⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点在α_vβ₃整联蛋白表达黑素瘤异种移植物模型中的肾清除和体内特异性主动靶向。

为了解决超小肾可清除的cRGDY-PEG-C'点的放射性标记中的攻击，开发了两种⁸⁹Zr放射性标记策略，并根据其生物学和剂量学性质对其进行了比较。尽管两种纳米探针都具有相当的体外放射稳定性，但基于螯合剂的放射性标记表现出相较于不含螯合剂的制剂显著更高的体内放射稳定性。PK研究和PET成像估计均证实，在α_vβ₃整联蛋白表达黑素瘤异种移植物模型中无创地观察到两种产品的肾清除、低RES蓄积、增强的肿瘤摄取和高靶标/本底比值。所有这些都表明，这些新颖的“靶向或清除”⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点示踪剂对于人类受试者具有有利的可译性，从而可用于癌症的全身性靶向成像(或治疗)。

cRGDY-PEG-C'点和胺官能化NH₂-cRGDY-PEG-C'点的合成、纯化和表征。

cRGDY-PEG-C'点的合成遵循已知方案(参见例如美国申请第14/215,879号，以美国公开号US20140248210A1公开，其内容通过引用整体并入本文)，而NH₂-cRGDY-PEG-C'点的合成使用PEG化后通过***进行的表面修饰方法(马，K.(Ma,K.)；和威斯纳，U.(Wiesner,U.)，实现了五官能超小有机-二氧化硅杂化纳米颗粒的模块化和正交PEG化后通过***进行的表面修饰(Modular and Orthogonal Post-PEGylation Surface Modifications byInsertion Enabling Penta-functional Ultrasmall Organic-Silica HybridNanoparticles)，美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)，2017提交，其内容通过引用整体并入本文)。通过在剧烈搅拌下以7.3mM的浓度向合成中加入二乙氧基二甲基硅烷(DEDMS)，进一步使PEG化后NH₂-cRGDY-PEG-C'点上的其余硅烷醇基团封端。将反应溶液在室温下在剧烈搅拌下放置过夜，然后进行颗粒纯化。胺化颗粒的合成的其余过程遵循与cRGDY-PEG-C'点类似的方案。本文表述了不同C'点的纯化和表征方法，包含GPC纯化以及TEM、FCS和紫外-可见光测量。

DFO-cRGDY-PEG-Cy5-C'点的一锅合成

此外，可以使用一锅合成技术来进行cRGDY-PEG-C'点和/或NH₂-cRGDY-PEG-C'点的合成，例如如图17中所示。在化学中，一锅合成技术可以提高化学反应的效率。例如仅在一个反应器中使一或多种反应物进行连续的化学反应，从而提高化学反应的效率。如图17中的示意图中所描绘，使cRGDY-C'点与胺-硅烷接触以形成胺-cRGDY-C'点。然后，在同一“锅”中使胺-cRGDY-C'点与DFO-NCS接触，以生成DFO-cRGDY-C'点。

使用一锅水基合成方案(例如如图17中所示)产生DFO-cRGDY-PEG-Cy5-C'点。首先将17.2μmol NHS酯/马来酰亚胺基官能化杂官能聚乙二醇(PEG)(被称为mal-PEG-NHS)溶解在74.5μL二甲基亚砜(DMSO)中，然后在室温下在氮气下与15.5μmol(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(胺-硅烷)混合。然后，将反应混合物在室温下在氮气下放置两天，以经由NHS酯-胺反应使mal-PEG-NHS与胺-硅烷缀合，形成mal-PEG-硅烷缀合物。之后，将18.9μmol环(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Cys)肽(cRGDY)溶解在900μL DMSO中，然后在室温下在氮气下加入mal-PEG-硅烷的反应溶液中。然后，将反应混合物在室温下在氮气下放置过夜，以通过硫醇-烯反应使mal-PEG-硅烷与cRGDY肽的半胱氨酸残基上的硫醇基团进一步缀合，形成cRGDY-PEG-硅烷缀合物。同时，先将1.3μmol马来酰亚胺基官能化Cy5染料(Cy5-mal)溶解在100μLDMSO中，然后与28.4μmol(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(硫醇-硅烷)混合，以通过硫醇-烯反应使Cy5-mal与硫醇-硅烷缀合，形成Cy5-硅烷缀合物。

在下一步骤中，将204μL原硅酸四甲酯(TMOS液体)和在上一步骤中制备的所有Cy5-硅烷缀合物在室温下在剧烈搅拌下加入30mL氢氧化铵水溶液(氢氧化铵浓度为0.006M)中。将反应溶液在室温下在剧烈搅拌下放置过夜，以经由硅烷水解和缩合生成二氧化硅纳米颗粒，Cy5染料共价包封在其中。接下来，在室温下在剧烈搅拌下将在上一步骤中制备的cRGDY-PEG-硅烷缀合物加入反应混合物中，随后加入300μL硅烷官能化单官能PEG(PEG-硅烷液体)。之后，在剧烈搅拌下将反应溶液在室温下放置过夜。然后，将反应溶液在80℃静置过夜，以经由硅烷缩合进一步增强PEG-硅烷和cRGDY-PEG-硅烷与二氧化硅纳米颗粒表面的共价附接。在将反应溶液冷却至室温后，将二氧化硅纳米颗粒充分PEG化，形成cRGDY-PEG-Cy5-C'点。

接下来，在室温下在剧烈搅拌下将8.6μmol(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(胺-硅烷)进一步加入cRGDY-PEG-Cy5-C'点的反应溶液中。然后，在剧烈搅拌下将反应溶液在室温下放置过夜，以经由硅烷水解和缩合将胺-硅烷分子进一步共价附接到PEG层下的cRGDY-PEG-Cy5-C'点的二氧化硅表面上的其余硅烷醇基团。之后，首先将17μmol N-氯代琥珀酰亚胺官能化去铁胺(DFO-NCS)溶解在750μL DMSO中，然后在剧烈搅拌下在室温下加入反应溶液中。然后，在剧烈搅拌下将反应溶液在室温下放置过夜，以经由NCS-胺反应将DFO-NCS共价附接到C'点的PEG层下的胺基团，使得每颗粒有大约4个DFO分子。然后，DFO-cRGDY-PEG-Cy5-C'点通过GPC纯化，通过无菌注射器过滤器过滤，并在4℃下保存。然后，用⁸⁹Zr对DFO-cRGDY-PEG-Cy5-C'点进行放射性标记，形成⁸⁹Zr-DFO-cRGDY-PEG-Cy5-C'点。

制造官能化胺化纳米颗粒的方法的进一步描述描述于2017年5月19日提交的Wiesner等人的美国专利申请第62/508,703号中，其内容通过引用整体并入本文。

⁸⁹Zr草酸盐产生。

⁸⁹Zr是于纪念斯隆凯特琳癌症中心在TR19/9回旋加速器(Ebco Industries Inc.)上经由89Y(p，n)⁸⁹Zr反应而产生的，并且被纯化以得到比活性为5.28-13.43mCi/μg(470-1195Ci/mmol)的锆⁸⁹Zr。使用CRC-15R剂量校准器(Capintec)进行活性测量。为了活性的量化，在自动Wizard²γ计数器(PerkinElmer)上对实验样品进行计数。所有的体内实验均根据纪念斯隆凯特琳机构动物护理和使用委员会批准的协议(协议编号86-02-020)进行。对于所有⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点，使用放射性TLC来证实大于95％的纯度。

cRGDY-PEG-C'点的无螯合剂的⁸⁹Zr放射性标记。

对于cRGDY-PEG-C'点的无螯合剂的⁸⁹Zr标记，在75℃下将4nmol cRGDY-PEG-C'点(表面被马来酰亚胺基团官能化)与1mCi ⁸⁹Zr草酸盐的HEPES缓冲液溶液(pH 8)混合。使用水杨酸浸渍的即时薄层色谱纸(ITLCSA)(Agilent Technologies)监测cRGDY-PEG-C'点的放射性标记产率，并在使用Winscan放射性TLC软件的Bioscan AR-2000放射性TLC读板器(Bioscan Inc.，华盛顿特区)上或在自动Wizard²γ计数器(PerkinElmer)上进行分析。在培育后，取出5μL等分试样并与50μL EDTA(50mM，pH 5-6)混合，然后使用EDTA(50mM，pH 5-6)作为流动相溶剂通过ITLC进行分析。游离⁸⁹Zr与EDTA形成瞬时复合物，并用溶剂洗脱，而⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点仍保持在原点。为了更精确的量化，将试条切成两半，并在校准的γ计数器(PerkinElmer)上使用800-1000keV的动能窗口对909keV的γ射线发射进行计数。在研究cRGDY-PEG-C'点的pH依赖性、浓度依赖性和温度依赖性无螯合剂的标记时，引入了类似的程序。经发现，不含螯合剂的⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点的比活性在100-500Ci/mmol的范围内。

DFO-cRGDY-PEG-C'点的合成和基于螯合剂的⁸⁹Zr标记。

通过在室温下在pH 8-9下使胺官能化NH₂-cRGDY-PEG-C'点与DFO-NCS(摩尔比为1:20)反应1-2小时并以640rpm振摇来引入基于螯合剂的⁸⁹Zr标记技术。然后，通过使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)作为流动相将颗粒通过PD-10柱来纯化合成的DFO-cRGDY-PEG-C'点。对于基于螯合剂的⁸⁹Zr标记，然后在37℃将0.2-0.75nmol DFO-cRGDY-PEG-C'点与1mCi ⁸⁹Zr草酸盐的HEPES缓冲液溶液(pH 8)混合60分钟；最终标记pH保持为7-7.5。如本文所述监测标记产率。引入了EDTA攻击过程以去除任何非特异性结合的⁸⁹Zr。然后，通过使用PD-10柱来纯化合成的⁸⁹Zr-DFO-cRGDY-PEG-C'点。通过使用ITLC来测量最终放射化学纯度。经发现，比活性在1300-4300Ci/mmol的范围内。

每DFO-cRGDY-PEG-C'点^natZr的数量的MP-AES量化。

为了量化每DFO-cRGDY-PEG-C'点^natZr的数量，在37℃下将0.75nmol的DFO-cRGDY-PEG-C'点与过量的^natZrCl₄(15nmol)混合60分钟。最终标记pH保持为7-7.5。在标记后，将混合物与EDTA合并，并培育30分钟以上以消除任何非特异性^natZrCl₄。然后，用PD-10柱纯化样品。然后，使用微波等离子体-原子发射光谱法(MP-AES)测量总标记^natZr的量。每DFO-cRGDY-PEG-C'点^natZr的数量通过以下公式计算：

不希望被任何理论所束缚，由于使用了过量的^natZrCl₄进行标记，所以每^natZr-DFO-cRGDY-PEG-C'点^natZr的数量应大致等于每DFO-cRGDY-PEG-C'点可用DFO的数量。

血液循环半衰期估计。

为了估计两种⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点探针的血液循环半衰期，向健康小鼠(n＝3)静脉内(i.v.)注射放射性颗粒。在各个注射后时间点进行血液采样，并使用自动Wizard²γ计数器(PerkinElmer)对这些放射性样品进行计数。血液摄取值以每克注射剂量的百分比(％ID/g)呈现，并用两区室模型拟合。

体外和体内放射稳定性研究。

为了研究体外放射稳定性，在室温下将无螯合剂的和基于螯合剂的⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点都保持在PBS(1x)中。在从合成结束(EOS)开始的各个时间点，通过ITLC在1周的时间内测量放射化学纯度。对于体内放射稳定性，向健康小鼠注射～200μCi(～7.4MBq)不含螯合剂(或基于螯合剂)的⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点。在注射后2、24和48小时收集全血，并通过以8000rpm离心10分钟使血浆级分从红细胞分离。然后，通过使用ITLC来测量完整的⁸⁹Zr标记的cRGDY-PEG-C'点的百分比，其中在使用Winscan放射性TLC软件(Bioscan Inc.，华盛顿特区)的Bioscan AR-2000放射性TLC读板器上对板进行分析。

动物模型和肿瘤接种：

所有动物实验均按照纪念斯隆-凯特琳癌症中心的机构动物护理和使用委员会批准的方案进行，并遵循NIH动物福利准则。M21和M21-L异种移植物是通过向雌性无胸腺nu/nu小鼠(6-8周龄，Taconic Farms Inc.)的后腿同时皮下注射等体积的细胞(～5×10⁶个细胞/100μL)和基质胶而生成的。所有研究均使用200mm³的平均肿瘤体积。

剂量学。

对每个组织得出的时间-活性曲线进行解析积分，以说明放射性衰变，以获得相应的蓄积活性。然后，通过用蓄积活性乘以非穿透性辐射(正电子)的⁸⁹Zr平衡剂量常数来计算器官吸收剂量，假设此些辐射完全局部吸收并忽略穿透性辐射(即γ射线)的贡献。通过考虑小鼠和人(假设70kg标准人)之间的全身和器官质量的差异，将小鼠正常器官蓄积活性转换为人正常器官蓄积活性。将计算出的人正常器官蓄积活性输入到OLINDA剂量学程序中，以使用核医学学会的医用内部剂量委员会的形式计算标准人器官吸收剂量。这种人剂量模型是“正常”(即无肿瘤)的解剖学模型。

体内静态PET、动态PET成像和离体生物分布研究。

对于静态PET成像，向荷瘤小鼠(n＝3)i.v.注射200-300μCi(7.4-11.1MBq)PEG-cRGDY-[⁸⁹Zr]C'点或⁸⁹Zr-DFO-cRGDY-PEG-C'点。在注射后2、24、48和72小时，在小动物PET扫描仪(Focus 120microPET；Concorde Microsystems)中进行PET成像。通过使用IRW软件进行PET数据的图像重建和目标区域分析，结果以％ID/g呈现。

对于动态PET扫描，向健康小鼠i.v.注射～400μCi(～14.8MBq)C'点-PEG-cRGDY-[⁸⁹Zr]C'点或⁸⁹Zr-DFO-cRGDY-PEG-C'点。在小型动物PET扫描仪(Focus120microPET；Concorde Microsystems)中进行60分钟动态扫描，并分成46帧：12×5秒，6×10秒，6×30秒，10×60秒，6×150秒，5×300秒。通过使用IRW软件进行图像重建和目标区域(ROI)分析，结果以％ID/g呈现。

对于生物分布研究，向荷瘤(n＝3)的小鼠注射～100μCi(～3.7MBq)C'点-PEG-cRGDY-[⁸⁹Zr]C'点或⁸⁹Zr-DFO-cRGDY-PEG-C'点。在24小时，使用自动Wizard²γ计数器(PerkinElmer)测定主要实质内器官中的蓄积活性，并以％ID/g(平均值±SD)呈现。

统计。

所有比较均使用基于三个重复的两样品t测试进行。基于计算出的曲线下面积比较浓度和时间曲线。

用于靶向VEGFR过表达癌症的⁸⁹Zr-DFO-VEGF₁₂₁-PEG-Cy5-C'点的合成

第一步，使用本文所述的方法合成胺化C'点(被称为PEG-NH₂-Cy5-C'点)。在剧烈搅拌(600rpm)下，将原硅酸四甲酯(TMOS)和硅烷官能化Cy5荧光染料加入氢氧化铵溶液(pH～8.5，室温(RT))中。一天后，在剧烈搅拌条件(600rpm)下，将(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(APTMS)和摩尔质量为大约500(6到9个乙二醇单元)的单官能PEG-硅烷依次加入反应中，然后在不搅拌的情况下保持在80℃下。收集合成的PEG-NH₂-Cy5-C'点(在冷却至室温后)，通过凝胶渗透色谱法(GPC)纯化，并经由旋转过滤转移到去离子水(DI)中；随后通过荧光相关光谱法(FCS)分析确定粒径和浓度。

接下来，将PEG-NH₂-Cy5-C'点稀释到磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH 7.4)缓冲溶液中。将DBCO-PEG₄-NHS酯(DMSO溶液)加入反应混合物中，并在RT下在振摇(640rpm)下反应1小时。可以通过改变PEG-NH₂-Cy5-C'点和DBCO-PEG4-NHS酯之间的反应比来控制DBCO表面密度。然后，加入DFO-NCS(DMSO溶液)，并将反应pH调节至8-9，以便促进DFO与C'点的表面缀合(反应时间～2小时)。PEG-NH₂-Cy5-C'点与DFO-NCS的反应比为1:20，实现了每C'点至少3-4个DFO的缀合。然后，通过以PBS作为流动相将颗粒通过PD-10柱来纯化所合成的DFO-DBCO-PEG-Cy5-C'点通，以去除未反应的DBCO和DFO分子。

为了附接VEGF₁₂₁靶向配体，将2.5nmol含叠氮化物的VEGF₁₂₁加入100μL DFO-DBCO-PEG-Cy5-C'点(5μM)的PBS溶液中。VEGF₁₂₁为约12kDa。通过改变反应比或使用的DFO-DBCO-PEG-Cy5-C'点的浓度，可以精确地调节每颗粒VEGF₁₂₁的数量。将混合物在室温(RT)下连续振摇24小时。通过GPC纯化去除游离VEGF₁₂₁配体。然后，将纯化的DFO-VEGF₁₂₁-PEG-Cy5-C'点免疫缀合物在PBS中混悬，以进行流式细胞术和⁸⁹Zr放射性标记研究。

可替代地，也可以通过用DFO和VEGF₁₂₁使预合成的胺化DBCO-PEG-Cy5-C'点官能化来合成DFO-VEGF₁₂₁-PEG-Cy5-C'点。

对于⁸⁹Zr标记，可以在37℃下将0.75nmol DFO-VEGF₁₂₁-PEG-Cy5-C'点与1mCi ⁸⁹Zr草酸盐的HEPES缓冲液溶液(pH 8)混合60分钟；最终标记pH保持为7-7.5。通过在37℃下培育混合物30-60分钟来引入EDTA攻击过程以去除任何非特异性结合的⁸⁹Zr。最终的⁸⁹Zr标记产率在70％到80％的范围内。所合成的⁸⁹Zr-DFO-VEGF₁₂₁-PEG-Cy5-C'点可以使用PD-10柱进行纯化。放射化学纯度据估计大于99％(通过使用放射性TLC)，比活性为～1000Ci/mmol。