铂(Ⅳ)及cRGD修饰的GA/Fe纳米颗粒搭载多柔比星及其靶向治疗肿瘤的方法
阅读说明：本技术 铂(Ⅳ)及cRGD修饰的GA/Fe纳米颗粒搭载多柔比星及其靶向治疗肿瘤的方法 (Platinum (IV) and cRGD modified GA/Fe nano-particle carried doxorubicin and method for targeted therapy of tumors by using same ) 是由 倪石磊 张玉霖 封帆 于 2021-07-29 设计创作，主要内容包括：本发明提供铂(Ⅳ)及cRGD修饰的GA/Fe纳米颗粒搭载多柔比星及其靶向治疗肿瘤的方法,属于生物医药和肿瘤治疗技术领域。本发明创造性地构建了经顺铂Pt(Ⅳ)前药及cRGD修饰搭载多柔比星的GA/Fe纳米颗粒,通过组合DOX可以与Pt(II)协同诱导肿瘤细胞发生凋亡,同时GA/Fe纳米颗粒在近红外光照的刺激下释放大量的Fe～(2+),诱导细胞内发生芬顿反应,进一步促使细胞发生铁死亡。实现纳米药物抗肿瘤效果的最大化,是靶向纳米药物治疗胶质瘤的新方法,因此具有良好的实际应用之价值。(The invention provides platinum (IV) and cRGD modified GA/Fe nano-particles carrying doxorubicin and a method for treating tumors by targeting, belonging to the technical field of biological medicines and tumor treatment. The invention creatively constructs the GA/Fe nano-particles carrying doxorubicin and modified by cisplatin Pt (IV) prodrug and cRGD, can synergistically induce tumor cells to generate apoptosis by combining DOX and Pt (II), and simultaneously releases a large amount of Fe under the stimulation of near-infrared illumination 2+ Inducing the fenton reaction in the cell and further promoting the iron death of the cell. The method realizes the maximization of the anti-tumor effect of the nano-drug, is a new method for treating glioma by targeting the nano-drug, and therefore has good value of practical application.)
技术领域
本发明属于生物医药和肿瘤治疗技术领域，具体涉及铂(Ⅳ)及cRGD修饰的 GA/Fe纳米颗粒搭载多柔比星及其靶向治疗肿瘤的方法。
背景技术
公开该
背景技术
部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。胶质瘤被认为是最致命和最难治疗的癌症之一。胶质瘤可根据恶性程度分为4级(WHO I，II，III和VI)，最常见的胶质瘤是IV型胶质瘤，又称为胶质母细胞瘤(GBM)。目前，新诊断70岁以下胶质瘤患者的首选治疗方法是手术切除，术后结合放和化疗进行辅助治疗，但经过该标准治疗方案治疗的患者平均生存期仅为12-15个月。由于GBM生长部位在颅内，这严重限制了手术的切除范围，导致术后约90％的复发率。传统化学药物和靶向药物的作用机制主要是诱导肿瘤细胞凋亡，但由于GBM异质性的存在，单纯一种化疗药物或分子靶向药物的疗效不佳且容易产生耐药性。由于胶质瘤的异质性导致单一药物难以抑制胶质瘤的生长，探索多靶点、多药联合的胶质瘤综合治疗模式有望克服这一不利因素。
铁死亡(Ferroptosis)是一种铁依赖型细胞程序性死亡，细胞内过量的铁离子会与细胞内过氧化氢(H2O2)反应产生羟基自由基(芬顿反应)，羟基自由基可以引起细胞内不饱和脂肪酸过氧化，导致的脂质过氧化物蓄积而引起细胞铁死亡，诱导肿瘤细胞铁死亡现已成为治疗恶性肿瘤的新靶点。然而，如何将铁死亡与其他治疗模式有机结合，实现抗肿瘤效果的最大化，成为本领域亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供铂(Ⅳ)及cRGD修饰的GA/Fe纳米颗粒搭载多柔比星及其靶向治疗肿瘤的方法。本发明创造性地构建了经顺铂Pt(IV) 前药及cRGD修饰搭载多柔比星的GA/Fe纳米颗粒，通过组合DOX可以与Pt (II)协同诱导肿瘤细胞发生凋亡，同时GA/Fe纳米颗粒在近红外光照的刺激下释放大量的Fe2+，诱导细胞内发生芬顿反应，进一步促使细胞发生铁死亡。实现纳米药物抗肿瘤效果的最大化，是靶向纳米药物治疗胶质瘤的新方法。
具体的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供一种纳米颗粒，所述纳米颗粒为没食子酸/Fe纳米颗粒，且所述没食子酸/Fe纳米颗粒还修饰有顺铂、cRGD和多柔比星(DOX)。
其中，所述Fe为二价铁离子。
多柔比星的加载率不小于20％。
所述纳米颗粒其粒径不大于100nm。通常直径在100nm以内的纳米药物在胶质瘤的中期和晚期是能够顺利通过破损的血脑屏障和缺乏血脑屏障的肿瘤新生血管并在肿瘤部位富集，因此，本申请制备得到的纳米颗粒能够通过血液循环达到肿瘤部位。
本发明的第二个方面，提供上述纳米颗粒的制备方法，所述制备方法包括：
S1、制备DSPE-PEG(2000)Pt(IV)和DSPE-PEG(2000)-cRGD；
S2、制备GA/Fe纳米颗粒；
S3、将步骤S1制得的DSPE-PEG(2000)Pt(IV)和DSPE-PEG(2000)-cRGD 制成脂质体，将吸附有DOX的GA/Fe纳米颗粒加入所述脂质体中即得。
本发明的第三个方面，提供上述纳米颗粒在制备治疗肿瘤相关疾病的药物中的应用。
需要说明的是，肿瘤在本发明中如本领域技术人员所知的那样加以使用，其包括良性肿瘤和/或恶性肿瘤。良性肿瘤被定义为不能在体内形成侵略性、转移性肿瘤的细胞过度增殖。反之，恶性肿瘤被定义为能够形成全身性疾病(例如在远端器官中形成肿瘤转移)的具有多种细胞异常和生化异常的细胞。
本发明的第四个方面，提供一种药物组合物，其包含上述纳米颗粒。
本发明的第五个方面，提供一种药物制剂，其包含上述纳米颗粒和药学上可接受的辅料和/或载体。
本发明的第六个方面，提供一种治疗肿瘤的方法，所述方法包括：向受试者施用治疗有效剂量的上述纳米颗粒、上述药物组合物或上述药物制剂。
本发明的第七个方面，提供上述纳米颗粒、上述药物组合物或上述药物制剂在肿瘤示踪剂和/或制备肿瘤示踪剂中应用。
与传统应用化疗药物相比，上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
1.立足的机制新颖，铁死亡是2012年新发现的细胞死亡方式，具有铁离子依赖性，过量的铁会与细胞内过氧化氢(H2O2)发生芬顿反应，导致致命的脂质过氧化，是治疗恶性肿瘤的新靶点。
2.利用三种药物的协同作用提高疗效，创造性地将顺铂、多柔比星、没食子酸及Fe2+组合在一起，从细胞凋亡和铁死亡两个方面共同诱导GBM细胞死亡，弥补了传统单一化疗药物的不足，减少耐药性的产生。
3.cRGD/[email protected]靶向性好。通过将cRGD修饰到该纳米复合物表面，利用cRGD可以和肿瘤细胞和肿瘤内新生血管内皮细胞细胞表面高表达的αvβ3蛋白结合的特点，实现了该纳米药物的靶向递送，有利于药物在肿瘤局部浓聚，具有高效、全身副作用小的优点。
4.对肿瘤的抑制效果确切。实验证明cRGD/[email protected]对体外培养的胶质瘤细胞具有杀伤作用，并且在动物实验中能够抑制胶质瘤在小鼠体内的生长，延长荷瘤小鼠的生存期。
5.生物安全性高、相容性好。Pt(IV)前药是一种惰性药物，只有当到达癌细胞内具有酸性环境的内吞囊泡时才能释放出有细胞毒性的顺铂(II)。脂质体与生物膜结构相似，经修饰后包裹纳米药物在体内可稳定存在。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明中cRGD/[email protected]的制备和表观特征图，其中A为cRGD/[email protected]制备流程图，B为GFNPs和RPDGs纳米复合物的透射电镜图像，比例尺：50nm；C为水溶液中GFNPs和RPDGs纳米粒子的DLS 数据；D为吸附在GFNP，[email protected]，Pt(IV)[email protected]，和RPDG表面的DOX 紫外线-可见-近红外光谱；E为RPDGs纳米复合物的Elemental mapping。
图2为本发明中cRGD/[email protected]具有优异的催化活性及稳定性，其中，A为GFNPs、血晶素和Fe3O4纳米粒子在不同时间点降解MB的紫外线-可见-近红外光谱；B为GFNPs、游离Fe2+、GA-Fe2+和GA引发MB的时间依赖性降解；C为UV-MB水溶液经不同处理降解3h后的可见-近红外光谱和照片(插图)；D为孵育一周后游离Fe2+和GFNPs相对催化活性的比较；E为RPDGs纳米药物在PBS、含血清培养基和无血清培养基中的分散性和稳定性；F为不同pH值溶液中RPDGs的DOX释放曲线。
图3为本发明cRGD/[email protected]的靶向抗肿瘤作用图，其中，A为 U87MG细胞内吞后细胞中的Pt(IV)[email protected]和RPDGs，比例尺：10μm；B 为Pt(IV)[email protected]和RPDGs内化后U87MG细胞的透射电镜图像，顶部图像的比例尺为1.0μm；C为U87MG细胞经不同浓度Pt(IV)[email protected]和RPDGs 作用48h后的细胞活力；D为RPDG在NHAs和U87MG细胞中培养48h后的细胞毒性。
图4为本发明cRGD/[email protected]诱导细胞铁死亡相关图，其中，A为用RPDGs和/或凋亡抑制剂(Belnacasan)和坏死抑制剂(Necrosulfonamide)处理的U87MG细胞的细胞死亡比率；B为经过不同处理48h后U87MG细胞内Fe2+浓度变化；C为不同纳米粒子处理24h后的超氧化物探针(DHE，红色荧光)的代表图像，比例尺：75μm；D为U87MG细胞经不同处理24h后H2O2含量变化； E为U87MG细胞经BODIPY 581/591C11(红色)染色的代表性图像，比例尺： 25μm。
图5是本发明cRGD/[email protected]的体内抗肿瘤作用相关图，其中，A 为体内治疗的实验时间表；B为在第0、5、10和15天监测表达荧光素酶的 U87MG细胞的生物光来监测的胶质瘤在颅内的生长情况；C为定量测量各组荷瘤小鼠生物光；D为测定各组小鼠的Kaplan-Meier生存曲线；E为治疗过程中小鼠体重的变化情况；F为荷胶质母细胞瘤的小鼠脑切片H&E染色的代表性图像。比例尺：50μm。
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述
具体实施方式
，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。
术语解释：
铂(Ⅳ)：简称Pt(Ⅳ)，聚乙二醇化磷脂修饰的Pt(IV)前药。是一种惰性药物，只有当到达癌细胞内具有酸性环境的内吞囊泡时才能释放出有细胞毒性的顺铂 (II)。顺铂可破坏细胞内核DNA和线粒体mtDNA，诱导细胞凋亡，具有抗癌谱广、乏氧细胞有效、作用性强等优点，已普遍用于治疗卵巢癌、子宫癌、膀胱癌、肺癌、脑癌等，疗效显著。研究表明顺铂可以激活NADPH氧化酶(NOX)， NOX将NADPH转化为NADP+，释放电子，生成O2-，并参与形成过氧化氢 (H2O2)。但它在胶质瘤治疗中仍有几个限制，包括血脑屏障的阻隔、全身应用副作用的产生和耐药机制。研究表明，使用惰性铂(Ⅳ)可以获得具有较少副作用的有效肿瘤治疗。
cRGD:Arg-Gly-Asp(cRGD)环肽，是一种有效的靶向配体，可特异性地与肿瘤细胞和肿瘤内新生血管内皮细胞细胞表面高表达的αvβ3蛋白结合而介导纳米药物内吞。研究发现，cRGD修饰的纳米药物具有出色的肿瘤靶向能力，并在多种恶性肿瘤包括GBM中得以证实.。
没食子酸：英文名Gallic Acid，GA。GA是从中药五倍子中提取得到的一种天然化合物，具有收敛伤口、抗炎及抗肿瘤等作用。没食子酸可与Fe2+发生络合反应形成直径为纳米级别的GA/Fe纳米颗粒。Fe2+与H2O2反应转化为超氧化物·OH并产生Fe3+，即Fenton反应；而没食子酸可有效地将Fe3+还原为 Fe2+，进一步促进Fenton反应，诱导GBM细胞发生铁死亡。
多柔比星：英文名Doxorubicin，简写DOX。可以与细胞内DNA碱基对结合，阻止转录过程，抑制DNA复制和RNA合成，抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，已普遍用于治疗白血病、乳腺癌、膀胱癌、肺癌等，疗效显著。
本发明的一个具体实施方式中，提供一种纳米颗粒，所述纳米颗粒为没食子酸/Fe纳米颗粒，且所述没食子酸/Fe纳米颗粒还修饰有顺铂、cRGD和多柔比星(DOX)。
本发明的又一具体实施方式中，所述Fe为二价铁离子。
本发明的又一具体实施方式中，多柔比星的加载率不小于20％，如23.57％。
所述纳米颗粒其粒径不大于100nm。通常直径在100nm以内的纳米药物在胶质瘤的中期和晚期是能够顺利通过破损的血脑屏障和缺乏血脑屏障的肿瘤新生血管并在肿瘤部位富集，因此，本申请制备得到的纳米颗粒能够通过血液循环达到肿瘤部位。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述纳米颗粒的制备方法，所述制备方法包括：
S1、制备DSPE-PEG(2000)Pt(IV)和DSPE-PEG(2000)-cRGD；
S2、制备GA/Fe纳米颗粒；
S3、将步骤S1制得的DSPE-PEG(2000)Pt(IV)和DSPE-PEG(2000)-cRGD 制成脂质体，将吸附有DOX的GA/Fe纳米颗粒加入所述脂质体中即得。
其中，所述步骤S1和步骤S2并不存在先后顺序之分。
本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S1中，DSPE-PEG(2000)Pt(IV) 和DSPE-PEG(2000)-cRGD在现有技术中已有报道，在本发明的一个具体实施方式中，所述制备方法包括：
将Pt(IV)或cRGD与聚乙二醇化的磷脂偶联，经透析和纯化后即得。
本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S2中，所述GA/Fe纳米颗粒的制备方法包括：
将氯化亚铁和PVP加入水中搅拌，然后加入没食子酸溶液，在惰性气体氛围中进行搅拌后即得。
本发明的又一具体实施方式中，所述氯化亚铁、PVP和没食子酸的质量比控制为10-30：60-100:1-20；优选为23:80:10；
本发明的又一具体实施方式中，将氯化亚铁和PVP加入水中搅拌时间控制为1-10分钟，优选为5分钟；
本发明的又一具体实施方式中，所述水为去离子水(DI水)；
本发明的又一具体实施方式中，所述惰性气体为氮气；
本发明的又一具体实施方式中，在惰性气体氛围中进行搅拌时间控制为 20-30h，优选为24h。
本发明的又一具体实施方式中，向GA/Fe纳米颗粒中加入DOX，通过物理吸附作用将DOX加载到GA/Fe纳米颗粒上。经试验证明，GA/Fe纳米颗粒的DOX加载效率高达23.57％。
本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S3，其具体制备方法包括：
将DSPE-PEG-cRGD、DSPE-PEG(2000)-Pt(IV)、胆固醇以及二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)混合溶解后形成脂质体，将加载有DOXGA/Fe纳米颗粒加入脂质体中，经搅拌、过滤、分离、纯化后即得。
其中，所述DSPE-PEG-cRGD、DSPE-PEG(2000)-Pt(IV)、胆固醇以及二棕榈酰磷脂酰胆碱的摩尔比控制为1-3:2-4:3-5:6-8，优选为1:2:3:6；通过控制上述各原料的摩尔比，从而有助于制备性能优良的脂质体。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述纳米颗粒在制备治疗肿瘤相关疾病的药物中的应用。
需要说明的是，肿瘤在本发明中如本领域技术人员所知的那样加以使用，其包括良性肿瘤和/或恶性肿瘤。良性肿瘤被定义为不能在体内形成侵略性、转移性肿瘤的细胞过度增殖。反之，恶性肿瘤被定义为能够形成全身性疾病(例如在远端器官中形成肿瘤转移)的具有多种细胞异常和生化异常的细胞。
本发明的又一具体实施方式中，本发明的药物可用于治疗恶性瘤。可用本发明的药物治疗的恶性瘤的实例包括实体瘤和血液瘤。实体瘤可以是乳腺、膀胱、骨、脑、中枢和外周神经系统、结肠、内分泌腺(如甲状腺和肾上腺皮质)、食道、子宫内膜、生殖细胞、头和颈、肝、肺、喉和下咽的肿瘤、间皮瘤、卵巢、胰腺、前列腺、直肠、肾、小肠、软组织、睾丸、胃、皮肤(如黑色素瘤)、输尿管、阴道和外阴的肿瘤。恶性瘤包括遗传性癌症，例如视网膜母细胞瘤和肾母细胞瘤(Wilms tumor)。此外，恶性瘤包括在所述器官中的原发性肿瘤及在远端器官中的相应继发性肿瘤(肿瘤转移)。血液瘤可以是侵略性和无痛形式的白血病和淋巴瘤，即非霍奇金病、慢性和急性髓样白血病(CML/AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、霍奇金病、多发性骨髓瘤和T-细胞型淋巴瘤。还包括骨髓增生异常综合征、浆细胞瘤、类肿瘤综合征和未知原发部位的癌症及AIDS相关的恶性瘤。特别地，本发明证明了上述纳米颗粒在胶质瘤(如胶质母细胞瘤，GBM) 中具有良好的治疗作用。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种药物组合物，其包含上述纳米颗粒。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种药物制剂，其包含上述纳米颗粒和药学上可接受的辅料和/或载体。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种治疗(辅助治疗)肿瘤的方法，所述方法包括：向受试者施用治疗有效剂量的上述纳米颗粒、上述药物组合物或上述药物制剂。
所述方法还包括对受试者施用PDT治疗，包括使用近红外光(NIR)照射(如808nm)。本发明纳米颗粒在联合光热治疗后具有明显的抗肿瘤效果，同时全身应用也不会产生明显的副作用。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述纳米颗粒、上述药物组合物或上述药物制剂在肿瘤示踪剂中应用。本发明制备的纳米颗粒材料具有较高的肿瘤靶向性和光热转化性和MRI的T2低信号特性，使其成为良好的肿瘤示踪剂，从而可用于肿瘤的辅助诊断。
综上，本发明的纳米颗粒材料产生如下有益效果：
1.提高化疗药物治疗效果
传统单一化疗药物的使用是GBM耐药性产生的主要原因，而针对GBM细胞的多靶点联合化疗是降低耐药性的有力方法。本发明组合顺铂、多柔比星和没食子酸三种治疗性药物于一体，从细胞凋亡和铁死亡两个方面共同诱导GBM细胞死亡。一方面，顺铂和多柔比星可协同诱导肿瘤细胞发生凋亡。另一方面顺铂可激活NADPH氧化酶(NOX)，NOX将NADPH转化为NADP+，释放电子，生成O2-，并参与形成过氧化氢(H2O2)；而GA/Fe纳米颗粒在近红外光照的刺激下释放的Fe2+与H2O2反应转化为超氧化物·OH并产生Fe3+，没食子酸可有效地将Fe3+还原为Fe2+，进一步促进Fenton反应，诱导GBM细胞发生铁死亡。
顺铂使细胞内H2O2积累。GA/Fe纳米颗粒能提高细胞内铁离子浓度，铁离子和H2O2发生芬顿反应，产生具有强氧化性的羟自由基，破坏细胞膜结构及功能，最终导致细胞铁死亡。实验证明，集顺铂、多柔比星、没食子酸于一体的纳米药物在细胞实验和动物实验中对GBM均有很好的治疗效果。
2.提高化疗药物的生物相容性和靶向性
本发明使用cRGD修饰的包裹纳米颗粒的脂质体，具有靶向性好，生物相容性高的优点。首先，脂质体具有与生物膜相似的结构，脂质体转染试剂被广泛接受为将外源DNA或RNA输送到细胞中“金标准”。其次，cRGD环肽可特异性地与肿瘤细胞和肿瘤内新生血管内皮细胞细胞表面高表达的αvβ3蛋白结合而介导纳米药物内吞。研究发现，cRGD修饰的纳米药物具有出色的肿瘤靶向能力，并在多种恶性肿瘤包括GBM中得以证实。
3.降低化疗药物的毒副作用
尽管顺铂在临床上治疗多种肿瘤取得了成功，但它在治疗胶质瘤的使用仍有几个限制，其中就包括全身应用时副作用的产生。铂(IV)是惰性药物并且只有当到达癌细胞内具有酸性环境的内吞囊泡时才能释放出有细胞毒性的顺铂(II)。在被肿瘤细胞摄取以后，可以在肿瘤细胞中被还原成为有细胞毒性的Pt(II)药物，通过这种方式可以获得具有较少副作用的有效肿瘤治疗。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例
材料与方法
1.制备DSPE-PEG(2000)Pt(IV)及DSPE-PEG(2000)-cRGD：将顺式、顺式、反式[PtIV(NH3)2Cl2(O2CCH2CH2CO2H)2](9.6mg,18.0μmol)、二环己基碳二亚胺(3.7mg,18.0μmol)和4-(二甲氨基)吡啶(1.0mg,7.2μmol)溶解于DMSO(130μL) 中，10min后将含活性Pt(IV)配合物的溶液加入到制备的DSPE-PEG(2000)-NH2 (10mg,3.6μmol,170μL)DMSO溶液中，得到的混合物在室温下连续搅拌反应 72小时，反应产物加水离心后将上清液在分子量为2000的超滤过滤器上透析和纯化可得到DSPE-PEG(2000)Pt(IV)。同法将cRGD与聚乙二醇化的磷脂偶联，经透析和纯化得到DSPE-PEG(2000)-cRGD。
2.制备GA/Fe纳米颗粒：将23mg FeCl2-4H2O和80mg PVP加入到4ml DI 水中，室温下搅拌5min，再加入10mg/ml的GA溶液1ml，然后在氮气下持续搅拌24h，即可得到GA/Fe纳米颗粒。采用分子量为10kDa的超滤过滤器对制备的GA/Fe(II)进行纯化和干燥，最终获得的GFNPs在4℃真空环境中保存。
3.制备cRGD/[email protected](RPDGs)纳米颗粒：将DSPE-PEG-cRGD、 DSPE-PEG(2000)-Pt(IV)、胆固醇以及二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)按照1:2:3:6的摩尔比混合溶解后形成脂质体，将10mg/mL的[email protected]加到干燥后的脂质体中，室温下搅拌30min，使用100nm的聚碳酸酯膜反复滤过10次，Sephadex G-50柱分离未包覆的脂质体。最终得到的RPDGs纳米颗粒使用分子量为100kDa 的超滤过滤器进行浓缩和提纯。
4.测量描述cRGD/[email protected](RPDGs)纳米颗粒的表观特征：合成的纳米药物经1wt％磷钨酸处理后，在TEM投射电镜和SEM扫描电镜下观察其形态。采用MalvernZetasizer Nano ZS90纳米粒径电位分析仪在固定的散射角 (173°466)和zeta电位下测量粒径。紫外-可见-近红外光谱仪可测量纳米颗粒的吸光度。
结果与讨论
为了降低毒副作用，增加铂药的安全性，我们合成了聚乙二醇化磷脂修饰的Pt(IV)前药。铂(IV)是惰性药物并且只有当到达癌细胞内具有酸性环境的内吞囊泡时才能释放出有细胞毒性的顺铂(II)。我们选择了琥珀酸衍生物铂(IV)配合物顺式，顺式，反式[Pt(NH3)2Cl2(O2CCH2CH2CO2H)2](1) 作为前药。我们通过DCC介导的偶联反应，将该配合物DSPE-PEG(2000) -NH2偶联，经透析纯化得到顺铂Pt(IV)前药功能化磷脂(DSPE-PEG(2000) -Pt(IV))。Arg-Gly-Asp(cRGD)环肽是一种有效的靶向配体，可特异性地与肿瘤细胞和肿瘤新生血管中过表达的αvβ3蛋白结合。研究发现，cRGD 修饰的纳米药物具有出色的肿瘤靶向能力，并在多种恶性肿瘤包括GBM 中得以证实。同样的，我们将cRGD与聚乙二醇化的磷脂偶联，经透析和纯化得到DSPE-PEG(2000)-cRGD。该靶向基团不仅准确靶向肿瘤细胞，而且可对肿瘤新生血管等产生抑制作用，在降低副反应的同时增强了对 GBM的治疗作用。
为了提高GA/Fe(II)纳米颗粒在肿瘤内累积，提高生物相容性，我们将合成的DSPE-PEG(2000)-Pt(IV)、胆固醇、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)按照1:3:6的摩尔比以脂质体的形式包裹在GA/Fe(II)纳米颗粒外面。合成的 cRGD/[email protected](RPDGs)纳米药物的大小除受GA/Fe(II)纳米颗粒的影响外，还受脂质体混合物与GA/Fe(II)纳米颗粒的比例控制。为了控制合成的RPDGs纳米药物的直径，我们利用100nm的脂质体挤出器进行脂质体的包裹。透射电子显微镜(TEM)图像和动态光散射(DLS)测量用于确定GFNPs纳米颗粒和RPDGs纳米药物的大小(图1B和C)。TEM图像显示包裹了脂质体的RPDGs纳米药物呈球形形态，平均直径为60.4±8.3nm，一个颗粒内有较小的暗点，表明基于GFNPs纳米颗粒的包封成功。DLS显示，GFNPs纳米颗粒和RPDGs纳米药物的平均流体力学直径分别约为 58.77nm和68.06nm，比TEM测量的直径略大。电感耦合等离子体质谱 (ICP-MS)测定，GFNPs纳米颗粒中Fe2+的质量比约为7.4％。根据报道，直径在100nm以内的纳米药物在胶质瘤的中期和晚期是能够顺利通过破损的血脑屏障和缺乏血脑屏障的肿瘤新生血管并在肿瘤部位富集，据此，本实验合成的GFNPs和RPDGs都能够通过血液循环到达肿瘤部位。
为了研究GFNPs作为Fenton催化剂的潜力，我们以亚甲基蓝(MB)为指示剂，MB可以被产生的·OH氧化为无色液体。首先将GFNPs与之前报道的包括Fe3O4纳米颗粒、肝素等催化剂进行了平行比较。我们发现GFNPs 在H2O2(1mM)存在的情况下，与其他测试的Fenton反应催化剂包括血红素，Fe3O4纳米颗粒相比，在相同摩尔浓度Fe的情况下，GFNPs引发的 ROS生成水平最高(图2A)。这种超稳定的Fenton样催化活性的GFNPs应该归因于这样一个事实，即GFNPs纳米复合物内多余的酚基将Fenton反应或氧氧化过程中产生的活性较低的Fe3+离子瞬间还原为高活性的Fe2+离子。这一假设得到了实验证实，我们发现Fe2+离子的Fenton样催化能力在 GA的存在下得到了显著的提高(图2B)。基于GFNPs稳定且高效的Fenton 反应催化能力，我们进一步测试了RPDGs纳米药物降解亚甲蓝的效率。显然，当与RPDGs和H2O2(1mM)孵育时，MB的吸光度显著降低，而单独用RPDGs或H2O2处理时，MB的吸光度没有明显变化(图2C)。在H2O2存在的情况下，RPDGs纳米药物催化MB呈时间依赖性，亚甲基蓝(MB) 溶液的颜色逐渐从蓝色变为无色，在60分钟后几乎完全降解。最重要的是，游离的Fe2+催化Fenton反应在血清的存在下会受到显著的抑制，与游离的Fe2+离子不同，在生理条件下RPDGs催化Fenton反应具有优异的稳定性，在血清和培养基中表现出与纯水中测得的Fenton样催化活性相当。此外，DLS结果也进一步证实，当RPDGs与PBS，血清培养基，和无血清培养基共孵育一周后纳米颗粒直径均未发生明显改变(图2E)。因此，以上结果提示RPDGs纳米复合物是一种高效的Fenton催化剂，在生理环境中具有优异的催化活性和稳定性，有望在生物学上得到进一步应用。
为了研究这个以中药化合物没食子酸为基础的纳米药物的抗肿瘤效果，我们选择抗癌药物DOX作为模型药物，并通过物理吸附将其加载到 GFNPs中。GFNPs的DOX加载效率高达23.57％。GFNPs的zeta电位值为负，而在DOX加载后变为正电荷，当在表面加入DSPE-PEG(2000)-Pt(IV) 和DSPE-PEG(2000)-cRGD后合成的RPDGs纳米药物表面带负电荷。为了确认RPDGs的pH响应降解，将RPDGs浸入pH 7.4和5.5的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中以模拟不同的生物环境。如图2F所示，RPDGs已获得pH 响应的药物释放行为，并且在较低的pH值下可获得较高的释放速率,在 pH为5.5的环境下，24小时内释放了约20％的DOX。同样的，在24小时内，在pH分别为7.4和5.5的条件下，1mg/mL的RPDGs释放了约25.74μg 的Fe2+离子，约占总Fe2+含量的64.35％。
综合以上结果表明，pH下降可显着促进RPDGs的降解，使制备的 GFNPs成为用于肿瘤酸性反应性药物递送的极佳纳米载体。在上述结果的基础上，我们进一步研究了RPDGs纳米药物对U87MG细胞的抗肿瘤作用。首先，我们测试了cRGD的靶向递送能力，与Pt(IV)[email protected]相比，表面修饰了cRGD的cRGD/Pt(IV)[email protected](RPDGs)对U87MG细胞具有明显的靶向性，其细胞内部的DOX(红色荧光)强度明显增加，与溶酶体(绿色荧光) 重合以后的荧光(黄色荧光)更强(图3A)。相似的，分别用1mg/mL Pt(IV)[email protected]和RPDGs与U87MG细胞共同孵育4h后，RPDGs靶向纳米颗粒U87MG在细胞内表现出更高的摄取量，这可能是由于U87MG细胞表面高表达的αvβ3通过受体介导的方式选择性地增加了RPDGs的摄取(图 3B)。为了进一步验证GFNPs的抗肿瘤效果，我们首先研究了游离GA抑制 U87MG细胞活力的能力，从48小时的结果可以看出GA在U87MG细胞内的IC50约为1mg/mL。进一步研究发现，合成的GFNPs也保留了GA抗肿瘤的效果，其 IC50约为mg/mL，较游离GA明显降低。与游离的Pt(IV)和DOX相比，Pt(IV)[email protected]可以明显提高对U87MG的细胞毒性，增强各治疗药物的协同治疗效果。随着RPDGs浓度的增加，U87MG细胞的细胞活力明显下降，且RPDGs共孵育的细胞下降较Pt(IV)[email protected]更明显，其IC50分别为 1.19μg/mL和4.076μg/mL(图3C)。然而，在正常人星形细胞(NHA)中， RPDGs的IC50则为2.904μg/mL(图3D)。由此可见，添加了cRGD作为靶向配体的RPDGs纳米药物具有很好的GBM细胞靶向性，与非靶向纳米药物相比，其有更好的抑制GBM细胞增殖的能力。
为了进一步验证RPDGs引起的细胞死亡是由铁死亡参与的，我们应用了凋亡抑制剂(Belnacasan)和坏死抑制剂(Necrosulfonamide)来抑制 DOX和Pt(II)引起细胞死亡的常见的2种死亡形式，即凋亡和坏死。在图4A中我们可以看出，单纯应用2μg/mL的RPDGs可以引起90.1％的 U87MG细胞发生死亡，应用1nM的凋亡抑制剂预先处理12小时以后再加入2μg/mL的RPDGs，细胞死亡率降到53.9％，但应用1μM的坏死抑制剂孵育12小时候在给与2μg/mL的RPDGs治疗，细胞死亡率为82.1％，未出现明显下降。由此可见，RPDGs不仅可以引起GBM细胞发生凋亡和较少的凋亡，也可以引起细胞发生明显的铁死亡。为了进一步验证这种死亡是铁死亡，我们检测了细胞内的铁含量(图4B)，与基于GFNPs的非靶向纳米药物相比，RPDGs可以显著提高细胞内的Fe2+含量，使细胞内铁载量明显增多。纳米药物摄取的增加使细胞内氧化还原失衡，导致细胞内产生过多的活性氧(ROS)，其中包括H2O2。
细胞内超氧化物阴离子荧光探针(Dihydroethidium，DHE)结果显示，与对照组相比，所应用的纳米药物都能够引起细胞内活性氧ROS含量的增加，且与Pt(IV)[email protected]组相比，RPDGs可以明显提高细胞内 ROS产生，尤其是过氧化物和过氧化氢(图4C)。有趣的，细胞内还原型谷胱甘肽GSH含量则明显呈现相反的趋势，这可能与Pt(IV)还原成 Pt(II)的消耗导致的。此外，将U87MG细胞分别给与4μg/mL的纳米药物处理细胞后发现，与对照组相比，纳米药物可以明显提高细胞内H2O2的浓度，且RPDGs升高的最明显，是对照组的6.1倍(图4D)。细胞内过量的Fe2+和H2O2可以触发明显的Fenton反应，游离的GA可以进一步促进该反应的持续发生，导致细胞内产生过量的·OH，·OH进一步氧化不饱和脂肪酸，导致细胞内脂质过氧化产物堆积而引起细胞铁死亡。我们通过应用脂质过氧化传感器(BODIPY 581/591C11，Red)检测了细胞内的脂质过氧化产生物水平，发现与GFNPs组相比，Pt(IV)[email protected]和 RPDGs均能明显提高细胞内脂质过氧化产物的含量，且RPDGs可以产生更高浓度的脂质过氧化物(图4E)。以上结果表明，基于GFNPs的纳米药物可明显提高细胞内Fe2+含量，诱导ROS升高，触发Fenton反应，导致细胞脂质过氧化产物增加，进一步引起GBM细胞发生铁死亡。
我们对基于光热转换材料GFNPs的纳米药物进行了体内抗肿瘤效果进行了评价。将荧光素酶标记的U87MG细胞原位异体移植到裸鼠颅内7 天后，将原位肿瘤模型分成6组(每组10只)，对照组(射生理盐水)，游离Pt(IV)组，GFNPs组，Pt(IV)@GFNPs，Pt(IV)[email protected]和RPDGs 组，所有组都进行808nm NIR照射。在分组后第0天，3天，6天，9天， 12天进行尾静脉注射治疗(剂量：DOX 2mg/kg，Pt(IV)1.88mg/kg,Fe 2 mg/kg)。对于PDT治疗，注射后24小时后，荷瘤小鼠给予PDT治疗时，注射24h后，用660nm的光照射小鼠，功率密度为5mWcm-2，持续1h。接受不同治疗后，每5天用生物荧光成像(bioluminescence imaging)测量肿瘤体积。正如预期的那样，与游离Pt(IV)注射相比，Pt(IV)@GFNPs注射在早期表现出中等程度的肿瘤生长抑制效果，而使用GFNPs化疗则不能抑制肿瘤生长。重要的是，使用RPDGs加808nm光照射联合治疗后，小鼠的肿瘤生长受到明显抑制，与各种对照组相比，显示出明显改善的治疗效果，包括使用Pt(IV)[email protected]加光照射联合治疗(图5B,C)。 Kaplan-Meier生存曲线结果显示，对照组，GFNPs组，游离Pt(IV)组， Pt(IV)@GFNPs,Pt(IV)[email protected]和RPDGs组的荷瘤小鼠平均生存时间分别为17.2天、19.4天、22天、27.3天和52.8天以上(图5D)。在持续15天的治疗中，对照组，游离Pt(IV)组，GFNPs组裸鼠由于肿瘤持续增大，严重影响了正常的生理活动，导致体重明显下降，而RPDGs 组裸鼠体重未发生明显改变(图5E)。
此外，通过苏木精和曙红(H&E)染色，评价注射各种药物后收集的肿瘤片的组织学损伤水平，研究各种治疗方法的治疗效果。我们发现从和RPDGs 组小鼠采集的肿瘤片显示出严重的组织学损伤，Pt(IV)[email protected]组显示出中等程度的组织学损伤，而从其他4组小鼠采集的肿瘤片则没有明显的损伤(图5F)。心、肝、脾、肺、肾的H&E染色就显示所有治疗组均没有明显的形态学改变。我们体内实验的结果表明，RPDGs纳米颗粒作为胶质瘤治疗的潜在药物在联合光热治疗后具有明显的抗肿瘤效果，全身应用也不会产生明显的副作用。
综上，本发明设计了一种生物相容性的RPDGs纳米制剂，使GBM细胞内的氧化还原平衡被破坏，赋予胶质瘤高效的凋亡和铁死亡联合治疗。利用GFNPs在生理环境中高度稳定的Fenton催化活性和Pt(IV)消耗GSH 并增加ROS的功能，以及GFNPs高效的光热转化效率，我们合成的多功能和多靶点的RPDGs可以显著增加细胞内ROS，从而诱导细胞发生明显的铁死亡。在体内MRI成像和药物示踪的基础上，发现RPDGs在通过尾静脉注射给药后，在荷瘤小鼠的肿瘤部位积累明显增加。由于DOX诱导肿瘤细胞发生凋亡，结合由于近红外光照射的加入，既促进了GFNPs诱发的Fenton反应，又使得Pt(IV)还原成Pt(II)消耗GSH增加，进一步加强了凋亡和铁死亡联合治疗效果。结果表明，RPDGs纳米制剂不仅可以直接抑制肿瘤的生长，而且可以有效提高传统化疗药物的治疗效果。因此，我们的工作开辟了一条治疗胶质瘤的新途径，即通过靶向GBM细胞内高水平的H2O2和GSH扰乱细胞内氧化还原平衡，诱导细胞发生铁死亡，增强临床使用的广谱抗肿瘤药物治疗胶质瘤的效果。RPDGs具有较高的肿瘤靶向性和光热转化性，和MRI的T2低信号特性，可以成为未来临床转化的一种有前景的辅助诊断和治疗GBM的纳米药物。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：锌离子在抗肠道病毒EV-D68中的应用