全人源抗pcsk9抗体、其抗原结合片段及其应用
阅读说明：本技术 全人源抗pcsk9抗体、其抗原结合片段及其应用 (Fully human anti-PCSK9 antibody, antigen-binding fragment thereof and application thereof ) 是由 谭树华 徐梦龙 汪可 陈满满 雷高新 于 2020-06-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了全人源抗PCSK9抗体或其抗原结合片段及其应用,本发明以人PCSK9为抗原从高容量全人源噬菌体抗体库中筛选出抗PCSK9单链抗体。然后,采用体外亲和力成熟、CDR区交叉克隆及抗体全长化技术获得新型、高活性、全人源抗PCSK9单链及全长抗体。上述抗体及其片段可特异性结合PCSK9,有效抑制PCSK9介导的肝细胞表面低密度脂蛋白受体(LDLR)的降解,显著增强肝细胞对低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的摄取,从而明显降低血清LDL-C水平。本发明所述的抗体及其片段科应用于制备预防和治疗PCSK9介导的包括高胆固醇血症、高血脂症肥胖症、动脉粥样硬化以及心脑血管疾病等相关疾病的药物。(The invention discloses a fully human anti-PCSK9 antibody or an antigen binding fragment thereof and application thereof, and in the invention, an anti-PCSK9 single-chain antibody is screened from a high-capacity fully human phage antibody library by taking human PCSK9 as an antigen. Then, a novel, high-activity and fully human anti-PCSK9 single-chain and full-length antibody is obtained by adopting in vitro affinity maturation, CDR region cross cloning and antibody full-length technologies. The antibody and the fragment thereof can specifically bind to PCSK9, effectively inhibit PCSK 9-mediated degradation of low-density lipoprotein receptor (LDLR) on the surface of a liver cell, and remarkably enhance the uptake of low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) by the liver cell, thereby obviously reducing the level of serum LDL-C. The antibody and the fragment thereof are applied to preparing medicines for preventing and treating PCSK 9-mediated diseases related to hypercholesterolemia, hyperlipidemia obesity, atherosclerosis, cardiovascular and cerebrovascular diseases and the like.)
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种新的全人源抗前蛋白转化酶枯草溶菌素9(Proprotein convertase subtilisin/kexin 9,PCSK9)抗体、其抗原结合片段及其医药用途。
背景技术
心血管疾病(CVD)严重危害人类健康，而以血浆低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平升高为主要特征的高胆固醇血症可促进动脉粥样斑块形成，是诱发CVD的重要危险因素(Nature reviews Disease primers 2017,3:17093)。人体血液中LDL-C的清除主要通过肝细胞表面低密度脂蛋白受体(LDLR)来完成，当LDL-C与LDLR结合后可形成LDL-C/LDLR复合物并进入溶酶体，LDL-C被降解后LDLR可重新回到细胞膜表面循环利用。
前蛋白转化酶枯草溶菌素9(Proprotein convertase subtilisin/kexin 9,PCSK9)是一种由692个氨基酸组成的糖蛋白，属前蛋白转化酶(proprotein convertases,PCs)家族中的第九个成员。PCSK9是一种分泌型丝氨酸蛋白酶，主要在肝脏和肠道等组织中表达，然后释放到血液中(J Biol Chem.2004；279(47):48865-48875；Trends BiochemSci.2007；32(2):71-77)。PCSK9进入血液循环后可与肝细胞表面LDLR的表皮生长因子样结构域特异性结合，并引导其进入肝细胞到达溶酶体，使LDLR在溶酶体中降解，导致肝细胞表面LDLR减少，从而降低肝脏清除LDL-C的能力，最终导致血液中LDL-C水平升高及高胆固醇血症的发生(Proc Natl Acad Sci U S A.2008；105(35):13045-13050；CirculationResearch.2014；114(6):1022-1036)。因此，抑制PCSK9合成、分泌以及阻断其与LDLR相互作用的药物均就可促进LDL-C清除，降低患高胆固醇血症风险(Annu Rev PharmacolToxicol.2014；54:273-293)。
此外，有文献报道，PCSK9升高还与肥胖及2型糖尿病(PediatrDiabetes.2017.PMID:28093849,DOI:10.1111/pedi.12490；Diabetes Metab ResRev.2016；32(2):193-199.)以及肾病综合症以及蛋白尿等慢性肾病(Int UrolNephrol.2017.PMID:28084558，DOI:10.1007/s11255-017-1505-2)密切相关，因此，抑制PCSK9也可防治这些与PCSK9异常升高相关的疾病。
抗PCSK9抗体可特异性阻断PCSK9与LDLR的结合，抑制PCSK9介导的LDLR降解，提高肝细胞表面LDLR水平，从而增强肝细胞对LDL-C的清除功能。因此，抗PCSK9抗体的研发近年来备受瞩目。由美国Amgen公司开发的全人源单抗Evolocumab(AMG145)和Regeneron/Sanofi公司开发的全人源单抗Alirocumab(REGN727/SAR236553)已在美国和欧洲获批上市(J Clin Pharmacol.2017；57(1):7-32)，用于杂合子家族性高胆固醇血症的治疗，或他汀不能有效降低LDL-C的心血管高危者的治疗。
噬菌体展示技术(phage display)具有无需抗原免疫、筛选效率高、亲和力成熟方便的优点，目前已成为发现全人源抗体的主要技术平台。本发明以重组人PCSK9为抗原，从全人源噬菌体抗体库中筛选出抗人PCSK9单链抗体，然后通过体外亲和力成熟及CDR区交叉克隆(cross-cloning)技术(Molecular Immunology,2008,46(1):135-144)获得了新型、高活性、全人源抗人PCSK9抗体。该抗体具有免疫原性低、特异性强、活性高的优点，可用于诊断、预防和治疗PCSK9介导的高胆固醇血症、高血脂症、动脉粥样硬化、心脑血管疾病、非酒精性脂肪肝、肥胖症、肾病等疾病。
发明内容
发明目的：本发明要解决的技术问题是提供一种新型、全人源抗PCSK9抗体及其抗原结合片段。该抗体及其抗原结合片段可特异性结合PCSK9，有效抑制PCSK9对肝细胞表面LDLR的降解，从而提高肝细胞LDLR水平，增强肝细胞对LDL-C的吸收功能。
本发明还要解决的技术问题是提供上述全人源抗PCSK9抗体及其抗原结合片段在制备预防和治疗包括但不局限于高胆固醇血症、高血脂症、动脉粥样硬化、心脑血管疾病、脂肪肝、肥胖症、肾病等疾病药物中的应用。
技术方案：为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
构建人PCSK9重组表达质粒pTT5-hPCSK9，然后将该质粒瞬时转染CHO3E7细胞(南京金斯瑞生物科技有限公司)，悬浮培养7天后，离心收集培养液上清，采用镍柱亲和层析和分子排阻层析方法从中分离纯化得到重组人PCSK9蛋白。
以人PCSK9蛋白为靶抗原从高容量全人源噬菌体抗体库中筛选出抗PCSK9单链抗体。结合KABAT数据库序列比对和突变热点分析设计简并寡核苷酸引物，采用全质粒PCR扩增方式分别在六个CDR区引入半随机突变。PCR扩增产物经Dpn I酶切原模板后，电转化大肠杆菌E.coli TG1超级感受态细胞，制备全人源抗PCSK9单链抗体突变体库，经噬菌体展示筛选后，获得6个亲和力和活性均较高的优势突变体。采用CDR区交叉克隆方法(Molecularimmunology.2008；46:135-144)进一步提高优势突变体的亲和力和活性。在此基础上，将获得的高活性抗PCSK9单链抗体进行全长化，并检测其体外和体内生物学活性。
本发明获得的抗体及其抗原结合片段可特异性结合PCSK9，有效抑制PCSK9与LDLR之间的相互作用，阻断PCSK9介导的LDLR降解，显著增强肝细胞对LDL-C的摄取能力。
更具体地，本发明所述抗体或抗体片段包括重链可变区和轻链可变区，在一些实施例中，重链可变区和轻链可变区通过含15个氨基酸的柔性肽(GGGGSGGGGSGGGGS)连接形成单链抗体；在另外一些实施例中，重链可变区和轻链可变区通过与人IgG1恒定区连接形成全长抗体。
所述重链的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用HCDR1、HCDR2、HCDR3表示；所述轻链的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用LCDR1、LCDR2、LCDR3表示。
更具体而言，HCDR1包含SEQ ID NO：1～6任一所示的氨基酸序列，或者包含与SEQID NO：1～6所示的任一氨基酸序列具有至少85％同一性的序列，优选至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的序列，或者与所述序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、***或缺失)的氨基酸序列；
HCDR2包含SEQ ID NO：7、8所示的任一氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：7、8所示的任一氨基酸序列具有至少85％同一性的序列，优选至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的序列，或者与所述序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、***或缺失)的氨基酸序列；
HCDR3包含SEQ ID NO：9～12所示的任一氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：9～12所示的任一氨基酸序列具有至少85％同一性的序列，优选至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的序列，或者与所述序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、***或缺失)的氨基酸序列；
LCDR1包含SEQ ID NO：13～15所示的任一氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：13～15所示的任一氨基酸序列具有至少85％同一性的序列，优选至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的序列，或者与所述序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、***或缺失)的氨基酸序列；
LCDR2包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：16所示的任一氨基酸序列具有至少85％同一性的序列，优选至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的序列，或者与所述序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、***或缺失)的氨基酸序列；
LCDR3包含SEQ ID NO：17～24所示的任一氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：17～24所示的任一氨基酸序列具有至少85％同一性的序列，优选至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的序列，或者与所述序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、***或缺失)的氨基酸序列。
所述重链可变区序列优选SEQ ID NO：25～35所示的任一氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：25～35所示的任一氨基酸序列具有至少85％同一性的序列，优选至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的序列，或者与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个)保守氨基酸突变(优选置换、***或缺失)的氨基酸序列；
所述轻链可变区序列优选SEQ ID NO：36～46所示的任一氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：36～46所示的任一氨基酸序列具有至少85％同一性的序列，优选至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的序列，或者与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个)保守氨基酸突变(优选置换、***或缺失)的氨基酸序列。
在一些实施例中，重链可变区序列是SEQ ID NO：25；轻链可变区序列是SEQ IDNO：36，或者，与所述序列具有大于85％同一性的序列；优选至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的序列，或者与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个)保守氨基酸突变(优选置换、***或缺失)的氨基酸序列。
在优选的实施例中，重链可变区序列是SEQ ID NO：25；轻链可变区序列是SEQ IDNO：38、39、41、42、43、44或45，或者，与所述序列具有大于85％同一性的序列；优选至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的序列，或者与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个)保守氨基酸突变(优选置换、***或缺失)的氨基酸序列。
在优选的实施例中，重链可变区序列是SEQ ID NO：26；轻链可变区序列是SEQ IDNO：37，或者，与所述序列具有大于85％同一性的序列；优选至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的序列，或者与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个)保守氨基酸突变(优选置换、***或缺失)的氨基酸序列。
在优选的实施例中，重链可变区序列是SEQ ID NO：27、28、29、30、32、33或34中的任一种；轻链可变区序列是SEQ ID NO：36，或者，与所述序列具有大于85％同一性的序列；优选至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的序列，或者与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个)保守氨基酸突变(优选置换、***或缺失)的氨基酸序列。
在优选的实施例中，重链可变区序列是SEQ ID NO：31；轻链可变区序列是SEQ IDNO：40，或者，与所述序列具有大于85％同一性的序列；优选至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的序列，或者与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个)保守氨基酸突变(优选置换、***或缺失)的氨基酸序列。
在进一步优选的实施例中，重链可变区序列是SEQ ID NO：34；轻链可变区序列是SEQ ID NO：38、42、43、44或46中的任一种，或者，与所述序列具有大于85％同一性的序列；优选至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的序列，或者与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个)保守氨基酸突变(优选置换、***或缺失)的氨基酸序列。
在进一步优选的实施例中，重链可变区序列是SEQ ID NO：35；轻链可变区序列是SEQ ID NO：36、38、42或46中的任一种。且更优选的是包含SEQ ID NO：35和36的抗体，或者，与所述序列具有大于85％同一性的序列；优选至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的序列，或者与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个)保守氨基酸突变(优选置换、***或缺失)的氨基酸序列。
一种多核苷酸，其编码上述任一抗PCSK9抗体或抗原结合片段的氨基酸序列，或与其具有至少85％同一性的序列，优选至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的序列，或者与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个)保守核苷酸突变(优选置换、***或缺失)的核苷酸序列。
一种载体，其包含上述多核苷酸。
一种宿主细胞，其包含上述任一种抗体、抗原结合片段、多核苷酸、载体。所述宿主细胞包含原核细胞、酵母、昆虫或哺乳动物细胞。
一种组合物，其包含上述任一项的抗体、抗原结合片段、多核苷酸或载体及其药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂；或任选地与另一种治疗剂组合。所述的治疗剂包括：他汀类药物；所述他汀类药物包括：辛伐他汀、匹伐他汀、美伐他汀、阿托伐他汀、西利维司汀、氟伐他汀、洛伐他汀和普伐他汀中的一种或者几种的组合物。
一种包含上述全人源抗PCSK9抗体或其抗原结合片段的偶联物，所述偶联物为可检测的标记，所述可检测的标记包括荧光物质、发光物质、有色物质、放射性同位素或酶。
上述抗PCSK9抗体或其抗原结合片段在制备检测PCSK9在样品中存在的试剂中的应用将待测样品与本发明中的任一抗PCSK9抗体或其抗原结合片段接触，然后检测PCSK9或其片段与抗PCSK9抗体或其抗原结合片段的复合物的存在，所述复合物指示PCSK9的存在。
上述全人源抗PCSK9抗体或其抗原结合片段的偶联物在制备检测PCSK9在样品中存在的试剂中的应用。
上述抗PCSK9抗体或其抗原结合片段在制备用于预防或治疗可用PCSK9拮抗剂减轻、改善、抑制或预防的疾病或症状的药物中的应用；
其中，所述的疾病或症状包括高胆固醇血症、他汀类药物不耐受症、高血脂症、非酒精性脂肪肝、肥胖症、糖尿病、动脉粥样硬化、心脑血管疾病、肾病，所述的高胆固醇血症包括原发性高胆固醇血症、混合型高胆固醇血症和家族性高胆固醇血症。
本发明中所述抗体或其抗原结合片段选自如下结构形式：全长抗体、Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fv、scFv、双链抗体、微抗体、双特异抗体、多特异抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、重链可变区和完整轻链融合的抗体功能性片段VH-L和一个或多个CDR的排列、串联或组合而成的抗体功能性片段。
本发明所述抗体或抗体片段为胆固醇及脂类代谢性疾病等病症的诊断、预防和治疗提供了新的药物。
有益效果：
(1)本发明采用全人源噬菌体抗体库筛选靶向PCSK9的抗体，获得的抗体是全人源的，最大程度降低了免疫原性，消除了人抗鼠免疫反应，延长了抗体药物半衰期(Methods,2005,36(1):3-10)。
(2)本发明采用一步PCR法，仅在抗体CDR区的关键氨基酸位点引入限定性突变，极大提高了抗体亲和力成熟的效率和成功率(BMC biotechnology,2008,8(1):91；MAbs,2012,4(6):664-672)。
(3)本发明所述全长抗体Fc段经过改造，降低了对Fcγ受体以及补体C1q的亲和力，消除了ADCC和CDC细胞毒性作用(Current Opinion in Biotechnology 2009,20(6):685-691)。
附图说明
图1：pTT5-hPCSK9质粒图谱。Amp：氨苄抗性基因；PCSK9：PCSK9编码基因；CMV：CMV启动子；6×His tag：组氨酸标签。
图2：10％(w/v)SDS-PAGE和Western Blot分析鉴定纯化的重组人PCSK9蛋白。
A.SDS-PAGE分析鉴定纯化的重组人PCSK9蛋白，M：蛋白Marker；泳道1：纯化的重组人PCSK9蛋白。B.Western Blot鉴定纯化的重组人PCSK9蛋白。
图3：Phage ELISA检测筛选出的抗人PCSK9单链抗体阳性克隆与人PCSK9蛋白的相对亲和力。其中，PCSK9：包被5μg/mL人PCSK9；BSA：包被5μg/mL BSA；M13K07：未展示任何单链抗体的辅助噬菌体M13K07；n＝3,means±SEM。
图4：pET 27b-AP2质粒图谱。Kan：卡那霉素抗性基因；AP2：AP2编码基因；His tag：组氨酸标签。
图5：12％(w/v)SDS-PAGE和Western Blot鉴定亲本单链抗体AP2。
A.镍柱纯化的单链抗体AP2，泳道1：破碎上清；泳道2：镍柱纯化穿透液；泳道3：含50mM咪唑的PBS缓冲液洗脱液；泳道4：含100mM咪唑的PBS缓冲液洗脱液；M，蛋白Marker；泳道5-8：含500mM咪唑的PBS缓冲液洗脱液。
B.Western Blot鉴定单链抗体AP2。
图6：亲本单链抗体AP2的CDR区氨基酸保守性和替代序列(偏好性)分析。在KABAT数据库(http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html)下载与AP2同一chothia分类下的所有抗体序列后，采用WebLogo website在线作图分析各位点的氨基酸保守性和氨基酸偏好性(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)，图中氨基酸字母大小代表该氨基酸出现的频率。
图7：Phage ELISA检测单链抗体AP2的CDR区突变体(AP2M No.1～16)与人PCSK9抗原蛋白的相对亲和力。其中，PCSK9：5μg/mL人PCSK9包被；BSA：5μg/mL BSA包被；M13K07：未展示任何单链抗体的辅助噬菌体M13K07；n＝4,means±SEM。
图8：单链抗体AP2及其CDR区突变体(AP2M No.1～16)的重链可变区、轻链可变区与CDR区序列。采用DNAstar.lasergene.v7.1.分析软件对抗体序列进行比对，并依据Kabat编号方案(Kabat numbering scheme)对抗体可变区氨基酸序列进行编号，其中，用字母(a、b、c等)编号的氨基酸残基表示由Kabat编码方案所定义的***残基，粗体表示基于AbM定义(AbM definition)划分的CDR区，“-”表示该位点氨基酸残基与亲本相同。
图9：12％(w/v)SDS-PAGE鉴定纯化的单链抗体AP2的CDR区突变体(AP2M No.1～16)。
A.M：蛋白Marker；泳道1-8：AP2的CDR区突变体(AP2M No.1～8)。
B.M：蛋白Marker；泳道9-16：AP2的CDR区突变体(AP2M No.9～16)；泳道17：Ali-scFv阳性对照(抗体Alirocumab的重链可变区和轻链可变区通过柔性肽(G4S)3连接的单链抗体)。
图10：单链抗体AP2及其CDR区突变体(AP2M No.1～16)对HepG2细胞LDLR蛋白水平及LDL-C吸收的影响。
A.对PCSK9介导的HepG2细胞表面LDLR降解的抑制作用，其中，*P<0.05vs PCSK9group；#P<0.05vs AP2 group；n＝3,means±SEM。
B.对PCSK9介导的HepG2细胞摄取LDL-C下调的抑制作用，其中，*P<0.05vs PCSK9group；#P<0.05vs AP2 group；n＝3,means±SEM。
图11：单链抗体AP2及其交叉克隆突变体(AP2M No.17～25)的重链可变区、轻链可变区与CDR区序列。采用DNAstar.lasergene.v7.1.分析软件对抗体序列进行比对，并依据Kabat编号方案(Kabat numbering scheme)对抗体可变区氨基酸序列进行编号，其中，用字母(a、b、c等)编号的氨基酸残基表示由Kabat编码方案所定义的***残基，粗体表示基于AbM定义(AbM definition)划分的CDR区，“-”表示该位点氨基酸残基与亲本相同。
图12：12％(w/v)SDS-PAGE鉴定纯化的单链抗体AP2的交叉克隆突变体(AP2MNo.17～25)。M：蛋白Marker；泳道1-9：单链抗体AP2的交叉克隆突变体(AP2M No.17～25)。
图13：单链抗体AP2的交叉克隆突变体(AP2M No.17～25)对HepG2细胞LDLR蛋白水平及LDL-C吸收水平的影响。
A.对人PCSK9介导的HepG2细胞表面LDLR降解的抑制作用，其中：*P<0.05vs PCSK9group；#P<0.05vs AP2 group；n＝3,means±SEM。
B.对人PCSK9介导的HepG2细胞摄取LDL-C下调的抑制作用，其中：*P<0.05vsPCSK9 group；#P<0.05vs AP2 group；n＝3,means±SEM。
图14：Western Blot检测单链抗体AP2交叉克隆突变体(AP2M No.18、21)给药后对高血脂模型小鼠肝脏细胞LDLR蛋白水平的影响。其中：*P<0.05vs Model group；**P<0.01vs Model group；#P<0.05vs AP2 group；##P<0.01vs AP2group；ΔΔP<0.01vs Normalgroup；n＝3,means±SEM。
图15：pTT5-AP2/AP2M-HC和pTT5-AP2/AP2M-LC重组表达质粒图谱。Amp：氨苄抗性基因；AP2/AP2M-HC：AP2或AP2M重链编码基因；AP2/AP2M-LC：AP2或AP2M轻链编码基因；CMV：CMV启动子。
图16：12％(w/v)SDS-PAGE检测纯化的全长抗人PCSK9抗体(注：FAP2：亲本单链抗体AP2的全长抗体；FAP2M18及FAP2M21：为单链抗体AP2交叉克隆突变体(AP2M No.18、21)的全长抗体；Alirocumab：阳性对照全长抗体)。
A.非还原SDS-PAGE检测：泳道M，蛋白Marker；泳道1-4：FAP2、FAP2M18、FAP2M21、Alirocumab。B.还原SDS-PAGE检测：泳道M，蛋白Marker；泳道1-4：FAP2、FAP2M18、FAP2M21、Alirocumab。
图17：全长抗人PCSK9抗体对HepG2细胞LDLR表达水平及LDL-C吸收水平的影响(注：FAP2：亲本单链抗体AP2的全长抗体；FAP2M18及FAP2M21：为单链抗体AP2交叉克隆突变体(AP2M No.18、21)的全长抗体；Alirocumab：阳性对照全长抗体)。
A.对人PCSK9介导的HepG2细胞表面LDLR降解的抑制作用，其中：*P<0.05vs PCSK9group；**P<0.01vs PCSK9 group；##P<0.01vs Mock group；n＝6,means±SEM。
B.对HepG2细胞摄取LDL-C下调的抑制作用，其中：**P<0.01vs PCSK9group；###P<0.001vs Mock group；n＝5,means±SEM。
图18：Western Blot检测全长抗人PCSK9抗体尾静脉给药后对高血脂模型小鼠肝细胞LDLR蛋白水平的影响(注：FAP2M21：为单链抗体AP2交叉克隆突变体(AP2M No.21)的全长抗体；Alirocumab：阳性对照全长抗体)。其中：*P<0.05vs Model group；**P<0.01vsModel group；***P<0.001vs Model group；####P<0.0001vs Normal group；n＝3,means±SEM。
具体实施方式
以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
下述实例中所用的材料、试剂、装置、仪器、设备等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下面结合具体实施例对本发明进一步说明。应理解，该实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1、人PCSK9蛋白的表达纯化与鉴定
1.1重组人PCSK9真核表达载体的构建
人PCSK9编码基因(登录号：NM_174936.3)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，然后亚克隆至真核表达载体pTT5上，并将该重组表达质粒命名为pTT5-hPCSK9(图1)，为方便表达产物的纯化，在PCSK9编码基因3’端引入6×组氨酸标签(6×His-tag)。
1.2重组人PCSK9蛋白的表达与纯化
利用阳离子聚合物聚乙酰亚胺(Polyethyleneimine,PEI)将上述重组人PCSK9表达质粒pTT5-hPCSK9转染至CHO 3E7细胞中进行瞬时表达。HycloneTMHycell CHO Medium无血清培养基(GE公司，cat#SH30933.02)悬浮培养7天后，离心收集细胞培养液上清，镍离子亲和柱(GE公司，cat#17-5318-01)及Superdex 200分子排阻层析(GE公司，cat#28-9909-44)分离纯化得到重组人PCSK9蛋白，并采用10％(w/v)SDS-PAGE对其进行分析鉴定(图2A)。
1.3重组人PCSK9蛋白的Western Blot鉴定
将纯化得到的人PCSK9蛋白进行SDS-PAGE电泳(分离胶浓度为10％)后，4℃、100V恒压转印100min，将蛋白转印到PVDF膜(Roche,cat#03010040001)上。将膜置于5％MTBST(含有5％脱脂牛奶和0.1％吐温20的TBS)中室温封闭1h。用5％MTBST按1∶3000稀释Anti-PCSK9 rabbit monoclonal antibody抗体(Abcam,cat#ab181142)，室温孵育2h，TBST洗涤3遍，每次10min。用5％MTBST按1∶5000稀释HRP-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG二抗(上海生工，cat#D110058)，室温孵育1h，TBST洗涤3遍，每次10min，ECL显色(图2B)。
实施例2、噬菌体人源单链抗体库的构建
噬菌体人源单链抗体库的构建参照文献(Nat Biotechnol,2000,18(1):75-80；Immunotechnology,1998,3(4):271-278)方法进行。以105份健康人外周血及58份肿瘤病人外周血为来源，使用密度梯度离心的方法分离产生抗体的外周血淋巴细胞，提取总RNA，并逆转录合成cDNA，以此为模版，选用人特异性抗体可变区6条重链上游引物、4条重链下游引物、7条λ链上游引物和3条λ链下游引物进行PCR扩增，再于其两端分别加上Sfi I及Not I两个酶切位点序列和Linker序列，经SOE-PCR连接重链和轻链序列得到单链抗体scFv片段。按常规分子克隆操作，将单链抗体scFv片段克隆到噬菌粒载体pCANTAB 5E的Sfi I及Not I两个酶切位点间。将单链抗体scFv片段与噬菌粒pCANTAB 5E的连接产物通过电转化的方法转入大肠杆菌TG1超级感受态细胞(Methods Mol Biol,2004(248):117-134)，收集阳性菌落，得到人源单链抗体库。通过滴度测定表明，最终获得库容为1.1×108的噬菌体人源单链抗体库。
实施例3、全人源抗人PCSK9单链抗体的筛选
3.1抗人PCSK9单链抗体的固相淘选与富集
以包被缓冲液(50mM NaHCO3,pH9.6)稀释人PCSK9蛋白至60μg/mL，取1mL加入免疫管(北京宝科维食安生物技术有限公司，cat#444202)中，旋转摇床4℃包被过夜(二、三、四轮PCSK9蛋白包被浓度依次为30μg/mL、15μg/mL、7.5μg/mL)。次日，弃上清，PBS迅速洗涤免疫管3次，5％MPBS(含有5％脱脂牛奶的PBS)于37℃封闭2h。弃封闭液，用PBS迅速洗涤免疫管3次，将活化的噬菌体抗体库(～1012pfu)悬浮于4mL2％MPBS并加入到免疫管中，置于旋转摇床上反复旋转2h后，以含0.1％Tween-20的PBS洗涤免疫管5次，再以PBS洗涤免疫管5次(逐轮两倍递增洗涤次数)。加入1mL三乙胺(100mM)，室温反复旋转孵育10min，吸出洗脱的噬菌体，并用0.5mL Tris-HCL(1.0M,pH7.4)中和，混匀。中和后的噬菌体感染50mL对数期的大肠杆菌TG1后，扩大培养至200mL，加入辅助噬菌体M13K07，30℃培养过夜。次日离心收集培养液上清，经PEG/NaCL(20％(w/v)PEG 8000,2.5M NaCl)沉淀后用于下一轮淘选，共淘选4轮。
3.2 Phage ELISA筛选抗人PCSK9单链抗体
将3～5轮洗脱下的噬菌体颗粒感染大肠杆菌TG1后涂平板，用牙签挑单菌落至96孔深孔板(Corning公司，cat#3590)中，每孔500μL 2×YT-A(含100μg/mL氨苄青霉素)培养基，37℃培养过夜。将过夜培养物每孔50μL接至新的深孔板2×YT-AG(含100μg/mL氨苄青霉素和1％(w/v)葡萄糖)中，37℃培养至对数期，按TG1：M13KO7＝1：20的比例加入辅助噬菌体M13K07，37℃依次静置和震荡(220rpm)30min。于2000rpm，离心10min后彻底吸去上清。每孔用500μL 2×YT-AK(含100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素)培养基重悬，30℃，220rpm培养16h左右。次日将深孔板于2000rpm，离心10min后，上清即为展示的噬菌体抗体，用于phage ELISA筛选。
用包被缓冲液稀释人PCSK9蛋白至5μg/mL，100μL每孔加入到96孔酶标板中，4℃包被过夜。吸出人PCSK9包被液后，用5％MPBS封闭液37℃封闭2h，离心去除封闭液。将上述获得的单克隆噬菌体上清液加入到已包被抗原的96孔酶标板中，37℃温育2h。TBST洗板10次，每孔加入辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)标记的anti-M13抗体(北京义翘神州公司，cat#11973-MM05T-H)，37℃温育1h。TBST洗板10次，加底物3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)显色，酶标仪测定OD450nm值。以M13KO7孔作为阴性对照，以吸光度高于阴性对照值三倍以上作为阳性克隆，对亲和力较高的阳性克隆进行测序，得到15株野生型阳性克隆(pCANTAB 5E-AP1～15)，分别表达单链抗体AP1-15(图3)。将亲和力最高的AP2选作进一步体外亲和力成熟的亲本，其重链可变区序列见SEQ ID NO：25，轻链可变区序列见SEQ IDNO：36。
实施例4、单链抗体AP2的可溶性表达及分离纯化
按常规分子克隆操作，将得到的单链抗体AP2的基因亚克隆至表达载体pET27b，得到重组质粒pET27b-AP2(图4)，并转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。将该重组菌接种至2×YT-K(含50μg/mL卡那霉素)培养基，37℃培养至OD600nm＝0.6，加入终浓度为0.2mM的IPTG，16℃诱导表达20h。4640rpm，4℃离心10min，收集菌体。用0.4mol/L精氨酸缓冲液(pH 8.0)4℃孵育40min提取周质空间蛋白。12000rpm，4℃离心30min，收集上清。上清经0.22μm滤膜过滤后，过镍柱进行分离纯化，用不同浓度的咪唑洗脱杂蛋白与目的蛋白。12％(w/v)SDS-PAGE检测收集的样品(图5A)；将含目的蛋白的洗脱液超滤浓缩，再用Superdex75分子排阻层析(GE公司，cat#17-5174-01)进一步纯化单链抗体，并用Anti-6×His rabbit polyclonalantibody抗体(上海生工，cat#D110002)对纯化的蛋白进行Western Blot鉴定(图5B)。
实施例5、抗人PCSK9单链抗体AP2体外亲和力成熟
5.1以单链抗体AP2为亲本构建次级突变体库
对抗体氨基酸序列进行编号(numbering)是识别抗体CDR区、分析各个位点氨基酸分布及鉴别关键氨基酸的关键(Journal of Molecular Biology,2016,429(3):356-364)。本发明采用应用最广泛的Kabat编号方案(Kabat numbering scheme)对单链抗体AP2重链可变区和轻链可变区的每个氨基酸位点进行编号(www.abysis.org)，该方案通过在抗体长度变化的区域引入a,b,c等字母标识的方法，避免了常规编号方法造成的同一位点氨基酸位数的不一致，并保证保守氨基酸位点在不同的抗体中的一致性(PROTEINS:Structure,Function,and Genetics,1996,25:130-133)。此外，本发明优选AbM定义(AbM definition)方法划分单链抗体AP2的CDR区，因为AbM定义是Kabat定义(Kabat definition)和Chothia定义(Chothia definition)之间的最佳折中(compromise)，并且被Oxford Molecular′sAbM抗体建模软件所使用(Methods in molecular biology,2004,248:51-91)。
在亲本单链抗体AP2的6个CDR区分别引入限定性突变以构建次级突变库，其中对HCDR1、HCDR2、LCDR1、LCDR2、LCDR3区使用Kabat数据库分析其氨基酸保守性和突变情况后(图6)，设计简并寡核苷酸引物引入限定性突变(Journal of Biotechnology,2015,194:27-36)，对于HCDR3区，分析其突变热点(Mutational hot-spot,AGY/RGYW)后设计简并寡核苷酸引物在该热点引入随机突变(Journal of Molecular Biology,2011,414(4):545-562.)。AP2 CDR区突变所用引物见表1，其中M＝A/C，R＝A/G，W＝A/T，S＝G/C，Y＝C/T，K＝G/T，V＝A/G/C，H＝A/C/T，D＝A/G/T，B＝G/C/T，N＝A/G/C/T。
表1 AP2各CDR区突变所用引物
注：粗体+下划线表示碱基突变位点
以施例3.2中编码亲本单链抗体AP2的重组质粒pCANTAB 5E-AP2为模板，采用快速高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase(Takara公司，cat#R045A)和各CDR区引物分别对6个CDR区进行全质粒PCR扩增，PCR扩增产物胶回收后经Dpn I酶切和乙醇沉淀后电转化大肠杆菌E.coli TG1超级感受态细胞，即为突变体次级库。经多次电转化积累库容，使突变体库库容量达到4.2×107。
5.2次级突变体库的生物淘选和阳性克隆筛选
采用实施例3的方式进行生物淘选和阳性克隆筛选(图7)，对亲和力较高的克隆进行测序，共得到16个AP2的CDR区突变体单链抗体，分别命名为AP2M1、AP2M2、AP2M3、AP2M4、AP2M5、AP2M6、AP2M7、AP2M8、AP2M9、AP2M10、AP2M11、AP2M12、AP2M13、AP2M14、AP2M15和AP2M16。其突变的CDR区氨基酸序列见图8。
5.3单链抗体AP2及其CDR区突变体亲和力常数测定
按照实施例4方法表达和纯化单链抗体AP2及其CDR区突变体AP2M1～16蛋白，12％(w/v)SDS-PAGE鉴定结果见图9。采用ForteBio Octet QKe生物大分子相互作用分析仪测定AP2及其CDR区突变体AP2M1～16蛋白与人PCSK9的亲和力常数，基本过程如下：将人PCSK9蛋白与生物素以摩尔比1：5混匀，室温孵育2h，G25柱去除未反应的生物素，即得到生物素化的人PCSK9。测定前将仪器提前开机45min以上，将生物传感器置于1×SD buffer(PBS，pH7.4，0.02％Tween 20，0.1％BSA)中水化(Hydrate)至少10min。在黑色96孔板(Corning公司，cat#MH0255)的第1列和第3列每孔加入200μL SD Buffer。用SD Buffer将生物素化的人PCSK9稀释至50μg/mL，加至第2列，每孔200μL。将待测单链抗体用SD Buffer从6000nM或3000nM至少稀释4个浓度梯度，加入至第4列，每孔200μL，该列最后一个孔加SD Buffer作为对照孔。将96孔板放入Octet QKe生物大分子相互作用仪中，并设定运行程序，将链霉亲和素生物传感器(Streptavidin biosensors)依次在SD buffer中平衡60s，生物素化PCSK9中Loading 300s及在SD buffer中平衡120s后，与单链抗体结合300s并在SD buffer中解离600s。采用ForteBio Octet QKe数据分析软件计算平衡解离常数KD值和其它动力学参数。结果(表2)显示，单链抗体AP2及其CDR区突变体AP2M1～16均能与PCSK9结合。
表2.单链抗体AP2及其CDR区突变体结合PCSK9的结合速率常数(kon)、解离速率常数(koff)与平衡解离常数(KD)
序号
clones
kon(M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>)
koff(s<sup>-1</sup>)
KD(M)
1
AP2
1.41E+04
1.23E-03
8.72E-08
2
AP2M1
3.52E+05
6.08E-03
1.73E-08
3
AP2M2
1.01E+04
1.04E-03
1.03E-07
4
AP2M3
4.59E+04
2.23E-03
4.87E-08
5
AP2M4
1.36E+05
4.38E-02
3.22E-07
6
AP2M5
7.02E+04
2.11E-03
3.00E-08
7
AP2M6
1.44E+05
3.49E-03
2.41E-08
8
AP2M7
6.12E+04
7.89E-03
1.29E-07
9
AP2M8
5.40E+04
2.90E-03
5.37E-08
10
AP2M9
9.41E+04
5.39E-03
5.73E-08
11
AP2M10
1.27E+05
3.32E-03
2.62E-08
12
AP2M11
7.03E+02
8.23E-02
1.17E-04
13
AP2M12
9.14E+04
2.28E-03
2.50E-08
14
AP2M13
4.67E+04
8.30E-04
1.78E-08
15
AP2M14
5.72E+04
2.80E-03
4.89E-08
16
AP2M15
1.19E+04
6.81E-04
5.72E-08
17
AP2M16
6.48E+04
1.43E-02
2.21E-07
18
Ali-scFv
8.93E+03
4.55E-04
5.09E-08
实施例6、单链抗体AP2及其CDR区突变体体外活性检测
6.1单链抗体AP2及其CDR区突变体对PCSK9介导的LDLR降解的抑制
HepG2细胞于10％FBS的MEM培养基中，在37℃和5％CO2条件下培养至对数期，5×105cells/孔接种于6孔细胞培养板，500μL/孔，培养过夜。次日，将原培养基换成不含血浆的opti-MEM培养基继续孵育12h。将HepG2细胞分为3组：第1组为阴性对照(Mock组)；第2组加入终浓度为20μg/mL的PCSK9蛋白；其余各给药组分别加入终浓度为20μg/mL的PCSK9蛋白和50μg/mL的抗PCSK9单链抗体AP2或其CDR区突变体(AP2M1～16)或Ali-scFv。37℃继续培养12h。
将细胞从6孔板消化下来，加入适量RIPA裂解缓冲液冰上裂解30min，12000rpm离心10min，上清液用于Western Blot分析，检测HepG2细胞总LDLR变化。其中一抗为RabbitAnti-LDL Receptor antibody(Abcam，cat#ab52818)，二抗使用HRP-conjugated GoatAnti-Rabbit IgG(上海生工，cat#D110058)。
结果(图10A)表明，PCSK9可有效促进HepG2细胞表面LDLR降解，而单链抗体AP2及其CDR区突变体(AP2M1～16)可不同程度抑制PCSK9对HepG2细胞LDLR的降解作用。
6.2单链抗体AP2及其CDR区突变体对HepG2细胞摄取LDL-C的影响
按6.1所述方法，用单链抗体AP2及其CDR区突变体(AP2M1～16)处理细胞12h后，每孔加入1.5μg DiI-LDL(广州奕元生物公司，cat#YB-0011)，继续培养4h，PBS洗涤两次后，全波长酶标仪检测每孔的荧光强度(激发波长520nm，发射波长580nm)。以不加人PCSK9蛋白处理的HepG2细胞为对照，比较不同药物处理后细胞摄取LDL的活性变化(图10B)。
通过比较亲和力和生物学活性，获得6株亲和力和生物活性均较好的AP2的CDR区突变体单链抗体：AP2M3、AP2M10、AP2M12、AP2M13、AP2M14、AP2M15。其重链可变区(HCVR)序列及轻链可变区(LCVR)序列见图11。
实施例7、单链抗体AP2的CDR区突变体进一步体外亲和力成熟
7.1单链抗体AP2的CDR区突变体的交叉克隆
采用重叠延伸PCR方法将来源于同一个亲本抗体的各突变体的CDR区进行交叉克隆(cross-cloning)(Molecular Immunology,2008,46(1):135-144)，以获得亲和力和活性更优的抗人PCSK9单链抗体。AP2的CDR区突变体单链抗体具有相同的框架区，因此，可以框架区序列为模板设计引物(表3)，通过重叠延伸PCR(overlap PCR)，对实施例6中6株亲和力和生物活性均较好的AP2的CDR区突变体单链抗体(AP2M3、AP2M10、AP2M12、AP2M13、AP2M14、AP2M15)的CDR区进行交叉克隆(cross-cloning)。例如，将AP2M13(HCDR1)和AP2M12(LCDR1)通过重叠延伸PCR进行组合，得到一个新的单链抗体(命名为AP2M17)，其重链可变区序列见SEQ NO.34，轻链可变区序列见SEQ NO.42。按照此方法得到9株交叉克隆(cross-cloned)突变体抗体(图11)。
表3单链抗体AP2的CDR区突变体交叉克隆所用引物
7.2交叉克隆突变体抗体亲和力常数测定
按实施例4方法，表达和纯化图11中的9株交叉克隆抗体，并采用12％(w/v)SDS-PAGE对其纯度进行鉴定(图12)。采用实施例5.3方法测定其与人PCSK9的亲和力常数，结果见表4。
表4.交叉克隆突变体抗体与PCSK9的结合速率常数(kon)、解离速率常数(koff)和平衡解离常数(KD)
序号
交叉克隆抗体
kon(M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>)
koff(s<sup>-1</sup>)
KD(M)
1
AP2M17
7.85E+04
1.14E-03
1.46E-08
2
AP2M18
1.08E+04
5.41E-04
5.03E-08
3
AP2M19
8.98E+05
1.07E-02
1.18E-08
4
AP2M20
5.31E+04
1.51E-03
2.84E-08
5
AP2M21
1.29E+05
4.67E-04
3.61E-09
6
AP2M22
4.54E+04
6.13E-04
1.35E-08
7
AP2M23
9.58E+04
4.15E-03
4.33E-08
8
AP2M24
1.85E+05
1.91E-03
1.03E-08
9
AP2M25
4.17E+04
1.85E-03
4.43E-08
7.3交叉克隆突变体抗体生物学活性测定
按实施例6方法，检测交叉克隆突变体抗体处理后对HepG2细胞LDLR水平及LDL-C吸收的影响。结果显示，交叉克隆突变体抗体处理HepG2细胞后，可显著抑制PCSK9介导的LDLR降解(图13A)，同时显著上调HepG2细胞对LDL-C的吸收(图13B)。其中，AP2M18和AP2M21活性最高。
7.4交叉克隆突变体抗体AP2M18和AP2M21小鼠体内降血脂活性测定
C57BL/6雄性小鼠适应性饲养一周，随机分为正常组、模型组和4个给药组(AP2组、AP2M18组、AP2M21组和Ali-scFv组)，n＝6。按文献(GENE THERAPY,1999,6(7):1258-1266)所述方法造模，5s内尾静脉注射人PCSK9表达质粒pTT5-hPCSK9(50μg于2mL生理盐水中)，使人PCSK9在小鼠体内过表达，正常对照组注射生理盐水。造模第6天，给药组小鼠腹腔注射给予单链抗体(10mg/kg，于200μL PBS中)，模型组和正常对照组给予等体积PBS。给药后小鼠禁食不禁水饲养18h，于次日摘眼球采集血液和肝脏，血样于4℃冰箱放置4h，4000rpm离心15min，取上层血清，用LDL-C检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，cat#A113-1)和TC检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，cat#A111-1)测定血清中LDL-C、TC水平。同时，小鼠肝脏经匀浆和RIPA裂解液处理后，Western Blot检测各组LDLR及PCSK9蛋白水平。结果表明，AP2M21可显著降低血浆LDL-C(39.04％)和TC(26.01％)(表5)，并显著抑制PCSK9介导的LDLR降解(图14)，其活性与阳性对照Ali-scFv相当。
表5抗PCSK9单链抗体对高血脂模型小鼠血浆胆固醇LDL-C、TC水平的影响
“n”表示动物数，“##”表示和正常对照组相比，P<0.01；“*”、“**”表示和模型对照组相比，P<0.05、0.01(n＝6，values are means±SEM)。
实施例8、全长抗体构建及生物活性分析
8.1全长抗体制备
采用常规分子生物学方法，构建亲本单链抗体AP2以及交叉克隆突变体抗体AP2M18和AP2M21的全长抗体。具体过程如下：将VL序列连接到λ型轻链恒定区(SEQ NO.47)，将VH序列连接到IgG1重链恒定区(SEQ NO.48)，并分别亚克隆至真核表达载体pTT5中(图15)。同时在VH和VL的N端引入Kozak序列(GCCGCCACC)和信号肽序列。此外，为降低ADCC和CDC效应，将重链恒定区序列第234、235位氨基酸突变为Ala，第297位氨基酸突变为Gly，同时去除C末端Lys，以提高全长抗体表达产物均一性(Cellular Immunology 2000,200(1):16-26；Journal of biological chemistry 2017,292(5):1865-1875；Journal ofPharmaceutical Sciences,2016,105(7):2066-2072)。同时，将阳性对照抗体Alirocumab重链和轻链基因分别克隆至表达载体pTT5中。
采用PEI转染方法，将上述重链和轻链表达质粒共转染CHO 3E7细胞，无血清培养基培养7天后收集细胞培养液上清，protein A柱(Roche公司，cat#11134515001)亲和层析纯化后得到与AP2、AP2M18和AP2M21相对应的抗PCSK9全长抗体(图16)，并分别命名为FAP2、FAP2M18、FAP2M21。
8.2全长抗体体外活性检测
按实施例6方法，检测全长抗体FAP2、FAP2M18及FAP2M21对HepG2细胞LDLR蛋白水平和LDL-C吸收功能的影响。结果显示，全长抗体FAP2M21可显著抑制PCSK9对LDLR的降解(图17A)，并显著增强HepG2细胞LDL-C吸收功能(图17B)，其活性与阳性对照Alirocumab相当。
8.3 Fortebio OctetQKe测定全长抗体亲和力常数
按实施例5.3方法，测定FAP2M21及其亲本抗体FAP2和阳性对照Alirocumab与人PCSK9的亲和力常数，抗体浓度梯度设置为800nM，400nM，200nM和100nM，流经固定化(Immobilize)人PCSK9蛋白的SA传感器表面，测定抗体亲和力常数，结果见表6。
表6.抗PCSK9全长抗体亲和力常数
序号
抗PCSK9抗体
kon(M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>)
koff(s<sup>-1</sup>)
KD(M)
1
FAP2
1.76E+05
5.76E-03
3.28E-08
2
FAP2M21
3.33E+03
4.68E-06
1.41E-09
3
Alirocumab
8.04E+04
6.87E-05
8.54E-10
8.4抗PCSK9全长抗体小鼠体内降血脂活性检测
按实施例7.4方法建立高血脂小鼠模型，48只C57BL/6雄性小鼠共分为8组(n＝6)，设正常对照和模型组各1组，给药组共6组。造模后第6天开始尾静脉注射给药(给药容积200μL)，正常组和模型组给予生理盐水，阳性对照药Alirocumab和FAP2M21抗体均按低、中、高剂量(分别为1，3，10mg/kg)给药。
给药后小鼠禁食不禁水饲养18h，于次日摘眼球采集血液和肝脏，并按实施例7.4所述方法检测小鼠血清中LDL-C、TC水平，同时Western Blot检测小鼠血清中PCSK9及肝脏组织中LDLR蛋白水平。结果显示，FAP2M21和Alirocumab均可显著抑制PCSK9介导的LDL-R的降解(图18)，同时剂量依赖性降低小鼠血浆中LDL-C和TC水平(表7)。与模型组相比，FAP2M21抗体低、中、高剂量给药组LDL-C水平分别降低了3.3％、30.2％、37.2％，TC水平降低了5.2％、12.8％、16.7％，其降血脂活性与阳性对照药Alirocumab相当。
表7抗PCSK9全长抗体对高血脂模型小鼠血清LDL-C、TC水平的影响
“n”表示动物数，“###”表示和正常对照组相比，P<0.001；“*”、“**”表示和模型对照组相比，P<0.05、0.01(n＝6，values are means±SEM)。
序列表
<110> 中国药科大学
<120> 全人源抗PCSK9抗体、其抗原结合片段及其应用
<160> 48
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser
1 5 10
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Gly Tyr Glu Phe Ser Asp Tyr Phe Met Thr
1 5 10
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Gly Phe Glu Phe Arg Arg Tyr Thr Leu Asn
1 5 10
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Gly Phe Glu Ile Arg Arg Tyr Glu Phe Asn
1 5 10
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Gly Cys Ile Phe Leu Ile Tyr Glu Cys Thr
1 5 10
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Gly Val Asn Phe Asn Trp Tyr Glu Leu Ser
1 5 10
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr
1 5 10
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Thr Ile Glu Lys Ser Ser Glu Ser Arg Ser
1 5 10
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Arg Ala Val Gly Gln Gly Trp Arg Phe
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Arg Ala Val Gly Gln Gly Ser Leu Tyr
1 5
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Arg Ala Val Gly Gln Gly Tyr His Thr
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Arg Ala Val Gly Gln Gly Ser Glu Tyr
1 5
<210> 13
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn
1 5 10
<210> 14
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Pro Trp Val Phe
1 5 10
<210> 15
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Ser Glu Val Phe
1 5 10
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Ala Arg Val
1 5 10
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Ala Tyr Trp Asp Asp Thr Leu Ser Ala Arg Leu
1 5 10
<210> 19
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Ser Ser Trp Asp Pro Ser Leu Leu Leu Gly Val
1 5 10
<210> 20
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Asp Ser Trp Asp His Ser Leu Ser Ser Met Leu
1 5 10
<210> 21
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Ala Ser Trp Asp Asp Cys Leu Ser Ala Arg Pro
1 5 10
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Ala Ile Trp Asp Asp His Leu Ser Ala Arg Asn
1 5 10
<210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Asn Val Trp Asp Pro Ser Leu Arg Arg Gly Leu
1 5 10
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Ser Ser Trp Asp Ser Ser Leu Ser Arg Ala Val
1 5 10
<210> 25
<211> 118
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ala Val Gly Gln Gly Trp Arg Phe Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 118
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ala Val Gly Gln Gly Ser Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 27
<211> 118
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ala Val Gly Gln Gly Tyr His Thr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 28
<211> 118
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Glu Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Phe Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ala Val Gly Gln Gly Trp Arg Phe Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 29
<211> 118
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Glu Phe Arg Arg Tyr
20 25 30
Thr Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ala Val Gly Gln Gly Trp Arg Phe Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 30
<211> 118
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Glu Ile Arg Arg Tyr
20 25 30
Glu Phe Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ala Val Gly Gln Gly Trp Arg Phe Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 31
<211> 118
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ala Val Gly Gln Gly Ser Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 32
<211> 118
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Glu Lys Ser Ser Glu Ser Arg Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ala Val Gly Gln Gly Trp Arg Phe Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 33
<211> 118
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Cys Ile Phe Leu Ile Tyr
20 25 30
Glu Cys Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ala Val Gly Gln Gly Trp Arg Phe Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 34
<211> 118
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Asn Phe Asn Trp Tyr
20 25 30
Glu Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ala Val Gly Gln Gly Trp Arg Phe Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 35
<211> 118
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Asn Phe Asn Trp Tyr
20 25 30
Glu Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Glu Lys Ser Ser Glu Ser Arg Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ala Val Gly Gln Gly Trp Arg Phe Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 36
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Leu Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Asp Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Ala Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 37
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 37
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Leu Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Asp Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Tyr Trp Asp Asp Thr Leu
85 90 95
Ser Ala Arg Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 38
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Leu Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Asp Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Trp Asp Pro Ser Leu
85 90 95
Leu Leu Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 39
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Leu Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Asp Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asp Ser Trp Asp His Ser Leu
85 90 95
Ser Ser Met Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 40
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Leu Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Asp Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Asp Cys Leu
85 90 95
Ser Ala Arg Pro Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 41
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 41
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Leu Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Pro
20 25 30
Trp Val Phe Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Asp Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Ala Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 42
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Leu Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Ser
20 25 30
Glu Val Phe Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Asp Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Ala Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 43
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Leu Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Asp Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ile Trp Asp Asp His Leu
85 90 95
Ser Ala Arg Asn Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 44
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Leu Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Asp Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
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Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
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Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
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Gly Ser Lys Ser Asp Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
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Ser Arg Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
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<213> Homo sapiens
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325