阅读说明：本技术 一种白蛋白水凝胶、其制备方法及应用 (Albumin hydrogel, and preparation method and application thereof ) 是由 贺超良 王天然 张震 李杲 陈学思 于 2020-06-08 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种白蛋白水凝胶,由白蛋白、交联剂和溶剂混合制备得到；所述交联剂包含具有式(I)结构的重复单元和具有式(II)结构的端基。本发明开发了一种快速交联、成胶浓度低、无生物毒性的白蛋白水凝胶,以应用于细胞培养、组织工程和药物递送领域。另外,作为良好的紫杉醇局部治疗药物载体,本发明解决了紫杉醇溶解性差的缺点,且不引入具有生物毒性的聚氧乙烯蓖麻油,与全身制剂相比,本发明有效减少了给药次数、增加了肿瘤处药物浓度以及降低全身毒性。以包裹紫杉醇的纳米粒子为凝胶的成胶组分,可以实现紫杉醇在凝胶中的均匀分布,以实现稳定且持续的释放。(The invention provides an albumin hydrogel which is prepared by mixing albumin, a cross-linking agent and a solvent; the cross-linking agent comprises a repeating unit with a structure shown in a formula (I) and a terminal group with a structure shown in a formula (II). The invention develops an albumin hydrogel which is fast in crosslinking, low in gelling concentration and free of biotoxicity, and is applied to the fields of cell culture, tissue engineering and drug delivery. In addition, as a good paclitaxel local treatment drug carrier, the invention solves the defect of poor paclitaxel solubility, does not introduce polyoxyethylene castor oil with biotoxicity, and effectively reduces the administration times, increases the drug concentration at the tumor and reduces the systemic toxicity compared with a systemic preparation. The nanometer particle coating the taxol is used as the gel forming component of the gel, so that the taxol can be uniformly distributed in the gel, and the stable and continuous release can be realized.)

一种白蛋白水凝胶、其制备方法及应用

技术领域

本发明属于高分子材料技术领域，具体涉及一种白蛋白水凝胶、其制备方法及应用。

背景技术

化学交联水凝胶是一种通过共价键交联的、具有三维(3D)网络结构且含有大量水或生物体液的材料，通常具有良好的稳定性、持久性和力学性质。据组成成分来源的不同，水凝胶可分为天然高分子和合成高分子两大类。天然高分子主要包括多糖类，如壳聚糖、透明质酸和蛋白类，如胶原、明胶、白蛋白等；合成高分子则主要包括聚甲基丙烯酸衍生物、聚酯、聚醚和聚氨基酸材料等。在种类如此繁多的水凝胶中，使用天然蛋白作为基本结构单元构建的蛋白基水凝胶由于其良好的生物相容性、粘弹性及体内可降解性，在传感、药物递送、组织工程及人造器官等方面具有广泛的应用前景，其中，白蛋白作为一种蛋白类凝胶材料，因其具有溶解性好、稳定性好、肿瘤内积累、易于得到、生物可降解和无毒性等特点，常被用于生物医学领域。

据2018年国际癌症研究机构(IARC)调查的最新数据显示，乳腺癌在全球女性癌症中的发病率为24.2％，位居女性癌症的首位。而紫杉醇，作为目前已发现的最优秀的天然抗癌药物之一，在临床上已经广泛用于乳腺癌的治疗。然而，紫杉醇的水溶性极差，这很大程度上影响其治疗效率。因此，临床常用一种以聚氧乙烯蓖麻油与乙醇为溶媒来提高紫杉醇溶解度的制剂。但是，聚氧乙烯蓖麻油的引入可能会引起机体的过敏反应。为了降低其带来的毒性，同时提高紫杉醇的治疗效率，研究者们开发了众多载体用于传输药物，比如已临床应用的紫杉醇脂质体力扑素、胶束化紫杉醇

以及白蛋白结合型紫杉醇但以上紫杉醇制剂均为全身治疗制剂，具有给药次数多，全身毒性大的缺点。因此，开发新的可以减少给药次数、增加肿瘤处药物浓度以及降低全身毒性的局部治疗制剂是非常重要的。可注射水凝胶作为一种常用的局部治疗载体，以微创、位点特异性、延长药物释放时间、全身毒性低及可递送亲水和疏水制剂等优点，在局部药物释放和肿瘤治疗领域受到了广泛的关注。

现有技术公开了多种基于白蛋白的水凝胶，如利用BSA中的二硫键制备氧化还原刺激响应水凝胶(Scientific Reports,2015,5:15977)，通过BSA中酪氨酸残基与环氧氯丙烷的环氧部分反应，制备用于药物递送的水凝胶(ACS Sustainable Chem.Eng.,2018,6:3321-3330)以及通过BSA中氨基与戊二醛反应以包裹钌-多吡啶络合物，以制备用于癌症治疗和发光成像的金属复合水凝胶(Journal of Inorganic Biochemistry,2019,194:19-25)，这些水凝胶都具有良好的生物相容性及体内可降解性。然而，目前报道的这些水凝胶在制备方面具有一定缺点，比如，成胶时间长、成胶浓度大以及需要具有潜在毒性的小分子作交联剂，这大大限制了其在细胞培养及组织工程上的应用。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种快速交联、成胶浓度低、无生物毒性的白蛋白水凝胶，以应用于细胞培养、组织工程和药物递送领域。

本发明提供了一种白蛋白水凝胶，由白蛋白、交联剂和溶剂混合制备得到；

所述交联剂包含具有式(I)结构的重复单元和具有式(II)结构的端基；

优选的，所述交联剂选自具有式(III)～式(Ⅴ)结构的化合物中的一种或多种；

其中，n为聚合度，50≤n≤100；m为聚合度，25≤m≤50；p为聚合度，67≤p≤133。

优选的，所述白蛋白选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白纳米粒子、人血清白蛋白纳米粒子、牛血清白蛋白/紫杉醇纳米粒子或人血清白蛋白/紫杉醇纳米粒子。

优选的，所述牛血清白蛋白纳米粒子、人血清白蛋白纳米粒子、牛血清白蛋白/紫杉醇纳米粒子或人血清白蛋白/紫杉醇纳米粒子通过去溶剂法制备得到。

优选的，所述溶剂选自水、生理盐水、缓冲溶液、组织培养液或体液。

本发明还提供了一种上述白蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

将白蛋白溶液与交联剂溶液混合，得到白蛋白水凝胶。

优选的，所述白蛋白溶液为白蛋白与溶剂的混合物，所述白蛋白溶液中白蛋白的质量体积浓度为4％～20％。

优选的，所述交联剂溶液为交联剂与溶剂的混合物，所述交联剂溶液中交联剂的质量体积浓度为4％～20％。

优选的，所述混合的温度为25～37℃。

本发明还提供了一种上述白蛋白水凝胶在组织工程及药物递送中的应用。

与现有技术相比，本发明提供了一种白蛋白水凝胶，由白蛋白、交联剂和溶剂混合制备得到；所述交联剂包含具有式(I)结构的重复单元和具有式(II)结构的端基。本发明开发了一种快速交联、成胶浓度低、无生物毒性的白蛋白水凝胶，以应用于细胞培养、组织工程和药物递送领域。另外，作为良好的紫杉醇局部治疗药物载体，本发明解决了紫杉醇溶解性差的缺点，且不引入具有生物毒性的聚氧乙烯蓖麻油，与全身制剂相比，本发明有效减少了给药次数、增加了肿瘤处药物浓度以及降低全身毒性。以包裹紫杉醇的纳米粒子为凝胶的成胶组分，可以实现紫杉醇在凝胶中的均匀分布，以实现稳定且持续的释放。

附图说明

图1为本发明实施例9所制备的邻苯二醛衍生物的核磁共振氢谱图；

图2为本发明实施例10所制备的4aPEG-OPA的核磁共振氢谱图；

图3为质量浓度为4％的白蛋白水凝胶的机械强度测试结果；

图4为质量浓度为8％的白蛋白水凝胶的机械强度测试结果；

图5为质量浓度为8％、10％、12％的白蛋白紫杉醇纳米粒子组成的水凝胶机械强度的测试结果；

图6为质量浓度为8％、10％和12％的白蛋白紫杉醇纳米粒子组成的水凝胶机械强度的测试结果；

图7为实施例17制备的凝胶的扫描电子显微镜图；

图8为实施例18制备的凝胶的扫描电子显微镜图；

图9为实施例19制备的凝胶的体外降解实验结果；

图10为不同浓度的凝胶材料对L929细胞的细胞毒性结果。

具体实施方式

本发明提供了一种白蛋白水凝胶，由白蛋白、交联剂和溶剂混合制备得到；

所述交联剂包含具有式(I)结构的重复单元和具有式(II)结构的端基；

在本发明的一些具体实施方式中，所述交联剂选自具有式(III)～式(Ⅴ)结构的化合物中的一种或多种；

其中，n为聚合度，50≤n≤100；m为聚合度，25≤m≤50；p为聚合度，67≤p≤133。

在本发明的一些具体实施方式中，所述交联剂选自具有式(III)结构的化合物。

在本发明中，所述白蛋白选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白纳米粒子、人血清白蛋白纳米粒子、牛血清白蛋白/紫杉醇纳米粒子或人血清白蛋白/紫杉醇纳米粒子。

其中，所述牛血清白蛋白纳米粒子、人血清白蛋白纳米粒子、牛血清白蛋白/紫杉醇纳米粒子或人血清白蛋白/紫杉醇纳米粒子通过去溶剂法制备得到。

具体的，将一定量牛血清白蛋白或人血清白蛋白溶解于去离子水中，搅拌溶解后调节pH至7.0～9.0，优选为7.7，得到蛋白溶液。

将一定量紫杉醇用无水乙醇溶解，得到紫杉醇乙醇溶液。

其中，白蛋白与紫杉醇的质量比为20:1～10:1，去离子水与无水乙醇的体积比为1:2～1:4

然后，设置转速为400～600rpm，将无水乙醇或紫杉醇乙醇溶液滴加入蛋白溶液中，室温下搅拌24h。反应完毕后透析3天，冷冻干燥，得到牛血清白蛋白纳米粒子或人血清白蛋白纳米粒子或牛血清白蛋白/紫杉醇纳米粒子或人血清白蛋白/紫杉醇纳米粒子。

在本发明中，所述溶剂选自水、生理盐水、缓冲溶液、组织培养液或体液，优选为缓冲溶液。

本发明还提供了一种上述白蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

将白蛋白溶液与交联剂溶液混合，得到白蛋白水凝胶。

具体的，将白蛋白溶解于溶剂中，得到白蛋白溶液。所述溶剂选自水、生理盐水、缓冲溶液、组织培养液或体液，优选为缓冲溶液。所述白蛋白溶液中白蛋白的质量体积浓度为4％～20％，优选为5％～15％。

将交联剂溶解于溶剂中，得到交联剂溶液。所述溶剂选自水、生理盐水、缓冲溶液、组织培养液或体液，优选为缓冲溶液。所述交联剂溶液中交联剂的质量体积浓度为4％～20％，优选为5％～15％。

然后将白蛋白溶液与交联剂溶液混合，得到白蛋白水凝胶。所述混合的温度为25～37℃。

本发明还提供了一种上述白蛋白水凝胶在组织工程及药物递送中的应用。

本发明提供的白蛋白水凝胶具有如下有益效果：

1、本发明成胶时间短，成胶浓度低，不需要其他的交联剂即可实现快速交联成胶，且改变组分浓度配比可方便的调控凝胶的成胶时间以及机械强度。当白蛋白组分为载药纳米粒子时，改变纳米粒子的浓度还可以改变凝胶的载药量，便于后续的医学应用。

2、本发明以载药纳米粒子为凝胶的成胶组分，可以使紫杉醇均匀的分布于凝胶中，有利于实现紫杉醇的稳定、长期释放。

3、本发明为局部治疗制剂，除了避免了具有毒性的溶剂的使用，而且减少给药次数、增加了肿瘤处药物浓度以及降低了全身毒性。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的白蛋白水凝胶、其制备方法及应用进行说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。

实施例1

将300mg牛血清白蛋白加入去离子水中，搅拌溶解，用0.2mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.0。将15mg紫杉醇加入无水乙醇中，搅拌溶解。以500r/min的速度搅拌牛血清白蛋白溶液，并将紫杉醇乙醇溶液以0.5mL/min的速度滴加至牛血清白蛋白中，室温下搅拌24h。反应结束后，将反应液加入透析袋中，用去离子水透析三天，然后冻干，即得到牛血清白蛋白/紫杉醇纳米粒子。

对得到的纳米粒子进行高效液相色谱分析，结果表明紫杉醇成功包封在牛血清白蛋白中，载药量为2.0％。

实施例2

将300mg牛血清白蛋白加入去离子水中，搅拌溶解，用0.2mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.7。将15mg紫杉醇加入无水乙醇中，搅拌溶解。以500r/min的速度搅拌牛血清白蛋白溶液，并将紫杉醇乙醇溶液以0.5mL/min的速度滴加至牛血清白蛋白中，室温下搅拌24h。反应结束后，将反应液加入透析袋中，用去离子水透析三天，然后冻干，即得到牛血清白蛋白/紫杉醇纳米粒子。

对得到的纳米粒子进行高效液相色谱分析，结果表明紫杉醇成功包封在牛血清白蛋白中，载药量为3.9％。

实施例3

将300mg牛血清白蛋白加入去离子水中，搅拌溶解，用0.2mol/L氢氧化钠溶液调节pH至8.0。将15mg紫杉醇加入无水乙醇中，搅拌溶解。以500r/min的速度搅拌牛血清白蛋白溶液，并将紫杉醇乙醇溶液以0.5mL/min的速度滴加至牛血清白蛋白中，室温下搅拌24h。反应结束后，将反应液加入透析袋中，用去离子水透析三天，然后冻干，即得到牛血清白蛋白/紫杉醇纳米粒子。

对得到的纳米粒子进行高效液相色谱分析，结果表明紫杉醇成功包封在牛血清白蛋白中，载药量为0.019％。

实施例4

将300mg牛血清白蛋白加入去离子水中，搅拌溶解，用0.2mol/L氢氧化钠溶液调节pH至9.0。将15mg紫杉醇加入无水乙醇中，搅拌溶解。以500r/min的速度搅拌牛血清白蛋白溶液，并将紫杉醇乙醇溶液以0.5mL/min的速度滴加至牛血清白蛋白中，室温下搅拌24h。反应结束后，将反应液加入透析袋中，用去离子水透析三天，然后冻干，即得到牛血清白蛋白/紫杉醇纳米粒子。

对得到的纳米粒子进行高效液相色谱分析，结果表明紫杉醇成功包封在牛血清白蛋白中，载药量为0.00023％。

实施例5

将300mg牛血清白蛋白加入去离子水中，搅拌溶解，用0.2mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.7。将15mg紫杉醇加入无水乙醇中，搅拌溶解。以500r/min的速度搅拌牛血清白蛋白溶液，并将紫杉醇乙醇溶液以1mL/min的速度滴加至牛血清白蛋白中，室温下搅拌24h。反应结束后，将反应液加入透析袋中，用去离子水透析三天，然后冻干，即得到牛血清白蛋白/紫杉醇纳米粒子。

对得到的纳米粒子进行高效液相色谱分析，结果表明紫杉醇成功包封在牛血清白蛋白中，载药量为1.0％。

实施例6

将300mg牛血清白蛋白加入去离子水中，搅拌溶解，用0.2mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.7。将30mg紫杉醇加入无水乙醇中，搅拌溶解。以500r/min的速度搅拌牛血清白蛋白溶液，并将紫杉醇乙醇溶液以0.5mL/min的速度滴加至牛血清白蛋白中，室温下搅拌24h。反应结束后，将反应液加入透析袋中，用去离子水透析三天，然后冻干，即得到牛血清白蛋白/紫杉醇纳米粒子。

对得到的纳米粒子进行高效液相色谱分析，结果表明紫杉醇成功包封在牛血清白蛋白中，载药量为8.9％。

实施例7

将300mg牛血清白蛋白加入去离子水中，搅拌溶解，用0.2mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.7。将30mg紫杉醇加入无水乙醇中，搅拌溶解。以500r/min的速度搅拌牛血清白蛋白溶液，并将紫杉醇乙醇溶液以1mL/min的速度滴加至牛血清白蛋白中，室温下搅拌24h。反应结束后，将反应液加入透析袋中，用去离子水透析三天，然后冻干，即得到牛血清白蛋白/紫杉醇纳米粒子。

对得到的纳米粒子进行高效液相色谱分析，结果表明紫杉醇成功包封在牛血清白蛋白中，载药量为6.3％。

实施例8

将300mg牛血清白蛋白加入去离子水中，搅拌溶解，用0.2mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.7。以500r/min的速度搅拌牛血清白蛋白溶液，并将无水乙醇溶液以0.5mL/min的速度滴加至牛血清白蛋白中，室温下搅拌24h。反应结束后，将反应液加入透析袋中，用去离子水透析三天，然后冻干，即得到牛血清白蛋白纳米粒子。

实施例9

将12g 3,4-二甲基苯甲酸和57g N-溴代琥珀酰亚胺溶解于200mL温的四氯化碳中。将1.62g过氧化苯甲酰加入到反应混合物中，在81℃下回流15h。将得到的白色沉淀趁热过滤，并分别用苯(3×100mL)和***(3×100mL)洗涤三次。蒸发合并的滤液，并将剩余物溶解在300mL 10％的碳酸钠溶液中。将该溶液用二氯甲烷洗涤，并用浓盐酸酸化至pH为1，然后用乙酸乙酯(4×60mL)萃取。有机相用饱和食盐水洗涤，并用硫酸钠干燥、过滤，然后真空浓缩。在乙腈中通过结晶纯化浅黄色固体来获得3,4-双(二溴甲基)苯甲酸。

将3,4-双(二溴甲基)苯甲酸溶解在180mL 10％的碳酸钠溶液中，并在70℃下反应4小时。将反应混合物在冰水浴中用盐酸酸化至pH为1，并用乙酸乙酯(5×40mL)萃取。有机相用饱和食盐水洗涤，并用硫酸钠干燥、过滤，然后真空浓缩。将由此获得的黄色固体溶解于100mL无水甲醇中，并在室温下用750mg Sc(OTf)₃处理过夜。然后，蒸发甲醇，混合物溶解于100mL乙腈中，并加入4.8g NHS和8.1g EDC·HCl。将混合物在室温下搅拌过夜，然后真空浓缩。将剩余物溶解在二氯甲烷中，用饱和食盐水洗涤三次，并用硫酸镁干燥。通过硅胶色谱法在正己烷/乙酸乙酯中纯化粗产物，得到邻苯二醛衍生物。

对得到的邻苯二醛衍生物进行核磁共振分析，图1为本发明实施例9所制备的邻苯二醛衍生物的核磁共振氢谱图。

实施例10

将2g末端为氨基的四臂聚乙二醇(4aPEG-NH₂)与514mg由实施例8所制备的邻苯二醛衍生物溶解于25mL无水二氯甲烷中，并加入0.5mL吡啶。混合物在室温下搅拌2天并在冰***中沉淀，得到末端为邻苯二醛衍生物的四臂聚乙二醇。然后将其溶解于5mL去离子水中，加入5mL三氟乙酸。混合物在室温下搅拌1小时并且稀释到50mL。将混合物透析2天并冻干，得到末端为邻苯二醛的四臂聚乙二醇(4aPEG-OPA)。

对得到的4aPEG-OPA进行核磁共振分析，图2为本发明实施例10所制备的4aPEG-OPA的核磁共振氢谱图。

实施例11

将通过实施例10所制得的交联剂与牛血清白蛋白分别用pH为7.4的PBS缓冲溶液配置成质量浓度为4％的溶液，二者等体积混合，使用涡旋仪混合均匀后采用小管倒置法测定其成胶时间，以小管倒置时，30s内不发生流动为凝胶化，记录成胶时间，37℃下质量浓度为4％的白蛋白水凝胶成胶时间为309±6s。

实施例12

将通过实施例10所制得的交联剂与牛血清白蛋白分别用pH为7.4的PBS缓冲溶液配置成质量浓度为8％的溶液，二者等体积混合，使用涡旋仪混合均匀后采用小管倒置法测定其成胶时间，以小管倒置时，30s内不发生流动为凝胶化，记录成胶时间，37℃下质量浓度为8％的白蛋白水凝胶成胶时间为151±6s。

实施例13

将通过实施例10所制得的交联剂与牛血清白蛋白分别用pH为7.4的PBS缓冲溶液配置成质量浓度为4％的溶液，二者等体积混合，使用涡旋仪混合均匀后迅速转移至旋转流变仪测定其机械强度，结果参见图3，质量浓度为4％的白蛋白水凝胶机械强度为600Pa。

实施例14

将通过实施例10所制得的交联剂与牛血清白蛋白分别用pH为7.4的PBS缓冲溶液配置成质量浓度为8％的溶液，二者等体积混合，使用涡旋仪混合均匀后迅速转移至旋转流变仪测定其机械强度，结果参见图4，质量浓度为8％的白蛋白水凝胶机械强度为13000Pa。

实施例15

将通过实施例10所制得的交联剂与通过实施例2所制备的牛血清白蛋白/紫杉醇纳米粒子用pH为7.4的PBS缓冲溶液分别配置成质量浓度为6％(交联剂浓度)和8％-12％(纳米粒子浓度)的溶液，二者等体积混合，使用涡旋仪混合均匀后迅速转移至旋转流变仪测定其机械强度，结果参见图5，质量浓度为8％、10％、12％的白蛋白紫杉醇纳米粒子组成的水凝胶机械强度分别为900Pa、2100Pa和4900Pa。

实施例16

将通过实施例10所制得的交联剂与通过实施例6所制备的牛血清白蛋白/紫杉醇纳米粒子用pH为7.4的PBS缓冲溶液分别配置成质量浓度为6％(交联剂浓度)和8％-12％(纳米粒子浓度)的溶液，二者等体积混合，使用涡旋仪混合均匀后迅速转移至旋转流变仪测定其机械强度，结果参见图6，质量浓度为8％、10％和12％的白蛋白紫杉醇纳米粒子组成的水凝胶机械强度分别为300Pa、1000Pa和2800Pa。

实施例17

将通过实施例10所制得的交联剂与牛血清白蛋白分别用pH为7.4的PBS缓冲溶液配置成质量浓度为4％的溶液，二者等体积混合，使用涡旋仪混合均匀后在37℃下成胶，冻干后扫描电子显微镜图如图7所示。由图7可知，凝胶具有多孔结构，有利于营养物质的传输以及药物包埋，可应用于组织工程及药物递送领域。

实施例18

将通过实施例10制得的交联剂与牛血清白蛋白分别用pH为7.4的PBS缓冲溶液配置成质量浓度为8％的溶液，二者等体积混合，使用涡旋仪混合均匀后在37℃下成胶，冻干后扫描电子显微镜图如图8所示。由图8可知，凝胶具有多孔结构，有利于营养物质的传输以及药物包埋，可应用于组织工程及药物递送领域。

实施例19

将通过实施例10所制得的交联剂与通过实施例8所制备的牛血清白蛋白纳米粒子用pH为7.4的PBS缓冲溶液分别配置成质量浓度为6％(交联剂浓度)和8％～12％(纳米粒子浓度)的溶液，二者等体积混合，使用涡旋仪混合均匀后放置37℃下成胶。待凝胶稳定后，向其中分别加入pH为7.4的PBS缓冲溶液和浓度为1U/mL的弹性蛋白酶的PBS缓冲溶液，置于37℃下培养。在特定的时间点吸干液体，称取凝胶质量。而后再分别加入pH为7.4的PBS缓冲溶液和浓度为1U/mL的弹性蛋白酶的PBS缓冲溶液，继续37℃下培养。降解曲线参见图9，体外降解实验结果表明凝胶本身具有一定的稳定性，而且在弹性蛋白酶存在的模拟体内条件下可降解，证明凝胶的生物降解性，有利于生物医学应用。

实施例20

将小鼠成纤维细胞L929以8000细胞/孔的密度种植于96孔板中，每孔200μL完全培养基(90％DMEM培养基+10％新生牛血清)，置于培养箱中孵育24h。24h后取出培养板，培养板中分别加入20μL pH为7.4的PBS缓冲溶液以及浓度为10～0.625mg/mL的通过实施例8所制备的牛血清白蛋白纳米粒子和通过实施例10所制备的交联剂4aPEG-OPA以达到终浓度为1～0.0625mg/mL，置于培养箱中孵育24h。24h后取出培养板，吸走培养基，用PBS洗2～3遍，避光加入10％的CCK-8溶液，置于培养箱中孵育1h，用酶标仪测试其450nm和630nm处的吸光度。不同浓度的材料对L929细胞的细胞毒性参见图10，实验结果表明材料对于正常的成纤维细胞没有细胞毒性，证明凝胶无生物毒性，可应用于生物医学领域。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。