阅读说明：本技术 四氧化三铁纳米酶的新用途 (New application of ferroferric oxide nanoenzyme ) 是由 颜丙春 高利增 高满满 许卓斌 王莉 张洁 于 2019-10-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及四氧化三铁纳米酶的新用途,属于西药制药领域,具体涉及聚乙二醇包裹的四氧化三铁纳米酶(PEG-Fe3O4 nanozyme)在促进神经母细胞增殖和分化中的应用。本发明通过日常饮用水中给予小剂量PEG-Fe3O4 nanozyme后能使海马区成神经母细胞分化增加,保护血脑屏障,增强自噬,减少氧自由基水平。由本发明可知,聚乙二醇包裹的四氧化三铁纳米酶(PEG-Fe3O4 nanozyme)从多方面促进神经母细胞分化作用,对神经退行性疾病的治疗有一定价值。(The invention relates to a new application of ferroferric oxide nanoenzyme, belongs to the field of western medicine pharmacy, and particularly relates to an application of polyethylene glycol coated ferroferric oxide nanoenzyme (PEG-Fe3O4 nanozyme) in promoting proliferation and differentiation of neuroblast cells. The invention can increase the differentiation of hippocampal neuroblast cells, protect blood brain barrier, enhance autophagy and reduce the level of oxygen free radicals by giving a small dose of PEG-Fe3O4nanozyme to daily drinking water. According to the invention, the polyethylene glycol-coated ferroferric oxide nanoenzyme (PEG-Fe3O4 nanozyme) has the function of promoting the differentiation of the neuroblast from multiple aspects, and has certain value for treating neurodegenerative diseases.)

四氧化三铁纳米酶的新用途

技术领域

本发明属于西药制剂领域，涉及四氧化三铁纳米酶的药用新用途，具体涉及四氧化三铁纳米酶在制备促进神经母细胞分化药物的应用。

背景技术

神经干细胞(neural stem cells,NSCs)具有自我更新特性和多向分化潜能,利用NSCs的特性,通过改善微环境,有效刺激促进这一过程,修复、替代受损的神经细胞在神经系统疾病的防治中具有重要的应用前景。海马齿状回(Dg)颗粒下区(SGZ)的神经元分化与大脑认知储备和脑可塑性有关。活性氧被认为是细胞中最重要的氧化分子，包括超氧物(O2-)、羟自由基(OH-)和过氧化氢(H2O2)。在生理条件下，ROS参与了多种生物学过程，如炎症反应、凋亡和自噬诱导，以及突触可塑性、学习和记忆。然而，当活性氧过度产生时，这些分子会引起氧化应激，减少神经分化，导致认知和记忆障碍。

在过去几十年中，Fe3O4纳米颗粒在生物传感器、磁共振成像(MRI)造影剂、热疗和放射线给药等生物技术中显示了广泛的应用前景。2007年中国科学家首次报道了Fe3O4纳米颗粒能够催化3,3'5,5'-四甲基联苯胺(TME)、邻苯二胺(OPD)、重氮氨基苯(DAB)等多种过氧化物酶底物显色，具有类似天然酶的催化活性。聚乙二醇(PEG)，一种能提高生物安全性，延长体内生物半衰期，并通过延长血液循环时间来增加纳米颗粒在脑中的通透性的聚合物，我们利用热吸收法制备了PEG包裹的Fe3O4纳米酶，经测定该酶具有过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶。通过观察了长期应用Fe3O4纳米酶对D-gal所诱导的小鼠海马神经元分化和BBB完整性的影响，并观察了纳米酶处理后的抗氧化、自噬和凋亡相关蛋白水平，探讨了PEG-Fe3O4纳米酶促进海马神经分化的作用机制。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述技术问题，提供了PEG-Fe3O4 nanozyme(聚乙二醇包裹的四氧化三铁纳米酶)的药用新用途，具体涉及PEG-Fe3O4 nanozyme在促神经分化药物中的治疗应用。

本发明的技术方案如下：

四氧化三铁纳米酶的新用途，其特征是，由聚乙二醇包裹的四氧化三铁纳米酶在促进神经母细胞增殖和分化中的应用。

优选的，所述聚乙二醇包裹的四氧化三铁纳米酶，其直径200nm。

优选的，通过日常饮用水中给予小剂量聚乙二醇包裹的四氧化三铁纳米酶后，能使海马区成神经母细胞分化增加，保护血脑屏障，增强自噬，减少氧自由基水平。

本发明观察PEG-Fe3O4 nanozyme对小鼠海马区神经分化的促进作用。

本发明应用免疫组织化学观察PEG-Fe3O4 nanozyme对小鼠海马区成神经细胞分化影响。实验结果显示，PEG-Fe3O4 nanozyme对神经分化具有促进作用。

本发明应用免疫组织化学染色、Western Blot观察PEG-Fe3O4 nanozyme对小鼠血脑屏障的影响。免疫组化结果显示，PEG-Fe3O4 nanozyme显著增加小鼠海马区PECAM-1的表达；Western Blot结果显示，PEG-Fe3O4 nanozyme显著增加小鼠海马区紧密连接蛋白ZO-1、claudin-5的表达。

本发明应用Western Blot方法检测PEG-Fe3O4 nanozyme对小鼠海马区抗氧化物酶SOD1,SOD2 and catalase的表达和凋亡相关蛋白Caspase-3and Bcl-2；自噬相关蛋白BECN-1、LC3A/B、ATg7和AKT/MTOR信号通路影响。实验结果显示，PEG-Fe3O4 nanozyme显著提高小鼠脑内抗氧化物酶蛋白表达，抑制AKT/MTOR信号通路，增加自噬水平，减少细胞凋亡。

本发明运用多系统、多角度的研究，综合阐明PEG-Fe3O4 nanozyme的促神经分化作用。由本发明所述可知，PEG-Fe3O4 nanozyme对神经分化有促进作用，与其具有类抗氧化物酶活性，增加脑内抗氧化物酶水平，增强自噬，减少细胞凋亡，保护血脑屏障有关。

本发明的有益效果：本发明中所述PEG-Fe3O4 nanozyme通过其类抗氧化物酶活性对神经分化起促进作用，有望对神经分化的新药研发提供依据。

本发明涉及聚乙二醇包裹的四氧化三铁纳米酶(PEG-Fe3O4 nanozyme)在促进神经母细胞增殖和分化中的应用。由本发明可知，聚乙二醇包裹的四氧化三铁纳米酶(PEG-Fe3O4 nanozyme)从多方面促进神经母细胞分化作用，对神经退行性疾病的治疗有一定价值。

附图说明

图1：PEG-Fe3O4 nanozyme对小鼠海马区神经分化的影响；图1A-1E是DCX+成神经细胞(X200),图1a-1e分别是图1A-1E放大的结果；n＝7，**P<0.01,与对照组比较；^#P＜0.05，^##P<0.01，与模型组比较；(A)正常小鼠；(B):D-gal处理小鼠；(C)：正常小鼠加纳米酶；(D):D-gal处理小鼠加纳米酶；(E):D-gal处理小鼠加Melatonin；D-gal:D-半乳糖；Mel：美拉托宁；PFe3O4:PEG-Fe3O4nanozyme；PL:多形层；GCL:颗粒细胞层；SGZ：颗粒下层；ML:分子层；

图2：PEG-Fe3O4 nanozyme对小鼠海马区血小板内皮细胞黏附分子-1(PECAM-1)的影响；n＝7，**P<0.01,与对照组比较；^#P＜0.05，^##P<0.01，与模型组比较；(A)正常小鼠；(B):D-gal处理小鼠；(C):D-gal小鼠加Melatonin(D)：正常小鼠加纳米酶；(E):D-gal处理小鼠加纳米酶；D-gal:D-半乳糖；Mel：美拉托宁；PFe3O4:PEG-Fe3O4 nanozyme；

图3：PEG-Fe3O4 nanozyme对小鼠海马区血脑屏障相关蛋白ZO-1和claudin-5表达的影响；其中，数据用目的蛋白和内参β-actin相比n＝7，*P<0.05,**P<0.01,与对照组比较；#P＜0.05，##P<0.01，与模型组比较；(A)正常小鼠；(B):D-gal处理小鼠；(C):D-gal小鼠加Melatonin；(D)：正常小鼠加纳米酶；(E):D-gal处理小鼠加纳米酶；D-gal:D-半乳糖；Mel：美拉托宁；PFe3O4:PEG-Fe3O4nanozyme.Saline：生理盐水；

图4：PEG-Fe3O4 nanozyme对小鼠海马区抗氧化物酶相关标记蛋白SOD1,SOD2和catalase表达的影响；其中，数据用目的蛋白和内参β-actin相比n＝7，*P<0.05,**P<0.01,与对照组比较；#P＜0.05，##P<0.01，与模型组比较；(A)正常小鼠；(B):D-gal处理小鼠；(C):D-gal小鼠加Melatonin；(D)：正常小鼠加纳米酶；(E):D-gal处理小鼠加纳米酶；D-gal:D-半乳糖；Mel：美拉托宁；PFe3O4:PEG-Fe3O4 nanozyme.Saline：生理盐水；

图5：PEG-Fe3O4 nanozyme对小鼠海马区凋亡相关标记蛋白Caspase-3and Bcl-2表达的影响；其中，数据用目的蛋白和内参β-actin相比n＝7，*P<0.05,**P<0.01,与对照组比较；#P＜0.05，##P<0.01，与模型组比较；(A)正常小鼠；(B):D-gal处理小鼠；(C):D-gal小鼠加Melatonin；(D)：正常小鼠加纳米酶；(E):D-gal处理小鼠加纳米酶；D-gal:D-半乳糖；Mel：美拉托宁；PFe3O4:PEG-Fe3O4nanozyme.Saline：生理盐水；

图6：PEG-Fe3O4 nanozyme对小鼠海马区自噬相关标记蛋白Atg7,Beclin-1andLC3II/I表达的影响；其中，数据用目的蛋白和内参β-actin相比n＝7，*P<0.05,**P<0.01,与对照组比较；#P＜0.05，##P<0.01，与模型组比较；(A)正常小鼠；(B):D-gal处理小鼠；(C):D-gal小鼠加Melatonin；(D)：正常小鼠加纳米酶；(E):D-gal处理小鼠加纳米酶；D-gal:D-半乳糖；Mel：美拉托宁；PFe3O4:PEG-Fe3O4 nanozyme.Saline：生理盐水；

图7：PEG-Fe3O4 nanozyme对小鼠海马区AKT/mTOR信号通路的影响；其中，数据用目的蛋白和内参β-actin相比n＝7，*P<0.05,**P<0.01,与对照组比较；#P＜0.05，##P<0.01，与模型组比较；(A)正常小鼠；(B):D-gal处理小鼠；(C):D-gal小鼠加Melatonin；(D)：正常小鼠加纳米酶；(E):D-gal处理小鼠加纳米酶；D-gal:D-半乳糖；Mel：美拉托宁；PFe3O4:PEG-Fe3O4 nanozyme.Saline：生理盐水；

图8为本发明中PEG-Fe3O4 nanozyme的示意图。

具体实施方式

实验材料和仪器：

实验材料：

1.PEG-Fe3O4 nanozyme的制备

采用热吸收法制备了PEG包裹的Fe3O4纳米酶。

2.美拉托宁(Melatonin)购于abcam公司。抗体使用情况如下：鼠抗PECAM-1购自美国Bio-techne公司，兔抗Caspase-3、LC3II/I、Atg7、AKT、P-AKT、mTOR、P-mTOR购自美国CellSignaling Technology公司；免疫组化二抗兔抗羊和羊抗鼠、兔抗ZO-1、Claudin5、SOD1and2购自abcam公司，羊抗DCX、BCL-2、BECN-1、兔抗β-actin购自Santa CruzBiotechnology公司。

实验仪器：computer-based microscope(Nikon Corporation；Tokyo,Japan)；Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate(Thermo Scientific,Rockford,USA)

小鼠来源：8周龄雄性ICR小鼠，在扬州大学比较医学中心(扬州，中国)购买。

实施例1：动物模型制备

本发明采用国际学术界公认的雄性8周龄雄性ICR小鼠，体重18～22g，2～3月龄，购自扬州大学比较医学中心，保持适当温度(23℃)和湿度(60％)，12小时光照/12小时黑暗环境，适应性饲养1周后。正常对照组小鼠正常摄食饮水，将动物随机分为5组(每组14只)：

1)对照组(0.9％生理盐水)，2)100mg/kg D-半乳糖处理组(D-gal-组)，3)50mg/kg褪黑素d-gal组(Mel-gal组)，4)10μg/ml PEG-Fe3O4纳米酶处理组(pfe3O4-组)；5)10μg/mlPEG-Fe3O4纳米酶+100mg/kg D-gal处理组(pFe3O4+D-gal组)。

D-半乳糖腹腔注射100mg/kg，每日1次，共12周制备小鼠模型。已证实美拉托宁是神经发生的正性内源性调节因子之一，具有改善记忆和促进海马神经分化的重要作用，在我们的研究中，我们选择美拉托宁作为阳性对照，每日灌胃一次，每次50mg/kg体重，给药4周。PEG-Fe3O4纳米酶给药方式为每日饮用Fe3o4纳米酶(10μg/ml，用ddh2O稀释)给药4周。

实施例2：PEG-Fe3O4 nanozyme对D-gal处理小鼠海马DG区神经发生的保护作用

本部分采用实施例1所述动物模型，每日饮用Fe3o4纳米酶，持续4周，末次给药后1h深麻醉小鼠，迅速剥离脑组织，4％多聚甲醛灌注，梯度蔗糖脱水，脑组织进行冰冻切片，根据脑图谱挑选海马脑片进行免疫组化染色,使用电子显微镜观察成神经细胞的形态。

结果如图1所示：Doublecortin(DCX)是一种在迁移的成神经细胞中存在的微管相关蛋白，是早期神经元的特异性标志物之一，DCX+细胞的数量与神经发生率相关，DCX阳性细胞主要位于海马的齿状回的颗粒下层(图1)。在对照组中，在颗粒下层中观察到许多DCX+细胞体(图1A)。D-gal组的DCX免疫反应阳性细胞远少于对照组(图1B)。但是，我们发现与D-gal相比，Mel+D-gal和PFe3O4+D-gal组DCX的阳性细胞数量明显增加(图1D，1E)。相比之下，PFe3O4组与对照组相比，DCX免疫反应阳性细胞明显减少(图1C)。

此外，我们根据先前描述的方法将DCX免疫阳性神经细胞的树突分为三类。在对照组中，大多数DCX免疫阳性细胞具有“α”型树突，这些树突很长，突出到DG的分子层(ML)中(图1a)。在D-gal和PFe3O4组，许多DCX免疫反应性细胞的树突为“β”和“γ”型(图1b，1c)。但是，Mel-gal和PFe3O4+D-gal中大多数DCX免疫阳性细胞的树突为“α”和“β”型。(图1d，1e)

实施例3：PEG-Fe3O4 nanozyme对D-gal处理小鼠海马DG区血小板内皮细胞黏附分子-1(PECAM-1)的影响。

本部分采用实施例1所述动物模型，每日饮用Fe3O4纳米酶，持续4周，末次给药后1h深麻醉小鼠，迅速剥离脑组织，4％多聚甲醛灌注，梯度蔗糖脱水，脑组织进行冰冻切片，根据脑图谱挑选海马脑片进行免疫组化染色,使用电子显微镜观察血管内皮血小板内皮细胞黏附分子-1(PECAM-1)的表达。

结果如图2所示：对照组海马DG区很容易检测到PECAM-1表达(图2A)。在D-gal组中，我们注意到与对照组相比，海马DG区PECAM-1免疫反应性显著降低(图2B)。然而，在Mel+D-gal和PFe3O4+D-gal组中，PECAM-1免疫反应性明显高于D-gal组(图2C，2E)。在PFe3O4组中，PECAM-1免疫反应性较对照组明显降低。

实施例4：PEG-Fe3O4 nanozyme对D-gal处理小鼠海马区脑组织中紧密连接蛋白ZO-1和claudin-5表达的影响

本部分采用实施例1所述动物模型，每日饮用Fe3O4纳米酶，持续4周，末次给药后1h深麻醉小鼠，迅速分离海马组织，应用Western blot方法检测小鼠海马区脑组织中紧密连接蛋白ZO-1和claudin-5表达，用全蛋白提取试剂盒对组织进行预处理，冰上裂解30min，2500rpm×4℃×15min，吸取上清。取1μL进行BCA蛋白定量(碧云天，上海)，余下上清蛋白按照体积比加入5X上样缓冲液95℃下变性5min，分装后-20℃保存。根据BCA定量结果，取30μg样品/泳道上样，根据蛋白的分子量选择浓度制备SDS-PAGE胶进行恒压(80-120V)凝胶电泳分离，300mA恒流下电转70-120min至PVDF膜(Millipore，USA)。5％(质量百分比脱脂奶粉的TBST(pH7.4，10mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.1％Tween-20)室温下震荡封闭1h，加入5％(质量百分比)BSA-TBST配制的一抗：兔抗ZO-1、Claudin5(1:1000,abcam)，兔抗β-actin(1:1000，Santa Cruz Biotechnology)。4℃孵育过夜。TBST漂洗10min 3遍，加入辣根过氧化物酶标记的二抗：山羊抗兔-HRP(1:3000，Santa Cruz,USA)，室温孵育60min，加入化学发光底物显色(Thermo Scientific,Rockford,USA)，并使用Quantity One分析软件(Bio-Rad)进行定量光密度分析，该软件用于计算相对光密度(ROD)的比率：校准ROD in％，对照组为指定为100％。用目的蛋白灰度值与各自内参β-actin灰度值之比进行半定量分析(ImageJ.)。以上的1:1000均指的是稀释1000倍。

图3结果显示，与对照组相比，D-gal组的ZO-1和Claudin-5蛋白水平明显降低。与D-gal组相比，Mel+D-gal和PFe3O4+D-gal组ZO-1和Claudin-5蛋白水平均明显升高，然而PFe3O4组ZO-1和Claudin-5蛋白水平较对照组减少。

实施例5：PEG-Fe3O4 nanozyme对D-gal处理海马区脑组织中抗氧化物酶标记蛋白含量的影响

本部分采用实施例1所述动物模型，每日饮用Fe3O4纳米酶，持续4周，末次给药后1h深麻醉小鼠，迅速分离海马组织，加入蛋白裂解液，组织蛋白提取，应用Western blot方法(同实施例4)检测小鼠海马区抗氧化物酶标记蛋白的含量。

结果如图4所示，与对照组相比，D-gal组的SOD1,SOD2和catalase蛋白质水平明显降低。然而，与D-gal组相比，Mel+D-gal和PFe3O4+D-gal组中明显升高；与对照组相比，PFe3O4中SOD1，SOD2和catalase蛋白水平显着下降。

实施例6：PEG-Fe3O4 nanozyme对小鼠海马区脑组织中凋亡相关蛋白的影响。

本部分采用实施例1所述动物模型，每日饮用Fe3O4纳米酶，持续4周，末次给药后1h深麻醉小鼠，迅速分离海马组织，加入蛋白裂解液，组织蛋白提取，应用Western blot方法(同实施例4)检测小鼠海马区凋亡相关蛋白的含量。

结果如图5显示，在PFe3O4组中，Caspase-3蛋白水平显著升高，而Bcl-2蛋白水平则大大降低。

实施例7：PEG-Fe3O4 nanozyme对小鼠海马区脑组织中自噬相关蛋白的影响。

本部分采用实施例1所述动物模型，每日饮用Fe3O4纳米酶，持续4周，末次给药后1h深麻醉小鼠，迅速分离海马组织，加入蛋白裂解液，组织蛋白提取，应用Western blot方法(同实施例4)检测小鼠海马区自噬相关蛋白的含量。

结果如图6显示，在PFe3O4组中，我们注意到与对照组相比，这些蛋白质水平显着降低。

实施例8：PEG-Fe3O4 nanozyme对小鼠海马区Akt/mTOR信号通路的影响。

Akt/mTOR途径在神经分化中起着关键作用，是影响自噬水平的重要途径，结果如图7显示，对照组和实验组之间p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR的比率存在差异。与对照组相比，pFe3O4组中p-Akt和p-mTOR明显增强，自噬被抑制。