阅读说明：本技术 3-氰基非那烯酮类化合物及其应用 (3-cyano phenalenone compound and application thereof ) 是由 张志超 王紫千 于 2020-04-16 设计创作，主要内容包括：3-氰基非那烯酮类化合物及其应用,其属于荧光标记的技术领域。本发明采用多种手段检测了3-氰基非那烯酮类化合物与PKM2的结合能力,该类化合物可以有效的共价结合PKM2蛋白。并通过凝胶荧光成像、活细胞荧光成像实验检测了它们在体外和活细胞(包括肿瘤细胞和正常组织细胞)内特异性荧光标记PKM2蛋白的能力。表明该类化合物可以有效的在体外和活细胞内与PKM2发生亲核取代反应,并生成具有橙红色荧光的结构,实现对于PKM2的特异性荧光标记。肿瘤细胞和正常细胞的活细胞荧光成像实验进一步表明该类化合物能够特异性的对肿瘤细胞进行荧光染色,而不对正常细胞进行荧光染色,实现对于肿瘤细胞、组织的荧光可视化和肿瘤细胞、组织的分子影像学诊断。(3-cyano phenalenone compounds and application thereof, which belong to the technical field of fluorescent labeling. The invention adopts a plurality of means to detect the binding capacity of the 3-cyano phenalenone compound and the PKM2, and the compound can be effectively and covalently bound with the PKM2 protein. And the gel fluorescence imaging and living cell fluorescence imaging experiments are used for detecting the capability of the protein of PKM2 of specific fluorescence labeling in vitro and in living cells (including tumor cells and normal tissue cells). The compounds can effectively perform nucleophilic substitution reaction with PKM2 in vitro and in living cells, generate an orange-red fluorescent structure, and realize specific fluorescent labeling on PKM 2. The living cell fluorescence imaging experiment of the tumor cells and the normal cells further shows that the compounds can specifically carry out fluorescence staining on the tumor cells, but not on the normal cells, thereby realizing the fluorescence visualization of the tumor cells and tissues and the molecular imaging diagnosis of the tumor cells and tissues.)

3-氰基非那烯酮类化合物及其应用

技术领域

本发明涉及一类3-氰基非那烯酮类化合物，特别涉及6-苯琉基-3-氰基非那烯酮类及其衍生物。具体涉及这些化合物在体外、活细胞内和活体内的对M2型丙酮酸激酶(PKM2)进行特异性荧光标记的应用；以及这些化合物作为分子诊断探针实现肿瘤细胞可视化的应用。

背景技术

分子影像学即对活体状态下的生物过程应用影像学的相关方法进行活体、组织、细胞甚至分子水平的定性与定量研究，在肿瘤的早期影像诊断，细胞信号，疾病机制研究，药物研发，药物传递，药效评价等方面有着广泛的应用。其中，荧光分析法具有灵敏度高、选择性好、动态响应范围宽以及测定条件更接近生命体的生理环境等优点，在分子影像学分析中得到了广泛应用。其中，利用化学小分子探针对与特定疾病的发生、发展、治疗高度相关的蛋白质，即疾病的分子标志物，进行特异性荧光标记，可以实现在细胞、组织、活体水平上实现对肿瘤标志物蛋白的含量、活性、组织分布的荧光可视化,帮助了解相关疾病的组织发生、细胞分化、细胞功能，为肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗指导。

肌肉型丙酮酸激酶(PKM)是调节糖酵解最后一步反应的关键酶，催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和ADP反应生成丙酮酸和ATP。PKM又分为两个亚型，分别是M1型丙酮酸激酶(PKM1)和M2型丙酮酸激酶(PKM2)。PKM1和PKM2在不同细胞中的表达量有很大差异：PKM1主要在肌肉和脑这些对能量需求旺盛的分化终末细胞中表达；PKM2则主要在胚胎细胞、干细胞和肿瘤细胞这些对合成代谢需求强的细胞中表达，通过调节瓦伯格而在肿瘤细胞的生长过程中发挥至关重要的作用。因此，PKM2是多种肿瘤细胞的分子标志物，即细胞、组织中PKM2的含量可以提示该细胞、组织是否具备肿瘤的性质。通过检测细胞、组织中PKM2的含量，我们可以了解肿瘤的组织发生、细胞分化、细胞功能，实现对肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗指导。

因此，设计开发针对PKM2蛋白的小分子荧光标记探针，可以应用于在细胞、组织、活体水平上对于肿瘤分子标志物PKM2蛋白的特异性荧光标记和荧光可视化，可以实现肿瘤细胞的荧光可视化检测和肿瘤细胞、组织的分子影像学诊断、分类和预后判断，对肿瘤的治疗实现指导，对实现肿瘤的精准诊疗具有重要意义。

发明内容

本发明旨在获得以下一类分子：在体外、活细胞内和活体内的对M2型丙酮酸激酶(PKM2)进行特异性荧光标记小分子荧光探针；对PKM2家族蛋白的表达水平、时空分布等生物信息进行检测的功能分子；对肿瘤细胞进行荧光可视化检测和肿瘤分子影像学诊断的功能分子。

本发明一方面提供一种3-氰基非那烯酮类化合物，具有通式I的结构：

其中：

R₁选自C_1-4烯基、C_1-4炔基、F、C₂F₅、CF₃、NO₂、CN、CHO、COOH、SO₃H、COR₃、COOR₃、CONHR₃、SO₃R₃、SO₂NHR₃；

R₂选自哌啶基、哌啶酮基、哌啶二酮基、吡咯烷基、吡咯烷酮基、吡咯烷二酮基或-XR₄；

R₃选自取代或未取代的C_1-4烷基、C_1-4烯基、C_1-4炔基，所述的取代是由下述基团任意取代：OH、I、Br、Cl、F、NO₂、NHCH₃、N(CH₃)₂、CN、CF₃；

R₄选自取代或非取代的苯基、萘基、噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、哒嗪基、吡嗪基、嘧啶基、吲哚基、苯并噻吩基、苯并吲哚基、苯并呋喃基、喹啉基、异喹啉基或嘌呤基，其中所述的取代是由下述基团任意取代：C_1-4烷基、C_1-4烯基、C_1-4炔基、苯基、OH、I、Br、Cl、F、NO₂、NHCH₃、N(CH₃)₂、CN、CF₃、CHO、COOH、SO₃H、COR₅、COOR₅、CONHR₅、SO₃R₅、SO₂NHR₅或OR₅；

R₅选自C_1-4烷基、C_1-4烯基、C_1-4炔基；

X选自S或O。

R₁优选CN、COR₃、COOR₃。

R₂优选XR₄。R₄优选苯基、2-甲基苯基、3-甲基苯基、4-甲基苯基、4-乙基苯基、3-异丙基苯基、4-异丙基苯基、4-叔丁基苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、4-碘苯基、4-甲氧基苯基、4-二甲氨基苯基。

所述R₃优选自C_1-4烷基、C_1-4烯基、C_1-4炔基。

所述X优选S。

更为具体的技术方案中，本发明所述的硫/氧非那烯酮类化合物，选自下述结构的化合物：

对于上述-氰基非那烯酮类化合物，本发明通过多种手段检测了它们与PKM2的结合能力能力。结果表明，本发明的上述具有通式I的化合物可以有效的共价结合PKM2蛋白。本发明通过凝胶荧光成像、活细胞荧光成像实验检测了它们在体外和活细胞(包括肿瘤细胞和正常组织细胞)内特异性荧光标记PKM2蛋白的能力。结果表明，该类化合物可以有效的在体外和活细胞内与PKM2发生亲核取代反应，并生成具有橙红色荧光的结构，实现对于PKM2的特异性荧光标记。肿瘤细胞和正常细胞的活细胞荧光成像实验进一步表明该类化合物能够特异性的对肿瘤细胞进行荧光染色，而不对正常细胞进行荧光染色，实现对于肿瘤细胞、组织的荧光可视化和肿瘤细胞、组织的分子影像学诊断。

附图说明

图1是化合物5和9在体外与PKM2蛋白共孵育时的荧光变化曲线。

图2是化合物1、8、9、10、14在Hela细胞裂解液中荧光标记PKM2的凝胶荧光实验结果。

图3是化合物9在Hela细胞内的共聚焦效果图。绿色通道为探针分子的标记效果图，红色通道为免疫荧光法标记PKM2蛋白效果图。

图4是荧光显微镜下化合物9对肿瘤细胞MCF-7、Hela和正常细胞HEK-293T的荧光染色结果。

具体实施方式

本发明所提供的3-氰基非那烯酮类化合物，具有通式I的结构

其中：R₁选自C_1-4烯基、C_1-4炔基、F、C₂F₅、CF₃、NO₂、CN、CHO、COOH、SO₃H、COR₃、COOR₃、CONHR₃、SO₃R₃、SO₂NHR₃；

R₂选自哌啶基、哌啶酮基、哌啶二酮基、吡咯烷基、吡咯烷酮基、吡咯烷二酮基或XR₄；

R₃选自取代或未取代的C_1-4烷基、C_1-4烯基、C_1-4炔基，所述的取代是由下述基团任意取代：OH、I、Br、Cl、F、NO₂、NHCH₃、N(CH₃)₂、CN、CF₃；

R₄选自取代或非取代的苯基、萘基、噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、哒嗪基、吡嗪基、嘧啶基、吲哚基、苯并噻吩基、苯并吲哚基、苯并呋喃基、喹啉基、异喹啉基或嘌呤基，其中所述的取代是由下述基团任意取代：C_1-4烷基、C_1-4烯基、C_1-4炔基、苯基、OH、I、Br、Cl、F、NO₂、NHCH₃、N(CH₃)₂、CN、CF₃、CHO、COOH、SO₃H、COR₅、COOR₅、CONHR₅、SO₃R₅、SO₂NHR₅或OR₅；

R₅选自C_1-4烷基、C_1-4烯基、C_1-4炔基；

X选自S或O。

R₁优选CN、COR₃、COOR₃。

R₂优选XR₄。R₄优选苯基、2-甲基苯基、3-甲基苯基、4-甲基苯基、4-乙基苯基、3-异丙基苯基、4-异丙基苯基、4-叔丁基苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、4-碘苯基、4-甲氧基苯基、4-二甲氨基苯基。

所述的R₃选自C_1-4烷基、C_1-4烯基、C_1-4炔基。

所述X优选S。

更为具体的技术方案中，本发明所述的硫/氧代非那烯酮类化合物，选自下述结构的化合物：

本发明进一步提供上述本发明的3-氰基非那烯酮类化合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)5-溴苊醌与R₂CH₂CN按照投料摩尔比1:1-1:1.5反应，制得化合物II；反应时间为3-12h，反应温度为60-120℃，反应溶剂为乙腈；

(2)化合物II在缚酸剂存在下加热反应，得化合物III，反应时间为3-12h，反应温度为60-120℃，反应溶剂为乙腈，缚酸剂为碳酸钾；

(3)化合物III和R₁XH在缚酸剂存在下按照摩尔比1:1.2-1：5反应，得化合物I，反应时间为3-12h，反应温度为60-150℃，反应溶剂为乙腈，缚酸剂为碳酸钾；该步骤优选在氮气保护下进行；

本发明以上所述及的所有技术方案中，使用的术语“烷基”包括直链烷基和支链烷基。如提及单个烷基如“丙基”，则只特指直链烷基，如提及单个支链烷基如“异丙基”，则只特指支链烷基。又如“C_1-4烷基”包括C_1-3烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用原料和试剂等均可从化学或生物试剂公司购买或从已公开的方法制备。

实施例1：6-硫代吗啉基-2,3-二氰基非那烯酮(化合物1)的制备

(1)中间体A1的合成

分别取520mg(2mmol)5-溴苊醌，304mg(2.2mmol)碳酸钾，加入50mL乙腈，60℃反应3h，冷却至室温后，抽滤，得中间体A1，为橙红色固体，粗产率86％。

(2)化合物B1的合成

分别取493mg(1.6mmol)中间体A1，27.6mg(0.2mmol)碳酸钾，加入50mL乙腈，60℃反应4h，冷却，析出固体，过滤，固体用乙腈重结晶，得中间体B1，粗产率73％。

(3)化合物1的合成

分别取308mg(1mmol)中间体B1，145mg(2.2mmol)硫代吗啉，304mg(2.2mmol)碳酸钾，加入30mL乙腈，60℃反应3h，冷却至室温后倒入100mL水中，抽滤。所的固体用硅胶柱层析分离，展开剂为CH₂Cl₂：CH₃OH＝100：1(v/v)，得化合物1，为蓝紫色固体，产率65％。

化合物1的¹H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：¹H NMR(400MHz,⁶D-DMSO):δ8.61(d,J＝8.0Hz,2H),8.12(d,J＝8.8Hz,1H),7.94(dd,J＝8.0Hz,1H),7.41(d,J＝8.4Hz,1H),3.93(t,J＝4.8Hz,4H),2.96(t,J＝4.8Hz,4H).ESI-MS:C₁₉H₁₅N₃OS[M+H]⁺,理论值：332.09,实测值：332.07.

实施例2：6-哌啶基-2,3-二氰基非那烯酮(化合物2)的制备

除使用哌啶代替硫代吗啉外，其他合成与分离方法和化合物1相同。目标化合物2为蓝紫色固体，产率82％。

化合物2的¹H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:¹HNMR(400MHz,⁶D-DMSO):δ8.61(d,J＝8.0Hz,2H),8.12(d,J＝8.8Hz,1H),7.94(dd,J＝8.0Hz,1H),7.41(d,J＝8.4Hz,1H),3.35(t,J＝6.4Hz,4H),1.63-1.58(m,5H).ESI-MS:C₂₀H₁₆N₃O[M+H]⁺,理论值：314.37,实测值：314.39.

实施例3：6-苯琉基-2,3-二氰基非那烯酮(化合物3)的制备

除使用苯硫酚代替硫代吗啉外，其他合成与分离方法和化合物1相同。目标化合物2为红色固体，产率85％。

化合物3的¹H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.57(d,J＝8.4Hz,1H),8.47(t,J＝8.4Hz,2H),7.87(t,J＝8.0Hz,1H),7.92(d,J＝8.0Hz,1H),7.61(t,J＝8.0Hz,1H),7.52(t,J＝8.4Hz,1H),7.31(t,J＝9.2Hz,2H),7.22(d,J＝8.4Hz,1H).ESI-MS:C₂₁H₁₁N₂OS[M+H]⁺,理论值：338.05,实测值：338.05.

实施例4：6-(4-溴苯琉基)-2,3-二氰基非那烯酮(化合物4)的制备

除使用4-溴苯硫酚代替硫代吗啉外，其他合成与分离方法和化合物1相同。目标化合物4为红色固体，产率65％。

化合物4的¹H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.86(d,J＝8.4Hz,1H),8.81(d,J＝8.4Hz,1H),8.01(d,J＝8.0Hz,1H),7.96(t,J＝8.0Hz,1H),7.56(d,J＝8.8Hz,2H),7.09(d,J＝8.8Hz,2H),7.00(d,J＝8.0Hz,1H).ESI-MS:C₂₁H₉N₂OSBr[M+H]⁺,calc 416.96,found 416.94.

实施例5：6-(4-异丙基苯琉基)--2,3-二氰基非那烯酮(化合物5)

除使用4-异丙基苯硫酚代替硫代吗啉外，其他合成与分离方法和化合物1相同。目标化合物5为红色固体，产率71％。

化合物5的¹H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.87(d,J＝8.0Hz,1H),8.22(d,J＝8.0Hz,2H),8.04(d,J＝8.4Hz,1H),7.69(t,J＝8.0Hz,1H),7.56(d,J＝8.0Hz,2H),7.43(d,J＝8.4Hz,2H),7.06(d,J＝8.4Hz,1H),3.03(m,1H),1.33(d,J＝6.8Hz,6H).TOF-MS(EI+):C₂₄H₁₆BrN₂OS,理论值：380.10,实测值：380.10.

实施例6：6-(1-呋喃琉基)--2,3-二氰基非那烯酮(化合物6)的制备

除使用1-巯基呋喃代替硫代吗啉外，其他合成与分离方法和化合物1相同。目标化合物6为红色固体，产率64％。

化合物6的¹H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.85(d,J＝8.4Hz,1H),8.81(d,J＝8.4Hz,1H),8.01(d,J＝8.4Hz,1H),7.96(t,J＝8.4Hz,1H),7.82(d,J＝8.0Hz,1H),7.16(d,J＝8.0Hz,1H),7.00(d,J＝8.4Hz,1H),6.53(dd,J＝8.0Hz,1H).TOF MS(EI⁺):C₁₉H₈N₂O₂S,理论值：328.03,实测值：328.04.

实施例7：6-(4-甲基-1-呋喃琉基)-2,3-二氰基非那烯酮(化合物7)的制备

除使用1-巯基-4-甲基呋喃代替硫代吗啉外，其他合成与分离方法和化合物1相同。目标化合物7为红色固体，产率68％。

化合物7的¹H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.85(d,J＝8.4Hz,1H),8.81(d,J＝8.4Hz,1H),8.01(d,J＝8.4Hz,1H),7.96(t,J＝8.4Hz,1H),7.05(d,J＝8.0Hz,1H),7.00(d,J＝8.4Hz,1H),6.11(d,J＝8.0Hz,1H),2.33(s,3H).TOF MS(EI⁺):C₂₀H₁₀N₂O₂S,理论值：342.05,实测值：342.04.

实施例8：6-(萘-2-基硫基)-2,3-二氰基非那烯酮(化合物8)的制备

除使用萘-2-硫醇代替硫代吗啉外，其他合成与分离方法和化合物1相同。目标化合物8为红色固体，产率53％。

化合物8的¹H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.33(d,J＝8.2Hz,2H),7.96(d,J＝8.4Hz,1H),7.80-7.89(m,6H),7.72(s,1H),7.53(d,J＝8.0Hz,1H),7.40(d,J＝8.4Hz,1H).TOF MS(EI⁺):C₂₅H₁₂N₂OS,理论值：388.07,实测值：388.13.

实施例9：6-((4-异丙基苯基)硫基)-2-甲酸甲酯-3-氰基非那烯酮(化合物9)的制备

(1)中间体A2的合成

分别取520mg(2mmol)5-溴苊醌，304mg(2.2mmol)碳酸钾，加入50mL乙腈，297mg(2mmol)2-氰基乙酸甲酯，60℃反应3h，冷却至室温后，抽滤，得中间体A2，为红色固体，粗产率79％。

(2)化合物B2的合成

分别取545mg(1.6mmol)中间体A2，27.6mg(0.2mmol)碳酸钾，加入50mL乙腈，60℃反应4h，冷却，析出固体，过滤，固体用乙腈重结晶，得中间体B2，粗产率60％。

(3)化合物9的合成

分别取341mg(1mmol)中间体B2，335mg(2.2mmol)4-异丙基-苯硫酚，304mg(2.2mmol)碳酸钾，加入40mL乙腈，60℃反应3h，冷却至室温后倒入100mL水中，抽滤。所的固体用硅胶柱层析分离，展开剂为CH₂Cl₂：CH₃OH＝100：1(v/v)，得化合物1，为红色固体，产率50％。

化合物9的¹H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：¹H NMR(400MHz,⁶D-DMSO):δ8.33(d,J＝8.0Hz,2H),8.17(d,J＝8.8Hz,1H),7.94(t,J＝4.6Hz,1H),7.52(d,J＝8.0Hz,2H),7.33(d,J＝8.0Hz,1H),7.10(d,J＝8.0Hz,2H),3.69(s,3H),2.65(m,1H),1.33(d,J＝8.4Hz,6H).ESI-MS:C₂₅H₁₉NO₃S[M+H]⁺,理论值：414.11,实测值：414.24.

实施例10：6-((4-异丙基苯基)硫基)-2-乙酰基-3-氰基非那烯酮(化合物10)的制备

(1)中间体A3的合成

分别取520mg(2mmol)5-溴苊醌，304mg(2.2mmol)碳酸钾，加入50mL乙腈，166mg(2mmol)3-氧代丁腈，60℃反应3h，冷却至室温后，抽滤，得中间体A3，为红色固体，粗产率83％。

(2)化合物B3的合成

分别取520mg(1.6mmol)中间体A3，27.6mg(0.2mmol)碳酸钾，加入50mL乙腈，60℃反应4h，冷却，析出固体，过滤，固体用乙腈重结晶，得中间体B3，粗产率58％。

(3)化合物10的合成

除使用中间体B3代替中间体B2外，其他合成与分离方法和化合物9相同。目标化合物10为红色固体，产率61％。

化合物10的¹H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：¹H NMR(400MHz,⁶D-DMSO):δ8.48(d,J＝8.4Hz,2H),8.01(d,J＝8.4Hz,1H),7.87(t,J＝4.4Hz,1H),7.64(d,J＝8.4Hz,2H),7.48(d,J＝8.4Hz,1H),7.32(d,J＝8.0Hz,2H),2.76(m,1H),2.54(s,3H),1.53(d,J＝8.6Hz,6H).ESI-MS:C₂₅H₁₉NO₂S[M+H]⁺,理论值：398.11,实测值：398.32.

实施例11：6-((4-异丙基苯基)硫基)-2-氟-3-氰基非那烯酮(化合物11)的制备

(1)中间体A4的合成

分别取520mg(2mmol)5-溴苊醌，304mg(2.2mmol)碳酸钾，加入50mL乙腈，118mg(2mmol)2-氟乙腈，60℃反应3h，冷却至室温后，抽滤，得中间体A4，为红色固体，粗产率85％。

(2)化合物B4的合成

分别取481mg(1.6mmol)中间体A4，27.6mg(0.2mmol)碳酸钾，加入50mL乙腈，60℃反应4h，冷却，析出固体，过滤，固体用乙腈重结晶，得中间体B4，粗产率69％。

(3)化合物11的合成

除使用中间体B4代替中间体B2外，其他合成与分离方法和化合物9相同。目标化合物11为红色固体，产率53％。

化合物11的¹H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：¹H NMR(400MHz,⁶D-DMSO):δ8.32(d,J＝8.0Hz,2H),8.13(d,J＝8.2Hz,1H),7.75(t,J＝4.6Hz,1H),7.68(d,J＝8.6Hz,2H),7.52(d,J＝8.4Hz,1H),7.45(d,J＝8.6Hz,2H),2.83(m,1H),1.23(d,J＝8.4Hz,6H).ESI-MS:C₂₃H₁₆FNOS[M+H]⁺,理论值：374.09,实测值：374.13.

实施例12：6-((4-异丙基苯基)硫基)-2-乙炔基-3-氰基非那烯酮(化合物12)的制备

(1)中间体A5的合成

分别取520mg(2mmol)5-溴苊醌，304mg(2.2mmol)碳酸钾，加入50mL乙腈，130mg(2mmol)3-炔丁腈，60℃反应3h，冷却至室温后，抽滤，得中间体A5，为红色固体，粗产率60％。

(2)化合物B5的合成

分别取481mg(1.6mmol)中间体A5，27.6mg(0.2mmol)碳酸钾，加入50mL乙腈，60℃反应4h，冷却，析出固体，过滤，固体用乙腈重结晶，得中间体B5，粗产率74％。

(3)化合物12的合成

除使用中间体B5代替中间体B2外，其他合成与分离方法和化合物9相同。目标化合物11为红色固体，产率53％。

化合物12的¹H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：¹H NMR(400MHz,⁶D-DMSO):δ8.43(d,J＝8.2Hz,2H),8.31(d,J＝8.4Hz,1H),7.91(t,J＝4.4Hz,1H),7.75(d,J＝8.4Hz,2H),7.62(d,J＝8.4Hz,1H),7.51(d,J＝8.6Hz,2H),2.83(m,1H),2.52(s,1H),1.31(d,J＝8.6Hz,6H).ESI-MS:C₂₅H₁₇NOS[M+H]⁺,理论值：380.10,实测值：380.25.

实施例13：6-(4-异丙基苯氧基)-2,3-二氰基非那烯酮(化合物13)的制备

除使用4-异丙基苯酚代替硫代吗啉外，其他合成与分离方法和化合物1相同。目标化合物13为红色固体，产率43％。

化合物13的¹H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：¹H NMR(400MHz,⁶D-DMSO):δ8.34(d,J＝8.0Hz,1H),8.24(d,J＝8.4Hz,1H),7.95(t,J＝4.4Hz,1H),7.83(d,J＝8.6Hz,1H),7.54-7.61(m,4H),7.43(d,J＝8.6Hz,1H),2.91(m,1H),1.19(d,J＝8.6Hz,6H).ESI-MS:C₂₄H₁₆N₂O₂[M+H]⁺,理论值：365.12,实测值：365.33.

实施例14：6-(4-异丙基苯氧基)-2-甲酸甲酯-3-氰基非那烯酮(化合物14)的制备

除使用4-异丙基苯酚代替4-异丙基苯硫酚外，其他合成与分离方法和化合物9相同。目标化合物13为红色固体，产率43％。

化合物14的¹H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：¹H NMR(400MHz,⁶D-DMSO):δ8.23(d,J＝8.2Hz,1H),8.15(d,J＝8.8Hz,2H),7.83(t,J＝4.6Hz,1H),7.52-7.59(m,4H),7.32(d,J＝8.6Hz,1H),3.82(s,3H),2.83(m,1H),1.21(d,J＝8.0Hz,6H).ESI-MS:C₂₅H₁₉NO₄[M+H]⁺,理论值：398.13,实测值：398.24.

实施例15：利用荧光分光光度计检测化合物在体外与PKM2蛋白反应并产生荧光发射的能力

在PKM2的PBS缓冲液中(蛋白浓度0.2μM)分别加入化合物5或9(分子终浓度为1.0μM)，室温孵育5h。在加入分子0h、1h、2h、3h、4h和5h后利用荧光分光光度计分别检测混合溶液的荧光光谱。结果如图1所示，加入化合物1h之内化合物与蛋白的混合液即可产生明显荧光发射(最大发射波长＝585nm)，荧光发射强度随化合物与蛋白孵育时间延长而增加。

本发明的化合物1-14均可以在PBS缓冲液中与PKM2蛋白反应并产生荧光发射。

实施例16：通过电泳凝胶成像检测化合物在Hela细胞裂解液中荧光标记PKM2蛋白的能力

将10μM化合物1、8、9、10、14分别加入Hela细胞裂解液中，室温孵育12h。加入5XSDS loading buffer煮样，然后进行SDS-PAGE电泳和凝胶成像。结果如图2所示，加入化合物1、9、10、14的实验组在凝胶成像图中能够特异性的标记PKM2蛋白(55KD左右)，而对其他蛋白几乎没有明显的标记。结果表明化合物1、9、10、14可以应用于在大肠杆菌裂解液中的PKM2家族蛋白的特异性荧光标记。

本发明的化合物1-14均可以在体外选择性的荧光标记PKM2蛋白。

实施例17：通过共聚焦荧光成像实验检测化合物9在Hela细胞中标记PKM2蛋白的能力。

在confocal培养皿培养好的Hela细胞中加入0.5μM探针，37摄氏度孵育12h。然后经过细胞固定，通透，封闭，孵育一抗，孵育二抗等步骤后，进行共聚焦荧光拍照(图3)。其中，左图绿色通道为探针荧光成像；中间图红色通道为二抗荧光通道；右图为绿色通道和红色通道的重叠图。

标记效果显示如图3，从图中可以看出探针对蛋白的标记与二抗荧光对蛋白的标记有很好的重叠(皮尔森系数为0.92).因此探针可以在细胞内特异性的标记PKM2蛋白。

本发明的化合物1-14均可以在细胞内选择性的荧光标记PKM2蛋白。

实施例18：利用荧光显微成像实验对比检测化合物9对肿瘤细胞MCF-7、Hela和正常组织细胞HEK-293T的荧光染色能力。

在confocal培养皿培养好的MCF-7、H23、HL-60和DC细胞中分别加入10μM探针，37摄氏度孵育12h，利用荧光显微镜拍照。

化合物9的对各种细胞的染色能力如图4，从图中可以看出探针能够有效染色肿瘤细胞MCF-7、Hela，但不能染色正常组织细胞HEK-293T。因此探针可以通过在细胞内特异性的标记PKM2蛋白实现对肿瘤细胞的荧光可视化检测和肿瘤细胞、组织的分子影像学诊断。

本发明的化合物1-14均可以通过在细胞内特异性的标记PKM2蛋白实现对肿瘤细胞的荧光可视化检测和肿瘤细胞、组织的分子影像学诊断。