具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的现有技术所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂以及其他仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品或仪器。

在现有的物理方法诱导小鼠角膜新生血管模型通常包括角膜缝线模型中，热度烧伤模型灼伤力度难以控制，力度过大而容易致角膜穿孔，形成瘢痕导致造模失败；化学烧伤模型同样难以控制，通常引起较强免疫反应，干扰因素多，不利于单纯研究角膜新生血管或角膜淋巴管。

在角膜缝线模型中，其基质内缝线埋入，会引起角膜缝线部位局部水肿，炎症细胞侵入；再者，角膜缝线还会导致角膜上皮、基底细胞损伤，进而导致炎症反应。而炎症反应时，一方面，炎症反应中，炎细胞会分泌促血管生长的细胞因子，促进血管生成；另一方面，角膜损伤造成的角膜微环境缺氧也会促进VEGF等促血管生成细胞因子的表达，从而促进血管生成。然而，角膜缝线模型的缝线成功与否，受术者技巧影响较大，大鼠、小鼠角膜厚度较薄面积较小，单纯缝线造模难度大，容易导致角膜穿孔，若缝线稍浅则容易脱线致使模型失败。

并且，目前缺乏可靠的角膜淋巴管生成模型，而随着近期国际研究前沿对淋巴管和免疫调控之间的研究日益增多，本技术领域急需一种可靠的大、小鼠角膜淋巴管生成模型。

为解决上述技术问题，本发明的发明人提出的技术构思主要包括：结合角膜缝线的优势，采用角膜上皮机械刮除联合生物胶黏合角膜缝线于角膜基质的方式，构建角膜新生血管/淋巴管生成损伤模型。采用这样的方法构建模型，既解决了角膜缝线模型应用在小型啮齿类动物时造模难度大效率问题，又避免了角膜穿孔、缝线脱落等造模失败常见原因，还保留了角膜缝线新生血管生长比较规则、避免化学诱导方法中化学试剂影响、损伤方式单一可控等优点。基于该技术构思，本发明实施例提供了一种角膜新生血管/淋巴管生成损伤模型及其构建方法和应用。具体实施内容如下：

第一方面，本发明实施例提供了一种角膜新生血管/淋巴管生成损伤模型。该角膜新生血管/淋巴管生成损伤模型是指：采用角膜上皮机械刮除联合生物胶黏合角膜缝线于角膜基质的方式，构建得到的小鼠/大鼠角膜新生血管/淋巴管生成损伤模型。

由于啮齿类动物小鼠/大鼠的眼睛比较小，操作困难，所以现有的大眼式动物模型(例如兔子模型)不能顺利实施，即现有的大眼式动物模型其在实际应用过程中的有效性较低。而本实施例提供的角膜新生血管/淋巴管生成损伤模型，是一种新型小鼠/大鼠角膜新生血管/淋巴管生成损伤模型，因此，可以利用本实施例提供的角膜新生血管/淋巴管生成损伤模型提高小鼠/大鼠模型构建的成功率。

为了避免损伤到角膜缘干细胞以及更好地实现模型的可控性和可靠性，本实施例中，优选的机械刮除范围为2～2.5mm。即，本实施例中，角膜上皮机械刮除为角膜中央直径2～2.5mm进行角膜上皮机械刮除。并且，其中的角膜上皮机械刮除为：利用角膜刮刀在角膜上皮层机械刮除或刮至浅基质层。

本实施例中，采用角膜上皮机械刮除的具体原因如下：

角膜上皮机械机械刮除模型是最接近生理性修复过程的模型，具有的特点包括：1、损伤修复速度较快；2、模型简易、可靠、易重复；3、引起炎症反应较弱；4、属于完全生理性修复，修复后无瘢痕。本实施例中，选择此模型作为模型的基础，其主要目的是：想暴露角膜前基质层，并将缝线线结牢固的固定于基质层(在此，需要指出的是，如果角膜上皮层细胞连接不够紧密，则易受外力连同线结造成细胞脱落，因而，本实施例中选择将缝线线结牢固的固定于结构紧密的角膜基质层)。

基于上述原因，本实施例提供的新型模型(即角膜新生血管/淋巴管生成损伤模型)，正是利用了角膜上皮机械机械刮除模型具有的简单可操作性强，又不引起其他如碱烧伤模型等复杂的免疫应答，最大效能的保障并发挥此新型模型的异物刺激作用，使此模型成为一种简易稳定可靠重复率高的小鼠/大鼠角膜新生血管/淋巴管生成损伤模型。

本实施例中，生物胶黏合角膜缝线于角膜基质，具体地是指：采用生物组织粘合剂，将角膜缝线固定于角膜基质表面。

本实施例中，优选的生物组织粘合剂为氰基丙烯酸盐粘合剂或人纤维蛋白组织胶。

本实施例中，由于构建的是损伤模型，因而需要使用不可吸收缝线；再者，由于是对小鼠/大鼠进行角膜损伤，因而需要使用较细的不可吸收缝线。基于此，本实施例优选的角膜缝线为10-0不可吸收缝线或11-0不可吸收缝线。

在此，发明人需要指出的是：本实施例提供的模型，针对现有的传统缝线模型中存在的技术问题的进一步改进，提供了不同于传统缝线模型构建方法的新型构建方法，以实现既解决现有缝线模型中存在的技术问题，又避免了热烧伤模型和化学烧伤模型中存在的技术问题。

并且，本实施例提供的模型，属于损伤模型类。具体是指：模拟临床疾病，对正常的眼角膜进行损伤，形成了一定的病理生理改变，从而构建得到的一种模型。

此外，本发明实施例提供的角膜新生血管/淋巴管生成损伤模型，还具有以下优点：

A、本发明实施例提供的角膜新生血管/淋巴管生成损伤模型，是采用角膜上皮机械刮除联合生物胶黏合角膜缝线于角膜基质的方式，构建得到的，因而，其构建方法具有简便、高效、容易实施等优点，适用于啮齿类和哺乳类等多种类实验动物。

B、本发明实施例提供的角膜新生血管/淋巴管生成损伤模型，可以通过调节不可吸收缝线的长度和范围(即缝线的长度和首尾相连后成圈的面积)，来控制损伤的程度(即：长入角膜中异物的长度和面积)，因而本发明实施例提供的角膜新生血管/淋巴管生成损伤模型，具有可控性。

C、本发明实施例提供的角膜新生血管/淋巴管生成损伤模型，在通过调节不可吸收缝线的长度和范围，控制每次损伤的深度和面积的基础上，结合小鼠/大鼠角膜的自生长过程，保证了模型的高成功率，并且，还避免了人为操作导致每次老鼠损伤的差异性，因而本发明实施例提供的角膜新生血管/淋巴管生成损伤模型，具有稳定性(即有效性)。

综上，本发明实施例提供的角膜新生血管/淋巴管生成损伤模型，结合角膜缝线的优势，采用角膜上皮机械刮除联合生物胶黏合角膜缝线于角膜基质的方式，既解决了角膜缝线模型应用在小型啮齿类动物时造模难度大效率低的问题，又避免了角膜穿孔、缝线脱落等造模失败常见原因，还保留了角膜缝线新生血管生长比较规则、避免化学诱导方法中化学试剂影响、损伤方式单一可控等优点。该模型，能够简便、有效、可控的作为小鼠、大鼠角膜新生血管或淋巴管生成的一种新型有效模型。

第二方面，本发明实施例提供了一种上述第一方面所述角膜新生血管/淋巴管生成损伤模型的构建方法。如图1所示，该构建方法包括：

步骤1(S1)，对小鼠/大鼠进行全身麻醉后，再进行角膜局部浸润麻醉。

在本实施例的步骤1中，进行全身麻醉所用的麻醉剂为由3.3％三溴乙醇与叔戊醇按照1g：1ml混合而成的混合液；进行局部浸润麻醉所用的麻醉剂为奥布卡因滴眼液。

本实施步骤中，麻药的种类选择和配比，是基于有效性和安全性，以最大程度上适合此模型的种类、配比及剂量，来进行全身麻醉的。其中，有效性是指：剂量完全适合此模型的造模时长，在有效时间内保持实验动物的深麻醉状态，便于操作进行。安全性是指：剂量控制在造模完成后约10min内实验动物开始复苏，复苏过程较快，因麻醉造成的死亡率极低。

步骤2(S2)，对局麻后的小鼠/大鼠进行散瞳，并确定局麻后的小鼠/大鼠的瞳孔完全散开。

当瞳孔完全散开后，执行下述的步骤3。

步骤3(S3)，在角膜中央直径为2～2.5mm的规则圆形内，利用角膜刮刀在进行角膜上皮机械刮除。

在本实施例的步骤3中，角膜上皮机械刮除为角膜上皮层机械刮除或刮至浅基质层。机械刮除操作完毕后，执行下述步骤4。

步骤4(S3)，采用不可吸收缝线对机械刮除后的角膜进行缝线造模，并采用生物组织粘合剂将首尾打结后的不可吸收缝线固定于角膜基质表面。

在本实施例的步骤4中，不可吸收缝线为10-0不可吸收缝线或11-0不可吸收缝线；生物组织粘合剂为氰基丙烯酸盐粘合剂或人纤维蛋白组织胶。

步骤5(S5)，待生物组织粘合剂凝固后，在结膜囊内涂抗生素凝胶，然后缝合小鼠/大鼠眼睑2～3针。

在本实施例的步骤5中，缝合小鼠/大鼠眼睑所采用缝线为6-0不可吸收缝线。

具体实施时，待生物组织粘合剂凝固后，在结膜囊内涂抗生素凝胶，然后再对每只眼利用6-0的不可吸收线不连续缝合实验动物小鼠眼睑2-3针。

在本实施步骤中，对实验动物小鼠眼睑进行缝合，是为了防止动物抓挠角膜造成二次损伤或使粘合的线结脱落；而在缝眼睑之前，涂抗生素凝胶，是为了保持结膜囊内抗生素凝胶持续发挥保湿抑菌的作用。

本实施步骤中，抗生素凝胶可以为加替沙星凝胶。

步骤6(S6)，在眼睑外涂抹抗生素软膏。

具体实施时，在缝合后的眼睑周围继续涂抹抗生素软膏，以达到局部抑菌，防止角膜炎发生或眼睑伤口感染等情况。

本实施步骤中，抗生素软膏可以为金霉素眼膏或妥布霉素眼膏。

步骤7(S7)，基于角模上皮修复增殖移行方式，角膜上皮重新长出并覆盖不可吸收缝线。

步骤8(S8)，角膜新生血管/淋巴管突破角膜缘栅栏结构，角膜缘以内的区域长出规则的角膜新生血管/淋巴管，即得上述第一方面所述的角膜新生血管/淋巴管生成损伤模型。

本实施例提供的构建方法，即解决了现有造模技术中造模难度大效率低的问题，又避免了角膜穿孔、缝线脱落等造模失败常见原因，还保留了角膜缝线新生血管生长比较规则、避免化学诱导方法中化学试剂影响、损伤方式单一可控等优点。并且，通过本实施例提供的构建方法，能够简便、有效、可控地构建出作为小鼠/大鼠角膜新生血管/淋巴管生成的新型有效模型，与临床疾病特征相一致。

第三方面，本发明实施例提供了一种角膜新生血管/淋巴管生成损伤模型的应用，即，将上述第一方面所述的角膜新生血管/淋巴管生成损伤模型，应用于研究药物对角膜新生血管或角膜淋巴管的抑制作用；或

将上述第一方面所述的角膜新生血管/淋巴管生成损伤模型，应用于研究某分子及其相关信号通路在角膜新生血管或角膜淋巴管的作用。

第四方面，本发明实施例还提供了一种角膜新生血管/淋巴管生成损伤模型的应用，即，将上述第一方面所述的角膜新生血管/淋巴管生成损伤模型，应用于研究角膜炎症反应及相关免疫机制；或

将上述第一方面所述的角膜新生血管/淋巴管生成损伤模型，应用于进行角膜新生血管和淋巴管在生成阶段和消散阶段相互作用、相互影响的研究；或

将上述第一方面所述的角膜新生血管/淋巴管生成损伤模型，应用于进行抑制新生血管或淋巴管的药物研究。

为使本领域技术人员更好地理解本发明，以下通过多个具体的实施例来说明本发明提供的角膜新生血管/淋巴管生成损伤模型的构建方法。

实施例1

所需动物：C57成年小鼠

仪器设备：体式显微镜，显微手术器械，角膜上皮机械刮除器，奥布卡因麻醉剂，生物组织粘合剂，10-0不可吸收缝线

操作流程：

步骤1(S1)，对C57成年小鼠进行全身麻醉后，再进行角膜局部浸润麻醉。

具体实施时，配置3.3％三溴乙醇和叔戊醇混合液(1g：1ml)，按照0.024ml/g体重进行腹腔麻醉。C57成年小鼠腹腔注射可以用1ml的注射器，配合4号针头。腹腔注射时右手持注射器，左手的小指和无名指抓住C57成年小鼠的尾巴，另外三个手指抓住C57成年小鼠的颈部，使C57成年小鼠的头部向下。这样腹腔中的器官就会自然倒向胸部，防止注射器刺入时损伤大肠、小肠等器官。进针的动作要轻柔，防止刺伤腹部器官。腹腔注射时针头可以在腹部皮下穿行一小段距离，最好是从腹部一侧进针，穿过腹中线后在腹部的另一侧进入腹腔，注射完药物后，缓缓拔出针头，并轻微旋转针头，防止漏液。

在腹腔注射麻药5min后，完成动物全身麻醉，并确认C57成年小鼠麻醉状态后，利用奥布卡因滴眼液进行角膜局部表面浸润麻醉，每只眼约1滴麻药，局部麻醉时长约2min。

步骤2(S2)，对局麻后的C57成年小鼠进行散瞳，并确定局麻后的C57成年小鼠的瞳孔完全散开。

具体实施时，利用复方托吡卡胺滴眼液进行散瞳5min，在体式显微镜下观察在光照下瞳孔完全散开后进行下一步试验。

步骤3(S3)，在角膜中央直径为2～2.5mm的规则圆形内，进行角膜上皮机械刮除。

具体实施时，在体式显微镜下进行角膜中央直径约2mm进行角膜上皮层机械刮除。具体的机械刮除操作为：用直径2mm的环形标记器以角膜为中心，压迹划痕，然后用角膜上皮刀沿着划痕去除角膜上皮，并将直径扩大为2.5mm的规则圆形，使其边缘光滑，操作由外向内，边刮上皮边用吸水棉签轻轻擦除残留的上皮碎片。

步骤4(S3)，采用不可吸收缝线对机械刮除后的角膜进行缝线造模，并采用生物组织粘合剂将首尾打结后的不可吸收缝线固定于角膜基质表面。

具体实施时，利用经美国食品药物管理局FDA认证过的生物组织粘合剂(本实施例选用的生物组织粘合剂为氰基丙烯酸盐粘合剂)喷取合适剂量后将首尾打结成圈状后的10-0不可吸收缝线固定于角膜基质表面。

步骤5(S5)，待生物组织粘合剂凝固后，在结膜囊内涂抗生素凝胶，然后缝合C57成年小鼠眼睑2针。

具体实施时，待生物组织粘合剂凝固后，在结膜囊内涂抗生素凝胶(本实施步骤中，选用加替沙星凝胶)，然后再对每只眼利用6-0的不可吸收线不连续缝合C57成年小鼠眼睑2针，以保持角膜表面湿润的同时，防止动物抓挠角膜造成二次损伤或使粘合的线结脱落。

步骤6(S6)，在眼睑外涂抹抗生素软膏。

具体实施时，术后为预防感染，在结膜囊内涂抗生素软膏(本实施步骤中，选用金霉素眼膏)，在眼睑外眼表滴抗生素眼液。

步骤7(S7)，基于角膜上皮细胞增殖移行方式，角膜上皮重新长出并覆盖不可吸收缝线。

具体实施时，约24h后角膜上皮将通过增殖移行的方式重新长出并覆盖在损伤处，将异物缝线覆盖在内经生物组织粘合剂固定在角膜基质的缝线。

角膜上皮细胞自我更新修复速度很快，单纯的机械刮除损伤一般在损伤后48h内重新覆盖完毕。可通过荧光素染色，裂隙灯钴蓝光下拍照验证。

上皮愈合只是一个自我修复的阶段，并不是损伤模型的核心。上皮愈合可以确保缝线生长进入角膜中，不会轻易掉落。若上皮无法如期愈合，角膜局部炎症加重，线结将作为异物刺激因素持续刺激角膜，将大量持续的新生血管和淋巴管突破角膜缘长入角膜中，使模型的效果更好。

步骤8(S8)，角膜缘以内的区域长出规则的角膜新生血管/淋巴管，即得上述第一方面所述的角膜新生血管/淋巴管生成损伤模型。

具体实施时，约72h后角膜缘以内的区域开始上长出规则的角膜新生血管和淋巴管。

角膜新生血管可通过裂隙灯直接观察。

角膜新生血管和角膜淋巴管还可通过角膜铺片免疫荧光染色观察：正常角膜仅在角膜缘处见CD31(角膜血管标记物)阳性血管网呈襟状分布，和少量LYVE-1(淋巴管内皮标记物)阳性淋巴管以膨大的盲端出现于角膜缘，中央角膜区域无任何角膜血管和角膜淋巴管的分布。

图2示出了本发明实施例1构建的角膜新生血管/淋巴管生成损伤模型在缝线术后14d的裂隙灯下新生血管图，图2中，从左到右依次为14d时裂隙灯下拍摄前节像，14d新生血管像和14d裂隙灯钴蓝灯下荧光素染色像；图3示出了本发明实施例1构建的角膜新生血管/淋巴管生成损伤模型在缝线术后14d的淋巴管(LYVE1)免疫荧光染色图；图4示出了本发明实施例1构建的角膜新生血管/淋巴管生成损伤模型的模型损伤过程中的图。图4中，从左到右分别为角膜上皮机械刮除露出前基质层的图，生物胶粘合打结缝线后的图，造模后即刻裂隙灯钴蓝灯下荧光素染色像图。

如图2—4所示，新型缝线术(即上述步骤3-5所示的缝线术)后14d，角膜血管和淋巴管处于旺盛的生长期，裂隙灯前节像可见大量血管呈树枝状垂直角膜缘方向长入角膜，末端尖锐毛刺状，仅少数血管可见尖端吻合。LYVE-1阳性淋巴管伴随血管呈火焰状伸入角膜中央，以盲端结束，管腔较血管粗且粗细不均，形态更加不规则，部分区域可见管腔扭曲，角膜基质内可见散在的LYVE-1弱阳性树枝状细胞。

通过上述的造模过程可知，本实施例提供的模型造模过程较为便捷，造模的范围和程度均可控，并且，根据14d的裂隙灯图说明了缝线与角膜上皮-基质层结合良好，角膜上皮已愈合，模型创建成功。

同时，根据图2-图4可知，14d时，大量新生血管和角膜淋巴管呈树枝状垂直角膜缘方向突破角膜缘向角膜中央延伸，长入角膜，末端尖锐毛刺状，仅少数血管可见尖端吻合；并且，LYVE-1阳性淋巴管伴随血管呈火焰状伸入角膜中央，以盲端结束，管腔较血管粗且粗细不均，形态更加不规则，部分区域可见管腔扭曲。由此可知，通过本实施方式构建的模型效果较为理想。。

实施例2

本实施例的构建方法，与实施例1的构建方法相似，不同之处具体如下：

在步骤1中，在腹腔注射麻药3min后，完成动物全身麻醉。

在步骤2中，散瞳时间为3min，在3min后即可在体式显微镜下观察在光照下瞳孔完全散开。

在步骤3中，角膜机械刮除时，是刮至浅基质层；具体的机械刮除操作为：用酒精辅助利用2mm的标记环置角膜正中压痕，环内注入20％乙醇30ul，30s后用干的吸血海绵吸除剩余乙醇，立即用平衡液或生理盐水冲洗角膜上皮，用角膜上皮刀机械刮除直径为2.5mm的规则圆形的角膜上皮，暴露出浅层基质。

在步骤4中，本实施例选用的生物组织粘合剂为人纤维蛋白组织胶，选用的不可吸收缝线为11-0不可吸收缝线。

在步骤5中，缝合C57成年小鼠眼睑时，缝合的是3针。

在步骤6中，在眼睑外眼表，选用妥布霉素眼膏进行涂抹。

在步骤7中，约48h后角膜上皮将通过增殖移行的方式重新长出并覆盖在损伤处。

采用本实施例提供的构建方法，得到的角膜新生血管/淋巴管生成损伤模型，与实施例1中得到的角膜新生血管/淋巴管生成损伤模型相同。

实施例3

本实施例的构建方法，与实施例1的构建方法相似，不同之处具体如下：

本实施例中选用的是SD成年大鼠，构建的是大鼠角膜新生血管/淋巴管生成损伤模型。

本实施例构建的大鼠角膜新生血管/淋巴管生成损伤模型，其在缝线术后14d的裂隙灯下新生血管图、在缝线术后14d的淋巴管(LYVE1)免疫荧光染色图以及模型损伤过程中的图，与实施例1中的示出的图相同，在本实施例中的不再重复给出。

实施例4

本实施例的构建方法，与实施例3的构建方法相似，不同之处具体如下：

在步骤1中，在腹腔注射麻药3min后，完成动物全身麻醉。

在步骤2中，散瞳时间为3min，在3min后即可在体式显微镜下观察在光照下瞳孔完全散开。

在步骤3中，角膜机械刮除时，是刮至浅基质层；具体的机械刮除操作为：用酒精辅助利用2mm的标记环置角膜正中压痕，环内注入20％乙醇30ul，30s后用干的吸血海绵吸除剩余乙醇，立即用平衡液或生理盐水冲洗角膜上皮，用角膜上皮刀机械刮除直径为2.5mm的规则圆形的角膜上皮，暴露出浅层基质。

在步骤4中，本实施例选用的生物组织粘合剂为人纤维蛋白组织胶，选用的不可吸收缝线为11-0不可吸收缝线。

在步骤5中，缝合C57成年小鼠眼睑时，缝合的是3针。

在步骤6中，在眼睑外眼表，涂抹的是抗生素眼用凝胶眼膏。

在步骤7中，约36h后角膜上皮将通过增殖移行的方式重新长出并覆盖在损伤处。

需要指出的是，本申请的各个实施例中的步骤和方法，不仅限于对应的实施例中，各个实施例的操作细节以及注意事项，互相都是相应的。各物质的取值范围和各参数的取值范围仅是本发明的优选方案，本发明对取值并不做限定，凡是适用于本发明的取值范围均可行。

对于方法实施例，为了简单描述，故将其都表述为一系列的动作组合，但是本领域技术人员应该知悉，本发明并不受所描述的动作顺序的限制，因为依据本发明，某些步骤可以采用其他顺序或者同时进行。其次，本领域技术人员也应该知悉，说明书中所描述的实施例均属于优选实施例，所涉及的动作和部件并不一定是本发明所必须的。

以上对本发明所提供的一种角膜新生血管/淋巴管生成损伤模型及其构建方法和应用进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。