阅读说明：本技术 一种pH敏感纳米载体及其在基因药物递送中的应用 (pH sensitive nano-carrier and application thereof in gene drug delivery ) 是由 赵秀丽 史梦浩 张九龙 于 2020-06-01 设计创作，主要内容包括：本发明涉及医药技术领域,具体涉及一种pH敏感纳米载体及其在基因药物递送系统中的应用。本发明提供一种pH敏感纳米载体,所述的pH敏感纳米载体为PEG-PHis-PSD三嵌段共聚物修饰在阳离子脂质体的表面,即所述的pH敏感纳米载体由阳离子脂质体与聚乙二醇-聚组氨酸-聚磺胺二甲氧嘧啶(PEG-PHis-PSD)三嵌段共聚物正负电荷吸附连接,在生理环境中(pH7.3～7.4),阳离子脂质体与聚乙二醇-聚组氨酸-聚磺胺二甲氧嘧啶(PEG-PHis-PSD)三嵌段共聚物正负电荷吸附,即得一种新型的pH敏感纳米载体。所述的PEG-PHis-PSD三嵌段共聚物结构如下：本发明的pH敏感纳米载体中,PEG增加其在血液中循环时间,PHis达到溶酶体逃逸功能,另外,由于pH敏感的PSD链的存在,其可以快速的在肿瘤部位释放基因药物。(The invention relates to the technical field of medicines, in particular to a pH sensitive nano-carrier and application thereof in a gene drug delivery system. The invention provides a pH sensitive nano-carrier, wherein the pH sensitive nano-carrier is a novel pH sensitive nano-carrier which is obtained by modifying a PEG-PHIS-PSD triblock copolymer on the surface of a cationic liposome, namely the pH sensitive nano-carrier is in adsorption connection with positive and negative charges of the polyethylene glycol-polyhistidine-polysulfonamide dimethoxypyrimidine (PEG-PHIS-PSD) triblock copolymer by the cationic liposome, and the positive and negative charges of the cationic liposome and the polyethylene glycol-polyhistidine-polysulfonamide dimethoxypyrimidine (PEG-PHIS-PSD) triblock copolymer are adsorbed in a physiological environment (pH 7.3-7.4). The PEG-PHIS-PSD triblock copolymer has the following structure: in the pH sensitive nano-carrier, PEG prolongs the circulation time of the pH sensitive nano-carrier in blood, PHIs achieves the escape function of lysosomes, and in addition, due to the existence of a pH sensitive PSD chain, the pH sensitive nano-carrier can quickly release gene drugs at tumor parts.)

一种pH敏感纳米载体及其在基因药物递送中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种pH敏感纳米载体及其在基因药物递送系统中的应用。

背景技术

恶性肿瘤已经成为导致世界范围人类死亡的首要疾病之一，成为严重威胁人类生存质量的世界性难题。基因治疗(gene therapy)具有高度安全性、高效性以及特异性等优势应用越来越广泛。但是siRNA的递送主要有以下几个障碍：首先，在生理环境下siRNA极不稳定，易被血清中的核糖核酸酶(ribonuclease,RNase)迅速降解。另外，siRNA是一个带负电的亲水大分子，而细胞膜表面的负电荷导致其细胞膜穿透能力极差。之后，siRNA进入靶细胞后需从溶酶体逃逸至胞浆中，避免进入溶酶体被吞噬降解，随后才能介导RNAi。因此，开发具有多功能递药系统来有效递送siRNA势在必行。

用于递送siRNA的多功能基因递送载体主要有脂质体、阳离子胶束和蛋白多肽类等，由于阳离子脂质体具有低毒，易修饰、良好的生物相容性、基因负载率高等特性被广泛应用。但是其稳定性差、转染效率低、肿瘤靶向性较差等缺点也一直限制阳离子脂质体的应用。因此通过对脂质体表面修饰具有一定功能的共聚物来提高基因递送系统的稳定性、转染效率和肿瘤靶向性。

大量文献报道肿瘤部位的生理环境与正常组织存在显著差别。其中包括弱酸性、高浓度还原物质谷胱甘肽(GSH)以及高水平活性氧(ROS)等。当纳米载体以内吞的形式进入内涵体或溶酶体时，pH值会进一步降低(pH 5.0-6.0)。因此根据肿瘤细胞低pH的特性，可以设计各种基于pH敏感的聚合物药物传输载体。

在众多pH敏感材料中，聚组氨酸(poly(histidine),PHis)由于具有高生物相容性、低毒性，尤其是溶酶体逃逸功能脱颖而出。组氨酸的咪唑环在生理环境下(pH 7.4)为疏水性，而当pH低于pKa时，由于其质子化变为亲水，实现“质子海绵效应”达到溶酶体逃逸作用，增加药物的胞内释放。

聚磺胺二甲氧嘧啶(poly(sulfadimethoxine),PSD)具有磺胺类化合物的普遍特性，显示弱酸性。在高pH环境中，由于磺酰基团(-SO₂NH-)中的氧原子具有较高的电负性，能够吸引硫原子的电子，从而吸引氮原子的电子，导致N-H键的电子云移向氮原子从而释放出质子。SD中的二甲氧嘧啶基团也是吸电子基团，这也促使氮原子更易释放出质子。所以当在正常生理pH条件下，PSD表面带有负电荷，当在溶酶体酸性环境下，PSD表面电荷会从负电荷转变为中性电荷，实现电荷反转。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的pH敏感纳米载体，以提高基因药物递送的稳定性，提高特异性以及快速释放基因药物的作用。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

本发明提供了PSD-PHis-PEG三嵌段共聚物，其结构式如下：

其中：n＝40～50。

本发明所述的PEG-PHis-PSD三嵌段共聚物，通过如下方法制备：

(1)聚磺胺二甲氧嘧啶(PSD)的合成：采用自由基引发溶剂聚合法，合成pH敏感聚合物聚磺胺二甲氧嘧啶(PSD)。

(2)聚磺胺二甲氧嘧啶(PSD)经NHS和DCC催化后与聚组氨酸(PHis)进行酰胺化反应得到产物聚磺胺二甲氧嘧啶-聚组氨酸(PSD-PHis)。

(3)一端羧基化的聚乙二醇(PEG)经过酰胺化反应与PSD-PHis进行连接，得终产物聚乙二醇-聚组氨酸-聚磺胺二甲氧嘧啶(PEG-PHis-PSD)。

PSD的合成：磺胺二甲氧嘧啶(SD)和NaOH溶于丙酮/水，缓慢滴加过量的甲基丙稀酰氯(MC)，甲醇/水纯化3-4h，过滤，真空干燥48h，即得SD酰化产物(SDM)。SDM溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，通入氮气，加入AIBN密封，迅速滴加巯基乙胺搅拌，70-80℃持续通氮气48h，水中陈化3-4h，过滤，真空干燥48h，即得PSD。

PHis-PSD的合成：Fmoc-NH-PHis-COOH、NHS和EDC溶于二甲基亚砜(DMSO)中，氮气保护下室温搅拌24h，加入PSD的DMSO溶液，氮气保护下室温搅拌48h，冰***沉淀，过滤，真空干燥得Fmoc-NH-PHis-PSD；除Fmoc保护：Fmoc-NH-PHis-PSD溶于二甲基亚砜(DMSO)中，加入二乙胺反应2-3h，旋蒸，加入冰***沉淀产物，过滤，真空干燥即得PHis-PSD粉末。

PEG-PHis-PSD的合成：PEG、NHS和EDC溶于二甲基亚砜(DMSO)中，氮气保护下室温搅拌24h，加入PHis-PSD的DMSO溶液，氮气保护室温搅拌48h，透析袋(MW 3500)透析48-72h，冻干即得PEG-PHis-PSD粉末。

本发明提供一种pH敏感纳米载体，所述的pH敏感纳米载体为PEG-PHis-PSD三嵌段共聚物修饰在阳离子脂质体的表面，即所述的pH敏感纳米载体由阳离子脂质体与聚乙二醇-聚组氨酸-聚磺胺二甲氧嘧啶(PEG-PHis-PSD)三嵌段共聚物正负电荷吸附连接，在生理环境中(pH7.3～7.4)，阳离子脂质体与聚乙二醇-聚组氨酸-聚磺胺二甲氧嘧啶(PEG-PHis-PSD)三嵌段共聚物正负电荷吸附，即得一种新型的pH敏感纳米载体。

所述的阳离子脂质体中至少含有(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(DOTAP)。

进一步地，所述的阳离子脂质体组成为：DOTAP与如下物质中的一种或几种的组合：大豆卵磷脂、胆固醇、蛋黄卵磷脂等。

优选为DOTAP、大豆卵磷脂、胆固醇的组合。

其中，DOTAP:大豆卵磷脂：胆固醇＝4～8:2～4:1。

所述的阳离子脂质体通过如下方法制备：DOTAP、大豆磷脂、胆固醇溶于氯仿和甲醇的混合溶剂，所述的氯仿和甲醇的混合溶剂中，氯仿：甲醇的体积比为3-4:1，减压旋转蒸发除去有机溶剂，形成干燥的脂质薄膜；加入水作为水相水化，超声处理后，0.22μm聚碳酸酯膜进行整粒，即得阳离子脂质体(L)。

进一步地，本发明提供了药物与pH敏感纳米载体通过静电作用结合获得的脂质纳米载体，所述的纳米脂质载体通过如下步骤制备：在生理环境中(pH7.3～7.4)，药物与带正电荷的阳离子脂质通过静电作用结合形成LR。之后，负电荷的PEG-PHis-PSD三嵌段共聚物与LR正负电荷吸附，即得一种新型的含药pH敏感脂质纳米载体(PHD/LR)。

所述的药物为基因药物，核酸类药物，选自：siRNA、miRNA、质粒DNA，所述核酸类药物带有负电荷，与带有正电荷的pH敏感纳米载体正负电荷吸附作用结合形成含药pH敏感脂质纳米载体。

基因药物与pH敏感纳米载体的重量比为：1～10：1。

脂质体的结构与正常的生物膜具有较高的相似度，这就决定了脂质体容易被体循环中的各种物质降解代谢从而减少其在体内的循环时间。为解决这一问题，本发明中聚乙二醇-聚组氨酸-聚磺胺二甲氧嘧啶(PEG-PHis-PSD)三嵌段共聚物达到长循环作用；制备的脂质体粒径较小(约150nm-200nm)，其可以通过EPR效应特异性富集于肿瘤组织从而体现靶向性；基因药物递送到肿瘤细胞内，被溶酶体吞噬，由于其表面的PHis的“质子海绵效应”达到溶酶体逃逸效果，将基因药物释放到细胞质中；同时，由于溶酶体偏酸性环境下，pH敏感性的PSD从负电荷变为中性电荷，从阳离子脂质体表面脱离，快速释放出基因药物，从而发挥治疗作用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1)本发明的含药pH敏感脂质纳米载体中，pH敏感纳米载体中的阳离子脂质与基因药物通过静电作用结合，提高了基因药物在pH敏感纳米载体中的包封率，制备方法简单易行，重现性好，稳定性高；

2)本发明中，制备的脂质体粒径较小(约150-200nm)，其可以通过EPR效应特异性富集于肿瘤组织从而具有靶向性；

3)本发明中，pH敏感三嵌段共聚物的PEG可以增加其在血液中循环时间，PHis快速的溶酶体逃逸功能，同时由于pH敏感的PSD链的存在，其可以快速的在肿瘤部位释放基因药物。

4)本发明中，与空白阳离子脂质体相比，通过静电吸附将PSD-PHis-PEG修饰在阳离子脂质体表面，增加制剂的稳定性，提高特异性以及增强靶向性。

附图说明

图1为本发明所述实例1的共聚物的¹HNMR图谱：

(A)聚磺胺二甲氧嘧啶(PSD)的¹HNMR图谱；(B)聚磺胺二甲氧嘧啶-聚组氨酸(PSD-PHis)的¹HNMR图谱；(C)聚磺胺二甲氧嘧啶-聚组氨酸-聚乙二醇(PSD-PHis-PEG)的¹HNMR图谱；

图2为本发明所述实例1的共聚物的FTIR图谱：

(A)聚磺胺二甲氧嘧啶(PSD)的FTIR图谱；(B)聚磺胺二甲氧嘧啶-聚组氨酸(PSD-PHis)的FTIR图谱；(C)聚磺胺二甲氧嘧啶-聚组氨酸-聚乙二醇(PSD-PHis-PEG)的FTIR图谱；

图3为本发明所述实例3的pH敏感PHD/LR的pH敏感性考察图。

图4为本发明所述实例4的pH敏感PHD/LR的透射电子显微镜图片。

图5为本发明所述实例4的pH敏感PHD/LR的原子力显微镜图片。

图6为本发明所述实例5的PHD/LR在不同pH模拟介质中的体外释放实验。

图7为本发明所述实例6的PHD/LR的体外肝素解络实验图片。

图8为本发明所述实例7的PHD/LR的体外血清稳定性实验图片。

图9为本发明所述实施例8的PHD/LR的体内抗肿瘤实验肿瘤体积变化图。

图10为本发明所述实施例8的PHD/LR的体内抗肿瘤实验小鼠体重变化图。

具体实施方式

通过以下实施例进一步对本发明进行阐述。这些实施例仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1

一种pH敏感三嵌段共聚物(PSD-PHis-PEG)的合成

PSD的合成：磺胺二甲氧嘧啶(SD)和NaOH溶于丙酮/水，缓慢滴加过量的甲基丙稀酰氯(MC)，甲醇/水纯化3-4h，过滤，真空干燥48h，即得SD酰化产物(SDM)。SDM溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，通入氮气，加入AIBN密封，迅速滴加巯基乙胺搅拌，70-80℃持续通氮气48h，水中陈化3-4h，过滤，真空干燥48h，即得PSD。

PHis-PSD的合成：Fmoc-NH-PHis-COOH、NHS和EDC溶于二甲基亚砜(DMSO)中，氮气保护下室温搅拌24h，加入PSD的DMSO溶液，氮气保护下室温搅拌48h，冰***沉淀，过滤，真空干燥得Fmoc-NH-PHis-PSD；除Fmoc保护：Fmoc-NH-PHis-PSD溶于二甲基亚砜(DMSO)中，加入二乙胺反应2-3h，旋蒸，加入冰***沉淀产物，过滤，真空干燥即得PHis-PSD粉末。

PEG-PHis-PSD的合成：PEG、NHS和EDC溶于二甲基亚砜(DMSO)中，氮气保护下室温搅拌24h，加入PHis-PSD的DMSO溶液，氮气保护室温搅拌48h，透析袋(MW 3500)透析48-72h，冻干即得PEG-PHis-PSD粉末。

其中，PEG的分子量为2000。

采用核磁共振光谱法(¹H NMR)测定各个反应产物的结构，分别取适量聚合物粉末溶解于氘代试剂中，采用核磁共振仪进行样品结构的确证，结果如图1所示。聚磺胺二甲氧嘧啶(PSD)的二甲氧嘧啶基团中的甲氧基化学位移为3.72ppm(-OCH₃)，PSD中的酰胺基的化学位移为10.17ppm(-NH-CO-)。而聚组氨酸上的羧基质子峰位于13ppm，在聚磺胺二甲氧嘧啶-聚组氨酸(PSD-PHis)中出现了以上两种化合物的特征峰，而没有出现羧基质子峰，证明PHis和PSD成功连接。PEG-PHis-PSD的核磁共振氢谱中出现PEG的甲氧基的质子峰在3.21ppm(-O-CH₃)和-CH₂-CH₂-O-基团的化学位移在2.88ppm，这些特征峰的出现证明PEG-PHis-PSD共聚物的成功合成。

采用红外光谱法(FTIR)测定各个反应产物的结构官能团，分别取适量的产物与溴化钾粉末研磨打片进行测试，结果如图2所示。3386cm^-1的单峰为PSD特征吸收峰；1635和1591cm^-1为聚组氨酸羧酸伸缩振动的特征吸收峰；1755cm^-1为PEG中羧酸吸收峰，2889cm^-1为PEG中的-CH₂-基团的特征吸收峰。在PSD-PHis红外光谱中，出现了PSD和PHis特征峰，没有出现1635cm^-1羧酸基团的吸收峰，证明PSD和PHis的成功连接。三嵌段共聚物PEG-PHis-PSD的红外光谱中出现PEG的特征峰，这证明PEG-PHis-PSD共聚物的成功合成。

实施例2

一种新型的pH敏感纳米载体的制备

DOTAP、大豆磷脂、胆固醇溶于一定比例的氯仿和甲醇(3:1,v/v)，减压旋转蒸发除去有机溶剂，形成干燥的脂质薄膜；加入水进行水化，超声处理后，0.22μm聚碳酸酯膜进行整粒，即得空白阳离子脂质体(L)。在生理环境中(pH＝7.4)，siRNA与带正电荷的阳离子脂质体通过静电作用结合形成LR。之后，负电荷的PSD-PHis-PEG与LR正负电荷吸附，即得一种新型含药pH敏感脂质纳米载体(PHD/LR)。

实施例3

一种含药pH敏感纳米载体的pH敏感性考察

在生理情况下，带有负电荷的PSD-PHis-PEG会掩盖阳离子脂质体表面的正电荷，因此本发明通过测定PHD/LR的zeta电位的变化来证明该载体的pH敏感性，具体操作如下：采用动态光衍射法(DLS)测定制剂在pH 5.0和pH 7.4的DEPC水中的Zeta电位，37℃，100rpm孵育，在不同时间点取样测定Zeta电位。结果如图3所示。PHD/LR制剂在5min时Zeta电位迅速变大，10min后，PHD/LR制剂的电位和LR制剂的电位几乎一致，说明PHD/LR制剂在pH为5.0条件下，修饰的共聚物可以迅速从LR上面解离使Zeta电位增加。这说明PHD/LR具有明显的pH敏感性。

实施例4

PHD/LR的形态观察

通过透射电子显微镜和原子力显微镜测定实施例中制备的PHD/LR的粒径和形状。结果如图4和图5所示，PHD/LR呈现球形和类球形，分布比较均一，粒径在150nm-200nm之间。

实施例5

PHD/LR在不同pH模拟介质中的体外释放实验

以pH5.0和7.4的DEPC水介质中，考察PHD/LR在不同pH模拟介质中的体外释放实验。将实施例2制备的PHD/LR放入超滤管中，离心去除游离的FAM siRNA，将超滤管中的样品转移至pH为5.0和7.4的DEPC水中，恒温37℃下摇床振荡，定时将释放介质全部取出至于超滤离心管中，离心后回收滤液。将超滤管中的样品继续转移至释放介质内，重复操作。通过标准曲线计算含量并绘制释放曲线。按公式计算累计释放百分比。

累积释放百分比＝累积释放量/PLK1-siRNA总量×100％

结果如图6所示。在pH 7.4时，72h后约有45％的FAM siRNA释放出来，而在pH 5.0时，约有80％的药物从PHD/LR中释放出来，证明PHD/LR具有pH敏感性，此结果与pH敏感性考察实验的结果一致。

实施例6

PHD/LR的肝素解络实验

取实施例2中制备的PHD/LR制剂，按不同的肝素钠/siRNA质量比(IU/μg)加入肝素钠，加入质量分数为50％的蔗糖溶液，取适量样品进行琼脂糖凝胶电泳实验，采用透射光观察成像并拍照。结果如图7所示。当LR的肝素:siRNA(IU/μg)为6时，可显现出siRNA条带，当PHD/LR组在比例为8时，才出现siRNA条带，说明包裹PHD的制剂具有更好的抵御肝素的能力。

实施例7

PHD/LR的血清稳定性实验

取实施例2制备的PHD/LR，与FBS混合后分别在不同时间点取适量样品，-20℃保存。按肝素/siRNA质量比(IU/μg)为10加入肝素后加入质量分数为50％的蔗糖溶液，取适量样品进行琼脂糖凝胶电泳实验，采用透射光观察成像并拍照。结果如图8所示。游离siRNA在血清中1h即开始降解，3h已基本完全降解。LR制剂明显增强siRNA在血清中的稳定性，10h后才会基本全部降解。PHD/LR包裹的PHD/LR制剂在24h时才开始出现微弱的siRNA条带，表明PHD/LR在血清中的保护效果更加明显。

实施例8

pH敏感纳米载体的抗肿瘤实验

将A549细胞悬液接种于雄性裸鼠的腋窝下，待肿瘤生长至100-120mm³时分组，每组6只，共随机分为3组(空白对照组，LR组和PHD/LR组)并给予不同的药物治疗。每组按照1mg/kg siRNA的剂量尾静脉注射给药，每2天一次，共给药4次，记录肿瘤的体积和小鼠的体重。空白对照组给予相同体积的生理盐水。

肿瘤体积变化如图9所示，相比于对照组，两个制剂组均表现出明显的抗肿瘤性活性，肿瘤体积生长速度明显低于对照组，说明纳米制剂其较小粒径(<200nm)可以通过EPR效应富集于肿瘤组织。相比于LR组，PHD/LR组具有更明显的抗肿瘤活性，证明pH敏感三嵌段共聚物的加入可以增加siRNA在细胞质中的蓄积，从而发挥抗肿瘤活性。

体重变化的结果如图10所示，各个组别的裸鼠体重均无明显的变化，说明将pH敏感纳米载体无明显的体内毒性。