一种基于均二苯乙烯骨架的细胞脂滴荧光成像探针及其应用
阅读说明：本技术 一种基于均二苯乙烯骨架的细胞脂滴荧光成像探针及其应用 (Cell lipid drop fluorescence imaging probe based on stilbene skeleton and application thereof ) 是由 卢革宇 王晨光 周日 刘方猛 闫旭 刘晓敏 孙鹏 于 2020-12-22 设计创作，主要内容包括：一种基于均二苯乙烯骨架的细胞脂滴荧光成像探针及其应用,属于生物成像技术领域。该荧光探针的结构式如下所示,R为二甲胺基、二乙胺基和哌啶基,其中以R为二乙胺基的荧光探针Lipi-DSB成像效果最好。本发明还公开了该荧光探针在特异性标记细胞中脂滴和追踪活细胞内脂滴分布和动力学变化方面的应用。实验证实本发明的荧光探针Lipi-DSB是一种具有高亮度和成像信噪比,超高的脂滴染色选择性和光稳定性,以及较低的细胞毒性等优点的脂滴荧光探针,具有巨大的应用前景。(A cell lipid drop fluorescence imaging probe based on a stilbene skeleton and an application thereof belong to the technical field of biological imaging. The structural formula of the fluorescent probe is shown as follows, R is dimethylamino, diethylamino and piperidyl, and the fluorescent probe Lipi-DSB with R as diethylamino has the best imaging effect. The invention also discloses application of the fluorescent probe in specifically labeling lipid droplets in cells and tracking lipid droplet distribution and kinetic change in living cells. Experiments prove that the fluorescent probe Lipi-DSB has high brightness, high imaging signal-to-noise ratio and ultrahigh lipid drop dyeingThe lipid drop fluorescent probe has the advantages of selectivity, light stability, lower cytotoxicity and the like, and has huge application prospect.)
技术领域
本发明属于生物成像技术领域，具体涉及一种基于均二苯乙烯骨架的细胞脂滴荧光成像探针及其在特异性标记细胞中脂滴和追踪活细胞内脂滴分布和动力学变化方面的应用。
背景技术
脂滴在早些年前只是被人们当成细胞内的脂肪堆积颗粒，直到近些年对脂滴的研究逐渐深入，才发现脂滴是一种球形细胞器，它由中性脂质核(甘油三酯和胆固醇酯)和磷脂单层膜构成，膜上固定有围脂滴蛋白和脂分化蛋白等多种蛋白质，广泛分布于从原核生物到人类几乎所有的生物体中。脂滴参与了很多重要的细胞活动，例如：膜的合成和转运，蛋白质的储存和降解，以及发炎等。脂滴的功能紊乱会导致多种疾病的发生，如肥胖症、糖尿病、脂肪肝、动脉粥样硬化和癌症等。因此，近十年来针对脂滴的研究成为了细胞生物学中最热门的领域。
为了观察脂滴研究脂滴多种多样的功能，荧光成像技术如共聚焦、双光子和受激发射损耗(STED)成像等是最有力的工具之一。然而，由于光的衍射极限限制，共聚焦或双光子荧光显微镜所能达到的分辨率极限只有250nm左右，无法观察到小个脂滴。并且，脂滴成像最常用的荧光探针BODIPY和Nile Red(Materials，2018，11，1768)也都有着一定的不足之处，例如：BODIPY的斯托克斯位移较小，会导致吸收和发射光谱的重叠，Nile Red染色脂滴的同时还会染色其它疏水性结构导致较低的脂滴特异性和成像信噪比。而具有纳米尺度分辨率的STED超分辨显微镜可以观察到小个脂滴，但对荧光探针的光稳定性有着极高的要求，常用的荧光探针很快就会被超强的STED损耗光所漂白。因此，开发具有大斯托克斯位移、高的脂滴特异性和成像信噪比、以及超高光稳定性的荧光探针是实现高质量脂滴荧光成像的迫切需求。
发明内容
针对现有细胞脂滴成像荧光探针技术方面的不足，本发明要解决的问题是提供一种基于均二苯乙烯骨架的细胞脂滴荧光成像探针及其在特异性标记细胞中脂滴和追踪活细胞内脂滴分布和动力学变化方面的应用。
本发明所述的一种基于均二苯乙烯骨架的细胞脂滴荧光成像探针，其特征在于：分子结构为给受体结构，其化学结构通式如式(I)所示：
其中R是二甲胺基、二乙胺基或哌啶基，其结构式为
本发明所述性能最优异的细胞脂滴荧光探针的化学名称为(2Z，2'Z)-3,3'-(1,4-亚苯基)双(2-(4-(二乙氨基)苯基)丙烯腈)，简称为Lipi-DSB，它的两个类似物化学名称分别为(2Z，2'Z)-3,3'-(1,4-亚苯基)双(2-(4-(二甲基氨基)苯基)丙烯腈)和(2Z，2'Z)-3,3'-(1,4-亚苯基)双(2-(4-(4-哌啶基-1-基)苯基)丙烯腈)，简称分别为化合物1和2。它们都是本发明合成的新的荧光分子，制备反应式如下：
针对现有细胞脂滴荧光成像探针的不足，本发明在开发新型脂滴成像荧光探针方面选择了基于均二苯乙烯骨架的荧光分子。本发明中在均二苯乙烯骨架的两端和中间苯环上分别引入胺基和氰基基团作为给体和受体，制备的具有给受体结构的荧光分子展现较高亮度的同时，保持了较大的斯托克斯位移。氰基的引入显著提高了该荧光探针的光稳定性，而胺基基团的微调可以改变荧光探针染色脂滴的特异性。在荧光成像应用方面，大的斯托克斯位移一方面可以有效避免吸收和发射光谱的交叉重叠，另一方面长波发射可以有效降低细胞自荧光背景信号的影响。此外，较小的分子结构还可以有效增加细胞膜的通透性。基于上述优点，荧光探针Lipi-DSB能够作为脂滴探针实现高质量荧光成像(共聚焦成像和超分辨成像)。
本发明所述特异性标记细胞中脂滴的荧光探针Lipi-DSB在特异性标记细胞中脂滴和追踪活细胞内脂滴分布和动力学过程(实施例5、6和7)中的应用。
本发明所述细胞为HeLa细胞。
本发明制备的特异性标记细胞中脂滴的荧光探针Lipi-DSB是具有高亮度、大斯托克斯位移、超高染色选择性和光稳定性的可用于共聚焦成像和延时STED、双色STED和3DSTED超分辨成像的荧光探针。
实验结果证实，本发明所述的荧光探针Lipi-DSB具有较高的亮度和超高的染色选择性，在相同的染色和成像条件下，Lipi-DSB表现出了与Nile Red相当的亮度和更优异的染色选择性。通过MTT测试证实，Lipi-DSB的细胞毒性很低，可与其它荧光探针兼容。最重要的是，Lipi-DSB具有超高的光稳定性，可用于脂滴的STED超分辨动态追踪成像和3D STED超分辨成像。因此，荧光探针Lipi-DSB可作为特异性标记脂滴追踪活细胞内脂滴分布和动力学过程的强有力的工具，有望引领脂滴STED超分辨成像荧光探针的发展浪潮，成为商业化的脂滴STED超分辨成像荧光探针。更重要的是它可以为脂滴细胞生物学的研究提供新的视野，促进脂滴细胞生物学的发展。
总之，本发明所述的探针Lipi-DSB是一种全新的荧光探针，与其它脂滴荧光探针相比，Lipi-DSB具有高的亮度和成像信噪比，超高的脂滴染色选择性和光稳定性，以及较低的细胞毒性等优点。鉴于上述特点，其在细胞脂滴荧光成像方面的应用具有广阔前景。
附图说明
图1：本发明实施例1中制备的荧光探针Lipi-DSB的核磁氢谱；
图2：本发明实施例1中制备的荧光探针Lipi-DSB的核磁碳谱；
图3：本发明实施例1中制备的荧光探针化合物1的核磁氢谱；
图4：本发明实施例1中制备的荧光探针化合物2的核磁氢谱；
图5：本发明实施例1中制备的荧光探针Lipi-DSB在甲苯(toluene)中的吸收-发射光谱；
其中，左侧虚线部分为吸收光谱，右侧实线部分为发射光谱。
图6：用不同浓度的荧光探针Lipi-DSB染色HeLa细胞24小时后细胞的存活率；
图7：荧光探针Lipi-DSB与脂滴荧光探针Ph-Red在HeLa细胞中共定位照片；
其中，第一张照片(a)是488nm激光激发下500-540nm成像通道内Lipi-DSB的照片；第二张照片(b)是488nm激光激发下680-720nm成像通道内Ph-Red的照片；第三张照片(c)是前两张荧光照片和明场照片的叠加；第四张照片(d)是前两个荧光通道的皮尔森相关系数(R＝0.96)。标尺：10μm。
图8：荧光探针Lipi-DSB、化合物1和脂滴荧光探针Nile Red在HeLa细胞中光稳定性的量化图；
其中，图a部分分别是荧光探针Lipi-DSB、化合物1和Nile Red在染色HeLa细胞后在同一区域连续成像50张照片中的第1、25和50张照片；图b部分分别是这50张照片的相对荧光强度随成像张数的变化趋势。标尺：10μm。
图9：荧光探针Lipi-DSB在STED超分辨模式下追踪HeLa细胞内脂滴动力学过程；
其中，从上到下三张图依次是第1张、第100张和第1000张STED超分辨模式照片。标尺：2μm。
具体实施方式
实施例1：
1、(2Z，2'Z)-3,3'-(1,4-亚苯基)双(2-(4-(二乙氨基)苯基)丙烯腈)(Lipi-DSB)的合成
向30mL对氨基苯乙腈(2.00g，15.0mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中加入碳酸钾(4.50g，30.0mmol)和溴乙烷(9.80g，90.0mmol)，反应体系在80℃下搅拌12小时，经萃取和柱层析提纯后得到中间体产物2.00g(10.6mmol，71％)，之后我们将这些中间体产物与对苯二甲醛(0.670g，5.00mmol)溶于40mL叔丁醇和20mL四氢呋喃的混合溶液，之后再向体系内加入叔丁醇钾(1.12g，10.0mmol)，混合物在50℃下搅拌4小时，冷却至室温后将反应混合物倒入100mL甲醇中，过滤得到1.20g(2.53mmol，51％)红色粉末状的Lipi-DSB。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ7.94(s,4H),7.59(s,4H),7.35(s,2H),6.73(s,4H),3.44(d,J＝7.5Hz,8H),1.24(t,J＝7.1Hz,12H).13C NMR(126MHz,CDCl3):δ148.46,135.37,135.16,129.16,127.31,121.01,118.37,112.21,111.51,44.47,12.59.
图1为实施例1所合成荧光探针Lipi-DSB的核磁氢谱，图2为实施例1所合成荧光探针Lipi-DSB的核磁碳谱，表明制备得到了目标产物Lipi-DSB。
2、(2Z，2'Z)-3,3'-(1,4-亚苯基)双(2-(4-(二甲基氨基)苯基)丙烯腈)(化合物1)的合成
我们将上述Lipi-DSB合成步骤中的溴乙烷替换为相同摩尔数的碘甲烷，其它实验步骤完全相同，即可达到1.00g(2.40mmol，48％)深红色粉末状的化合物1。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ7.96(s,4H),7.63(d,J＝8.5Hz,4H),7.40(s,2H),6.87(s,4H),3.08(s,12H).
图3为实施例1所合成荧光探针化合物1的核磁氢谱，表明制备得到了目标产物化合物1。
3、(2Z，2'Z)-3,3'-(1,4-亚苯基)双(2-(4-(4-哌啶基-1-基)苯基)丙烯腈)(化合物2)的合成
将对溴苯乙腈(1.95g，10.0mmol)和对苯二甲醛(0.670g，5.00mmol)溶于氢氧化钠的乙醇溶液，50℃搅拌4小时即可得到2.00g(4.10mmol，82％)的中间体产物，之后将该中间体产物与碳酸铯(1.90g，6.00mmol)溶于甲苯中，依次加入哌啶(3.00mL,30.0mmol)，醋酸钯催化剂和有机磷配体，反应体系在120℃下反应18小时，经萃取和柱层析提纯即可得到0.420g(0.840mmol，56％)橙红色粉末状的化合物2。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ7.96(s,4H),7.62(s,4H),7.41(s,2H),6.97(s,4H),3.32(s,8H),1.70(m,12H).
图4为实施例1所合成荧光探针化合物2的核磁氢谱，表明制备得到了目标产物化合物2。
实施例2：实施例1中制备的荧光探针Lipi-DSB吸收-发射光谱的测定
用10mL甲苯(toluene)溶剂将实施例1中合成的荧光探针Lipi-DSB配成10μM浓度的溶液。在300～700nm波长范围内用紫外可见分光光度计扫描得到吸收光谱，用光纤式荧光光谱仪在470nm激发下收集得到荧光发射光谱，用Origin软件处理数据得到如图5所示的荧光探针Lipi-DSB在甲苯溶液中的吸收-发射光谱(左侧虚线部分为吸收光谱，右侧实线部分为发射光谱)，说明了荧光探针Lipi-DSB的吸收-发射峰位和它大的斯托克斯位移。化合物1和化合物2在甲苯中的吸收-发射光谱与Lipi-DSB基本相同，这里不做赘述。
实施例3：HeLa细胞的培养
本实施例中所有百分数均为体积分数。
HeLa细胞株是在37℃、CO2浓度为5％的培养箱中进行培养，培养液为含有10％胎牛血清和1％双抗(青链霉素混合液)的高糖DMEM。其中，胎牛血清、双抗和高糖DMEM是直接从生物试剂公司购买得到的。
待细胞生长到对数期，我们对细胞进行传代处理：将细胞培养瓶中原有的5mL培养液吸走后用2mL不含胎牛血清的DMEM培养液清洗细胞表面，将该培养液吸走后再用0.5mL胰酶消化处理细胞2分钟，待大部分细胞脱壁后，加入2mL含10％胎牛血清和1％双抗的高糖DMEM培养液吹打均匀，取适量该细胞分散液分别转移至新的细胞培养瓶和培养皿中，放入CO2细胞培养箱中培养，培养皿中的细胞待浓度适宜后用于共聚焦或超分辨成像实验。
实施例4：实施例1中制备的荧光探针Lipi-DSB细胞毒性的测试
我们使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)对荧光探针Lipi-DSB进行细胞毒性测试。在96孔板上接种HeLa细胞(每个孔1*104个细胞)，放入CO2细胞培养箱中培养24小时。之后将中间的60个孔的培养液换成含有不同浓度(0、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0μM)荧光探针Lipi-DSB和1％(体积分数)DMSO的培养液(每个浓度设置10组平行试验)，再培养24小时后，向这些孔中加入MTT试剂(每孔10μL)，放回细胞培养箱中继续培养4小时。将这些孔中原有培养液移除后加入DMSO(每孔100μL)溶解生成的甲瓒结晶，室温放置30分钟后用酶标仪在490nm处测量各个孔的吸光度值。因为只有活细胞才能与MTT试剂作用生成甲瓒结晶，所以我们可以用各组浓度不同孔的平均吸光度值与对照组(探针浓度为0的10个孔)的平均吸光度值作比，计算细胞存活率，结果如图6所示，说明荧光探针Lipi-DSB细胞毒性很小，10.0μM浓度的荧光探针Lipi-DSB在24小时内也不会影响HeLa细胞的正常生长。
实施例5：实施例1中制备的荧光探针Lipi-DSB与脂滴荧光探针Ph-Red在HeLa细胞中共染色实验
我们将HeLa细胞培养于20mm直径玻璃底的培养皿中，在CO2培养箱中繁殖2天。从培养箱中拿出后，移除培养皿中原有DMEM培养液，加入1mL含有Lipi-DSB(2μM)、Ph-Red(500nM)和1％(体积分数)DMSO的DMEM培养液，放入细胞培养箱继续培养2小时。取出之后，用HBSS溶液洗3遍，之后在HBSS溶液中进行荧光成像。如图7所示，我们可以清晰地观察到实施例1中制备的荧光探针Lipi-DSB与脂滴荧光探针Ph-Red在HeLa细胞中能很好地实现共定位，说明了实施例1中制备的荧光探针Lipi-DSB具有优异的细胞脂滴特异性。
实施例6：实施例1中制备的荧光探针Lipi-DSB的光稳定性测试
我们将实施例5中铺满HeLa细胞的3个培养皿从细胞培养箱中取出后，移除原有DMEM培养液，分别加入含有2μM Lipi-DSB、2μM化合物1和2μM Nile Red的DMEM培养液(含1％DMSO)，放回培养箱中继续培养2小时后，取出3个培养皿，分别用HBSS溶液洗3遍，之后进行荧光成像。我们在3个培养皿中分别选定3个区域，之后分别连续成像50张，发现Nile Red会很快被光漂白，化合物1成像50张后相对荧光强度在80％左右，而实施例1中制备的荧光探针Lipi-DSB在成像50张后相对荧光强度仍能保持在90％以上，说明了其优异的光稳定性。
实施例7：实施例1中制备的荧光探针Lipi-DSB在STED超分辨模式下追踪HeLa细胞内脂滴动力学过程
我们将实施例5中铺满HeLa细胞的培养皿从培养箱取出后，移除原有DMEM培养液，加入含有2μM Lipi-DSB和1％DMSO的DMEM培养液，放回培养箱培养2小时后取出，用HBSS溶液洗3遍，然后进行STED超分辨成像。选定一个脂滴含量较多的区域后，在STED模式下连续成像1000张后，图像仍能保持有意义的荧光强度，而且从这连续的1000张STED照片中我们发现了小脂滴的快速运动，说明了荧光探针Lipi-DSB前所未有的超高光稳定性以及作为脂滴超分辨成像荧光探针在追踪脂滴动力学方面的实用性。
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